REZULTATELE INVESTIGATIILOR PCR REZULTATELE INVESTIGATIILOR PCR IN PRECIZAREA DIAGNOSTICULUI IN PRECIZAREA DIAGNOSTICULUI

BOLILOR LA PASARIBOLILOR LA PASARI IN PERIOADA IANUARIE - NOIEMBRIE 2012IN PERIOADA IANUARIE - NOIEMBRIE 2012

INTALNIREA TRIMESTRIALA A INTALNIREA TRIMESTRIALA A SOCIETATII MEDICILOR VETERINARI IN PATOLOGIA AVIARA SOCIETATII MEDICILOR VETERINARI IN PATOLOGIA AVIARA

SI A ANIMALELOR MICI DIN ROMANIASI A ANIMALELOR MICI DIN ROMANIA

ACADEMIA DE STIINTE AGRICOLE SI SILVICE ‘GHEORGHE IONESCU SISESTI” ACADEMIA DE STIINTE AGRICOLE SI SILVICE ‘GHEORGHE IONESCU SISESTI” AULA MAGNA AULA MAGNA

Bucuresti Bucuresti 1212 decembrie 2012 decembrie 2012

Dr. Virgilia PopaDr. Virgilia Popa11, Dr. Eduard Caplan, Dr. Eduard Caplan11, Dr. Marian Culcescu, Dr. Marian Culcescu11, , Dr. Jenica BucurDr. Jenica Bucur22, Prof. univ. Dr. Nicolae Catana, Prof. univ. Dr. Nicolae Catana33, Dr. Ionica Fodor, Dr. Ionica Fodor33, ,

Conf. Univ. Dr. Nicolae AlexandruConf. Univ. Dr. Nicolae Alexandru11, Prof. univ. Dr. Valer Teusdea, Prof. univ. Dr. Valer Teusdea11

11SN Institutul Pasteur SA, SN Institutul Pasteur SA, 22SC Farmavet SA, SC Farmavet SA, 33FMV Timisoara, Catedra de boli infectioaseFMV Timisoara, Catedra de boli infectioase

CENTRUL DE DIAGNOSTIC CENTRUL DE DIAGNOSTIC INSTITUTUL PASTEURINSTITUTUL PASTEUR

176 examene PCR176 examene PCR ((PCR clasic, multiplex PCR clasic, rPCRPCR clasic, multiplex PCR clasic, rPCR, RAPD), RAPD)

colisepticemia / colibacilozele aviarecolisepticemia / colibacilozele aviare ( (tipizarea tipizarea E.coliE.coli specific specific patogenpatogenaa pentru pasari - pentru pasari - APECAPEC))

micoplasmozele aviare cauzate de micoplasmozele aviare cauzate de Mycoplasma gallisepticumMycoplasma gallisepticum ((MGMG) si ) si M. synoviaeM. synoviae ( (MSMS), ),

ornitobacterioza (detectia agentului cauzal ornitobacterioza (detectia agentului cauzal Ornithobacterium Ornithobacterium rhinotrachealerhinotracheale - - ORTORT), ),

bronsita infectioasa aviara (bronsita infectioasa aviara (IBVIBV, prin detectia si discriminarea , prin detectia si discriminarea tulpinilor tip tulpinilor tip QxQx, , MassMass si si It02It02), ),

laringotraheita infectioasa aviara (laringotraheita infectioasa aviara (ILTILT), ), boala Marek (detectia agentului cauzal, boala Marek (detectia agentului cauzal, MDVMDV), ), bursita infectioasa aviara (bursita infectioasa aviara (IBDVIBDV, cu detectia si discriminarea , cu detectia si discriminarea

patotipului foarte virulent, patotipului foarte virulent, vvvv, si a patotipului atenuat, , si a patotipului atenuat, attatt) ) rinotraheita infectioasa aviara (rinotraheita infectioasa aviara (AMPV / ART / TRTAMPV / ART / TRT, cu detectia si , cu detectia si

discriminarea tipurilor virale discriminarea tipurilor virale A, B, CA, B, C si si DD). ).

