+ All Categories
Home > Documents > Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul...

Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul...

Date post: 14-Oct-2019
Category:
Upload: others
View: 7 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
35
1 ACADEMIA ROMÂNĂ INSTITUTUL DE VIRUSOLOGIE ŞTEFAN S. NICOLAU BUCUREŞTI TEZĂ DE DOCTORAT - REZUMAT - Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor tumorale la tratamentul cu agenți chimioterapeuticiCONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Dr. Lorelei Irina Braşoveanu, CS I DOCTORAND: Maria Monica G. Vasilescu BUCUREŞTI - 2019-
Transcript
Page 1: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

1

ACADEMIA ROMÂNĂ

INSTITUTUL DE VIRUSOLOGIE ŞTEFAN S. NICOLAU

BUCUREŞTI

TEZĂ DE DOCTORAT

- REZUMAT -

“Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor

tumorale la tratamentul cu agenți chimioterapeutici”

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:

Dr. Lorelei Irina Braşoveanu, CS I

DOCTORAND:

Maria Monica G. Vasilescu

BUCUREŞTI

- 2019-

Page 2: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

2

CUPRINS Pag

Introducere 4

Scopul, obiectivele şi originalitatea tezei 6

Structura tezei 7

Cercetari proprii 8

Materiale şi metode 8

Rezultate şi discuţii 11

Concluzii 31

Bibliografie selectivă 33

Page 3: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

3

INTRODUCERE

Cu toate progresele realizate în domeniile chirurgiei, radioterapiei, dar mai ales

chimioterapiei, progrese care au dus la schimbări majore în tratamentul cancerului,

dezvoltarea rezistenței celulelor tumorale la agenții chimioterapeutici constituie încă o

problemă importantă, reducând eficiența terapiilor disponibile.

Numărul mare de pacienți care nu răspund la tratament se poate datora fie capacității

înnăscute mai scăzute de răspuns la chimioterapia citotoxică pe care o au unele tumori precum

carcinomul renal, cancerul de colon, cancerul pancreatic, melanoamele, unele tipuri de

cancere de plămâni, fie dobândirii rezistenței pe parcursul tratamentului, frecvent întâlnită în

cancerul de plămâni cu celule mici, cancerul de sân sau ovarian (Fodale 2011, Holohan 2013).

De regulă, celulele tumorale expuse la un singur compus chimioterapic (antracicline, alcaloizii

de vinca, taxol) dezvoltă rezistență încrucișată la o serie de alți compuși neînrudiți structural și

funcțional, proces numit rezistență la medicamente multiple (MDR) (Ganapathy 2013, Kibria

2014).

Rezistența clinică la citostatice reprezintă un fenomen complex, multifactorial, la nivelul

populațiilor de celule tumorale, putând să fie exprimate în același timp o serie de mecanisme

care să determine un grad crescut de rezistență celulară (Jie Qi 2011, Xing Ke 2017). La baza

rezistenței la chimioterapie pot sta mecanisme legate de modificări de acumulare și distribuție

intracelulară a compușilor chimioterapeutici sau de metabolism celular. O serie de alte

mecanisme responsabile pentru apariția fenotipului rezistent sunt legate de activarea

sistemelor de detoxifiere sau alterarea căilor de semnalizare a apoptozei și creșterea reparării

leziunilor ADN cât și de alterări ale țintelor chimioterapicelor. (Cox 2016, Holohan 2013). În

cadrul acestor mecanisme alterările topoizomerazelor ocupă un loc important.

Capacitatea topoizomerazelor de a tăia ADN-ul dublu catenar și apoi de a relega

catenele clivate, face ca aceste enzime să fie ținte primare pentru o serie de agenți

chimioterapeutici folosiți frecvent pentru tratarea multor forme de neoplazii. (Kellner 2002,

Nitiss 2009, Darzynkiewicz 2009).

Potențialul citotoxic al inhibitorilor topoizomerazelor (camptotecina, irinotecanul,

topotecanul, etoposidulul, teniposidul, doxorubicina) se asociază cu capacitatea pe care o au

de a stabiliza complexele covalente Topo – ADN clivat (complexe de clivare), intermediari

temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent

chimioterapeutic formate, împiedică enzima să relege ADN-ul clivat conducând în final la

lezarea ADN-ului și moartea celulelor (Pommier 2010, Nitiss 2009).

Page 4: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

4

Rezistența “atipică” la medicamente multiple (at-MDR) este specifică pentru agenții

chimioterapici care țintesc ADN topoizomerazele și se consideră că este mediată de alterările

cantitative și/sau calitative ale topoizomerazelor (Nielsen 2004, Plo 2002).

Cu toate că alterările topoizomerazelor reprezintă probabil doar unul dintre multiplele

mecanisme de rezistență la terapia antitumorală, se pare că ele pot juca un rol important în

răspunsul chimioterapic. În prezent se fac studii intense pentru a determina care mecanism de

rezistență predomină într-un tip particular de tumoră.

În ultimii ani rolul topoizomerazelor în rezistența la chimioterapie a fost investigat într-o

serie de studii, însă implicarea acestor enzime în chimio-sensibilitate sau chimio-rezistență

rămâne în continuare să fie elucidată întrucât rezultatele au fost neconcludente, uneori

contradictorii și astfel rolul lor predictiv este încă controversat. Aceasta se datorează faptului

că datele furnizate de diferite studii sunt dificil de comparat, deoarece în unele s-a determinat

statusul genic (amplificări, deleții), în altele expresia proteică sau expresia mRNA. In plus,

metodele de determinare folosite au variat destul de mult (FISH/CISH, IHC, WB, qRT-PCR),

întrucăt nu există metode de analiză standardizate pentru topoizomeraze, iar cut-off-urile au

fost alese în mod arbitar.

Pe lângă acestea, cele mai multe studii au urmărit rezistența la citostatice în raport cu o

singură topoizomerază, evaluarea expresiilor celor trei topoizomeraze simultan și implicarea

în rezistență au fost prea puțin abordate. Mai mult, în cazul topoizomerazei II încă nu se

cunoaște sigur care dintre cele două izoforme, alfa sau beta, reprezintă ținte celulare primare

pentru diferite citostatice.

O mai bună cunoaștere a mecanismelor moleculare ale rezistenței la chimioterapie ar

putea permite identificarea unor markeri moleculari predictivi, cu adevarat relevanți pentru

răspunsul la medicamentele antitumorale, precum si la identificarea unor agenți și strategii

terapeutice noi.

Page 5: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

5

SCOPUL, OBIECTIVELE SI ORIGINALIZATEA TEZEI

Scopul tezei de doctorat a fost acela de a determina implicarea topoizomerazelor

(topoizomerazei I (Topo I) și izoformelor alfa și beta ale topoizomerazei II (Topo II si )) în

rezistența celulelor tumorale la agenții chimioterapeutici care țintesc aceste enzime, evaluând

modificările care survin în expresiile acestora pe parcursul achiziției fenotipului de rezistență.

De asemenea, s-a urmărit dacă în cazul inhibitorilor de Topoizomeraza I (Topotecanul) și

Topoizomeraza II (Adriablastina) intervine rezistența încrucișată.

Obiectivele urmărite pe parcursul tezei de doctorat au fost:

Obținerea unor modele experimentale reprezentate de sublinii celulare rezistente la

agenți antitumorali reprezentativi pentru clasele de agenti chimioterapeutici care țintesc Topo

I și Topo II, pornind de la linii celulare standardizate.

Determinarea sensibilității/ rezistenței la citostatice, atat directe cât și încrucișate, la

nivelul subliniilor celulare cu rezistență dobândită, prin analiza citotoxicității celulare,

apoptozei și cineticii ciclului celular.

Evaluarea expresiilor proteice și genice ale Topo I și izoformelor α și β ale Topo II

înainte și pe parcursul achiziției fenotipului de rezistență, printr-o abordare complexa si

folosind o serie de tehnici moderne de laborator (citometrie în flux, Western Blot, RT-PCR).

Determinarea eventualelor corelații între nivelurile de expresie a topoizomerazelor și

sensibilitatea/ rezistența la citostatice.

Originalitatea lucrării:

Elaborarea unor modele experimentale in vitro, realizate pe 5 linii tumorale umane

(mamare, ovariene sau de cervix), de inducere a rezistenței tumorale la agenți

chimioterapeutici anti-topoizomeraze, utilizate in studii ulterioare;

Efectuarea unor studii complexe de evaluare concomitentă a modulării expresiei celor

trei topoizomeraze funcție de rezistența indusă la agenti chimioterapeutici anti-topoizomeraze

prin toate tehnicile de laborator prezentate în teza;

Utilizarea în paralel a unor tehnici moderne de imunologie, biologie moleculară,

biochimie, citometrie în flux a permis elucidarea unor aspecte legate de implicarea individuală

a fiecărei topoizomeraze în fenotipul rezistenței directe sau incrucisate la tratament.

Page 6: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

6

STRUCTURA TEZEI

Teza de doctorat „Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor tumorale la

tratamentul cu agenți chimioterapeutici” cuprinde doua parti:

I. Partea teoretica, ce consta in fundamentarea stiintifica a subiectului abordat, si

II. Partea experimentala, ce consta in cercetarile proprii, originale.

Partea teoretica este reprezentata de 5 capitole si cuprinde 57 de pagini. Astfel, in

primul capitol, „Cancerul (generalitati)” prezinta sumar informatii despre epidemiologia

cancerelor umane, aspecte generale ale cancerului si strategii terapeutice utilizate.

In capitolul „Rezistența la agenții chimioterapeutici care țintesc topoizomerazele”

sunt descrise aspecte referitoare la mecanismele de rezistență la agenții chimioterapeutici care

țintesc topoizomerazele: alterari în transportul intracelular și metabolismul agenților

chimioterapeutici, sechestrarea agenților chimioterapeutici în diferite compartimente celulare,

activarea sistemelor de detoxifiere, apărarea antioxidantă, statusul proliferativ, mecanisme

care implică alterări în răspunsul celular la lezarea ADN-ului sau alți factori/ mecanisme ale

rezistenței la agenții chimioterapeutici care țintesc topoizomerazele. Capitolul trei „ADN

topoizomerazele” prezinta in detaliu clasificarea ADN topoizomerazelor, caracterizarea și

structura ADN topoizomerazelor de tip I si II alfa și beta, mecanismele de acțiune, functiile

acestora si procesele celulare în care sunt implicate, necesare intelegerii studiilor realizate in

cadrul tezei. In capitolul patru „Agenții chimioterapeutici care țintesc topoizomerazele”,

se fac unele precizari de clasificare a agenților chimioterapeutici anti-topoizomeraze cat si in

ceea ce priveste mecanismele citotoxicitatii mediate de topoizomerazele I și II. Partea

teoretica a tezei se incheie cu capitolul cinci ”Mecanisme de rezistență ce implică alterări

ale topoizomerazelor I și II alfa și beta” in care sunt descrise alterarile topoizomerazelor

(expresia proteica, activitatea enzimatica si mutatiile) implicate in raspunsul la chimioterapie.

