________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal Izolarea şi caracterizarea unor gene de rezistenţă la atacul nematozilor, prezente în genomul vegetal Există o categorie de nematozi paraziţi care nu au capacitatea de a se reproduce pe plante gazdă ce poartă în genomul lor gene majore de rezistenţă. Până în prezent, au fost cartate peste 25 de gene majore de rezistenţă a plantelor la atacul nematozilor. Plantele au un repertoriu al genelor de rezistenţă care le protejează de atacul multor patogeni, printre care se numără virusuri, bacterii, fungi şi nematozi. In cele mai multe cazuri, recunoaşterea patogenului de către gazdă se realizează prin interacţii de tipul „genă-pentru- genă”, între genele majore de rezistenţă (notate „R”) prezente la gazdă şi genele majore pentru avirulenţă (notate „Avr”) de la patogen. Recunoaşterea R-Avr declanşează o succesiune de reacţii defensive, reacţii care includ frecvent şi răspunsul de hipersensibilitate (HR), ce constă într-o necroză localizată la nivelul celulelor de la situl de infecţie. 1
Transcript
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
Izolarea şi caracterizarea unor gene de rezistenţă la atacul nematozilor, prezente în
genomul vegetal
Există o categorie de nematozi paraziţi care nu au
capacitatea de a se reproduce pe plante gazdă ce poartă în
genomul lor gene majore de rezistenţă.
Până în prezent, au fost cartate peste 25 de gene
majore de rezistenţă a plantelor la atacul nematozilor.
Plantele au un repertoriu al genelor de rezistenţă care
le protejează de atacul multor patogeni, printre care se
numără virusuri, bacterii, fungi şi nematozi. In cele mai
multe cazuri, recunoaşterea patogenului de către gazdă se
realizează prin interacţii de tipul „genă-pentru-genă”, între
genele majore de rezistenţă (notate „R”) prezente la gazdă
şi genele majore pentru avirulenţă (notate „Avr”) de la
patogen.
Recunoaşterea R-Avr declanşează o succesiune de
reacţii defensive, reacţii care includ frecvent şi răspunsul de
hipersensibilitate (HR), ce constă într-o necroză localizată la
nivelul celulelor de la situl de infecţie.
Recent, s-a reuşit clonarea unor gene R de la câteva
specii de plante. Cele mai multe dintre acestea codifică
proteine care au un motiv structural cu un model repetitiv
de 20-30 aminoacizi, numit LRR (leucine-rich-repeat).
Genele R ce conţin secvenţe LRR pot să fie subdivizate în 2
clase majore : una în care produsul genic conţine o secvenţă
1
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
LRR la capătul amino, cu dispunere extracelulară şi o
secvenţă de ancorare la membrana plasmatică şi o a doua
clasă în care produşii genelor R se presupune a avea o
localizare citoplasmică. Aceştia din urmă sunt caracterizaţi
de prezenţa unei regiuni conservate de aproximativ 260 de
aminoacizi, conţinând un sit de legare la nucleotide (NBS) şi
o regiune LRR la terminalul carboxil.
Genele de rezistenţă la nematozi au fost detectate la
câteva varietăţi ale unor plante de cultură, printre care se
numără şi tomatele, cartoful, soia şi unele cereale.
Prima genă de rezistenţă la nematozi, a cărei clonare a
reuşit, a fost gena desemnată Hs1pro-1, identificată la o rudă
sălbatică a trestiei de zahăr. Gena conferă rezistenţă la
nematodul Heterodera shachtii care parazitează trestia de
zahăr. In cadrul unor experimente „in vitro”, ADNc
corespunzător acestei gene, asociat cu promotorul
CaMV35S, a fost transferat în rădăcinile unei varietăţi
sensibile a acestei plante de cultură, prin transformare cu
Agrobacterium rhizogenes. S-a constatat dobândirea
rezistenţei la infecţie.
Analiza produsului genei Hs1pro-1 a condus la concluzia
că acesta este o proteină mică, cu destinaţie în membrana
plasmatică (are o secvenţă semnal la capătul amino).
Proteina matură are 282 aminoacizi şi conţine o regiune
LRR la capătul amino (Fig.22). Compararea secvenţei şi a
2
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
structurii genei Hs1pro-1 cu a altor gene R cunoscute (inclusiv
cele de la tomate, care conferă rezistenţă la fungul
Cladosporium fulgum) a demonstrat că gena Hs1pro-1 nu este
similară cu nici una dintre genele de rezistenţă cunoscute,
în privinta structurii proteinei codificate.
Gena Mi-1, izolată de la o specie sălbatică de tomate,
conferă o rezistenţă mare faţă de câteva specii de nematozi
producători de noduli (din genul Meloidogyne). Această
genă a fost introdusă la specia cultivată Lycopersicon
esculentum, de la ruda sa sălbatică L.peruvianum, prin
salvarea embrionului în urma unei încrucişări interspecifice.