Escherichia coli Escherichia coli

patogena pentru pasaripatogena pentru pasari - - APECAPECExtracţie ADN: lizat termic, din culturi pure obtinute in BHI (Himedia), Extracţie ADN: lizat termic, din culturi pure obtinute in BHI (Himedia), la 37oC, timp de 18 ore (Germani 1995). Multiplex PCR pentru genele la 37oC, timp de 18 ore (Germani 1995). Multiplex PCR pentru genele ompA, iss si fimH:ompA, iss si fimH: (Popa et al. 2004, Scientific Papers Veterinary (Popa et al. 2004, Scientific Papers Veterinary Medicine Timisoara, 37: 522 – 528). Amestec de amplificare: Ilustra Medicine Timisoara, 37: 522 – 528). Amestec de amplificare: Ilustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare). Volum de PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare). Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial (NAPS Unit, UBC reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial (NAPS Unit, UBC Vancouver, Canada): ompA – 30 pmol fiecare, iss si fimH – 25 pmol Vancouver, Canada): ompA – 30 pmol fiecare, iss si fimH – 25 pmol fiecare. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Applied fiecare. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems) sau iCyler (Biorad). Program de amplificare (81PE): Biosystems) sau iCyler (Biorad). Program de amplificare (81PE): 94oC, 10min – 1x; 94oC, 1 min + 55oC, 1,5 min + 72oC, 2,5 min – 94oC, 10min – 1x; 94oC, 1 min + 55oC, 1,5 min + 72oC, 2,5 min – 30x; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – for ever. Martor pozitiv intern: tulpina 30x; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – for ever. Martor pozitiv intern: tulpina E.coli PIB4293 (origine aviară; 1996; CRb+; serr; iss+; ompA+; E.coli PIB4293 (origine aviară; 1996; CRb+; serr; iss+; ompA+; fimH+). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – fimH+). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C). P119C). Escherichia coli de origine aviara. Gel electroforeza post-multiplex PCR ompA+iss+fimH pentru tipizare moleculara APEC. Linia 1 – standard ADN – 100bp DNA Ladder (Promega); linia 2 – martor pozitiv E.coli PIB 4293 (pozitiv ompA, iss, fimH); linia 3 – E.coli 9987 (pozitiv ompA, iss, fimH); linia 4 – E.coli 9988 (pozitiv ompA, iss, fimH); linia 5 – E.coli 9989 (pozitiv ompA, iss, fimH); linia 6 – martor negativ (NFW).

1 2 3 4 5 6

670bp

737bp

1421bp

Cultivarea probelor de Cultivarea probelor de organ (amprente) prelevate organ (amprente) prelevate pe tampoane de sanitatie pe tampoane de sanitatie pentru examenele prin pentru examenele prin PCR pentru evidentierea PCR pentru evidentierea prezentei de material prezentei de material genetic apartinand genetic apartinand MycoplasmaMycoplasma spp., timp de spp., timp de 1h la 371h la 37ooC, in Mycoplasma C, in Mycoplasma Synoviae Medium Base Synoviae Medium Base (M624, Himedia), (M624, Himedia), suplimentat cu 10% ser de suplimentat cu 10% ser de porc inactivat la 56oC, porc inactivat la 56oC, 100000 UI % penicilina G 100000 UI % penicilina G si 0.025% acetat de taliu.si 0.025% acetat de taliu.

Mycoplasma gallisepticumMycoplasma gallisepticum – – MGMG Mycoplasma synoviaeMycoplasma synoviae - - MSMS

Probe prelevate de la tineret RG 25 – 28 zile (pool-uri Probe prelevate de la tineret RG 25 – 28 zile (pool-uri narine - N, pulmon -P, trahee - T). Gel-electroforeza narine - N, pulmon -P, trahee - T). Gel-electroforeza post multiplex PCR (pMGA1.9 + 23s rRNA – MS) post multiplex PCR (pMGA1.9 + 23s rRNA – MS) pentru detectia pentru detectia Mycoplasma gallisepticumMycoplasma gallisepticum si si M. M. synoviaesynoviae. Linia 1: Martor negativ (NFW, Promega); linia . Linia 1: Martor negativ (NFW, Promega); linia 2: narine N (pozitiv MS, ampliocn 300 bp); linia 3: T1 2: narine N (pozitiv MS, ampliocn 300 bp); linia 3: T1 (negativ MG, negativ MS); linia 4: T2 (negativ MG, (negativ MG, negativ MS); linia 4: T2 (negativ MG, negativ MS); linia 5: T3 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp); negativ MS); linia 5: T3 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp); linia 6: P1 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp; + ampliconi linia 6: P1 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp; + ampliconi nespecifici); linia 7: P2 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp; + nespecifici); linia 7: P2 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp; + ampliconi nespecifici); linia 8: P3 (pozitiv MS, ampliocn ampliconi nespecifici); linia 8: P3 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp; + ampliconi nespecifici); linia 9: P4 (pozitiv MS, 300 bp; + ampliconi nespecifici); linia 9: P4 (pozitiv MS, ampliocn 300 bp; + ampliconi nespecifici); linia 10: ampliocn 300 bp; + ampliconi nespecifici); linia 10: Martor pozitiv: mix Martor pozitiv: mix M. gallisepticumM. gallisepticum, amplicon 163 bp) si , amplicon 163 bp) si M. synoviae, amplicon 300 bp); linia 11 - Standard ADN M. synoviae, amplicon 300 bp); linia 11 - Standard ADN - 100bp DNA Ladder (Promega).- 100bp DNA Ladder (Promega).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