Partea experimentala cuprinde Metodologia, care include principiile metodelor,

materialul biologic, consumabilele, reactivii, echipamentele și protocoalele de lucru, si

capitolul de Rezultate, discuții și concluzii partiale ce au reiesit in urma studiilor efectuate.

La finalul acestei parti sunt incluse Concluziile generale, lista de abrevieri, o bibliografie

vasta, ce consta in aproximativ 300 de referinte, lista tabelelor si a figurilor din cadrul tezei de

doctorat.

Page 7: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

7

PARTEA EXPERIMENTALA

METODOLOGIE

Studiul implicării topoizomerazelor în rezistența celulelor tumorale la agenți

chimioterapeutici reprezentativi pentru clasele care țintesc cele două tipuri de topoizomeraze

(Topo I și Topo II) s-a realizat pe material biologic reprezentat de linii celulare standardizate,

derivate din adenocarcinoame umane (mamar, ovarian, cervical) și sublinii celulare obținute

din acestea, prin inducerea în laborator a fenotipului rezistent. În acest scop s-au realizat

culturi de celule și pasaje repetate, s-au utilizat o serie de tehnici de determinare a viabilității

celulelor funcție de citotoxicitatea agenților chimioterapeutici, de evaluare a evenimentelor

apoptotice, de analiză a dinamicii ciclului celular și a expresiei proteice, genice a

topoizomerazelor.

- Studiile desfășurate pe parcursul acestei teze de doctorat au fost realizate folosind ca

material biologic un panel de linii celulare umane derivate din tumori maligne mamare

(MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231), ovariene (SK-OV-3) și cervicale (HeLa), care aparțin

conform clasificării moleculare unor subclase reprezentative pentru cele trei tipuri de cancer și

prezintă o serie de caracteristici ce le diferențiază între ele. Toate liniile celulare luate în

studiu au provenit de la European Collection of Cell Culture (ECACC), cu excepția liniei SK-

BR-3 care a fost pusă la dispoziție de dr. Michele Maio (Centro Regionale Oncologico di

Aviano, Advanced Immunotherapy Unit). Drept linie celulara de control pentru studiile

efectuate in cadrul tezei s-a utilizat linia MCF-7/A, rezistenta la Adriamicina, pusa la

dispozitie de dr. Liliana Puiu (Institutul Oncologic „Prof. Dr. Alexandru Trestioreanu”,

Bucuresti).

- Cultivarea liniilor celulare: mentinerea in cultura, manipularea si stocarea liniilor celulare

luate in studiu s-a realizat conform protocoalelor recomandate de ECACC pentru fiecare linie

in parte.

- Elaborarea modelelor experimentale in vitro: subliniile rezistente la adriablastină (ADB),

respectiv topotecan (TPT) au fost obținute în laborator prin expunerea continuă a liniilor

celulare umane parentale de cancer mamar (MCF-7, SKBR3, MDA-MB231), ovarian

(SKOV3) și cervical (HeLa) la concentrații crescatoare de topotecan (TPT) sau adriablastină

(ADB), citostatice reprezentative pentru clasele de chimioterapice care țintesc cele două tipuri

de topoizomeraze Topo I, respectiv Topo II. Inducerea caracterului rezistent s-a facut intr-o

perioada lunga de timp, 10 luni, cu concentratii situate intre 20 nM si 700nM pentru ADB sau

3 nM si 60nM pentru TPT, functie de rezistenta fiecarei linii parentale si IC50 evaluat prin

Page 8: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

8

testele de citotoxicitate prin metoda colorimetrică cu MTS sau analiza celulara in timp

real (RTCA). Subliniile cu rezistenta indusa au fost denumite: MCF-7/AR și MCF-7/TR;

SK-BR-3/AR și SK-BR-3/TR; MDA-MB-231/AR și MDA-MB-231/TR; SK-OV-3/AR și SK-

OV-3/TR; HeLa/AR și HeLa/TR.

- Determinarea gradului de rezistență la tratamentele anti-topoizomeraze s-a realizat prin

tehnici colorimetrice (MTS) cu ajutorul kitului CellTiter 96® AQueous One Solution Cell

Proliferation Assay (MTS) (Promega) și calcularea indicelui de citotoxicitate IC50.

Rezultatele obținute în urma testelor de citotoxicitate prin tehnica MTS si determinarilor

spectrofotometrice ( = 490 nm) au fost exprimate ca valori ale densitatii optice (D.O.) si

transformate in valori procentuale ale viabilitătii celulare, ce reprezinta valorile medii ±SD

rezultate din trei experimente, calculate după formula: Viabilitate (%) = DO proba – DO

blank/ DO control – DO blank. Rezultatele au fost confirmate prin analiza celulară în timp

real (RTCA), cu ajutorul sistemului xCELLigence (analizor RTCA+computer cu software

RTCA 1.2.2.).

- Evaluarea evenimentelor apoptotice prin citometrie în flux, in scopul determinarii și

monitorizarii sensibilității/ rezistenței la citostatice, utilizand dubla marcare cu Anexina V-

FITC şi iodură de propidiu (PI), cu ajutorul kitului Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit

(BioVision Inc, USA).

- Prin dubla marcare s-au determinat celulele aflate în diferite faze de moarte celulară:

apoptoza timpurie (anexina V+/ PI

-), apoptoza târzie (anexina V

+ /PI

+) sau necroza (anexina V

-

/PI+). Analiza datelor achizitionate cu citometrul in flux FACS CantoII s-a facut cu

programele software Diva 7.2., WinMDI 2.9 si Kaluza.

- Analiza progresiei prin fazele ciclului celular in liniile celulare tumorale parentale si cu

rezistenta indusa cuprinse in studiu s-a realizat prin tehnica de colorare cu PI, dupa tratarea in

prealabil cu RNAza, urmata de achizitia datelor cu citometrul in flux FACS Calibur si analiza

acestora cu programele ModFIT sau CellFIT. Intensitatea luminii fluorescente este direct

proporțională cu cantitatea de ADN permițând astfel estimarea fazelor ciclului celular (G0/G1,

S si G2/M).

- Evaluarea expresiei antigenelor nucleare Topo I și izoformelor α și β ale TopoII prin

citometrie în flux s-a efectuat înainte și pe parcursul dobândirii caracterului de rezistență la

panelul de linii celulare umane de cancer mamar, ovarian și cervical, cărora li s-a indus

rezistența la ADB sau TPT, după permeabilizarea în prealabil a membranelor celulare.

Achiziția datelor s-a realizat cu citometrul in flux FACS Calibur, iar analiza fluorescenței

celulare s-a facut prin utilizarea programului WinMdi 2.9. Rezultatele au fost exprimate ca

procente de celule pozitive (IIF %) si valori medii ale intensității de fluorescență (MFI),

Page 9: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

9

probele fiind clasificate drept pozitive dacă mai mult de 5% dintre celule au legat mAb

specific.

- Determinarea expresiei antigenice funcție de fazele ciclului celular prin citometrie în flux

cu ajutorul citometrului in flux FACS Calibur, in scopul evaluarii expresiei antigenelor în

funcție de fazele ciclului celular prin marcarea celulelor atât cu anticorpi monoclonali

specifici fluorescenți, cât și cu PI. Analiza probelor s-a facut la fel ca si în cazul analizei

ciclului celular. Drept control s-a folosit o probă marcata doar cu anticorpul secundar si PI.

- Determinarea expresiei antigenice prin tehnica SDS-PAGE/ Western blot pentru

detectarea specifică a proteinelor (prezenţa/absenta, nivel de expresie) s-a realizat in lizatele

netratate sau celulelor tratate cu ADB sau TPT. Din lizatele ce contineau amestecuri de

proteine, topoizomerazele au fost separate pe baza greutatii moleculare, prin electroforeză

verticala în gel de poliacrilamidă, iar apoi au fost sunt transferate pe membrane PVDF

(polivinildienă). Detecția proteinelor țintă s-a realizat dupa legarea anticorpilor primari specifici si

anticorpilor secundari marcati cu peroxidaza prin chemiluminiscența ECL (“enhanced

chemiluminescence”), avand ca substrat luminolul, care este oxidat de HRP în prezența H2O2.

- Evaluarea expresiei genice a topoizomerazelor prin tehnica real time PCR (RT-PCR) s-

a realizat in probe de ARNm total, izolate din suspensiile liniilor celulare cu reactivul TRIzol

si purificate (clean-up) pe coloane mini spin cu DNază cu ajutorul kitului RNeasy Mini

(Qiagen Inc, USA). Dupa cuantificarea ARNm-ului, prin citirea densităților optice la 260, 280

și 230 nm si utilizând spectrofotometrul Nanodrop 1000 (Nanodrop Technologies, USA),

probele de ARNm au fost supuse revers-transcripției folosind primeri nespecifici, randomici,

cu ajutorul kitului High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems).

Amplificarea probelor de ADNc a fost realizată prin tehnologia TaqMan, cu ajutorul sondelor

TaqMan gene expression assay, furnizate de Thermo Fisher Scientific. Probele au fost testate în

duplicat si normalizate prin raportarea la gena de referință (gena de housekeeping) GAPDH.

Datele au fost analizate folosind metoda Ct comparativ sau metoda ∆∆Ct.

- Analiza statistica a rezultatelor obtinute si efectuarea studiilor de corelaţie s-au realizat prin

utilizarea programului GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software) sau programul Excel (testul

Student’s t, determinarea coeficientului de corelatie liniara Pearson). Datele analizate cu p <

0.05 au fost considerate semnificative statistic. Analizele de corelatie cu o valoare a indicelui

de corelatie r sau r2 ce au corespus unei valori p < 0.05 au fost considerate semnificative

statistic.

Page 10: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

10

REZULTATE ȘI DISCUȚII

I. Profilurile sensibilității/ rezistenței și rezistenței încrucișate la citostatice

1) Evaluarea citotoxicității agenților chimioterapeutici prin analiza celulară în timp

real (tehnica RTCA)

Evaluarea în timp real a efectelor tratamentelor cu Adriablastina (ADB) si Topotecan

(TPT) efectuate pe toate liniile parentale luate in studiu a folosit la stabilirea dozelor şi

perioadelor de timp de tratament specific pentru fiecare agent chimioterapeutic si linie

celulara. În vederea evaluării citotoxicităţii modulatorilor prin metoda RTCA, celulele

tumorale au fost cultivate timp de 24h in placi de cultura de 75 cm2, in mediu de cultura

complet, pana la atingerea unei densităţi de 50%. După indepartarea mediului de cultura,

celulele au fost desprinse, spălate şi incubate în plăci tip E-view cu 16 godeuri cu senzori de

impedanţă (Roche).

