Post on 01-Jul-2015
transcript
Metode de transfer a Metode de transfer a genelor de la un genelor de la un
organism la altul organism la altul
Curs: Alimente modificate Curs: Alimente modificate geneticgenetic
CEPA IVCEPA IV
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Descoperiri care au permis Descoperiri care au permis aparitia tehnologiei ADN-ului aparitia tehnologiei ADN-ului recombinatrecombinat Structura primară a acizilor nucleiciStructura primară a acizilor nucleici
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Metode pentru sinteza chimica a oligonucleotidelor si genelor
Tehnici care au la bază sinteza chimica a oligonucleotidelor:PCR (Polymerase Chain Reaction) Real-Time PCRDNA sequencingSite direct mutagenesisMicroarrays
Metode:Phosphoramidite methodePhosphoramidite building blocks
Metode de determinare a secventelor de nucleotide: SECVENȚIEREA –identifică ordinea bazelor nucleotidice din catena polinucleotidicăChain-terminator methodutilizează ddNTP ca și terminatori ai reacției; ADN-primer; ADN-polimerază; dNTP.
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Dye-terminator sequencing-secventiere într-o singura reactie, ddNTP marcate fluorescentIdentificarea nucleotidelor prin electroforeza capilară
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Descoperiri care au permis Descoperiri care au permis aparitia tehnologiei ADN-ului aparitia tehnologiei ADN-ului recombinatrecombinat Replicarea și biosinteza ADNReplicarea și biosinteza ADN:: 1957, M. Delbruck și G.S. Stent- mecanismul de 1957, M. Delbruck și G.S. Stent- mecanismul de
replicare ADN semiconsevativreplicare ADN semiconsevativ Enzime implicate în replicareEnzime implicate în replicare::ADN-helicazeADN-helicazeADN-topoizomerazeADN-topoizomerazeUnwindaze –proteine destabilizatoare ale dublului helixUnwindaze –proteine destabilizatoare ale dublului helixPrimaza (ARN polimeraza ADN-dependentă)Primaza (ARN polimeraza ADN-dependentă)ADN-polimeraze ADN-dependenteADN-polimeraze ADN-dependenteADN-ligazaADN-ligaza
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Descoperiri care au permis Descoperiri care au permis aparitia tehnologiei ADN-ului aparitia tehnologiei ADN-ului recombinatrecombinat Metode pentru izolarea unor gene si Metode pentru izolarea unor gene si
clonarea lorclonarea lor Vectori utilizati pentru transferul de Vectori utilizati pentru transferul de
genegene Metode de includere a vectorilor in Metode de includere a vectorilor in
celula pro si eucariotacelula pro si eucariota
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Descoperiri care au permis Descoperiri care au permis aparitia tehnologiei ADN-ului aparitia tehnologiei ADN-ului recombinatrecombinat EEndonucleazelendonucleazele de restrictie de restrictie
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Vectori pentru transferul de Vectori pentru transferul de genegene
Vectori pVectori plasmidlasmidialiiali• Molecule circulare de ADN, nelegate de Molecule circulare de ADN, nelegate de
cromozomicromozomi• Masa moleculara 10Masa moleculara 1066 – 2x10 – 2x1088 D Daa• Contin gene pentru rezistenta la Contin gene pentru rezistenta la
antibiotice, producere de toxine, formare antibiotice, producere de toxine, formare de tumoride tumori
• Pot fi conjugative sau non-conjugativePot fi conjugative sau non-conjugative• Exemple: pBR 313, pSC101-ColE1, Ti Exemple: pBR 313, pSC101-ColE1, Ti
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Descoperiri care au permis Descoperiri care au permis aparitia tehnologiei ADN-ului aparitia tehnologiei ADN-ului recombinatrecombinatEtape în cadrul tehnologiei ADN Etape în cadrul tehnologiei ADN
recombinantrecombinant
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
TRANSDUCȚIATRANSDUCȚIA
Virusuri cu ciclu lizogeVirusuri cu ciclu lizogen/liticn/litic (fagi) (fagi)
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Vectori pentru transferul de Vectori pentru transferul de genegene Cosmide = combinatiiCosmide = combinatii plasmide cu plasmide cu
fagifagi
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Transferul genelorTransferul genelor
Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens
Tumori-crown ball
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Transfer de gene intermediat Transfer de gene intermediat de de AgrobacterAgrobacteriumium tumefaciens tumefaciens ––Transformarea geneticăTransformarea genetică
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Transfer de gene prin Transfer de gene prin metoda biolistica (balistica metoda biolistica (balistica biologica)biologica)
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Pusca de genePusca de gene- creată de John Sanford, 1987- creată de John Sanford, 1987
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Pusca de genePusca de gene
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Pusca de genePusca de gene
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Transfer de gene prin Transfer de gene prin metoda biolistica (balistica metoda biolistica (balistica biologica)biologica)
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Transfer de gene prin Transfer de gene prin metoda biolistica (balistica metoda biolistica (balistica biologica)biologica) Embrion de Embrion de
porumb porumb bombardat cu bombardat cu CaMV35SCaMV35S marcat marcat cu cu GFPGFP. .
Fotografie Fotografie realizata dupa realizata dupa 48h48h de la de la bombardarebombardare
Frecventa de Frecventa de transformare: transformare: 15%15%
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Transfer de geneTransfer de gene
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
ElectroporareElectroporare
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Transfer de gene Transfer de gene
prin prin electroporareelectroporare
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Transfer de gene – fuziune de Transfer de gene – fuziune de protoplaprotoplaștiști
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Identificarea transformerilorIdentificarea transformerilor
Evidentierea rezistentei la antibioticeEvidentierea rezistentei la antibiotice
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Identificarea transformerilorIdentificarea transformerilor
Marcare cu GFPMarcare cu GFP
Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria
AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati
Identificarea transformerilorIdentificarea transformerilor
Metode imunologiceMetode imunologice Hibridizare si autoradiografieHibridizare si autoradiografie Analiza cu endonucleaze de restrictieAnaliza cu endonucleaze de restrictie Evidentierea unor activitati Evidentierea unor activitati
enzimaticeenzimatice