Fig. 22
Structura proteinelor codificate de 3 dintre genele R izolate de la plante. LR – domeniu proteic bogat în resturi de leucină; TM – un posibil domeniu transmembranar; LZ – „fermoarul” de leucină; NBS – sit de legare la un domeniu nucleotidic (după Williamson, 1999).
Interesant este că plantele transgenice care conţin
gena Mi-1 au fost detectate a fi rezistente şi la afidul
cartofului Macrosiphum euphorbiae, indicând faptul că gena
3
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
Mi-1 are un spectru mai larg de acţiune. Rămâne de stabilit
dacă gena respectivă codifică un factor de recunoaştere a
patogenului, factor care este eficient atât pentru
recunoaşterea nematodului, cât şi a afidului.
Gena Mi-1 codifică o proteină cu 1257 de aminoacizi,
care este unul dintre membrii unei familii de proteine
caracterizate de prezenţa domeniilor NBS şi LRR (Fig.22).
Proteinei îi lipseşte secvenţa semnal, sugerând că
recunoaşterea nematodului de către gazdă, în măsura în
care este mediată de produsul genei Mi, se realizează în
citoplasmă. Proteina conţine secvenţe care indică faptul că
ea intră în interacţiuni complexe cu alte proteine. In cazul
altor gene de rezistenţă, există evidenţe că regiunea LRR
are un rol major în determinarea specificităţii de
recunoaştere a patogenului.
Regiunea NBS seamănă cu un domeniu ATP-azic
prezent în proteinele care joacă roluri reglatoare cheie în
apoptoză. Acest domeniu s-a demonstrat că mediază
oligomerizarea acestor proteine reglatorii, modificare
necesară în activarea proteazelor apoptotice. In cazul genei
Mi şi al altor gene de rezistenţă la plante, o posibilă
secvenţă LZ precede domeniul NBS.
Recent a fost clonată gena Gpa 2, care conferă
rezistenţă la unele izolate ale nematodului Globodera
pallida – parazit la cartof. Analiza secvenţei genice şi a
4
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
secvenţei proteice dedusă din secvenţa bazelor azotate, a
demonstrat că şi această proteină este un potenţial membru
al familiei proteice NBS-LRR. Gena Gpa 2 conţine
informaţia genetică inclusiv pentru un sector LZ poziţionat
în apropierea capătului amino al proteinei.
Gena Gpa 2 este foarte asemănătoare ca secvenţă de
aminoacizi codificată, cu gena Rx1 care conferă o rezistenţă
foarte mare la virusul X al cartofului.
S-a acumulat un număr mare de date care
demonstrează că domeniile NBS-LRR sunt caracteristice
proteinelor codificate de genele R de la nematozi. Printre
genele care codifică astfel de proteine se numără şi gena
Gro I, care mediază rezistenţa faţă de atacul nematodului
Globodera rostochiensis ; la grâu, au fost detectate 3 cópii
ale unei gene care codifică o proteină cu domenii NBS-LRR,
având o secvenţă genică apropiată de a genei Cre 3, genă
care conferă rezistenţă unor cereale la atacul nematozilor
producători de chişti.
Secvenţierea produşilor genici ai unor gene care
conferă rezistenţă la infecţia cu nematozi, a condus la
observaţia că, în secvenţa lor de aminoacizi, apare, într-o
poziţie adiacentă domeniului de legare la ADN (NBS), un alt
sunt regiuni proteice în care 4 sau 5 molecule de leucină
5
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
apar la intervale regulate în interiorul unui -helix, astfel
încât, ele se aliniază pe aceeaşi parte a helixului (Fig.23).
Apariţia regulată a leucinelor dă naştere unei benzi
hidrofobe de-a lungul helixului, bandă care va interacţiona
cu o structură similară a unei alte proteine.
Fig. 23
Secvenţă proteică cuprinzând resturile de aminoacizi între 315 şi 359, a factorului de transcriere C/EBP, prezentată sub formă helicală. Iniţialele corespund câte unui aminoacid. Helixul este amfipatic: reziduurile polare sunt distribuite, în cea mai mare parte, pe una din părţile helixului; cele hidrofobe se află pe cealaltă parte (după Darnell et al., 1990, citat de Fosket, 1994)
Datorită acestei structuri particulare – LZ – astfel de
proteine sunt capabile să formeze dimeri (Fig.24).
6
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
Unii reglatori ai transcrierii genice de la plante sunt
proteine care au în constituţia lor domenii LZ. Printre
aceştia, se numără, cum s-a amintit mai sus, şi gene de
rezistenţă la atacul nematozilor (exemplu: Gpa 2 şi Mi-1). O
altă genă - Opaque 2 - codifică o proteină cu domeniu LZ,
care este un factor de transcriere a unora dintre genele
pentru proteinele stocate în seminţele de porumb; o altă
proteină cu domeniu LZ este implicată în medierea
procesului de sinteză a acidului abscizic.