300 bp

163 bp

Extracţie ADN : lizat termic (Ramirez et al. 2006, Veterinary Microbiology 118: 76–82).. Extracţie ADN : lizat termic (Ramirez et al. 2006, Veterinary Microbiology 118: 76–82).. Amorse Popa V (date personale) gena pMGA1.9, M. gallisepticum, amplicon 163 bp si Amorse Popa V (date personale) gena pMGA1.9, M. gallisepticum, amplicon 163 bp si Ramirez 2006, gena 23s ARN, M. synoviae, amplicon 300bp. Amestec de amplificare: Ramirez 2006, gena 23s ARN, M. synoviae, amplicon 300bp. Amestec de amplificare: illustraTM PuReTaqTM Ready-To-GoTM PCR Beads (GE Healthcare 27-9557-01), illustraTM PuReTaqTM Ready-To-GoTM PCR Beads (GE Healthcare 27-9557-01), suplimentat cu 0.5mM MgCl2. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Applied suplimentat cu 0.5mM MgCl2. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems) sau iCyler (Biorad).. Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 30 Biosystems) sau iCyler (Biorad).. Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 30 pmol fiecare. Program de amplificare (127PE / MgallSyn,iCy): 80oC, 30min – 1x; 94oC, 15 sec pmol fiecare. Program de amplificare (127PE / MgallSyn,iCy): 80oC, 30min – 1x; 94oC, 15 sec + 55oC, 30 sec + 72oC, 1 min – 5x; 94oC, 15 sec + 55oC, 30 sec + 72oC, 1 min – 30x, cu + 55oC, 30 sec + 72oC, 1 min – 5x; 94oC, 15 sec + 55oC, 30 sec + 72oC, 1 min – 30x, cu increment de 2 sec la fiecare ciclu; 72oC, 10 min – 1x; 4oC, 10 min (for ever) – 1x. Martori increment de 2 sec la fiecare ciclu; 72oC, 10 min – 1x; 4oC, 10 min (for ever) – 1x. Martori pozitivi: Mycoplasma gallisepticum A5969 (Charles River Spafas – Affinitech), Mycoplasma pozitivi: Mycoplasma gallisepticum A5969 (Charles River Spafas – Affinitech), Mycoplasma synoviae WVU1853 (Charles River Spafas – Affinitech). Martor negativ: apa ultrapura PCR synoviae WVU1853 (Charles River Spafas – Affinitech). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega, NFW – P119C). sterila (Promega, NFW – P119C).

Test rPCR Sybr Green pentru tipul / serotipul Qx (CR/FR) al VBI. Fereastra din programul logic MxPro v4.01/2007, care asista echipamentul de amplificare spectrofotometrica Mx3005P (Stratagene). .Curba de disociere si calculul Tm al ampliconilor obtinuti. Probele din teren (amprente pulmon si trahee prelevate pe tampoane de sanitatie) inregistreaza varfuri similare intre ele dar cu Tm diferit de cel al martorului pozitiv (IB88, Merial), in marja de ± 4 Tm, acceptata in literatura..