Stabilirea concentraţiilor de citostatice folosite ulterior pentru tratarea celulelor s-a făcut

prin utilizarea sistemului de analiză a proliferării celulare RTCA (Real Time Cell Analyzer)

cu ajutorul aparatului xCelligence, varianta RTCA-DP (Acea Biosciences/ prin Roche). In

vederea efectuarii testelor de inhibare a proliferării si alegerea densității optime a celulelor în

godeuri s-a făcut trasarea unor curbe de densitate pentru fiecare linie celulara în parte, prin

adaugarea unor suspensii celulare cu densităţi diferite (5000, 10000, 15000, 20000

celule/godeu). Curbele de creştere celulară s-au înregistrat automat pe sistemul xCELLigence

System în timp real. Datele de creştere brute (exprimate prin indecsi celulari, IC) au fost

normalizate prin soft (“normalized cell index”) la momentul adaugarii compusilor testati.

Figura 1. Profilul curbelor de proliferare induse de ADB sau TPT in liniile celulare parentale

ADB TPT

MCF-7/A

Page 11: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

11

MCF-7

Sk-Br-3

MDA-MB-231

Sk-Ov-3

HeLa

NT ---- 10 M ---- 5 M ---- 2 M -----10M ---- 0.5 M ---- 12 h ------ 24 h ------ 36 h ------48 h ------- 60 h ------- 72 h ------

Metoda a permis studiul citotoxicităţii mediate de catre compușii studiati, medicamente

ce tintesc Topo I sau Topo II alpha si beta. Monitorizarea dinamică în timp real a

Page 12: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

12

citotoxicităţii a permis calcularea valorilor IC50 dependente de timp, in orice moment al

proliferarii celulare. Astfel, se poate selecta momentul în care o concentrație atinge răspunsul

maxim. Curbele de creştere celulară au fost normalizate faţă de control (reprezentat de curba

celulelor netratate).

- Utilizarea sistemului xCELLigence pentru analiza in timp real a proliferarii vs.

citotoxicitatea celulara sub actiunea unor agenti chimioterapeutici anti-topoizomeraze a oferit

avantaje importante comparativ cu metodele clasice, colorimetrice, tip “end-point”;

- Intregul proces de modulare a proliferării celulare de către stimulii utilizați (agenți

chimioterapeutici anti-topoizomeraza) a putut fi urmarit in timp real, pe parcursul unei

perioade de timp indelungate;

- Normalizarea datelor achizitionate la momentul aplicării tratamentelor a permis o analiză

mai bună a efectului indus de concentrațiile mici comparativ cu cele mai mari;

- Datele obținute au permis selecția concentrațiilor de agenti anti-topoizomeraze și perioadele

de timp pentru aplicarea tratamentelor, utile în testele ulterioare tip „end-point” (citometrie in

flux, RT-PCR, WB);

- Metoda a facut posibila calcularea IC50 in orice moment al curbei de proliferare; valorile

IC50 obținute prin analiza RTCA au fost comparabile cu valorile obținute în urma realizării

testelor de citotoxicitate clasice, colorimetrice (cu MTS). Astfel, în urma analizei curbelor de

inhibare a proliferarii si calcularea IC50 s-a ales un interval pentru concentrațiile de lucru in

functie de rezistenta constitutiva sau indusa a liniilor celulare luate in studiu.

2) Analiza răspunsului celulelor liniilor parentale și subliniilor cu rezistenta la

adriablastină sau topotecan prin colorare cu MTS

Raspunsul citotoxic la diferite concentrații de adriablastină (ADB) sau topotecan (TPT),

agenți antitumorali reprezentativi pentru clasele de chimioterapice care țintesc Topo I și Topo

II, s-a realizat prin evaluarea chimiosensibilitatii liniilor parentale si rezistenței subliniilor

derivate pe baza determinarii indicelui de citotoxicitate IC50 (concentrația de citostatic care

determină o scădere cu 50% a viabilității celulelor), calculat pentru fiecare citostatic din

curbele de supraviețuire obținute după tratarea timp de 72 ore cu ADB sau TPT atât a liniilor

parentale, cât și a subliniilor rezistente.

La nivelul panelului de linii parentale luat în studiu (MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3,

HeLa și SK-OV-3) s-au determinat paternuri de sensibiliate diferite la adriablastină sau

topotecan. Cele mai ridicate valori ale IC50 atât pentru ADB (IC50 = 103.02 μM), cât și TPT

(IC50 = 7.56 μM) au fost determinate pentru linia SK-BR-3; linia MCF-7 a avut un IC50

crescut la ADB (IC50 = 58.44 μM), dar a avut sensibilitate ridicată la TPT (IC50 = 1.33 μM);

Page 13: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

13

celulele liniei MDA-MB-231 au fost cele mai sensibile atât la ADB (IC50 = 8.64 μM) cât și

la TPT (IC50 = 1.29 μM); liniile HeLa și SK-OV-3 au avut sensibilități moderate cu indici de

citotoxicitate diferiți la cele două chimioterapice 12.45 μM și 25.92 μM pentru ADB,

respectiv 5.27 μM și 2.31 μM pentru TPT.

Celulele subliniilor rezistente au fost viabile și la concentrații de citostatic la care

celulele liniilor parentale au fost evident mai afectate. Între liniile parentale și subliniile cu

rezistenta care au provenit din acestea, în condiții identice de cultură s-au determinat diferențe

ale valorilor IC50 atât pentru ADB, cât și pentru TPT (Tabel 1).

Tabel 1. Sensibilitatea și cross-rezistența liniilor sensibile și rezistente la

inhibitorii Topo I (TPT) și Topo II (ADB)

a) Factorii de rezistență la adriablastină pentru liniile rezistente la adriablastină

b)Factorii de rezistență la topotecan pentru liniile rezistente la topotecan

Comparând subliniile rezistente între ele, am constatat că în ceea ce privește rezistența

încrucișată la ADB, subliniile cu rezistenta la TPT au păstrat profilul de sensibilitate pe care

l-au avut liniile parentale din care au derivat; si în cazul subliniilor rezistente la ADB s-a

păstrat sensibilitatea la TPT (Tabel 1).

Analiza comparativa a datelelor obținute a arătat că subliniile MCF-7/AR și MCF-7/TR,

MDA-MB-231/AR și MDA-MB-231/TR, SK-BR3/AR și SK-BR3/TR, HeLa/AR și HeLa/TR,

SK-OV-3/AR și SK-OV-3/TR, sunt variante cu diferite grade de rezistență indusa la

adriablastină sau topotecan, prin selecția progresiva a liniilor celulare umane de cancer mamar

Linii celulare

IC50 (μM)

Adriablastina Topotecan

MCF-7

58,44

1,33

MCF-7/TR 68,95 5,66 (4,25)b)

MCF-7/AR 101,15 (1.73)a)

3,08

MDA-MB-231 8,64 1,29

MDA-MB-231/TR 9,99 3,54 (2,74)b)

MDA-MB-231/AR 18,29 (2,12)a)

1,43

SK-BR-3 103,02 7,56

SK-BR-3/TR 108,87 19,02 (2,51)b)

SK-BR-3/AR 204,27 (1,98)a)

7,57

HeLa 12,45 5,27

HeLa/TR 17,95 10,76 (2,04)b)

HeLa/AR 24,68 (1,98)a)

6

SK-OV-3 25,92 2,31

SK-OV-3/TR 26,92 6,34 (2,74)b)

SK-OV-3/AR 58,94 (2,27)a)

2,54

MCF-7/A 129,25 4,84

Page 14: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

14

MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231, cancer ovarian SK-OV-3 și cancer cervical HeLa, cultivate

în mediu cu concentrații crescânde de ADB sau TPT.

Rezultatele obtinute au arătat că rezistența la adriablastină nu induce rezistență

încrucișată la topotecan, și viceversa.

3) Determinarea sensibilității sau rezistenței liniilor celulare parentale și subliniilor

cu rezistenta indusa la ADB sau TPT prin evaluarea evenimentelor apoptotice

Indiferent de mecanismul de acțiune, agenții chimioterapeutici determină în final

apoptoza celulelor (moartea celulară programată). De aceea, ca o metodă suplimentară de

analiză a chimiosensibilității liniilor parentale și subliniilor cu rezistenta indusa la ADB sau

TPT, cat si pentru determinarea rezistentei incrucisate, s-a realizat si evaluarea evenimentelor

apoptotice, in paralel cu celelalte teste de laborator.

Agenții chimioterapeutici indiferent de mecanismul de acțiune determină în final

apoptoza celulelor (moartea celulară programată). Alături de inhibiția proliferării celulare, ea

este frecvent evaluată în răspunsul biologic la tratamentul cu diferiți agenți chimioterapeutici.

În studiul de față, evaluarea apoptozei prin dubla marcare cu Anexina V- FITC şi iodura

de propidiu (PI) la flow citometru s-a realizat, alături de MTT ca o metodă suplimentară de

analiză a sensibilității liniilor parentale și subliniilor rezistente la doxorubicină sau topotecan

obținute în laborator. Așadar, determinarea evenimentelor apoptotice a fost utilizată în

monitorizarea și confirmarea fenotipului rezistent, dar și pentru a evalua rezistența încrucișată

la adriablastină sau topotecan.

Pentru aceasta, celulele liniilor parentale (MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3, HeLa, SK-

OV-3) și subliniilor rezistente atât la adriablastină (MCF7/AR, MDA-MB-231/AR, SK-BR-

3/AR, HeLa/AR și SK-OV-3/AR) cât și topotecan (MCF-7/TR , MDA-MB-231/TR, SK-BR-

3/TR, HeLa/TR și SK-OV-3/TR), după ce au fost cultivate și lăsate să adere 24 ore în

la 370C și atmosferă umedă cu 5% CO

2, au fost tratate cu 50 nM topotecan sau 1 μM

adriablastină o perioada de 24 ore. După desprinderea celulelor analiza apoptozei panelurilor

de linii parentale și subliniilor rezistente s-a realizat cu kitul Annexin V-FITC Apoptosis

Detection kit, BioVision, cu dublă marcare a celulelor cu Anexina V-FITC şi iodură de

propidiu (PI). Achiziția și analiza datelor s-a realizat la citometru în flux FACS Canto II. Și au

fost determinate procentele celulelor viabile (celule negative pentru anexina-V și PI) și

celulelor aflate în diferite stadii de moarte celulară: apoptoza timpurie (celule pozitive pentru

anexina V și negative pentru PI), apoptoza târzie/ necroză (celule pozitive pentru anexina-V și

PI).

Page 15: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

15

a) Modularea apoptozei de catre ADB in liniile celulare parentale si subliniile cu

rezistenta indusa la ADB

Analiza comparativă a sensibilității celulelor liniilor parentale și rezistente la

adriablastină, la 24 ore de expunere la adriablastină (concentrație 1 μM) a arătat o creștere a

procentului de evenimente apoptotice la toate liniile celulare parentale față de liniile rezistente

(Fig. 2).

