Baze de date pentru enzime - biochimiero.files.wordpress.com · Scindarea legaturilor peptidice din...

transcript

Clasificarea enzimelor

Baze de date generale

Baze de date specificeShewale – Enzyme everywere - 1996

Baze de date pentru enzime

http://www.enzyme-database.org/

Bazele de date generale

ExplorEnz

https://enzyme.expasy.org/

SIB-ENZYME

http://www.ebi.ac.uk/intenz/

IntEnz – Integrated relational Enzyme database (nomenclatura)

Bazele de date generaleIntEnz

http://www.brenda-enzymes.org/index.php

BRENDA

o clasificare și nomenclatură

BRENDA - gamă largă de proprietăți enzimatice

o structura enzimelor

o reacții și specificitate (substrate naturale/artificiale)

o parametri funcționali

o informații legate de organismul din care provin

o izolarea și prepararea

o referințe bibliografice

o aplicații și inginerie

o enzimele - responsabile pentru anumite boli

KEGG - gamă largă de proprietăți enzimatice

Baze de date cu enzime specializate

MEROPS (https://www.ebi.ac.uk/merops/)

MEROPS – specificitate de clivareaminopeptidase A

(Homo sapiens)

Ectoenzimă

degradează

angiotensina II

Dostal, D.E. Baker, K. M.

Circulation Research.

1999;85:643-650

MEROPS – substrate cu relevanță fiziologică (P) sau nu (N)

substrate sintetice (S)

MetaCyc (https://metacyc.org)

MetaCyc

REBASE (http://rebase.neb.com/rebase/rebadvsearch.html)

REBASE

http://www.cazy.org/

CAZY – Carbohydrate-Active enZYme Database

CAZYpedia

http://bioinf.man.ac.uk/phosphabase/index.html

PhosphaBase (PhB) – baza de date pentru fosfataze

http://depod.bioss.uni-freiburg.de/

http://www0.nih.go.jp/mirror/Kinases/

PKR – the Protein Kinase Resource

https://randr.nist.gov/enzyme/Default.aspx

TECRDB

The Thermodynamics of Enzyme-catalyzed Reactions Database

TECRDB

http://enzymefunction.org/projects

EFI (Enzyme Function Initiative)

Scindarea legaturilor peptidice din lanturile proteinelor (enzimelor)

2. Caracterizarea enzimei3.2. Determinarea structurii primare

Proteaza Natura legaturii peptidice clivate

N-terminal -----XYZ----------C-terminal

Tripsina

Clostripaina

Chimotripsina

Elastaza

Papaina

Endoproteaza Glu-C

Pepsina

Lys, Arg

Trp, Tyr, Phe

Leu, Met, Ala

Glu, Asp

Leu si Trp

Phe, Trp, Tyr

CLASA Caracteristici inhibitor exemple functia

Serin proteaze situsul activ fluorofosfat tripsina digestia

H57, D102, S195 trombina coagulare sange

plasmina scindare cheaguri

subtilisina digestia

Cistein proteaze situsul activ iodoacetat papaina digestia

C25, H159, N175 strept. proteinaza digestia

catepsin B digestia

Acid proteaze pH optim acid diazocetone pepsina digestia

D32, D215 chimozina coagulare lapte

Metaloproteaze Zn2+, E270 o-phenanthroline carboxipeptidazele digestia

Zn2+, Ca2+ o-phenanthroline termolizina digestia

E143, H231

Scindarea legaturilor peptidice din lanturile proteinelor (enzimelor)

Tripsina-scindeaza la legaturile peptidice Lys/Arg

Exemplu de proteaze

Scindarea metioninei

Scindare chimica

Enzima

puraReactii de

clivare

Etapa 1 Amestec de

fragmenteSepararea

fragmentelor

Etapa 2 Fragmente

purificate

Etapa 3

secventierea

Set de

secvente

individuale

Etapa 4

-clivarea

alternativa;

-separarea si

secventiereaSecventa

completa

Amestec

complexProteoliza

PeptideSepararea

fragmentelor

HPLC Fragmente

purificate

LC-MS/MS

Izolare

peptidaFragmentare

(Spectru de masa)

Tripsina

Baza de date

Secvente

Complete

Pehr Edman

1972-secventa

fibrinogenului

Structura

primara

Localizare AA

Identificarea de parti functionale

Stabilirea unor relatii de evolutie

Determinarea pI

Structuri 3D determinate experimental http://www.rcsb.org/pdb/

Baze de date pentru proteine/enzime

http://www.expasy.org/proteomics

http://www.uniprot.org/ (pir.georgetown.edu)

http://www.nextprot.org/ Proteine umane

http://string-db.org/ Interactiuni dintre proteine

NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

Cea mai mare baza de date

5 milioane proteine

Expert Protein Analysis System ExPASy

Structura secundara descrie modalitatile de impachetare

ale lantului polipeptidic

-helix -pliata paralela

2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii secundare

Enzima/proteina noua

Secventa primara noua

Fara omologi in bazele de date

Transmembranara?