Coronavirusul aviarCoronavirusul aviar – – IBV / VBIIBV / VBI

Extracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR IBV pentru gena S1: amorse Popa V Extracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR IBV pentru gena S1: amorse Popa V (date personale), designate pentru tipul Massachussetts, pentru tipul Qx si pentru tipul It02. Amestec de (date personale), designate pentru tipul Massachussetts, pentru tipul Qx si pentru tipul It02. Amestec de amplificare 2x Brilliant II Sybr Green qRT-PCR Master Mix, 1 step (Agilent 600825-51). Volum de reactie: 25 ul. amplificare 2x Brilliant II Sybr Green qRT-PCR Master Mix, 1 step (Agilent 600825-51). Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 12.5 pmol fiecare. Amplificator spectrofotometric Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 12.5 pmol fiecare. Amplificator spectrofotometric Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare (25Mx): 42oC, 30 min + 95oC, 15 min – 1x; 94oC, 45 sec + Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare (25Mx): 42oC, 30 min + 95oC, 15 min – 1x; 94oC, 45 sec + 50oC, 45 sec + 72oC, 1 min – 40x; 72oC, 10 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere, 50oC, 45 sec + 72oC, 1 min – 40x; 72oC, 10 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere, din probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor; apoi, curba de din probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor; apoi, curba de disociere implicita a programului MxPro v01/2007 (95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. Si rampa la 95oC, cu date disociere implicita a programului MxPro v01/2007 (95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. Si rampa la 95oC, cu date colectate in toate punctele acesteia). Martori pozitivi: tulpina vaccinala IB88 (Merial, amplicon 190 bp, pentru colectate in toate punctele acesteia). Martori pozitivi: tulpina vaccinala IB88 (Merial, amplicon 190 bp, pentru grupul de tulpini Qx, inclusiv CR / FR / 4/91) si tulpina vaccinala Ma5 (Intervet, amplicon 212 bp, pentru grupul de grupul de tulpini Qx, inclusiv CR / FR / 4/91) si tulpina vaccinala Ma5 (Intervet, amplicon 212 bp, pentru grupul de tulpini tip Massachussetts, inclusiv H120, H52 – tulpini vaccinale clasice). Martor negativ: apa ultrapura PCR tulpini tip Massachussetts, inclusiv H120, H52 – tulpini vaccinale clasice). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).sterila (Promega NFW – P119C).

Confirmarea prin gel-electroforeza a testelor rPCR Sybr Green pentru tipul / serotipul Qx (CR/FR, 4/91), A, liniile 1 – 7, pentru tipul / serotipul Mass (H120 / H52 / Ma5), B, liniile 1 – 7, si pentru tipul / serotipul It02, B, liniile 9 - 14., ale coronavirusului bronsitic aviar (VBI). Liniile 1, 9: martor negativ apa ultrapura (NFW, Promega); liniile 2, 10: martor negativ LS79 (NDV, Pasteur). Liniile 8: Standard ADN: 100 bp DNA Ladder (Promega). A: liniile 3 - 6: pool-uri de pulmon broiler 33 zile (pozitive Qx);; linia 7: Martor pozitiv IB88, Merial pentru Qx (amplicon 190 bp). B: liniile 3 - 6: pool-uri de pulmon broiler 33 zile (negative Mass); linia 7: Martor pozitiv Ma5, Intervet pentru Mass (amplicon 212 bp). B: linia liniile 11 - 14: pool-uri de pulmon broiler 33 zile (negative It02, ampliconi nespecifici).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

190 bp Qx

212 bp Mass

A

B

Test rPCR Sybr Green pentru VLTI. Curba de amplificare si calculul valorilor Ct realizat prin programul logic MxPro v4.01/2007, care asista echipamentul de amplificare spectrofotometrica Mx3005P (Stratagene).

Herpesvirusul aviar de tip 1Herpesvirusul aviar de tip 1 –– ILTV / VLTIILTV / VLTI

Extracţie ADN: cu trusa QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen 51304). PCR LTI pentru gena UL15a : amorse publicate de Extracţie ADN: cu trusa QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen 51304). PCR LTI pentru gena UL15a : amorse publicate de Mahmoudian et al. 2011 (Avian Pathology 40(3): 237-242). Amestec de amplificare 2x Brilliant II Sybr Green Mahmoudian et al. 2011 (Avian Pathology 40(3): 237-242). Amestec de amplificare 2x Brilliant II Sybr Green qPCR Master Mix (Agilent 600828-51). Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 15 pmol fiecare. qPCR Master Mix (Agilent 600828-51). Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 15 pmol fiecare. Volum de reactie: 20 ul. Amplificator spectrofotometric Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare (34Mx): Volum de reactie: 20 ul. Amplificator spectrofotometric Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare (34Mx): 50oC, 2 min – 1x; 95oC, 10 min – 1x; 95oC, 15 sec + 60oC, 1 min – 40x; 60oC, 5 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x 50oC, 2 min – 1x; 95oC, 10 min – 1x; 95oC, 15 sec + 60oC, 1 min – 40x; 60oC, 5 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x Martor pozitiv: tulpina Cover (Charles River Spafas – Affinitech). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila Martor pozitiv: tulpina Cover (Charles River Spafas – Affinitech). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).(Promega NFW – P119C).

