FIZIOLOGIA BACTERIILOR. METABOLISMUL MICROBIAN.NUTRIIA I RESPIRAIA BACTERIILOR

Fiziologia bacterian studiaz viaa i activitile bacteriilor nutriia, respiraia, creterea i multiplicarea, condiiile de cultivare a bacteriilor.Metabolismul bacterian reprezint ansamblul de reacii biochimice care au loc n celula vie. Catabolism reacii chimice de descompunere a substanelor complexe n elemente simple, nsoit de degajarea energiei (metabolism energetic)Anabolism reacii chimice de sintez a substanelor complexe din elemente simple, necesit energie (metabolism constructiv, de sintez)

Particularitile metabolismului bacterian:Este un metabolism unicelular, necompartimentat (toate procesele metabolice se desfoar intr-o singur celul)Este foarte flexibil, realizndu-se prin diverse ci metabolice (bacteriile se adapteaz rapid la condiiile mediului)Este foarte intens (viteza reaciilor este mare)Produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct n calitate de precursori pentru reaciile anabolice (amfibolism) n toate reaciile metabolice intervin catalizatori proteici specifici - enzimele

Enzimele bacteriene. Caractere generale:Substane proteiceActive n limite largi de temperaturi (0-65C) i de pH (2-9) Specificitate de substrat i de aciune (reacioneaz cu un substrat cataliznd un tip de reacie)Specificitatea este determinat de centrul activ al enzimei, complementar cu receptorul de pe substratNu se modific n cursul reaciei

Clasificarea enzimelorConstitutive, permanenteInductive, adaptive, se sintetizeaz n prezena substratului (ex.: lactaza)Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n exces a produsului reaciei catalizateDup locul de aciune (exoenzime, endoenzime)Dup tipul reaciei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)Dup impactul asupra ma/o Enzime metaboliceEnzime de patogenitate, responsabile de modificri patologice ale esuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza, proteaze, etc.

Importana practic a studierii enzimelorRol n identificarea i clasificarea bacteriilor (enzimele determin activitatea biochimic specific a bacteriilor)Unele substane chimice, antibiotice interfereaz cu activitatea unor enzime, inhibnd creterea bacteriilor (tratament)Determinarea mecanismelor patogenezei infeciilor (unele enzime sunt responsabile de producerea leziunilor n esutul gazdei)Aplicarea industrial a enzimelor

NUTRIIA BACTERIANNutriia modalitile prin care bacteriile asimileaz din mediu substanele necesare pentru metabolism. Modul (tipul) de nutriie la bacterii este absorbtiv. Nutrieni substane, soluiile crora pot traversa MCP pentru a fi antrenate n metabolismul celulei. Se obin din alimente prin solvire (sruri minerale, CO2, O2) sau dup o digestie prealabil (proteine, polizaharide, lipide).La bacterii digestia este extracelular (la bacteriile G- n spaiul periplasmic)

Nutrienii servesc n calitate de material de construcie i surs de energie pentru sinteza compuilor i meninerea vieii bacteriei. Transportul transmembranar 1. Difuzie simpl (conform gradientului de concentraie, fr utilizarea energiei): O2, CO2, acizi grai, nutrieni liposolubili

2. Difuzie facilitat (conform gradientului de concentraie) permite transportul transmembranar al moleculelor mari prin intermediul proteinelor de transport specifice - permeaze. 3. Transport activ (contra gradientului de concentraie, necesit energie). Particip permeazele i alte proteine de transport specifice. Nutrienii nu suport modificri.4. Translocaie substratul este modificat (ex.: fosforilat) n timpul transportului membranar; necesit energie

Substanele care au ptruns n citoplasm sunt descompuse de ctre enzimele bacteriene conform cilor metabolice proprii fiecrei specii bacteriene (ex.: Embden-Meyerhof, Entner-Doudoroff, ciclul pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine energie i precursori care vor fi antrenai n biosintez (anabolism).Excreia metaboliilor difuzie, proteine de transport, liza bacteriei

Necesitile nutritive ale bacteriilorNecesiti elementare, de baz: C, H, O, N n cantiti importante, S, P, Fe, Ca, Mg, K n cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo- Necesiti specifice. Bacteriile prototrofe sunt capabile a-i realiza integral sinteza metaboliilor eseniali. Unele bacterii auxotrofe - solicit suplimentar compui organici preformai (factori de cretere), care nu pot fi sintetizai de bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul de cultur este indispensabil creterii acestor bacterii.

Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbonBacterii autotrofe utilizeaz CO2 ca unic surs de carbon (nepatogene)Bacterii heterotrofe utilizeaz carbonul din compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli, etc) Bacteriile care utilizeaz materia organic moart sunt saprofite (reciclarea materiei organice)Bacteriile parazite (obligate, facultative) triesc pe contul organismelor vii, aducndu-le prejudiciiBacteriile patogene reprezint parazite care afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau moarte.

Surse de azot AA sau acizi nucleiciSruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic

Surse de substane minerale: S - din AA, sulfuri, sulfai; P - din fosfai;K, Mg, Ca, Na - din sruri minerale; Zn, Cu, Mn, Mo din ap

Clasificarea bacteriilor dup sursa de energieBacterii fototrofe utilizeaz energia solar (fotosint)Bacterii chemotrofe folosesc energia degajat din reaciile chimice de oxido-reducere. Ele necesit un substrat donor de hidrogen (e- i H+) i un substrat acceptor de hidrogen. n transfer particip transportori intermediari de electroni (lanul respirator, NAD, NADH, FAD, etc.)Bacteriile chemolitotrofe donorul de H este o substan anorganicBacteriile chemoorganotrofe donorul de H este o substan organic (glucoza, lipide...)Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe

Mecanismele de obinere a energiei la chemoorganotrofe n funcie de acceptorul final de H : Respiraie aerob. Acceptorul final este oxigenul gazos. Implic lanul respirator de transport al electronilor asociat MCP. Produs final H2O sau H2O2 . Respiraie anaerob. Acceptori finali compui anorganici (nitrat, sulfat, S). Transportul de electroni prin lanul respirator. Produse finale nitritul, amoniacul, sulfura (n prezena O H2O2).

Fermentaie. Substratul organic este metabolizat fr intervenia unui agent oxidant extern. Const n procese de ox-red care realizeaz numai o oxidare parial a substratului, donorul i acceptorul de H+ fiind substane organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o molecul mai oxidat (ex.: fermentare lactic, fermentare alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc). Fermentaia se poate desfura n prezena O2, dar fr intervenia acestuia.

Conservarea energiei O parte din energia eliberat se pierde sub form de cldur sau poate fi utilizat direct sub form de energie electro-chimic (fpm) la nivelul MCP (ex.: rotaia flagelilor, transport transmembranar) sau stocat n compui chimici macroergici bogai n energie: ATP (sintetizat prin fosforilare oxidativ sau fosforilare la substrat), fosfoenol-piruvat, acetilfosfat i acetil-CoA.n procesele de respiraie se elimin mai mult energie dect din fermentaie (n glicoliz dintr-un mol de glucoz - 38 moli ATP, prin fermentaie - 2 moli ATP). n procese de fermentare se formeaz deeuri rejetate de ctre celul.

Clasificarea bacteriilor dup sursele de energie i carbonBacterii fotoautotrofe (energie solar, CO2)Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., subst.org) Bacterii chemoautotrofe Bacterii chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe)

CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILORCreterea mrirea coordonat a masei i volumului structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor de sintezMultiplicarea creterea numrului de celule pe o unitate de suprafa sau de volumDiviziune binarnmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)Autoreproducere (virusuri)Spori (micete)Fragmentare (actinomicete)

Ciclul celular procesele care au loc de la formarea celulei pna la urmtoarea diviziuneFaza C replicarea ADNFaza G de laten, segregarea cromozomilorFaza D de diviziune, formarea septuluiReplicarea ADN depinde de masa critic a celulei, iar separarea cromozomilor i diviziunea intervin n momentul cnd celula atinge o lungime - limit

Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul (perioada) de generaie (TG).Durata TG depinde de specie i de condiiile de cretere (condiii optime vitez maxim)

Bacteria TG in vitro (min)TG in vivo (ore)Escherichia coli20-405Staphylococcus aureus403-5Vibrio cholerae102-3Mycobacterium tuberculosis120-24024-48

Creterea bacteriilor n laborator cultivare. Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din medii naturale (prelevate patologice, alimente, ap, etc). Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru:Identificarea mi/o (scop de diagnostic) Testatea sensibilitii lor fa de antibioticeObinerea unor produi de biosintez (antibiotice, AA), bioconversie (hormoni steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor, probioticelor...