Situsuri de fosforilareStructura

secundara care

poate fi intuita

Predictia elementelor de structura secundara

Elementele de tip -helix Glu, Leu, Ala >30-40%

Elementele de tip -pliat Val, Ile >40-50%

Intoarceri de tip Gly, Pro

Ser, Asp, Asn >30%

http://nptel.ac.in/courses/

Baze de date – structura secundara

http://biotools.umassmed.edu/cgi-bin/biobin/garnier

MGLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQE

VLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKA

SE DLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIK

PLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKH

PGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG

Structura primara a mioglobinei umane P02144 (UniParc)

Elementele de -helix

http://www-nmr.cabm.rutgers.edu/bioinformatics/

Proteomic_tools/Helical_wheel/

Elementele de -helix si -pliate - GARNIER

http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/

Baze de date – structura secundara

PSI PRED

http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/

COILS (elemente spiralate)

http://www.ch.embnet.org/cgi-bin/COILS_form_parser

Motivul

Michael Rossmann

Structura butoi TIM

Motivele structurale – sunt segmente scurte cu regiuni similare

Majoritatea 10-20 AA

Motivele comune → lanturi de AA → domeniile transmembranare→ situsuri de fosforilare

2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii secundare/supersecundare

Alte motivele structurale

2. Caracterizarea enzimei2.2. Determinarea structurii secundare/supersecundare

Situsul activ al aspartil proteazelor

PROSITE

http://prosite.expasy.org/

HPTPKKLHRGGGLTSPPTLQQVLPNQDLASILPVIPLDPARRPVIKAQV

DTQTSHPKTIEALLDTG ADMTVLPIALFSNNTPLKDTSVLGAGGQTQD

HFKLTSLPVLIRLPFRTTPIVLTSCLVDTKNNWAI IGRDALQQCQGVLYL

PEAKRPPVILPIQAPAVLGLEHLPRPPEISQFPLNQNASRPCNTWSGR

PWR QAISNPTPGQEITQYSQLKKPMEPGDSSTTCGPLTL

NCBI protease, partial [Human T-lymphotropic virus 1]

Protein kinaza C –situsuri de fosforilare din proteine

ST-xRK

Determinarea structurii tertiare

Puterea catalitica

Specificitatea

enzimelor

Structura

tertiara

Structura

primara

Structura

3DDifractie

raze XRMN

Difractia cu raze X

Determinarea structurii proteinelor prin difractie cu raze X:

1. Cristalizarea proteinei

2. Imprestierea radiatiei X de catre planurile cristalului

3. Din diagrama de difractie este modelata harta densitatii electronice

4. Contruirea unui model de proteina pe baza densitatii electronice

Difractia cu raze X

Deducerea fazei razelor imprastiate

Insertie

Densitate

electronic

a mare

E-CH2-SH + CH 3-Hg-NO3

E-CH2— —OH + I2 E-CH2— —OH

E-CH2-S-Hg- CH3 + NO3- + H+

catena laterala

a cisteinei

catena laterala

a tirozinei

Imprastierea

razelor X

Harta densitatii electronice a complexuluiProteina talomera-ADN

Cristalografie cu raze XHarta tridimensionala

de densitate electronica

Harta de densitate electronica a moleculeler

unghi de refractie mic Rezolutie modesta (5-6 Å)Forma

generala

Spoturi cu unghi

de refractie mai mareRezolutie medie (3,5 Å)

Traseu lant

polipetidic

Spoturi cu unghi

de refractie mai mareRezolutie medie (3 Å)

Catena

laterala

Spoturi cu unghi

de refractie mai mareRezolutie buna (2,5 Å) Determinarea

pozitiei atomilor

±0,4 Å

Spoturi cu unghi

de refractie mai mare

cristal omogenRezolutie mare (1,9 Å) Pozitia atomilor

±0,2 Å

Harta densitatii electronice

Structura primara

Legaturi

amidice

Resturi din

catena laterala

Structura tridimensionala

Structura quasistatica

rotatii vibratii

hexokinaza

Legarea ligandului

la substrat

Modificari

conformationale

Structura oxi- si deoxihemoglobinei

Accesul oxigenului la hemul hemoglobinei

Difractia cu raze X

Atomi de H

Pozitia atomilor de H

Densitate

de e- redusa

Difractie cu

neutroni

Imprastierea

neutronilor

Localizarea atomilor de H

Sincroton-producerea de neutroni

The beam makes about 104 orbits inside the synchrotron as it is accelerated before being kicked in a single

revolution into the extracted proton beam line, delivering 4 μC of protons in two 100 ns long pulses to a tungsten

spallation target. The entire acceleration process is repeated 50 times per second, so that a mean current of 200 μA

is delivered to the target, with a neutron yield of about 30 n/proton.