Fig.24
Interacţiunea a două proteine, prin intermediul regiunii „Leucine Zipper”, conduce la formarea unui dimer care permite poziţionarea optimă a domeniilor lor de asociere la ADN (după Fosket, 1994).
Este demn de semnalat aici faptul că mai mulţi factori
de transcriere genică izolaţi de la plante, în structura cărora
intră domenii LZ, prezintă o secvenţă de aminoacizi şi o
conformaţie care s-au dovedit a fi foarte similare cu cele ale
7
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
unor factori proteici specifici celulei animale (şi umane),
codificaţi de protooncogene precum myc, myb, erbA, jun şi
fos.
Concluzia este că proteinele cu situri de legare la ADN
şi cu domenii LZ joacă un rol important în reglarea
transcrierii genetice la plante.
Loci cu omologie cu genele R şi care asigură rezistenţă
faţă de afide, au mai fost detectaţi la orz. Cel puţin 8 gene
R, care dau rezistenţă faţă de nematozii producători de
noduli, au fost cartate la specia sălbatică de tomate
Lycopersicon peruvianum.
Ereditatea caracterului de rezistenţă la atacul
nematozilor este, în cazul unor specii de plante, incluzând şi
soia, complexă, fiind determinată atât de gene majore,
dominante, cât şi de gene recesive.
Mecanisme de rezistenţă la atacul nematozilor
La specii diferite, momentul, localizarea, ca şi
mecanismul de răspuns declanşat de genele de rezistenţă,
variază considerabil.
Spre exemplu, în cazul tomatelor rezistente, nematozii
penetrează rădăcinile şi migrează către locul de hrănire, la
fel ca şi în cazul plantelor sensibile. Totuşi, în cazul
plantelor rezistente, nu se mai formează celulele gigant
8
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
caracteristice unei infecţii reuşite. In schimb, se observă o
necroză localizată, sugerând un răspuns de
hipersensibilitate (HR), la capătul anterior al nematodului,
la câteva zile de la producerea infecţiei.
Rezistenţa mediată de gena Mi se pierde la
temperaturi ridicate, iar experimentele de variere a
temperaturii au arătat că exprimarea rezistenţei în plantă
apare după 24-48 de ore de la infectarea rădăcinii.
Momentul şi localizarea răspunsului sugerează faptul că
penetrarea celulei de către stiletul nematodului şi injectarea
secreţiilor glandelor esofagiene, sunt evenimentele care
induc răspunsul de rezistenţă.
Nu este sigur dacă răspunsul de hipersensibilitate este
direct responsabil de rezistenţa indusă sau este un răspuns
secundar, determinat de instalarea rezistenţei, deoarece
succesiunea reacţiilor declanşate de infecţie este foarte
rapidă, în cazul plantelor rezistente. De exemplu, nivelele
de activitate ale enzimei phenyl-alanin-amonia-liaza (PAL),
ca şi ale unei peroxidaze anionice cresc în cazul plantelor de
tomate rezistente, în urma infecţiei cu nematozi.
In cazul altor gene de rezistenţă, răspunsul gazdei se
pare că apare cu o oarecare întârziere şi oarecum diferit
localizat, în comparaţie cu situaţia genei Mi. De exemplu, în
cazul genei H1, care determină rezistenţa cartofului la
atacul nematodului Globodera rostochiensis, în urma
infectării unor plante rezistente, locul de hrănire începe să
9
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
se formeze şi nematodul chiar ajunge să se instaleze în
rădăcină, atingând stadiul sedentar. Cu toate acestea, locul
de hrănire, care se află în plin proces de constituire, devine
înconjurat de ţesuturi necrotice şi, în final, colapsează. Cei
mai mulţi nematozi care ajung să se dezvolte în plante care
au, în genomul lor, gena H1, sunt, în cea mai mare parte
masculi, ceea ce reprezintă un semn de sărăcire a
resurselor de hrană pentru nematod.
Rezistenţa mediată de gena Hs1pro-1 nu pare să implice
un răspuns de hipersensibilitate. Nematozii mor în stadiul
J2 târziu, din cauza degradării structurii de hrănire (a
sinciţiului) din gazdă. Structura neobişnuită a produsului
genei Hs1pro-1, ca şi fenotipul rezistent sugerează că această
genă face parte dintr-un mecanism de rezistenţă aparte
faţă de ceea ce se cunoaşte până în prezent.
Având în vedere complexitatea răspunsurilor defensive
ale plantelor la atacul paraziţilor, precum şi structura
particulară a genelor de rezistenţă analizate până în
prezent, este foarte probabil ca aceste gene de rezistenţă să
codifice factori proteici reglatori care, în urma unei
semnalizări celulare corespunzătoare, declanşează
transcrierea unor seturi întregi de gene aflate sub controlul
lor ; fiecare dintre produşii genelor transcrise poate să facă
parte dintr-unul sau mai multe mecanisme de apărare
specifice plantelor.
10
________________Gene de rezistenta la atacul nematozilor, prezente in genomul vegetal
