BIOSENZORI
Istoric
• primul electrod – electrod de oxigen� Clark şi Lyons, 1962�folosind detectarea electrochimica
• Conceptul de biosenzor, a fost lansatpentru prima dată sub denumirea de“electrod enzimatic” de către Updikeşi Hicks (1967)
• Senzor fizic
– detectează sau măsoară proprietaţi fizice
– înregistrează, indică sau răspunde la aceste proprietăţi.
• Senzor chimic
– transformă informaţia chimică, (concentraţia unui analitspecific până la analiza completă a compoziţiei unei probe)într-un semnal analitic.
– Sunt constituiţi din două componente, conectate în serie: unsistem chimic (molecular) de recunoaştere şi un traductor
fizico-chimic.
TRADUCTOR
MEDIUL DE ANALIZA
Semnal electric sau optic
STRAT SENSIBIL
Recunoastere moleculara
Semnal biochimic
SCHEMA GENERALA
S
P
ANALIT
BIORECEPTOR
TRADUCTOR
AMPLIFICATOR DE SEMNAL
• elemente cu activitate biologica(enzime, anticorpi, acizi nucleici, tesuturi, celule,
microorganisme)
• traductori fizico-chimici (optici, electrochimici, termici, piezoelectrici sau magnetici)
• Semnalul traductorului este proportional cu
concentratia analitului
Biosenzor
Reprezentarea schematică şi principiul de funcţionare
Biosenzorii prezinta un deosebit interes pentrulumea ştiinţifică
•sunt capabili să detecteze analitul de interesîntr-o matrice naturală, fără o separareanterioară, în mod continuu, selectiv şireversibil
•prin componenta biologică, ii conferă oselectivitate superioară, comparativ cu metodelemicrobiologice (informaţii calitative despreprocesul fizico-chimic, neputând determinacantitativ analitul sau analiţii din proba de lucru)
Generaţii de biosenzori• Prima generaţie de biosenzori
produsul de reacţie necesită difuziune pânăla nivelul traductorului pentru a genera impulsulelectric;
· A doua generaţie de biosenzoriimplică mediatori specifici, care fac legătură
între produsul de reacţie şi traductor, pentru agenera răspuns;
• A treia generaţie de biosenzori
reacţia insăşi generează răspuns, fără a mainecesita difuziunea produsului sau amediatorului până la traductor.
• În comparaţie cu tehnicile clasice de analiză (cromatografia, spectroscopia), biosenzorii permit detecţia rapidă, sensibilă şi selectivă a analitului şi reprezintă o alternativă la tehnicile clasice de analiză care, deşi sunt sensibile şi precise, sunt costisitoare şi nu permit analize în timp real şi direct, la faţa locului (Suzuki, 2000).
• Performanţele analitice ale biosenzoruluidepind de natura bioreceptorului, detraductorul folosit, dar şi de capacitateaacestuia de a transforma semnalul biologicîn semnal fizic, care poate fi ulteriormăsurat şi cuantificat.
Caracteristicile unui biosenzor
1. Bioreceptorul trebuie să fie specific pentru scopulanalizei, să fie stabil în condiţii normale depăstrare şi, exceptând cazul benzilor enzimaticecolorimetrice, să aibă o bună stabilitate la un numărmare de analize (de ex. mai mult de 100).
2. Reacţia trebuie să fie independentă de parametrifizici precum viteza de agitare, pH şi temperatură.Aceasta ar permite analiza mostrei cu un minim deprelucrare. Dacă reacţia ar necesita cofactori saucoenzime, acestea ar trebui imobilizate la rândul lor,alături de enzimă.
Caracteristicile unui biosenzor
3. Răspunsul trebuie să fie rapid, precis,reproductibil şi în domeniul liniar de interesanalitic, fără a fi necesară diluarea sau concentrareaprobei.