Determinarea structurii in solutie

Stingerea fluorescentei

Schimb izotopic (H-D)

Structuri

flexibile

Dicroism circular

in solutie

Tripsinogen Tripsina

Clivare

proteolitica

N-terminal

Lant flexibil

Difractie cu

neutroni

Mioglobina

In 95%D2O

Modificarea

legaturilor

amidice

tirozina

fenilalanina

Structura 3D

a enzimelor

Modele teoretice

Mecanisme de reactie

Similaritati structurale

Motivul Rossman Caseta de legare

a nucleotidelor

alcool dehidrogenazalactate dehidrogenaza

Rossman

Resturi implicate

cataliza

stabilitate

Structura cuaternara

Interactiuni dintre monomeri

Neuramidaza

tetramerAldolaza KDPG

trimer

Insulina hexamer Kinaza-octamer

Interactiuni dintre monomeri

Subunități diferite – situsuri diferite

Aspartat carbamoilaza R6C6

http://oregonstate.edu/

Freeman, Biochemistry, 2012

10-20% din volumul total al enzimei

Situsul activ al enzimelor

Interactiunea enzima-substrat in absenta sau prezenta cofactorului

Bugg, T.-Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry,Blackwell Publishing, 2004

“Deschizatura” hidrofoba

O retea de grupari din

catena laterala a aminoacizilor

Situsul activ

4 tipuri de interactiuni enzima-substrat

Interactiuni electrostatice

Rest de acid dicarboxilic

Rest de acid dicarboxilic Substrat-Grupare (+)

Legaturi de hidrogen

Substrat/ligandul

grupari polate

Luciferaza luciferin-AMP

http://photobiology.info/

Interactiuni enzima-substrat

Interactiuni nepolare (Van der Waals, distante mici 2-4 A)

Interactiuni hidrofobe

http://faculty.samford.edu/ Interactiuni ale izoniazidei (gri) cu

arilamin N-Acetil transferaza

Areej M. et al. Probing the architecture of

the Mycobacterium marinum arylamine

N-acetyltransferase active site,

Prot Cell, 2010, 1(4): 384-392

Mentinerea structurii tertiare

Grupari din situsul catalitic

Situsul activ al fosfatazei alcaline din Ecoli

Millab-Mammalian Alkaline Phosphatase,Willey, 2006

Obtinerea de enzime mutante

https://www.neb.com/

Beta-lactamaza

Tirozil-transfer

ARN sintaza

Mutageneza Proprietatile enzimelor

stabilitate

Modificarea

specificitatiiEficienta catalitica

kcat/Km

Temolizin proteaza

Stabilizarea enzimelor

B.Strearothermophilus

Mutatii specifice: A4T, T56A, G58A, T63F, S65P, A69P

Introducere 2 cisteine: N60C si G8C

Van den Burg et al. PNAS 95 (1998)

8 mutatii specifice temperatura optima 58 0C

37 0C (nativa)

McGrath-Directory of therapeutic enzymes-CRC Press-2006

O noua xiloz-izomeraza

producerea siropului de fructoza

Stabila in solutie 60–70°C

Mai putin susceptibila la glicozilare (T)

t1/2 (60°C) >1550h

nativa 607 h.

Whiterhouse-Enzyme in food technology-CRC Press-2002

McGrath-Directory of therapeutic enzymes-CRC Press-2006

Structura enzimei

Primara

Secundara

Super-secundara

Tertiara

Cuaternara

indol + 3-glicerol-fosfatindol-3-glicerol-fosfatSubunitatea

Subunitatile 2indol + serina triptofan

Triptofan sintaza

Subunități diferite – situsuri diferite

Busch,F. et al., Ancestral Tryptophan Synthase Reveals

Functional Sophistication of Primordial Enzyme

Complexes, Cell Chemical Biology, 23, 1-7, 2016

Hur,O., Leja, C., Dunn, MF., Biochemistry,

35, 7378-7386,1996.

Complexul piruvat dehidrogenazei - purtator grupe acil

Complex multienzimatic - 60 subunitati:

24 - dihidrolipoil transacetilaza

24 - piruvat dehidrogenaza

12 - dihidrolipoil dehidrogenaza

Diagrama de reacție catalizată de complexul enzimatic

al piruvat dehidrogenazei (L- gruparea lipoamidica)

Complexul piruvat dehidrogenazei - purtator grupe acil

E2 dihidrolipoil transacetilaza

8 trimeri aranjati dupa o simetrie cubica

Complexul din biosinteza pirimideinelor

Trei enzime:

CPSaza – carbamil fosfat sintetaza

GLN activitate amido trensferazica/glutamina

SYN activitate sintetazica

ATCaza – Aspartat transcarbamilaza

DHOaza - dihidrorotaza

Alte complexe enzimatice

Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GPDH)

Fosfoglicerat kinaza (PGK)https://encrypted-tbn2.gstatic.com/

Difuzia rapida a intermediarului de la o enzima la alta

Canalizarea compusilor de-a lungul complexului

Protejarea intermediarilor instabili

Transfer intermolecular rapid

Avantajele complexelor multienzimatice

http://www.frontiersin.org

Evitarea reactiilor nedorite

Toate reactiile au loc in cadrul aceluiasi complex

Baze de date pentru enzime - biochimiero.files.wordpress.com · Scindarea legaturilor peptidice din...

Documents