Pentru cretere bacteriile au nevoie de nutrieni i condiii fizico-chimice adecvate. Condiiile (principiile) de cultivareSurs nutritiv adecvatSurs de energieApTemperatura potrivitpH adecvatConcentraie optim a oxigenului i a CO2 Presiune osmotic adecvat

Temperatura de cretereExist temperaturi minime, maxime i optime de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu temperatura optim deosebim:Bacterii psichrofile t optim 10-20 C. Cresc i la 0 C.Bacterii mezofile optimum 30-37 C (limite 15-45 C)Bacterii termofile optimum 50-60 C (pn la 95 C)Bacterii hipertermofile (cresc la 70110 C)

pHBacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) pH 6-7,5Bacterii acidofile pH 2-6 (Lactobacillus)Bacterii alcalofile pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)Presiunea osmoticBacterii halotolerante (osmotolerante) cresc n concentraii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o patogeneBacterii halofile prefer concentraii mari de NaCl (1-30%) stafilococi, vibrioni (Vibrio parahaemolyticus)

Oxigenul Bacterii strict aerobe cresc doar n prezena O2. Obin energia prin respiraie aerob Bacterii microaerofile necesit concentraii reduse de O2 i 2-10% CO2. Obin energia prin respiraie sau fermentaie (Neisseria, Brucella, Campylobacter)Bacterii strict anaerobe cresc doar n absena O2. Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie anaerob. Toxicitatea O2 formarea H2O2, a radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi O22- pe care anaerobii nu le pot descompune (absena catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei) Clostridium, BacteroidesBacterii anaerobe aerotolerante pot crete n prezena O2, obin energia prin fermentaie, posed peroxidaz (Lactobacillus, streptococi)Bacterii facultativ anaerobe cresc n orice condiii, obin energia prin respiraie sau fermentaie

Mediile de cultur soluii sau substrate solide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru cultivarea (izolarea) bacteriilor, testarea sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul culturilor bacreiene.Cerinele fa de mediile de culturS asigure necesitile nutritive i energetice ale bacteriilorUmiditate optimalpH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon) Potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH210)S fie izotonice (0,5% NaCl)S fie sterile i transparente

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURDup provenien Empirice, naturale. Au la baz produse de origine animal sau vegetal (snge, ser, lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia lor chimic precis nu poate fi controlatSintetice includ ingrediente chimice pure, compoziia chimic este cunoscut cu exactitate Semisintetice

Dup consistenMedii lichide (bulion) utilizate pentru obinerea biomasei bacteriene i a produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)Medii solide conin 10-15% gelatin sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roii, t topire 80-100C, solidificare 42C). Placa de geloz n cutii Petri este utilizat pentru izolarea culturilor pure, geloza nclinat (n pant) pentru acumularea culturilor pureMedii semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se utilizeaz pentru studierea activitii biochimice sau a mobilitii bacteriilor.

Dup compoziia chimic (complexitate) i destinaieA. Medii uzuale (universale, simple) Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% NaCl)Bulion peptonat BP (extract apos din carne + 1% pepton+0,5% NaCl)Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar)Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin)Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivareSterilizarea prin autoclavare: 120C, 20 min

B. Medii complexe I. Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloz-snge streptococi, neisserii; ser coagulat corinebacterii, etc)II. Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice particulare care stimuleaz creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza salin - stafilococi, geloza alcalin - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)

Mediile de mbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru mbogirea florei patogene i inhibarea florei de asociaie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale)Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit )Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) SalmonellaBulion cu selenit Shigella, SalmonellaAp peptonat alcalin (pH=8) Vibrio choleraeKitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobi

III. Medii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenierea speciilor bacteriene n baza activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere)Sunt construite dup urmtoarea schem:Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate) Medii DD pentru izolarea culturii pureStudierea proprietilor zaharoliticeEndo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na)Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant)Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)

Studierea proprietilor de oxido-reducereMediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella (colonii negre reducerea sulfitului n sulfura de Bi)

Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de K) pentru Corynebacterium diphtheriaeStudierea proprietilor lipoliticeGeloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei

Studierea proprietilor hemoliticeGeloza-snge (geloza+5-15% snge defibrinat)n cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o zon clar

Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicatorKligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+ureeIndicatorul Andrede fucsin+NaOH Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n galben. n pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), n coloan-glucoza (fermentare).Producerea H2S nnegrirea mediului

Medii DD pentru identificarea final a culturii pure- irul pestri Hiss (lichid sau semi-solid) un ir de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i indicator.Aprecierea dup modificarea culorii (acid - A) i apariia bulelor de gaz (acid i gaz - AG)Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatoriIV. Medii speciale pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Lowenstein-Jensen pentru agenii tuberculozei, Sabouraud fungi)

V. Medii de transport destinate transportrii sau stocrii unui material (prelevat), care va fi examinat ulterior.Menine n via bacteriile, fr a favoriza multiplicarea lor.Mediul cu glicerin 30%Soluie tampon-fosfatSoluie NaCl 3%Mediul Cary-BlairMediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) pentru anaerobi, neisserii, etc

Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic de material ce conine bacterii (inoculum) se ntroduce ntr-un mediu de cultur (nsmnare, inoculare), care ulterior va fi incubat n termostat (pentru asigurarea temperaturii optime). n timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile cresc i se divid, formnd o cultur bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu). M.tuberculosis 3-5 sptmniV.cholerae 6-12 ore

Cultur pur format din bacterii de aceeai specie (indispensabil identificrii)Cultur mixt compus din bacterii de specii diferiteTulpin populaie microbian constituit din descendenii unei singure izolri n cultur pur, care va fi studiat ulterior. Clon populaie care rezult din multiplicarea unei singure celule

Manifestarea creterii i multiplicrii bacteriilor n mediu lichid - Turbiditate uniform- Formarea unei pelicule la suprafaa mediului (vibrioni, yersinia - agentul pestei)Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe perei (streptococi, Bacillus anthracis)

n mediu solid formarea coloniilorColonie o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o singur celul sau un grup de celule (UFC - unitate formatoare de colonii) pe suprafaa unui mediu solidFiecare specie bacterian formeaz colonii specifice (caracter util n identificare)

Caracteristica coloniilorDimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, etcSuprafa plat, bombat, convex, ombilicat, etcForm punctiform, circular, filamentoas, neregulatCuloare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etcDensitate opac, transparent, etcConsisten cremoas, untoas, uscat, mucoid

Tipurile de coloniiColonii S (smouth) rotunde, netede, umede, lucioase Colonii R (rough) margini neregulate, suprafaa uscat, rugoas

Caracterele de cultur ale bacteriilor reprezint exigenele nutritive (medii, temperatur, pH, aerare, etc), viteza i manifestarea creterii pe medii lichide i solide

Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi

n funcie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting:Culturi discontinueCulturi continueCulturi sincrone

Culturile discontinue se obin la cultivarea bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul microbiologic

Fazele dezvoltrii unei culturi discontinueI. Faza de lag faza de adaptare la condiiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc n dimensiuni, dar nu se divid.Durata este variabil (2-4 ore); depinde de starea bacteriei, condiiile mediului, etcII. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu vitez maximal constant, curba evolueaz exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la ageni antimicrobieni (culturi utile pentru testarea sensibilitii la antibiotice). Durata 8-10 ore

III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic scade treptat, numrul celulelor vii rmne constant mai multe ore.Cauza consumarea nutrienilor, acumularea metaboliilor toxici.Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la agenii antimicrobieni scade. Durata 10-12 oreIV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor progresiv

Cultura continu se realizeaz cnd mediul de cultur este continuu rennoit i mbogit cu oxigen cu evacuarea unei cantiti de cultur. Se realizeaz n chemostate sau turbidostate, cultura aflndu-se permanent n faza exponenial. Se utilizeaz n microbiologia industrial. n intestin culturi continue.Culturi sincrone culturi n care bacteriile se divid n acelai timp

EXAMENUL BACTERIOLOGICExamenul bacteriologic const n inocularea prelevatelor pe medii de cultur pentru izolarea culturilor pure de bacterii (tulpinilor) care vor fi ulterior identificate, testate vis-a-vis de antibiotice, eventual conservate.Examenul bacteriologic const din cteva etape succesive, de la prelevarea (recoltarea) probelor biologice pn la remiterea rezultatelor.

Faza pre-analitic (responsabilitatea medicului)Prescrierea investigaiei (n funcie de datele examenului clinic i paraclinic). n ordonan se fixeaz identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestrile patologice, locul, data apariiei, alte date: imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc.Prelevarea probelor Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare a agentului patogen)

Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni:Secreii rino-faringieneSputPuroiExudateSngeLCRUrinMase fecaleBioptateMaterial cadaveric

Materiale de examinat din mediul extern:ApAlimenteSolAerLavajeVectori, etc

Modul de prelevare (recoltare) n recipiente sterileRespectnd regulile de autoprotecieLa debutul boliiPn la administrarea antibioticelorTransportareaImediat sau utiliznd medii de transport, cu respectarea condiiilor speciale dup necesitaten ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)n fia de nsoire s fie indicat identitatea pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevrii, scopul investigaiei)

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBEPrelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) - orientare n diagnostic Dup necesitate, probele sunt supuse pregtirii pentru investigaie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc)Examinarea microscopic (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...) prezena mi/o, forma, cantitatea, G+/-.

I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE Scopul izolrii - de a obine o cultur pur dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic. O colonie separat constituie o cultur pur.Tehnici utilizate:Prin epuizarea inoculului pe suprafaa gelozei din cutia Petri (nsmnare n striuri paralele, nsmnare n cadrane, etalarea consecutiv pe trei cutii).Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n geloz topit i rcit la 50 C (10-1, 10-2,...), apoi turnate n cutii Petri sau eprubete.Incubare n termostat la 37 C, 18-24 h (n funcie de TG).