Figura 2. Evenimente apoptotice timpurii , târzii și totale induse de ADB

la nivelul liniilor parentale și rezistente la adriablastină (AR)

b) Modularea apoptozei de catre TPTin liniile celulare parentale si subliniile cu

rezistenta indusa la TPT

Analiza comparativă a sensibilității celulelor liniilor parentale și cu rezistenta indusa la

topotecan, la 24 ore de expunere la TPT (concentrație de 50nM), a arătat o creștere a

procentului de evenimente apoptotice in toate liniile celulare parentale față de liniile

rezistente, ceea ce demonstreaza o sensibilitate mai redusă a celulelor cu rezistență indusa la

topotecan față de celulele parentale (Fig. 3).

Figura 3. Evenimente apoptotice timpurii , târzii și totale induse de TPT

la nivelul liniilor parentale și rezistente la topotecan (TR)

0

5

10

15

20

25

30

Ap

op

toza

(%

)

0

5

10

15

20

25

Ap

op

toza

(%

)

Page 16: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

16

Rezultatele obținute au evidențiat fenotipul chimiorezistent al subliniilor cu rezistenta

indusa: subliniile rezistente la ADB sau TPT au o apoptoza redusă la expunerea la citostaticul

la care s-a indus rezistența. Datele sunt în concordanță cu cele din literatura de specialitate

(Potter 2002, Giovanetti 2015, Jin Mo Ku 2015). Astfel, studii realizate pe celulele liniei

MCF-7 rezistente la ADB au arătat că o expunere de 24 ore la 1μM ADB nu induce apoptoza

(Jin Mo Ku 2015).

Implicarea topoizomerazelor in procesul apoptotic este susținută de o serie de studii. Se

știe că ADB prezintă mai multe mecanisme de acțiune, însă atât în cazul acesteia, cât și a TPT

s-a demonstrat că citotoxicitatea se datorează în principal interacției cu topoizomerazele Topo

II, respectiv Topo I și formării complexelor ternare Topo-ADN-agent chimioterapic (Lee

2017, Giovanetti 2015); ulterior survine blocarea ciclului celular și moartea celulelor

incapabile să repare eficient ADN-ul (Lee 2017; Cox 2016; Darzynkiewicz 2009; Giovanetti

2015). Studiul lui Potter a arătat că într-adevar, distrugerea ADN-ului se produce

predominant în celulele aflate în Faza G2/M, când Topo II ɑ este supraexprimată (Potter,

2002).

4) Modularea rezistentei incrucisate la ADB si TPT, evaluata prin determinarea

evenimentelor apoptotice in liniile celulare parentale si subliniile cu rezistenta indusa

În cadrul studiului am evaluat și rezistența încrucișată prin cuantificarea evenimentelor

apoptotice după tratarea în paralel a liniilor rezistente cu cel de-al doilea citostatic. Rezultatele

obținute la analiza prin citometrie în flux au arătat că indiferent de tipul tumorii din care liniile

au derivat, la subliniile ADB-rezistente tratate cu TPT, fracțiile de celule apoptotice au avut în

general valori apropiate de cele ale liniilor parentale din care acestea au provenit (tratate și ele

cu aceeași concentrație de TPT). Și în cazul subliniilor TPT-rezistente, tratate cu adriablastină

s-a constatat că fracția de celule apoptotice este apropiată de cea a liniilor parentale.

Rezultatele experimentelor de modulare a apoptozei de catre agentii anti-topoizomeraze

in liniile parentale sau cu rezistenta indusa la ADB sau TPT sunt sistematizate în Tabelul 2.

Evaluarea evenimentelor apoptotice prin citometrie în flux confirmă fenotipul rezistent

achiziționat în timpul procesului de inducere a rezistenței la citostatice. Sensibilitatea la TPT a

celulelor ADB- rezistente și viceversa, sensibilitatea la ADB a celulelor TPT-rezistente,

observata anterior la determinarea citotoxicității prin tehnica MTS, într-o manieră dependentă

de concentrație sunt confirmate și la evaluarea evenimentelor apoptotice prin citometrie în

flux.

Page 17: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

17

Tabel 2. Distributia procentuala a evenimentelor apoptotice la nivelul

liniilor parentale și rezistente la TPT (TR) sau ADB (AR)

Linii celulare Agenti chimioterapeutici Apoptoza timpurie (%) Apoptoza tarzie (%) Apoptoza totala (%)

MCF-7

Control 1.18 3.51 4.69

Topotecan 16.81 4.10 20.91

Adriablastina 12.01 6.65 18.66

MCF-7/TR

Control 2.61 3.59 6.20

Topotecan 4.04 9.58 13.62

Adriablastina 9.75 7.24 16.99

MCF-7/AR

Control 4.21 3.72 7.93

Topotecan 4.03 11.35 15.38

Adriablastina 8.49 6.14 14.63

MDA-MB-231

Control 1.48 5.16 6.64

Topotecan 10.34 12.00 22.34

Adriablastina 2.27 23.63 25.9

MDA-MB-231/TR

Control 2.67 10.45 13.12

Topotecan 8.07 9.56 17.63

Adriablastina 4.92 21.89 26.81

MDA-MB-231/AR

Control 3.31 8.36 11.67

Topotecan 5.78 15.44 21.22

Adriablastina 4.34 11.14 15.48

SK-BR-3

Control 2.27 2.06 4.33

Topotecan 7.54 3.59 11.13

Adriablastina 10.60 4.38 14.98

SK-BR-3/TR

Control 3.37 4.35 7.72

Topotecan 5.78 2.67 8.45

Adriablastina 9.90 4.46 14.36

SK-BR-3/AR

Control 2.11 2.29 4.40

Topotecan 7.00 3.98 10.98

Adriablastina 3.81 3.70 7.51

HeLa

Control 2.62 2.62 5.24

Topotecan 1.96 12.52 14.47

Adriablastina 10.26 13.42 23.68

HeLa/TR

Control 4.42 4.65 9.07

Topotecan 1.71 8.65 10.36

Adriablastina 3.25 18.10 21.35

HeLa/AR

Control 3.74 2.44 6.18

Topotecan 2.22 12.10 14.32

Adriablastina 2.78 4.84 7.62

SK-OV-3

Control 0.50 2.64 3.14

Topotecan 2.73 11.94 14.72

Adriablastina 13.22 6.26 19.48

SK-OV-3/TR

Control 6.05 2.02 8.07

Topotecan 4.15 5.45 9.6

Adriablastina 15.02 2.41 17.43

SK-OV-3/AR

Control 1.87 3.09 4.96

Topotecan 5.48 8.21 13.69

Adriablastina 3.31 4.63 7.94

MCF-7/A

Control 1.10 1.76 2.86

Topotecan 2.67 11.18 13.85

Adriablastina 3.34 1.77 5.11

5) Evaluarea statusului de proliferare al liniilor celulare parentale și subliniilor

rezistente la adriablastină și topotecan prin analiza dinamicii ciclului celular

Citometria în flux reprezintă o tehnică superioară metodelor clasice de analiză celulară,

ea fiind cea mai adecvată pentru monitorizarea distribuției cantității de ADN în fazele ciclului

celular. Pentru a determina activitatea proliferativă a liniilor celulare parentale și subliniilor cu

rezistență la adriablastină sau topotecan prin masurarea distribuției nucleilor in fazele ciclului

celular (G0/G1, S și G2/M), s-a realizat colorarea cu iodura de propidiu (PI) a nucleilor liniilor

Page 18: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

18

parentale, AR sau TR, urmata de achizitia a 20000 de evenimente si analiza datelor utilizand

soft-urile dedicate.

Figura 4. Distribuția pe fazele ciclului celular a celulelor MCF-7 parentale și rezistente

MCF-7 MCF-7/AR MCF-7/TR

Linia celulara G0/G1 (%) S (%) G2/M (%) IP (%)

MCF-7 72.22 16.86 10.92 27.78 MCF-7/AR 70.17 19.17 10.66 29.83 MCF-7 /TR 71.11 19.01 9.88 28.89

Figura 5. Distribuția pe fazele ciclului celular a celulelor SK-OV-3 parentale și rezistente

SK-OV-3 SK-OV-3/AR SK-OV-3 /TR

Linia celulara G0/G1 (%) S (%) G2/M (%) IP (%)

SK-OV-3 73.08 10.38 15.82 26.2

SK-OV-3/AR 71.70 10.09 18.21 28.3 SK-OV-3/TR 74.85 9.12 16.03 25.15

Figura 6. Distribuția pe fazele ciclului celular a celulelor SK-BR-3 parentale și rezistente

SK-BR-3 SK-BR-3/AR SK-BR-3/TR

Linia celulara G0/G1 (%) S (%) G2/M (%) PI (%)

SK-BR-3 62.36 29.59 8.05 37.64 SK-BR-3/AR 66.15 20.37 13.47 33,84 SK-BR-3/TR 64.20 29.78 6.02 35,8

Page 19: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

19

Figura 7. Distribuția pe fazele ciclului celular a celulelor HeLa parentale și rezistente

HeLa HeLa /AR HeLa /TR

Linia celulara G0/G1 (%) S (%) G2/M (%) IP (%)

HeLa 74.57 13.25 12.18 25.43 HeLa/AR 77.62 10.35 11.57 21.92 HeLa/TR 74.03 7.94 13.83 21.77

Figura 8. Distribuția pe fazele ciclului celular a celulelor MCF-7/A parentale și rezistente

MCF-7 MCF-7/AR MCF-7/TR

Linia celulara G0/G1 (%) S (%) G2/M (%) IP (%)

MCF-7 72.22 16.86 10.92 27.78 MCF-7/AR 70.17 19.17 10.66 29.83 MCF-7 /TR 71.11 19.01 9.88 28.89

Rezultatele obținute la analiza dinamicii ciclului celular au arătat că între pattern-urile

de distribuție la nivelul ciclurilor celulare ale celulelor subliniilor rezistente și liniilor

parentale corespunzătoare pentru MCF-7, SK-OV-3 nu apar diferențe notabile în cazul

rezistenței la ADB și nici la TPT. O scădere ușoară a activității proliferative a fost înregistrată

la unele sublinii rezistente (SK-BR-3/Ar, HeLa/AR, HeLa/TR). Suprapunerea histogramelor

ADN (Fig. 9) arată foarte clar distribuția asemănătoare a fazelor ciclului celular in liniile

parentale și subliniile rezistente.

Datele sunt în concordanță cu cele din literatura de specialitate cu privire la scăderea

activității proliferative în rezistența la agenții chimioterapeutici. O explicație pentru scăderea

activității proliferative în celulele cu rezistență ar fi modificarea expresiilor unor proteine

implicate în controlul ciclului celular și diferențierea celulelor rezistente, dezvoltarea

fenotipului rezistent putând fi însoțită de o serie de schimbări în structura morfologică, în rata

de proliferare și în expresia proteinelor implicate în apoptoză și controlul ciclului celular

(Lukyanova, 2009). Se consideră că reducerea expresiei Topo II ar fi implicată în mod direct

Page 20: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

20

în reducerea ratei de proliferare întrucât este esențială pentru replicarea ADN-ului (Forushani,

2004), Topo IIα dovedindu-se a fi un marker de proliferare relevant (Romero, 2011).