Confirmarea prin gel-electroforeza a testului rPCR Sybr Green pentru VLTI. Linia 1: Martor negativ, NFW (Promega); linia 2: proba organ pozitiva pentru herpesvirusul Marek (control specificitate amorse LTI); liniile 3 – 8: probe comasate (2 probe / tampon) prelevate de la broileri de 17 zile (negative LTI); linia 9: martor pozitiv LTI tulpina Cover, dilutia 10-6 (pozitiv, amplicon 113 bp); linia 10: martor pozitiv LTI tulpina Cover, dilutia 10-2 (pozitiv, amplicon 113 bp); linia 11: Standard ADN - 100bp DNA Ladder (Promega).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

113 bp

Herpesvirusul aviar de tip Herpesvirusul aviar de tip 22 –– MDVMDV / / VBMVBM

Extracţie ADN: Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304). PCR MDV-B: amorse publicate de Cho et Extracţie ADN: Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304). PCR MDV-B: amorse publicate de Cho et al. 1999, Avian Pathology 28: 47-53, amplicon 669 bp. Amestec de amplificare: Ilustra PuReTaq Ready-To-al. 1999, Avian Pathology 28: 47-53, amplicon 669 bp. Amestec de amplificare: Ilustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare 27-9557-01). Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial Go PCR Beads (GE Healthcare 27-9557-01). Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial (Chroma BG): 50 pmol. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems) sau iCyler (Chroma BG): 50 pmol. Amplificator PE GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems) sau iCyler (Biorad). Program de amplificare: 94oC, 10min – 1x; 94oC, 1 min + 55oC, 1,5 min + 72oC, 2,5 min – 30x; (Biorad). Program de amplificare: 94oC, 10min – 1x; 94oC, 1 min + 55oC, 1,5 min + 72oC, 2,5 min – 30x; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – for ever.Martor pozitiv intern - ADN proba teren 2004. Martor negativ: apa 72oC, 10 min – 1x; 4oC – for ever.Martor pozitiv intern - ADN proba teren 2004. Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).

1 2 3 4 5 6

669 bp

Gel-electroforeza post PCR MDV-B pentru detectia virusului Gel-electroforeza post PCR MDV-B pentru detectia virusului Marek (GaHV2)Marek (GaHV2). . Linia 1: martor negativ (NFW, negativ); linia Linia 1: martor negativ (NFW, negativ); linia 2: proba 1401, splina, (negativ v.Marek, + ampliconi 2: proba 1401, splina, (negativ v.Marek, + ampliconi nespecifici); linia 3: proba 1402, splina, (pozitiv v.Marek, nespecifici); linia 3: proba 1402, splina, (pozitiv v.Marek, amplicon specific 669 bp, + ampliconi nespecifici); linia 4: amplicon specific 669 bp, + ampliconi nespecifici); linia 4: proba 1403, splina, (pozitiv v.Marek, amplicon specific 669 proba 1403, splina, (pozitiv v.Marek, amplicon specific 669 bp + ampliconi nespecifici); linia 5: martor intern pozitiv bp + ampliconi nespecifici); linia 5: martor intern pozitiv Marek - ADN proba teren 2004 (amplicon 669bp); linia 6: Marek - ADN proba teren 2004 (amplicon 669bp); linia 6: Standard ADN - 100bp DNA Ladder (Promega).Standard ADN - 100bp DNA Ladder (Promega).

Extracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR IBDV: amorse Thiveyrat Celine (date personale), designate pentru patotipul very Extracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR IBDV: amorse Thiveyrat Celine (date personale), designate pentru patotipul very virulent (vv, amplicon 141 bp) si pentru patotipul atenuat (att, amplicon 102 – 106 bp). Anterior amplificarii: denaturare ARN, 10 min la 100oC, cu racire virulent (vv, amplicon 141 bp) si pentru patotipul atenuat (att, amplicon 102 – 106 bp). Anterior amplificarii: denaturare ARN, 10 min la 100oC, cu racire brusca pe gheata. Amestec de amplificare 2x Brilliant II Sybr Green qRT-PCR Master Mix, 1 step (Agilent 600825-51). Volum de reactie: 25 ul. Amorse, brusca pe gheata. Amestec de amplificare 2x Brilliant II Sybr Green qRT-PCR Master Mix, 1 step (Agilent 600825-51). Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial (Dexter, Romania): 625 fmol fiecare. Amplificator spectrofotometric Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare: 42oC, 30 min + sintetizate comercial (Dexter, Romania): 625 fmol fiecare. Amplificator spectrofotometric Mx3005P (Stratagene). Program de amplificare: 42oC, 30 min + 95oC, 15 min – 1x; 94oC, 45 sec + 50oC, 45 sec + 72oC, 1 min – 45x; 72oC, 10 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere, din 95oC, 15 min – 1x; 94oC, 45 sec + 50oC, 45 sec + 72oC, 1 min – 45x; 72oC, 10 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere, din probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor; apoi, curba de disociere implicita a programului MxPro v01/2007 probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor; apoi, curba de disociere implicita a programului MxPro v01/2007 (95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. si rampa la 95oC, cu date colectate in toate punctele acesteia). Martori pozitivi: tulpinile vaccinale IPi si IPi+ (Pasteur, ampliconi (95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. si rampa la 95oC, cu date colectate in toate punctele acesteia). Martori pozitivi: tulpinile vaccinale IPi si IPi+ (Pasteur, ampliconi 141 bp si 106 bp). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).141 bp si 106 bp). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).

rPCR Sybr Green pentru virusul bursitei infectioase aviare (IBDV/BIA), patotip foarte virulent (vv) si patotip atenuat (vaccinal). Curba de disociere. Program logic MxPro (Stratagene / Agilent). Martorii pozitivi au inregistrat valori Tm 82.35 (vv), respectiv 81.80 (atenuat). Probele au inregistrat Tm 80.15 (3/5), 83.85 (1/5) si 84.4 (1/5), incadrandu-se in intervalul de ± 4Tm fata de martorul vv, si valori Tm de 75.85 (2/5), 77.45 (3/5), neincadrnadu-se in intervalul ± 4Tm fata de martorul atenuat.

AvibirnavirusAvibirnavirus –– IBDVIBDV / / VBIAVBIA

Confirmarea prin gel-electroforeza a testelor rPCR Sybr Green pentru VBIA (IBDV). Randul A (sus): rPCR Sybr Green pentru detectia patotipului foarte virulent de virus bursitic aviar (IBVD / BIA). Randul B (jos): rPCR Sybr Green pentru detectia patotipului atenuat de VBIA (IBDV). Liniile 1: NFW; liniile 2: martor negativ specificitate; liniile 3: BF1 (pozitiv very virulent, negativ atenuat); liniile 4: BF2 (pozitiv very virulent, negativ atenuat); liniile 5: BF3 (pozitiv very virulent, negativ atenuat); liniile 6: BF4 (pozitiv very virulent, negativ atenuat); liniile 7: BF5 (pozitiv very virulent, negativ atenuat); liniile 8: IPi+ (martor pozitiv, pozitiv vv, pozitiv atenuat); liniile 9: IPi+ (martor pozitiv, pozitiv vv, pozitiv atenuat); liniile 10: IPi (martor pozitiv, pozitiv vv, pozitiv atenuat); liniile 11: 100 bp DNA ladder (Promega)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11A

B

106 bp

141 bp

Extracţie ADN: Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304). PCR Ort-16s: amorse Popa V. (date Extracţie ADN: Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304). PCR Ort-16s: amorse Popa V. (date nepublicate), designate pe gena 16s ARNr, amplicon 197 bp. Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate nepublicate), designate pe gena 16s ARNr, amplicon 197 bp. Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 30 pmol.Amestec de amplificare: illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR comercial (Generi Biotech, Cehia): 30 pmol.Amestec de amplificare: illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare 27-9557-01). Amplificator iCycler (Biorad). Program de amplificare: 95oC, 10min – Beads (GE Healthcare 27-9557-01). Amplificator iCycler (Biorad). Program de amplificare: 95oC, 10min – 1x; 95oC, 45 sec + 50oC, 45 sec + 72oC, 1,5 min – 45x; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – 10 min. Martor pozitiv: 1x; 95oC, 45 sec + 50oC, 45 sec + 72oC, 1,5 min – 45x; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – 10 min. Martor pozitiv: Ornithobacterium rhinotracheale (ADN, dilutie 10-2), DSMZ 15997. Martor negativ: apa ultrapura PCR Ornithobacterium rhinotracheale (ADN, dilutie 10-2), DSMZ 15997. Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega, NFW).sterila (Promega, NFW).

