Post on 19-Jan-2016
transcript
Tehnica ELISA
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
Biochimie Medicina dentara
•Ce este ELISA?
•Tipuri
•Aplicatii
•Principiu
ELISA
Biochimie Medicina dentara
ELISA
Biochimie Medicina dentara
Ce este?• Evaluarea prezentei si concentratiei anticorpilor si antigenilor dintr-o proba
• Primele studii au fost facute in 1971 folosita pentru screeningul HIV
• O tehnica biochimica folosita in special in imunologie
• Primul si cel mai comun test folosit pentru detectarea unui patogen dintr-o proba
• Avantaje - sensitiva (0.01-10ng/ml) - cantitativa - reproductibila - format de kit
ELISA
Biochimie Medicina dentara
Tipuri • ELISA Calitativa- rezultatele sunt pozitive sau negative
• ELISA Cantitativa- densitatea optica a probei este comparata cu un standard
• ELISA - indirecta - competitiva - sandwich (directa)
ELISA
Biochimie Medicina dentara
Aplicatii • Evaluarea cantitativa/calitativa a anticorpilor si antigenilor dintr-o proba
• Medicina: metoda de diagnostic - HIV, holera, boli venerice, gripa aviara sau porcina, hormoni (sarcina)
• Industria alimentara: detectarea alergenilor din mancare lapte, alune, oua
• Toxicologie: detectarea drogurilor
• Cercetare
ELISA
Biochimie Medicina dentara
Principiu •Ce este un antigen? •Ce este un anticorp?
Anticorp
Antigen
Epitop
•Enzyme-linked immunosorbent assay: numele sugereaza 3 componente
Anticorp - permite detectia analitului de interes Faza solida - suportul unde are loc adsorbtia Enzima - determina schimbarea de culoare-semnalul
ELISA
Biochimie Medicina dentara
Primul anticorp
Antigenul
Al doilea anticorp conjugat cu enzima
ELISA-sandwich direct
Principiu
2
1
3
ELISA
Biochimie Medicina dentara
Principiu
substrat
produs
standard
proba
Tehnica PCRPolymerase Chain Reaction
Biochimie Medicina dentara
PCR
•Ce este PCR?
•Tipuri
•Aplicatii
•Principiu
Biochimie Medicina dentara
PCR
Ce este?
Biochimie Medicina dentara
• Polymerase Chain Reaction (Reactia in lant a polimerazei)
• Mullis & Faloona – Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, 1987
• Mullis: Premiul Nobel, Chimie, 1993
• Amplificarea cu ajutorul unei enzime (ADN-polimeraza) a numărului de copii ale unei regiuni specifice dintr-un lanţ ADN
Kary Mullis
PCR
Tipuri
Biochimie Medicina dentara
• Exista multe variatii ale acestei tehnici: long PCR, late PCR in situ PCR, colony PCR, single cell PCR
• Cele mai folosite:
- standard PCR- RT-PCR ( real-time)
PCR
Aplicatii
Biochimie Medicina dentara
•Testarea unor mutatii (ex.: fibroza chistica, gene tumorale)
•Testare prenatala (si screening preimplantare)
•Infectii virale (HIV), bacteriene (BK)
•Teste de histocompatibilitate
•Medicina legala
•Teste de paternitate
•Identificarea de persoane
•Cladistica
clade
PCR
Principiu
Biochimie Medicina dentara
Materiale
•ADN de amplificat: Sange, Sperma, Par, Periuta de dinti, Insecte (in chilhlimbar), Mumii, Amprente, Urina
•Primeri (oligonucleotide, amplimeri) : 20-30 de dezoxiribonucleotide complementare extremitatilor 5’ sau 3’ ale fragmentului de amplificat
•ADN-polimeraza : enzima care catalizeaza polimerizarea dTNP in catene ADN (elongarea primerilor)
•dNTP (dezoxiribonucleotid trifosfati)
•Solutie tampon
Colectare probe ADN
PCR
Principiu
Biochimie Medicina dentara
Etapele PCR
• Denaturarea ADN-ului dublu catenar
• Cuplarea primerilor de ADN-ul simplu catenar
• Extensia primerilor
PCR
Principiu
Biochimie Medicina dentara
Denaturarea ADN
• 94-98 ºC, 20-30 de secunde• ADN-ul este desfasurat in doua lanturi ADN simplu-catenare complementare
Cuplarea primerilor
• 50-65 ºC, 20-40 de secunde• Lant dublu-catenar hibrid – primeri si ADN de amplificat
Extensia primerilor• ADN-polimeraza: Se leaga de lantul hibrid „Citeste” secvenţa lantului ADN-tinta; Alungeste primerii prin adaugarea de dNTP, pe baza regulii complementaritatii
PCR
Principiu
Biochimie Medicina dentara
Amplificarea
MW: dimensiuni cunoscute1: ~1850 bp2: ~800 bp3: nu s-a amplificat4: ~800 bp5: benzi multiple
Vizualizare produsi de amplificare