Figura 9. Profilurile histogramelor ADN ale liniilor parentale și rezistente

MCF-7, MCF-7/AR, MCF-7/TR SK-BR-3, SK-BR/AR, SK-BR-3/TR

SK-OV-3, SK-OV-3/AR, SK-OV-3/TR HeLa-7, HeLa-7/AR, HeLa-7/TR

II. Statusul Topoizomerazei I, Topoizomerazelor II alfa și beta

Cu toate că mecanismele implicate atât în rezistența de novo cât și în cea dobândită au

fost studiate în profunzime, topoizomerazele fiind și ele investigate într-o serie de studii,

implicarea acestora în sensibilitate/rezistență nu este complet elucidată. Astfel, un obiectiv

important al studiului a constat în evaluarea expresiilor Topoizomerazei I și Topoizomerazelor

II α și II β pentru a determina implicarea acestora în rezistența la chimioterapie.

Determinarea s-a făcut la începutul demararii studiilor și pe parcursul dobândirii

caracterului de rezistență la ADB (inhibitor al Topo II) sau TPT (inhibitor al Topo II) pentru

întreg panelul de linii celulare parentale selectate pentru studiu (MCF-7, MDA-MB-231, SK-

BR-3, HeLa, SK-OV-3) și pentru variantele rezistente (MCF7/AR, MCF-7/TR, MDA-MB-

231/AR, MDA-MB-231/TR, SK-BR-3/AR, SK-BR-3/TR, HeLa/AR, HeLa/TR, SK-OV-3/AR

și SK-OV-3/TR).

Page 21: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

21

1) Analiza expresiei proteice constitutive a topoizomerazelor prin citometrie în flux și

imunocitochimie

A) Cuantificarea prin citometrie în flux a nivelurilor de expresie proteică constitutiva ale

Topo I, Topo IIα și II β

Determinarea expresiilor antigenelor nucleare Topo I, Topo II (izoformele α și β) prin

citometrie în flux s-a realizat, după permeabilizarea în prealabil a membranelor celulare, prin

marcarea secventiala cu anticorpi monoclonali specifici de iepure anti-om anti-Topo I, anti-

Topo II sau anti-Topo II β, și anticorpi secundari policlonali marcati fluorescent de capra

anti-iepure (IgG – FITC) (Abcam, Cambridge, UK).

Tabelul 3. Valorile procentuale ale nivelurilor de expresie ale Topo I, Topo IIα și IIβ

Antigen/

linie celulara

Celule pozitive (%)

MCF-7 MDA-MB-231 SK-BR-3 HeLa SK-OV-3

Topo I 95,31 94,35 86,79 87,74 91,35

Topo IIα 78,80 90,89 73,18 89,12 86,93

Topo IIβ 83,05 65,03 84,65 77,55 86,74

Analiza prin citometrie in flux, reprezentata prin histogramele distribuției fluorescenței

celulelor, a arătat în liniile parentale de același tip histologic MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-

3 (adenocarcinom mamar), dar și la cele aparținând altor tipuri precum HeLa (adenocarcinom

cervical) sau SK-OV-3 (adenocarcinom ovarian) o expresie proteică crescută a

topoizomerazelor înainte de inducerea rezistenței, exprimata atat ca valori procentuale de

celule pozitive, cât și ca valori MFI.

Tabelul 4. Valorile medii ale intensității fluorescenței ale Topo I, Topo IIα și IIβ

Antigen/

linie celulara

Intensitate medie de fluorescenta (MFI)

MCF-7 MDA-MB-231 SK-BR-3 HeLa SK-OV-3

Topo I 36,87 20,66 32,12 30 24,4

Topo IIα 21,98 25,3 32,14 27,92 25,14

Topo IIβ 21,79 14,66 37,94 25,69 17,83

Nivelurile de expresie antigenica ale Topo I, Topo IIɑ si IIβ determinate pe liniile

celulare parentale (MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3, HeLa și SK-OV-3), exprimate fie ca

procente de celule antigen- pozitive (IIF %), fie ca medii ale intensitatilor de fluorescenta

(MFI), sunt reprezentate prin suprapunerea histogramelor în figura 10.

Page 22: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

22

Figura 10. Expresia proteică a Topo I (profil albastu), Topo IIα și (profil roșu), și II β (profil verde),

în celulele liniilor tumorale MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3, HeLa și SK-OV-3

MCF-7 MDA-MB-231 SK-BR-3

MCF-7/A HeLa SK-OV-3

B) Cuantificarea prin citometrie în flux a nivelurilor de expresie proteică ale Topo I, Topo

IIα și IIβ în diversele faze ale ciclului celular

Dubla marcare cu anticorpi monoclonali specifici pentru Topo I, Topo IIα, Topo IIβ/

anticorpi secundari fluorescent și iodura de propidiu a permis cuantificarea nivelului acestor

enzime în diferitele faze ale ciclului celular. Analiza rezultatelor obtinute a evidențiat la toate

liniile celulare parentale luate in studiu expresii antigenice crescute ale celor trei

topoizomeraze in toate fazele ciclului celular, inclusiv în faza G0/G1.

C) Cuantificarea nivelului de expresie proteică al Topo I, Topo IIα și IIβ prin

imunocitochimie

Determinarea expresiei Topo I și izoformelor α și β ale TopoII la nivelul liniilor

celulare prin imunocitochimie s-a realizat pe preparate citospin marcate cu anticorpi primari

specifici după reactivarea epitopului, blocarea peroxidazei endogene și apoi amplificarea

reacției prin incubare cu un anticorp secundar cuplat cu peroxidază. Rezultatele obtinute,

vizualizate prin colorațiile nucleare intens pozitive, au arătat niveluri crescute ale expresiei

antigenice pentru toate cele trei topoizomeraze.

Page 23: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

23

Figura 11. Expresia Topo I (A), Topo IIα (B) și IIβ (C) în celulele MCF-7 si HeLa

A

B

C

A

B

C

In concluzie, analiza rezultatelor obtinute atat prin citometrie în flux, cât și prin

imunocitochimie a evidentiat o expresie ridicată constitutiva a topoizomerazelor in toate liniile

celulare luate in studiu si în toate fazele ciclului celular. Din literatura de specialitate (Baker

1995, Heck 1988, Bai 2016, Campos 2016) se cunoaște faptul că TopoI, si TopoII α si β au

pattern-uri de exprimare diferentiate, fiind reglate prin mecanisme diferite în timpul progresiei

prin fazele ciclului celular.

Nivelurile de exprimare ale TopoI și izoformei β a TopoII nu sunt dependente de fazele

ciclului celular, fiind exprimate indiferent de statusul proliferativ, inclusiv în G0/G1. Topo

IIα, cunoscută ca un marker de proliferare celulară și transformare malignă, este înalt

exprimată în celulele aflate în diviziune (Sandri 1996, Jin 2017). În celulele normale aceasta

izomeraza atinge un maxim în timpul fazelor G2/M și apoi scade semnificativ, după mitoză.

Unele studii au arătat că în celulele tumorale expresia este crescută indiferent de fazele

ciclului celular, fiind prezentă și în G0/G1 (Villman 2002).

Rezultatele noastre arată de asemenea o expresie crescută și pentru Topo II α în toate

liniile tumorale luate în studiu, indiferent de tipul histologic al tumorii din care au fost

imortalizate. Prezența topoizomerazelor în faza G0/G1 poate avea implicații clinice

importante, agenții chimioterapeutici care țintesc topoizomerazele I sau II putând acționa

inclusiv în G0 și astfel influența răspunsul la chimioterapie.

S-a observat ca expresiile proteice ale Topo I, Topo IIα și IIβ sunt crescute în liniile

celulare tumorale parentale (MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3, HeLa și SK-OV-3). În cadrul

Page 24: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

24

fiecarei linii celulare au fost observate unele diferențe intre nivelurile de expresie ale celor trei

topoizomeraze, fără însă să existe o corelație semnificativa intre ele, rezultata din analiza

statistica realizată pentru determinările prin citometrie în flux, urmărind atât procentul de

celule pozitive, cât si valorile MFI.

2) Analiza prin citometrie în flux a expresiei proteice a topoizomerazelor la nivelul

subliniilor cu rezistenta indusa

Nivelurile de exprimare ale Topo I, Topo IIα și Topo IIβ s-au monitorizat pe întreg

parcursul dobândirii caracterului de rezistență, prin tratarea celulelor cu concentrații crescânde

de TPT (intre 3 la 60 nM in functie de linia celulara) timp de 10 luni si analizând periodic prin

citometrie in flux expresia antigenica a celor trei topoizomeraze in subliniile rezistente la TPT

(MCF-7/TR, MDA-MB-231/TR, SK-BR-3/TR, HeLa/TR și SK-OV-3/TR). După 5 luni de la

inițierea inducerii fenotipului rezistent la TPT s-a observat o scădere tranzitorie, marcantă, a

expresiei Topo I, la nivelul subliniilor SK-BR-3/TR și HeLa/TR, si mai diminuata in

subliniile MCF-7/TR si MDA-MB-231/TR. Topo IIα a prezentat mici variații de expresie

antigenica, în timp ce expresia Topo IIβ a înregistrat fluctuații.

Inducerea rezistenței la ADB in liniile celulare luate in studiu s-a realizat prin

tratamente cu concentrații de la 20 la 700 nM, functie de linie, pe o perioada de 10 luni. La

nivelul subliniilor rezistente la ADB (MCF7/AR, MDA-MB-231/AR, SK-BR-3/AR,

HeLa/AR si SK-OV-3/AR) s-a înregistrat rapid o scădere a expresiei Topo IIα după inițierea

inducerii rezistenței, urmată de o tendință de revenire la un nivel mai ridicat, urmata din nou

de o scădere a expresiei. Cea mai marcantă scădere s-a înregistrat la subliniile MCF-7/AR și

SK-BR-3/AR, iar cel mai ridicat nivel de exprimare a proteinei s-a înregistrat la HeLa/AR.

Expresia Topo I a fost în general nemodificată, în timp ce expresia Topo IIβ a înregistrat

fluctuații.

In concluzie, rezultatele obținute prin analiza expresiei proteice, utilizand citometria in

flux, a Topo I, Topo IIα și Topo IIβ pe parcursul inducerii rezistenței la TPT (citostatic

inhibitor al Topo I) și ADB (citostatic inhibitor al Topo II), au arătat o scădere a nivelului

Topo IIα în cursul dobândirii fenotipului de rezistență la ADB, fără să survină și scăderea

nivelului Topo I; in schimb, în celulele cu rezistență la TPT, s-a constatat o scădere a

nivelului Topo I, fără reducerea expresiei proteice a Topo IIα.