Ornithobacterium rhinotrachealeOrnithobacterium rhinotracheale –– ORTORT

Gel-electroforeza post - PCR 16S rRNA Ornithobacterium rhinotracheale. Probele 8859, 8864, 8871 – liniile 3, 4. si 8 – pozitive ORT (prezenta amplicon 197 bp).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

197 bp

rPCR pentru AMPV A, B, C, D. Curba de amplificare si valorile Ct. Programul logic MxPro care asista ampificatorul spectrofotometric

Mx3005 (Stratagene). Extracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR APMV pentru gena G (AMPV-A, B, D) si gena SH (AMPV-C): amorse Guionie et al. Extracţie ARN: cu trusa QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen 52906). PCR APMV pentru gena G (AMPV-A, B, D) si gena SH (AMPV-C): amorse Guionie et al. 2007, Journal of Virological Methods 139: 150–158. Amplicon A – 116 bp, B – 135 bp, C – 82 bp, D – 63 bp. Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate 2007, Journal of Virological Methods 139: 150–158. Amplicon A – 116 bp, B – 135 bp, C – 82 bp, D – 63 bp. Volum de reactie: 25 ul. Amorse, sintetizate comercial (Generi Biotech, Cehia): 12.5 pmol. Amestec de amplificare Brilliant Sybr Green qRT-PCR Master Mix with low Rox, 1 step, Agilent 600837. comercial (Generi Biotech, Cehia): 12.5 pmol. Amestec de amplificare Brilliant Sybr Green qRT-PCR Master Mix with low Rox, 1 step, Agilent 600837. Amplificator spectrofotometric Mx3005P, Stratagene. Program de amplificare: 42oC, 30 min + 95oC, 10 min – 1x; 95oC, 15 sec + 60oC, 1 min – 45x; 60oC, 10 Amplificator spectrofotometric Mx3005P, Stratagene. Program de amplificare: 42oC, 30 min + 95oC, 10 min – 1x; 95oC, 15 sec + 60oC, 1 min – 45x; 60oC, 10 min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere, din probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor; min – 1x; 25oC, 1 min – 1x; anterior demararii curbei de disociere, din probele amplificate se fac controale prin gel-electroforeza pentru confirmarea reactiilor; apoi, curba de disociere implicita a programului MxPro v01/2007 (95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. si rampa la 95oC, cu date colectate in toate punctele acesteia). apoi, curba de disociere implicita a programului MxPro v01/2007 (95oC, 1 min, 55oC, 30 sec. si rampa la 95oC, cu date colectate in toate punctele acesteia). Martor pozitiv: EPC APV A/B/C, dilutie 10-2, TaqVet AMPV kit (LSI, France). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).Martor pozitiv: EPC APV A/B/C, dilutie 10-2, TaqVet AMPV kit (LSI, France). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).

Metapneumovirusul aviarMetapneumovirusul aviar –– ARTV / TRTV / SHSV / AMPVARTV / TRTV / SHSV / AMPV

Confirmarea prin gel-electroforeza a rPCR pentru detectia / discriminarea AMPV A, B