4. Dacă biosenzorul este folosit pentru monitorizareclinică invazivă, proba trebuie să fie mică şibiocompatibilă, fără să aibă efecte toxice sauantigenice. Trebuie să fie steril. Sterilizarea se faceprin autoclavare, de preferinţa, dar nici o enzima nueste capabilă să reziste la căldura umedă atratamentului.
5. Biosenzorul trebuie să fie ieftin, mic, portabil şi săpoată fi folosit de către personal semi-calificat.
6. Suprafaţa biosenzorului să nu fie supusă
fenomenului de pasivare în timp.
7. Biosenzorul trebuie să permită miniaturizarea şi să
poată fi integrat în aparate portabile de analiză.
8. Biosenzorul trebuie să permită analiza continuă,
direct pe teren dar la un preţ de cost mic.
Caracteristicile unui biosenzor
Clasificarea biosenzorilor
• Biosenzori calorimetrici
• Biosenzori potentiometrici
• Biosenzori amperometrici
• Biosenzori optici
• Biosenzori piezoelectrici
• Imunosenzori
Biosenzori calorimetrici
• Biosenzorii calorimetrici au fost utilizaţi pentrudeterminarea glicemiei (Harborn şi col. 1997) şiureei din ser (Bjarnason şi col. 1998).
• Ramanathan şi colab. au contribuit la dezvoltareaaplicaţiilor biosenzorilor termici pentrumonitorizarea bioproceselor (1999) şi au formulatprincipii şi aplicaţii ale senzorilor termici (2001).
Biosenzori calorimetrici
• Multiple reacţii, catalizate enzimatic, suntexogene � poate fi folosit ca bază pentrumăsurarea vitezei reacţiei şi pentrudeterminarea concentraţiei analitului.
• Este unul din cele mai folosite tipuri debiosenzori.
Entalpia molară a reacţiilor catalizate enzimatic
Reactant Enzimă Entalpia
-∆H (kJ mol-1)Colesterol Colesterol oxidază 53
Esteri Chimotripsină 4 - 16
Glucoză Glucozoxidază 80
Apă oxigenată Catalază 100
Penicilina G Penicilinază 67
Peptide Tripsină 10 - 30
Amidon Amilază 8
Sucroză Invertază 20
Uree Urează 61
Acid uric Uricază 49
Biosenzori potentiometrici• folosesc electrozi selectivi pentru ioni, pentru a
traduce reacţia biologică în răspuns electric
• sunt constituiţi dintr-o membrană subţire, de sticlă,
pe care este imobilizată enzima, care delimitează
proba de un pH-metru, unde reacţia catalizată,
produce sau absoarbe ioni de hidrogen
• Reacţia se desfăşoară în apropierea membranei de
sticlă, şi produce o modificare a pH-ului.
Biosenzori
potentiometrici
• Membrana semipermeabilă (a)înconjuară biocatalitul (b)imobilizat în apropiereamembranei de sticlă (c) asenzorului de pH (d).
• Potenţialul electric (e) estegenerat între electrodul intern, deAg/AgCl (f) scufundat în soluţiede HCl diluat, (g) şi un electrodextern, de referinţă (h).
• 1. Electrozi din sticlă pentru cationi în care elementul deanaliză este reprezentat de o membrană de sticlă, foarte subţire,care generează un potenţial electric transvers, datorită competiţieidependente de concentraţie dintre cationi pentru situsuri specificede legare. Selectivitatea acestei membrane este determinata decompoziţia sticlei. Sensibilitatea pentru H+ este mai mare decâtpentru NH4
+.
• 2. Electrozi din sticlă pentru pH acoperiţi cu o membranăpermeabilă pentru gaze, selectivă pentru CO2, NH3 sau H2S.Difuzia gazelor prin această membrană determină modificareapH-ului în soluţia dintre membrană şi electrod care este, apoi,calculată.
• 3. Electrozi în stare solidă, unde membrana de sticla esteinlocuită de o membrană subţire dintr-un conductor pentru ioni,alcatuită dintr-un amestec dintre sulfura de argint şi clorura deargint.