Page 25: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

25

3) Evaluarea prin Western Blot a expresiei proteice a topoizomerazelor la nivelul

subliniilor cu rezistenta indusa

Tehnica Western Blot reprezintă tehnica cea mai folosită pentru evaluarea expresiei

proteice a topoizomerazelor. Pentru această determinare, am preparat lizate celulare atat din

liniile celulare parentale, cât și din cele cu rezistență indusa la ADB sau TPT. Separarea

proteinelor s-a facut în gel de poliacrilamidă cu grad de inretelare de 7,5%, pe care apoi le-am

transferat pe membrane de PVDF, ce au fost in continuare tratate cu anticorpi primari specifici

soarece anti-om: clona C-21 anti-TopoI, clone 31 anti-TopoIIα și clone 40 anti-TopoIIβ, iar

apoi cu anticorpul secundar capra anti-soarece cuplat cu peroxidază (BD Biosciences, USA).

Drept control s-a folosit beta actina (MW = 42 kDa). Pentru detecție s-a folosit sistemul de

amplificare prin chemiluminescenta (ECL).

Intensitatea benzilor corespunzătoare maselor moleculare ale celor trei topoizomeraze

(MW = 100 kDa pentru Topo I; MW = 170 kDa pentru Topo IIα, MW = 180 kDa pentru Topo

IIβ) a fost diferită intre liniile parentale, chiar daca proveneau din acelasi tip histologic. Cea

mai înaltă expresie pentru Topo I a fost observată la nivelul liniei MDA-MB-231, iar cea mai

redusă in celulele SK-BR-3 si SK-OV-3. Topo IIα a avut cele mai intense benzi la nivelul

liniilor MDA-MB-231 si HeLa, cel mai redus nivel înregistrandu-se la MCF-7/ SK-BR-3/

SK-OV-3.

Din datele obținute s-a constatat ca intensitatea benzilor corespunzatoare Topo I este

mai redusă in subliniile cu rezistenta indusa la TPT comparativ cu liniile parentale. Analiza

comparativa a nivelurilor Topo I în liniile mentionate a arata că expresia cea mai scăzută este

înregistrată la nivelul subliniei SK-BR-3/TR, iar cea mai crescută in celulele MCF-7/TR. In

ceea ce priveste expresia proteica a Topo IIα si Topo II β, s-au constatat mici variatii.

In subliniile celulare cu rezistenta indusa la ADB, analizand comparativ intensitatea

benzilor corespunzatoare Topo IIα, se observă de asemenea o scadere a intensitații fată de

liniile parentale. Cea mai scăzută intensitate a benzilor s-a înregistrat la SK-BR-3/AR si

MCF-7/AR, intensitatea mai ridicată fiind inregistrată la HeLa/AR si MDA-MB-231/AR.

Topo I a avut in general pattern-uri de expresie asemănătoare liniilor parentale din care au

derivat, in timp ce expresia Topo IIβ a variat.

Rezultatele obținute prin Western Blot sunt în general în concordanță cu datele

obținute din evaluarea expresiei proteice prin citometrie în flux, și sustin ceea ce am constatat

la determinarea expresiei prin această tehnică: prin achiziția fenotipului rezistent la TPT

expresia Topo I scade, fără ca expresia Topo IIα să fie afectată, iar in celulele rezistente la

ADB se inregistrează o scadere a expresiei Topo IIα., fară afectarea expresiei Topo I.

Page 26: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

26

4) Analiza expresiei genice a topoizomerazelor la nivelul liniilor parentale și rezistente la

TPT sau ADB

În scopul identificării prezenței sau absenței expresiei genice a topoizomerazelor in

liniile parentale si cu rezistenta indusa, cDNA-urile celulelor au fost supuse analizei expresiei

genice prin RT-PCR, utilizând metoda Taqman și primeri specifici.

Figura 12. Nivelurile de expresie genica ale topoizomerazelor in liniile celulare cu rezistenta indusa,

raportate la liniile parentale (n-fold)

Rezultatele obținute, reprezentate pe scala logaritmica, demonstrează o expresie genică

diferențiată în liniile celulare cu rezistenta indusa, raportata la linia parentala pentru toate cele

trei topoizomeraze, Topo I, Topo IIα sau Topo IIβ, luate in studiu.

Page 27: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

27

III. Determinarea corelațiilor existente între nivelurile de expresie a topoizomerazelor și

sensibilitatea/ rezistența la ADB sau TPT

Pentru a determina implicarea topoizomerazelor în rezistența la ADB sau TPT am

analizat eventualele corelatii existente intre nivelurile de expresie proteică a fiecarei

topoizomeraze (Topo I, Topo IIα și β), evaluate prin citometrie in flux și exprimate ca

procente de celule pozitive (IIF%) si răspunsul celulelor la tratamentul cu ADB sau TPT,

exprimat prin valorile IC50.

Analiza corelațiilor dntre nivelurile proteice ale Topo I, Topo IIα sau Topo IIβ, și

valorile IC50 pentru cele două citostatice, a demonstrat corelatii inverse, statistic

semnificative, intre valorile IC50 la TPT si nivelul Topo I in liniile cu rezistenta indusa la

TPT, in timp ce in liniile cu rezistenta indusa la ADB, IC50 la ADB s-a corelat cu nivelul

Topo IIα (Fig. 13). Liniile parentale au demostrat acelasi tip de corelatii, atat pentru IC50/

TPT si nivelul Topo I, cat si pentru IC50/ADB si Topo IIα. Existenta corelatiilor inverse intre

concentratiile de citostatice si expresia topoizomerazelor denota de fapt corelatii directe intre

gradul de sensibilitate la tratament si nivelul de expresie proteica a acestor enzime nucleare.

Figura 13. Analiza corelațiilor între expresia topoizomerazelor (IIF%) și valorile IC50,

pe liniile parentale si rezistente laTPT sau ADB

A. B.

6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0

0

5

1 0

1 5

2 0

T o p o I

IC5

0 T

PT

R2

= 0 .7 4 7 6

p = 0 .0 0 1 2

5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

T o p o II a lp h a

IC

50

AD

B

R2

= 0 .7 6 1 8

p = 0 .0 0 0 5

In urma analizei statistice am găsit de asemenea o corelatie a raspunsului la TPT in

liniie parentale si rezistente la ADB si a raspunsului la ADB in liniile parentale si rezistente la

TPT (Fig. 14).

Page 28: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

28

Figura 14. Analiza corelațiilor pentru rezistenta incrucisata, între expresia topoizomerazelor (IIF%) și

valorile IC50, pe liniile parentale si rezistente laTPT sau ADB

A. B.

5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

T o p o II a lp h a

IC5

0 A

DB

R2

= 0 .8 6 1 1

p = 0 .0 0 0 1

Existența corelației între nivelul Topo I și sensibilitatea la TPT sau între nivelul Topo

IIα și sensibilitatea la ADB, plus faptul că în cursul dobândirii fenotipului de rezistență la

ADB scăderea nivelului Topo IIα survine fără să se producă și o diminuare a nivelului Topo I,

iar scăderea nivelului Topo I în celulele cu rezistență la TPT are loc fara diminuarea nivelului

Topo IIα, reprezintă dovezi că aceste enzime sunt implicate în sensibilitatea/ rezistența la

citostaticele care au ținte primare aceste proteine.

Rezultatele obtinute sunt în concordanță cu studii anterioare în care s-a demonstrat că

reducerea nivelului Topo IIα duce la rezistența la ADB (Jarvinen 2000, Houlbrook 1995,

Durbecq 2004) sau reducerea nivelului Topo I determină rezistență la TPT (Zander 2010). Și

în cazul altor inhibitori ai Topo II, de tipul altor antracicline (MacGrogan 2003), sau etoposid,

amsacrină (Matsumoto 2001), dar și inhibitori ai Topo I, cum este irinotecanul (Jandu 2016,

Kumler 2015) s-a arătat că reducerea expresiei topoizomerazelor este asociată cu rezistența.

Explicația cea mai probabilă pentru asocierea dintre nivelul topoizomerazelor și

rezistența la ADB sau TPT ar fi reducerea capacității inhibitorilor de topoizomeraze de a

induce la nivelul ADN-ului rupturi dublu-catenare în urma interacției cu Topo IIα (Cox 2016),

sau rupturi mono-catenare inițial, apoi dublu-catenare, în urma interacției cu Topo I

(Darzynkiewicz 2009), știut fiind faptul că principalul mecanism de acțiune atât al ADB, cât și

al TPT îl reprezintă interacția cu aceste topoizomeraze (Ferreto 2016; Pommier 2009, 2010,

Jain 2017).

Se cunoaște că celulele tumorale care prezintă rezistență la un agent chimioterapeutic

manifestă de regulă rezistență la o serie de alte chimioterapice diferite structural și funcțional

(Ganapathy 2013, Kibria 2014). Multe celule rezistente la ADB prezintă un nivel ridicat de

Page 29: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

29

rezistență încrucișată la chimioterapice care țintesc Topo II, precum mitoxantrona și

etoposidul, fără să prezinte însă rezistență încrucișată la cisplatin, carboplatin și 5-FU

(Forushani 2004). De aceea este necesar sa se stabileasca dacă și în cazul inhibitorilor de Topo

I și Topo II intervine rezistența încrucișată. Astfel, în urma analizei de corelație în ceea ce

privește rezistența încrucișată la TPT a liniilor rezistente la ADB și viceversa, s-a constatat că

rezistența la TPT nu conferă rezistență la ADB. Absența cross-rezistenței între ADB și TPT

are implicații clinice deosebite validând folosirea atât împreună a celor două chimioterapice,

cât și a TPT în linia a doua de tratament după utilizarea în prima linie a ADB, în prezent TPT

este în general folosit în cancerul ovarian, în linia a doua la pacienții cu rezistență la

tratamentul cu săruri de platină și taxani (Klejewski 2017), în cancerul cervical împreună cu

săruri de platină (Robati 2008) și cancerul de plămâni (Brahmer 1998).

Este important să se stabilească/cunoască dacă alterarea nivelului topoizomerazelor

determină rezistența la ADB sau TPT independent de alte mecanisme. Analiza trebuie sa fie

mai amplă, întrucât atât în rezistența la ADB, cât și la TPT sunt implicate mecanisme diferite.