Extractie ADN – Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304).Amorse: P1 (32280 – 257UT) si P2 (32282-207UT) – Ready to Go RAPD Analysis kit (GE Extractie ADN – Cu trusa QIAamp DNA Mini kit (Qiagen- 51304).Amorse: P1 (32280 – 257UT) si P2 (32282-207UT) – Ready to Go RAPD Analysis kit (GE Healthcare 27-9502-01). Amestec de amplificare Ready to Go RAPD Analysis kit (GE Healthcare 27-9502-01).Volum reactie de amplificare: 25 ul. Amplificator Healthcare 27-9502-01). Amestec de amplificare Ready to Go RAPD Analysis kit (GE Healthcare 27-9502-01).Volum reactie de amplificare: 25 ul. Amplificator iCycler (BioRad). Program de amplificare: 94oC, 5min – 1x; 94oC, 44 sec + 35oC, 1 min + 72oC, 2 min – 44x, cu rampa de 50 sec de la 94oC la 35oC si rampa iCycler (BioRad). Program de amplificare: 94oC, 5min – 1x; 94oC, 44 sec + 35oC, 1 min + 72oC, 2 min – 44x, cu rampa de 50 sec de la 94oC la 35oC si rampa de 130 sec de la 35oC la 72oC; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – 10 min. Gel-electroforeza TBE1.5x. Achizitie si digitalizare imagine: Easy RH, Herolab GmbH; program de 130 sec de la 35oC la 72oC; 72oC, 10 min – 1x; 4oC – 10 min. Gel-electroforeza TBE1.5x. Achizitie si digitalizare imagine: Easy RH, Herolab GmbH; program logic Image Win2PC. Prelucrare informatica imagine: UnScanIt (Silk Sci.Co). Prelucrare statistica: Bio1 v098 si Treecon v1.3b (coeficient Nei si Li cu analiza de logic Image Win2PC. Prelucrare informatica imagine: UnScanIt (Silk Sci.Co). Prelucrare statistica: Bio1 v098 si Treecon v1.3b (coeficient Nei si Li cu analiza de cluster prin UPMGA, pentru estimarea distantei genetice dintre tulpini si a ierahizarii acestora). Martor pozitiv: E.coli C1a (GE Healthcare 32294). Martor negativ: cluster prin UPMGA, pentru estimarea distantei genetice dintre tulpini si a ierahizarii acestora). Martor pozitiv: E.coli C1a (GE Healthcare 32294). Martor negativ: apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).apa ultrapura PCR sterila (Promega NFW – P119C).

subtipizarea moleculara a organismelor vii, in conditii bine definite

diferentierea tulpinilor apartinand aceluiasi serotip, sau intre tulpini patogene si vaccinale sau intre tulpini apartinand aceluiasi tip fagic

existenta unei clone epidemice, in cazul unor izolate cu origini diferite dar cu amprente genetice identice, stabilindu-se astfel o relatie directa intre focarele de boala asociate acestor izolate microbiene

Escherichia coli de origine aviara - patotip APEC. Gel-electroforeza post RAPD cu amorsa P1.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Amprenta genetica “Random amplified Amprenta genetica “Random amplified polymorphic DNApolymorphic DNA ““– – RAPDRAPD

E.coli 8657

E.coli 8654

E.coli 8656

E.coli 8655

E.coli 8658

0.10.20.3

Dendrograma E.coli de origine aviara (APEC). RAPD – amorsa P1 (GE Healthcare). Teecon (Nei & Li. Clustering. UPGMA).

RRezultatele testelor PCR ezultatele testelor PCR efectuate in perioada efectuate in perioada

iianuarie – noiembrie 2012anuarie – noiembrie 2012

Qx

Mas

s

It02

Vv

Att A B C D

1 + +

3 +

6 +10 +17 + - - - - +19 +20 +21 + + - + -24 + -27 + + + - - + + + + - -33 + + - -34 -14 + +

25–29 - +196 +329 +

11 - 16 - + - + -

15 - + - + +31 + + - - +32 - - - - +

40 - 47 - + - - -

Adulte RRG

Curci

TRT

OR

T

Pui carne

Tineret RRG

Categoria zootehnica

Varsta (zile)

Teste PCR

APE

C

IBV

ILT

MG

MS

MD

V

IBDV

ConcluzieConcluzie

Testele PCR s-au dovedit fiabile si adecvate in diagnosticul bolilor la pasari, semnaland prezenta

tulpinilor de virus bursitic, patotip foarte virulent,

a tulpinilor de Mycoplasma synoviae si M.gallisepticum,

a celor de virus Marek,

a tulpinilor de metapneumovirus aviar, tipurile A, B si C,

a celor de Ornithobacterium rhinotracheale si

a unor clone epidemice de E.coli APEC

in efective de pasari crescute si exploatate industrial in Romania in perioada ianuarie – noiembrie 2012

Multumiri colaboratorilor medici veterinari si fermierilor care au contribuit la aceste rezultate, atat material cat si financiar