Metode speciale de izolare n culturi pure:A bacteriilor sporulate: nclzirea prealabil a prelevatului 80 C 20 minA bacteriilor acido-rezistente: tratarea prealabil cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar cu o bazA bacteriilor din asociaii cu numr minim de mi/o patogene: mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd medii de mbogireA bacteriilor cu virulen nalt i pretenioase la cultivare: inocularea la animalele de laborator sensibile

II etap ACUMULAREA CULTURII PUREExaminarea macroscopic a coloniilor crescute (form, culoare, dimensiuni, etc)Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte, confirmarea puritii culturiiRepicarea coloniilor suspecte pe geloz n pant (nclinat) pentru acumularea culturii pureTermostat, 37 C, 18-24 ore

III etap IDENTIFICAREA CULTURII PUREVerificarea puritii culturii (frotiu Gram)Identificarea culturii pure const n evidenierea unor caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include ntr-o familie, gen, specie, variantSe studiaz caracterele:MorfologiceTinctorialeDe culturBiochimice Antigenice (seroidentificarea)De patogenitateSensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)Sensibilitatea la antibiotice

STUDIEREA ACTIVITII BIOCHIMICE A BACTERIILORActivitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea laptelui, etc) Activitatea proteoliticDegradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc)Evidenierea enzimelor specifice (ureaz, decarboxilaze, dezaminaze, etc) prin detectarea produsele finale ale reaciilor: H2S, NH3, indol

Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fer de culoare neagr n mediile multitest Kligler, Olkeniki, etc; plasarea unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu acetat de Pb deasupra BP n care crete cultura studiat (formarea sulfurii de Pb nnegrete hrtia)Depistarea indolului (produs al metabolizrii triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu acid oxalic. n prezena indolului indicatorul vireaz n roz.Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de turnesol se coloreaz n albastru.

Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2)(cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat apariia bulelor de gaz)Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei din lanul respirator)Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin (benzi sau rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc)Oxidarea reactivului culoare violet-neagrOxidazo+ : Neisseria, Vibrio, PseudomonasOxidazo- : Enterobacteriaceae

Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% - formarea unui halou opac n jurul coloniilorDepistarea lipazei mediu cu Twin 80 1% halou opac n jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai)Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-10% - zon clar n jurul colonieiDepistarea ADNazei, fosfatazei, etc Probele sunt incubate la 37 C, 18-24 h

Identificarea rapidUtilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spaiu, material)Sistemul API o galerie din plastic format din numeroase alveole care conin fiecare un mediu deshidratat diferit (glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacterian testat i incubate. Ulterior la necesitate se adaug reactive pentru detectarea metaboliilor particulari.Lectura conform unui cod de cifre sau computerizat

IV etap EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA RSPUNSULUICompararea rezultatelor obinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a gsi asemnri.Exemplu de rspuns: Din proba examinat a fost izolat tulpina de Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la .....

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene)Condiia principal cultivare n absena oxigenului Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100 C, 20 min, rcit, acoperit cu vazelin; nsmnarea n geloz n coloan)2. Crearea condiiilor de anaerobiozMetoda fizic utilizarea anaerostatuluiMetoda chimic n exicator se ntroduc substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz); utilizarea gas-pachetelorMetoda biologic Fortner cultivarea concomitent a aerobilor i anaerobilor

Recoltarea cu precauie, evitnd contactul cu aerul (n seringi, utiliznd medii speciale)I etap MBOGIREA ANAEROBILORnsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat nclzirea unui tub la 80 C, 20 min distrugerea florei nesporogeneIncubarea la 37 C, 24-48 h (va avea loc nmulirea anaerobilor)

II etap - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBIStudierea caracterelor de cultur tulburarea mediului, descompunerea bucilor de ficat, etcIzolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (nsmnarea a 0,1 ml din mediul K-T pe 3 cutii cu geloz-snge glucozat consecutiv). Incubarea n anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h

Metoda Weinberg diluii succesive a culturii n geloz glucozat lichefiat i aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise ermetic. Incubarea n termostat, 24 hIII etap - ACUMULAREA CULTURII PUREStudierea macroscopic a coloniilorExaminarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecteRepicarea n mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pureIncubarea n termostat, 24 h

IV etap - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBIVerificarea puritii culturii pure (frotiu Gram)Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiiilor de anaerobioz)

V etap - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA I ELIBERAREA RSPUNSULUI