Page 30: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

30

CONCLUZII GENERALE

- Utilizarea sistemului xCELLigence pentru analiza in timp real a proliferarii vs.

citotoxicitatea celulara sub actiunea unor agenti chimioterapeutici anti-topoizomeraze a oferit

avantaje importante comparativ cu metodele clasice, colorimetrice, tip “end-point”. Datele

obținute au permis selecția concentrațiilor de agenti anti-topoizomeraze și perioadele de timp

pentru aplicarea tratamentelor, utile în testele ulterioare tip „end-point” (citometrie in flux,

RT-PCR, WB);

- Analiza comparativa a datelelor obținute in urma testelor de citotoxicitate prin tehnica MTS

a arătat că subliniile MCF-7/AR și MCF-7/TR, MDA-MB-231/AR și MDA-MB-231/TR,

SK-BR3/AR și SK-BR3/TR, HeLa/AR și HeLa/TR, SK-OV-3/AR și SK-OV-3/TR, variante

ale liniilor umane de cancer mamar MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231, cancer ovarian SK-

OV-3 și cancer cervical HeLa obținute prin selecția treptată a celulelor cultivate în mediu cu

concentrații crescânde de ADB sau TPT, sunt sublinii cu rezistenta indusa, fiecare demostrand

un grad de rezistență specific la ADB sau TPT. Rezultatele obtinute au arătat că rezistența la

ADB nu induce rezistență încrucișată la TPT, și viceversa.

- Valorile IC50 obținute prin analiza RTCA au fost comparabile cu valorile obținute în urma

realizării testelor de citotoxicitate clasice, colorimetrice (cu MTS). Astfel, în urma analizei

curbelor de inhibare a proliferarii si calcularea IC50 s-a ales un interval pentru concentrațiile

de lucru in functie de rezistenta constitutiva sau indusa a liniilor celulare luate in studiu.

- Evaluarea evenimentelor apoptotice prin citometrie în flux confirmă fenotipul

chimiorezistent achiziționat în timpul procesului de inducere a rezistenței la citostatice:

subliniile rezistente la ADB sau TPT au o apoptoza redusă la expunerea la citostaticul la care

s-a indus rezistența. Astfel, sensibilitatea la TPT a celulelor ADB-rezistente și viceversa,

sensibilitatea la ADB a celulelor TPT-rezistente, observata anterior la determinarea

citotoxicității prin tehnica MTS, într-o manieră dependentă de concentrație, sunt confirmate și

la evaluarea evenimentelor apoptotice prin citometrie în flux.

- Analiza dinamicii ciclului celular a aratat că între pattern-urile de distribuție la nivelul

subliniilor cu rezistenta indusa și liniilor parentale corespunzătoare a aratat ca in general nu

apar diferențe notabile în cazul rezistenței la ADB sau TPT. Suprapunerea histogramelor ADN

arată o distribuție asemănătoare a nucleilor in fazele ciclului celular in liniile parentale și

subliniile rezistente. Datele sunt în concordanță cu cele din literatura de specialitate cu privire

la scăderea activității proliferative în rezistența la agenții chimioterapeutici.

Page 31: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

31

- Rezultatelor obtinute atat prin citometrie în flux, cât și prin imunocitochimie a evidentiat o

expresie ridicată constitutiva a topoizomerazelor in toate liniile celulare luate in studiu si în

toate fazele ciclului celular.

- Rezultatele obținute prin analiza expresiei proteice, utilizand citometria in flux, a Topo I,

Topo IIα și Topo IIβ pe parcursul inducerii rezistenței la TPT (citostatic inhibitor al Topo I)

sau ADB (citostatic inhibitor al Topo II), au arătat o scădere a nivelului Topo IIα în cursul

dobândirii fenotipului de rezistență la ADB, fără să survină și scăderea nivelului Topo I; in

schimb, în celulele cu rezistență la TPT, s-a constatat o scădere a nivelului Topo I, fără

reducerea expresiei proteice a Topo IIα.

- Rezultatele obținute prin Western Blot sunt în general în concordanță cu datele obținute din

evaluarea expresiei proteice prin citometrie în flux: prin achiziția fenotipului rezistent la TPT

expresia Topo I scade, fără ca expresia Topo IIα să fie afectată, iar in celulele rezistente la

ADB se inregistrează o scadere a expresiei Topo IIα., fară afectarea expresiei Topo I.

- Analiza RT-PCR a demonstrat o expresie genică diferențiată în liniile celulare cu rezistenta

indusa, raportata la linia parentala pentru toate cele trei topoizomeraze, Topo I, Topo IIα sau

Topo IIβ, luate in studiu.

- Analiza corelațiilor dntre nivelurile proteice ale Topo I, Topo IIα sau Topo IIβ, și valorile

IC50 pentru cele două citostatice, a demonstrat corelatii inverse, statistic semnificative, intre

valorile IC50 pentru TPT si nivelul Topo I in liniile cu rezistenta indusa la TPT, in timp ce in

liniile cu rezistenta indusa la ADB, IC50 la ADB s-a corelat cu nivelul Topo IIα.

- Rezultatele prezentate au arătat că scăderea nivelului Topo I sau Topo IIα este suficientă

pentru a determina rezistența la ADB sau TPT în liniile celulare de cancer mamar, cervical sau

ovarian; în cazul inhibitorilor de Topo I (topotecan) și Topo II (adriablastina) nu intervine

rezistența încrucișată.

- O mai bună cunoaștere a mecanismelor moleculare ale rezistenței la chimioterapie ar putea

conduce la identificarea unor markeri moleculari predictivi cu adevarat relevanți pentru

raspunsul la chimioterapie, iar topoizomerazele ar putea juca un rol important in stabilirea

unor strategii inovative, personalizate pentru pacienții cu neoplazii.

Page 32: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

32

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA

1. Bai, Y., Li, L.D., Li,J., Lu,X. (2016) Targeting of topoisomerases for prognosis and

drug resistance in ovarian cancer. Journal of Ovarian Research, 9 (1), 35.

2. Baker, S.D., Wadkins, R.M., Stewart, C.F., Beck, W.T., Danks, M.K. (1995) Cell

Cycle Analysis of Amount and Distribution of Nuclear DNA Topoisomerase I as

Determined by Fluorescence Digital Imaging Microscopy. Wilcy-Liss, 19 (2), 134 –

45.

3. Brahmer, J.R., Ettinger, D.S. (1998) The Role of Topotecan in the Treatment of Small

Cell Lung Cancer. The Oncologist, 3 (1), 11 – 14.

4. Campos-Nebel, M., Palmitelli, M., Gonzalez-Cid, M. (2016) A Flow Cytometry-Based

Method for a High-Throughput Analysis of Drug-Stabilized Topoisomerase II

Cleavage Complexes in Human Cells. Cytometry, 89 (9), 852 - 860.

5. Cox, J., Weinman, S. (2016) Mechanisms of doxorubicin resistance in hepatocellular

carcinoma. Hepat Oncol., 3 (1), 57 – 59.

6. Darzynkiewicz, Z., Halicka, D.H., Tanaka T. (2009) Cytometric Assessment of DNA

Damage Induced by DNA Topoisomerase Inhibitors. Methods Mol Biol., 582, 145 -

53.

7. Durbecq, V., Paesmans, M., Cardoso, F., Desmedt, C., Di Leo, A., Chan, S.,

Friedrichs, K., Pinter, T., Van Belle, S., Murray, E., Bodrogi, I., Walpole, E.,

Lesperance, B., Korec, S., Crown, J., Simmonds, P., Perren, T.J., Leroy, J.Y., Rouas,

G., Sotiriou, C., Piccart, M., Larsimont, D. (2004) Topoisomerase-IIA expression as a

predictive marker in a population of advanced breast cancer patients randomly treated

either with single-agent doxorubicin orsingle-agent docetaxel. Mol Cancer Ther, 3

(10), 1207 – 14.

8. Ferreto, N.P., Calaf, G.M. (2016) Influence of doxorubicin on apoptosis and oxidative

stress in breast cancer cell lines. International journal of oncology, 49, 753 - 762

9. Fodale, V., Pierobon, M., Liotta, L., Petricoin, E. (2011) Mechanism of Cell

Adaptation:When and How Do Cancer Cells Develop Chemoresistance? Cancer J., 17

(2), 89 – 95.

10. Forterre, P., Gadelle, D. (2009) Phylogenomics of DNA topoisomerases: their origin

and putative roles in the emergence of modern organisms. Nucleic Acids Research, 37

(3), 679 – 692.

11. Forushani, A.E., Azizi, E., Zeinali, S., Naser, Ostad, S.N. (2004) Cross-resistance to

Vincristin and Etoposide in a sub line of the human breast cancer T47D cells selected

for Adriamycin-resistance. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2: 103 – 107.

12. Friche, E., Danks, M.K., Schmidt, C.A., Beck, W.T. (1991) Decreased DNA

Topoisomerase II in Daunorubicin-resistant Ehrlich Ascites Tumor Cells. Cancer

Research, 51, 4211 – 4218.

13. Ganapathi, R.N., Ganapathi, M.K. (2013) Mechanisms regulating resistance to

inhibitors of topoisomerase II. Frontier in Pharmacology, 4, 89.

14. Giovannetti, E., Mey, V., Danesi, R., Basolo, F., Barachini, S., Deri, M., Tacca, M.D.

(2005) Interaction between gemcitabine and topotecan in human non-small-cell lung

cancer cells: effects on cell survival, cell cycle and pharmacogenetic profile. British

Journal of Cancer, 92, 681 – 689.

15. Heck, M.M.S., Hittelmant, W.N., Earnshaw, W.C. (1988) Cell Biology differential

expression of DNA topoisomerases I and II during the eukaryotic cell cycle. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 85 (4), 1086 – 1090.

16. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D.B., Johnston, P.G. (2013) Cancer drug

resistance: an evolving Paradigm. Nature Reviews Cancer, 13 (10), 714 - 26.

Page 33: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

33

17. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D.B., Johnston, P.G. (2013) Cancer drug

resistance: an evolving Paradigm. Nature Reviews | Cancer, 13 (10), 714 - 26.

18. Houlbrook ,S., Addison, CM., Davies, SL., Carmichaell, J., Stratford, IJ., Harris, AL.,

Hickson, I.D. (1995) Relationship between expression of topoisomerase II isoforms

and intrinsic sensitivity to topoisomerase II inhibitors in breast cancer cell lines.

British Journal of Cancer, 72 (6), 1454 – 1461.

19. Jain, C.K., Majumder, H.K., Roychoudhury, S. ( 2017) Natural Compounds as

Anticancer Agents Targeting DNA Topoisomerases. Current Genomics, 18 (1), 75 –

92.

20. Jandu, H.J., Aluzaite, K., Fogh, L., Thrane, S.W., Noer, J.B., Prosze, J.K., Do, N.,

Hansen, S.N., Damsgaard, B., Nielsen, S.L., Stougaard, M., Knudsen, B.R., Moreira,

J., Hamerlik, P., Gajjar, M., , Smid, M., Martens, J., Foekens, J., Pommier, Y.,

Brünner, N., Schrohl, A.-S. ,Stenvang, J. (2016) Molecular characterization of

irinotecan (SN-38) resistant human breast cancer cell lines. BMC Cancer, 16, 34.

21. Januchowski, R., Wojtowicz, K., Kordowska, P.S., Andrzejewska, M., Zabel, M.

(2013) MDR Gene Expression Analysis of Six Drug-Resistant Ovarian Cancer Cell

Lines. Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International, 241763

22. Jarvinen, T.A.H., Tanner, M., Rantanen, V., Barlund, M., Borg, Å., Grenman, S.,

Isola, J., (2000) Amplification and Deletion of Topoisomerase IIa Associate with

ErbB-2 Amplification and Affect Sensitivity to Topoisomerase II Inhibitor

Doxorubicin in Breast Cancer. American Journal of Pathology, 156 (3), 839 – 847.

23. Jin Mo Ku, Kim, S.R., Hong, S.H., Choi, H.S., Seo, H.S., Shin Y.G., Ko., S.G.

(2015)Cucurbitacin D induces cell cycle arrest and apoptosis by inhibiting STAT3 and

NF-jB signaling in doxorubicin-resistant human breast carcinoma (MCF7/ADR) cells.

Mol Cell Biochem, 409, 33 – 43

24. Jin, J., Zheng, D., Liu, Y. (2017) Correlation between the Expression of Topo Iiα and

Ki67 in Breast Cancer and its clinical Pathological characteristics. Pak J Med Sci, 33

(4), 844 - 848

25. Kar, I., Majumder, H.K., Chattopadhyaya, R. (2017) Extracts of Seven Indian Plants

Inhibit Human Topoisomerase I and Partially Inhibit Human Topoisomerase II.

iMedPub Journalsug 3 (1-1), 1 - 8.

26. Ke, X., Shen, L. (2017) Molecular targeted therapy of cancer: The progress and future

prospect. Frontiers in Laboratory Medicine, 1 (2), 69 – 75.

27. Kellner, U., Sehested, M., Jensen, P.B., Gieseler, F., Rudolph, P. (2002) Culprit and

victim – DNA topoisomerase II. The Lancet Oncology, 3 (4), 235 – 43.

28. Kibria, G., Hatakeyama, H., Akiyama, K., Hida, K., Harashima, H. (2014)

Comparative Study of the Sensitivities of Cancer Cells to Doxorubicin, and

Relationships between the Effect of the Drug-Efflux Pump P-gp. Biol. Pharm. Bull.,

37 (12), 1926 – 1935.

29. Klejewski, A., Świerczewska,M., Zaorska, K., Brązert, M., Nowicki, M., Zabel, M.,

Januchowski, R. (2017) New and Old Genes Associated with Topotecan Resistance

Development in Ovarian Cancer Cell Lines. Anticancer Research, 37, 1625-1636.

30. Kruczynski, A., Barret, J.M., Hille, B., Chansard, N., Astruc, J., Menon, Y., Duchier,

C., Cre´ancier, L., Hill., B.T. (2004) Decreased Nucleotide Excision Repair Activity

and Alterations of Topoisomerase II_ Are Associated with the in Vivo Resistance of a

P388 Leukemia Subline to F11782, a Novel Catalytic Inhibitor of Topoisomerases I

and II. Clinical Cancer Research, 10 (9), 3156 – 3168.

31. Lee, J.H., Wendorff, .J., Berger, J.M. (2017) Resveratrol: a novel type of

topoisomerase II inhibitor. JBC Papers in Press., 292 (51), 21011 – 21022.

32. Lee, K.C., Bramley, R.L., Cowell, I.G., Jackso , G.H., Austin, C.A. (2016)

Proteasomal inhibition potentiates drugs targeting DNA topoisomerase II. Biochemical

Pharmacology, 103, 29 – 39.

Page 34: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

34

33. Lukyanova, N.Y., Rusetskya, N.V., Tregubova, N.A., Chekhun, V.F. (2009)

Molecular profile and cell cycle in mcf-7 cells resistant to cisplatin and doxorubicin.

Exp Oncol 2009, 31 (2), 87 – 91

34. MacGrogan, G., Rudolph, P., Mascarel, I., Mauriac, L., Durand, M., Avril, A.,

Dilhuydy, J.M., Robert, J., Mathoulin-Pelissier, S., Picot, V., Floquet, A.,

Sierankowski, G., Coindre, J.M. (2003) DNA topoisomerase IIa expression and the

response to primary chemotherapy in breast cancer. British Journal of Cancer, 89 (4),

666 – 671.

35. Matsumoto, Y., Takano, H., Fojo, T. (1997) Cellular Adaptation to Drug Exposure:

Evolution of the Drug-resistant Phenotype. Cancer Research, 57 (22), 5086 – 5092.

36. Matsumoto, Y., Takano, H., Kunishio, K., Nagao, S., Fojo, T. (2001)

Hypophosphorylation of Topoisomerase II in Etoposide (VP-16)-resistant Human

Carcinoma Cell Lines Associated with Carboxy-terminal Truncation. Jpn. J. Cancer

Res., 92 (7), 799 – 805.

37. Monti, E. (2007) Molecular Determinants of Intrinsic Multidrug Resistance in Cancer

Cells and Tumors. Cancer Drug Resistance, 14, 241 – 260.

38. Nielsen, D.L. (2004) Mechanisms and functional aspects of multidrug resistance in

Ehrlich ascites tumour cells. Danish Medical Bulletin, 51, 393 – 414.

39. Nitiss, J.L. (2009) DNA topoisomerase II and its growing repertoire of biological

Functions. Nat Rev Cancer, 9 (5), 327 – 337.

40. Nitiss, J.L. (2009) Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nat Rev

Cancer, 9 (5), 338 – 350.

41. Nitiss, J.L., Liu, Y.-X., Harbury, P., Jannatipour, M., Wasserman, R., Wang, J.C.

(1992) Amsacrine and Etoposide Hypersensitivity of Yeast Cells Overexpressing DNA

Topoisomerase II. Cancer Research, 52 (16), 4467 – 4472.

42. Patel, A.G., Flatten, K.S., Peterson, K.L., Beito, T.G., Schneider, P.A., Perkins, A.L.,

Harki, D.A., Kaufmann, S.H. (2016) Immunodetection of human topoisomerase I-

DNA covalent complexes. Nucleic Acids Research, 44 (6), 2816 – 2826.

43. Patel, S., Keller, B.A., Fisher, L.M. (2000) Mutations at Arg486 and Glu571 in Human

Topoisomerase IIa Confer Resistance to Amsacrine: Relevance for Antitumor Drug

Resistance in Human Cells. Molecular Pharmacology, 57 (4), 784 – 791.

44. Plo, I., Hernandez, H., Kohlhagen, G., Lautier, D., Pommier, Y., Laurent, G. (2002)

Overexpression of the Atypical Protein Kinase C - Reduces Topoisomerase II

Catalytic Activity, Cleavable Complexes Formation, and Drug-induced Cytotoxicity in

Monocytic U937 Leukemia Cells. The Journal of Biological Chemistry, 277 (35),

31407 – 31415.

45. Plo, I., Hernandez, H., Kohlhagen, G., Lautier, D., Pommier, Y., Laurent, G. (2002)

Overexpression of the Atypical Protein Kinase C - Reduces Topoisomerase II

Catalytic Activity, Cleavable Complexes Formation, and Drug-induced Cytotoxicity in

Monocytic U937 Leukemia Cells. The Journal of Biological Chemistry, 277 (35),

31407 – 31415.

46. Pommier, Y. (2009) DNA Topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, Biology and

Interfacial Inhibition. Chem Rev., 109 (7), 2894 – 2902.

47. Pommier, Y., Leo, E., Zhang, H.L., Marchand, C. (2010) DNA Topoisomerases and

Their Poisoning by Anticancer and Antibacterial Drugs. Chemistry & Biology, 17 (5),

421 – 33.

48. Potter, A.J., Gollahon, K.A., Palanca, B.J.A., Hartbert, M.J., Choi, Y.M., Moskovitz,

A.H., Potter, J.D., Rabinovitch, P.S. (2002) Flow cytometric analysis of the cell cycle

phase specificity of DNA damage induced by radiation, hydrogen peroxide and

doxorubicin. Carcinogenesis, 23 (3), 389 -401.

49. Qi, J., McTigue, M.A., Rogers, A., Lifshits, E., Christensen, J.G., Janne, P.A.,

Engelman, J.A. (2011) Multiple Mutations and Bypass Mechanisms Can Contribute to

Page 35: Implicarea topoizomerazelor în rezistența celulelor ... romana... · temporari în ciclul catalitic normal al enzimei. Complexele ternare Topo-ADN-agent chimioterapeutic formate,

35

Development of Acquired Resistance to MET Inhibitors. Cancer Research, 71 (3),

1081 – 91.

50. Robati, M., Holtz, D., Dunton, C.J. (2008) A review of topotecan in combination

chemotherapy for advanced cervical cancer. Therapeutics and Clinical Risk

Management, 4 (1), 213 – 218.

51. Sakasai, R., Iwabuchi, K. (2016) The distinctive cellular responses to DNA strand

breaks caused by a DNA topoisomerase I poison in conjunction with DNA replication

and RNA transcription. Genes Genet. Syst., 90 (4), 187 – 194.

52. Sandri, M., Hochhauser, D., Ayton, P., Camplejohn, R.C., Whitehouse, R., Turley, H.,

Gatter ,K., Hickson, I.D. and Harris, A.L. (1996) Differential expression of the

topoisomerase lla and fi genes in human breast cancers. Itih Joum, d Cmcer, 73 (12),

1518 – 1524.

53. Schaefer-Klein, J.L., Murphy, S.J., Johnson, S.H., Vasmatzis, G., Kovtun, I.V. (2015)

Topoisomerase 2 Alpha Cooperates with Androgen Receptor to Contribute to Prostate

Cancer Progression. PLOS ONE, 10 (11), e0142327.

54. Tanaka, S., Aizawa, K., Katayanagi, N., Tanaka, O. (1994) Flow Cytometric Analysis

of early steps in development of Adriamycin Resistance in a human Gastric cancer

Cell Line. Jpn. J. Cancer Res., 85, 86-92.

55. Vanhoefer, U., Müller, M.R., Hilger, R.A., Lindtner, B., Klaassen, U., Schleucher, N.,

Rustum, Y.M., Seeber, S., Harstrick, A. (1999) Reversal of MDR1-associated

resistance to topotecan by PAK-200S, a new dihydropyridine analogue, in human

cancer cell lines. British Journal of Cancer, 81(8), 1304 – 1310

56. Villman, K., Stahl, E., Liljegren, G., Tidefelt, U., Karlsson, M.G. 2002 Topoisomerase

II- Expression in Different Cell Cycle Phases in Fresh Human Breast Carcinomas.

Mod Pathol 15 (5), 486 – 491.

57. Zander, S.A.L., Kersbergen, A., Van der Burg, E., Water, N., Van Tellingen, O.,

Gunnarsdottir, S., Jaspers, J.E., Pajic, M., Nygren, A.O.H., Jonkers, J., Borst, P.,

Rottenberg, S. (2010) Sensitivity and Acquired Resistance of BRCA1;p53-Deficient

Mouse Mammary Tumors to the Topoisomerase I Inhibitor Topotecan. Cancer

Research, 70 (4), 1700 – 10.


Recommended