MECANISME DE FUNCTIONARE
Funcţionarea biosenzorilor enzimatici are la baza douatipuri de mecanisme:
- Direct - transformarea catalitica a unui substratintr-un produs de reactie care poate fi detectat la suprafaţa traductorului fizic
- Indirect - prin detectia unui produs care inhiba sau activeaza enzima.
ELECTROD ENZIMATIC
• Conceptul de biosenzor, a fost lansat pentru
prima dată sub denumirea de “electrod
enzimatic” de către Updike şi Hicks (1967) şi
s-a dezvoltat în ultimii 30 de ani datorită
multiplelor aplicaţii în diverse domenii.
CARACTERISTICI
• COST SCAZUT
• PORTABIL
• UNICA FOLOSINTA
• REPRODUCTIBILITATE
• USURINTA DE MANUIRE
• PERSONAL CU CALIFICARE MEDIE
• DETECTIE RAPIDA
APLICATII
• analizele clinice,
• controlul medicamentelor,
• industria agroalimentară,
• monitorizarea poluanţilor din mediu(apa freatică, aer, sol).
Determinarea glucozei din sange
PESTICIDE
Pesticide PLAMANICIRCULATIASANGUINA
PIELE
TRACTDIGESTIV
depozitare
biotransformare
eliminare
renala
tegumentara
respiratorieaerexpirat
depozitatin alveole
orala
hepatobiliara
urina
Intoxicatia cu pesticide
- sindrom muscarinic
diminuarea acuităţii vizuale, tulburări de acomodare, lăcrimare, hipersecreţie bronşică, bronhospasm, laringospasm, transpiraţii abundente, vărsături, diaree, colici abdominale, bradicardie, colaps
- sindrom nicotinic
astenie generală, slăbiciune musculară, fibrilaţii şicrampe musculare, faze avansate de paraliziimusculare
• Afectarea SNC
Insecticide organofosforice si carbamice
Colinesteraze
Fungicide ditiocarbamice
Aldehid dehidrogenaza
FenoliTirozinaza
Ioni ai metalelor grele
Ureaza
Glucozoxidaza
Toxine bacteriene Colinesteraze
Proteinfosfataza
Insecticide organofosforice si carbamice
Colinesteraze
Toxine bacteriene Colinesteraze
Proteinfosfataza
Structure of Structure of acetylcholinesteraseacetylcholinesterase
Acetylcholinesterase structure
STRATEGIE
Hipersensibilitate
Enzime - modificate genetic - sintetice
StabilitateEncapsulare Metoda sol-gel Metoda prin afinitate
Inhibitie enzimatica Screen printare
Inhibitie enzimatica Screen printare
STRATEGIE
University of Perpignan, BIOMEM, Franta
TRADUCTORUL
Element de masura
Element de referinta Ag/AgCl
Element auxiliar
StabilitateEncapsulare Metoda sol-gel Metoda prin afinitate
STRATEGIE
Hipersensibilitate
Enzime - modificate genetic - sintetice
STRATEGIE
Detectia insecticidelor carbamice si organofosforice
SURSE DE ENZIME
�Electric Eel
�Bovine erythrocytes
�Torpedo californica
�Drosophila melanogaster (Dm)
PESTICIDE
� Carbamice
� Organofosforice
• Celula de lucru
• Masurarea curentuluielectric generat deprocesul deoxidoreducere al unorspecii electrochimicactive, cand selucreaza la un potentialconstant
Analiza amperometrica
Principiul determinarii
Determinarea amperometrica a tiocolinei, produsa in urma hidrolizei enzimatice a substratului ATCh
+ R-COO- + H+Cl-
(CH3)3N+-CH2-CH2-SH
tiocolina
(CH3)3N+-CH2-CH2-S-CO-CH3
Cl-
acetiltiocolinaH2O
AChE
Rezultate experimentale
semnal
timp
inhibitie enzimatica
inaintea inhibitiei enzimatice
Iinitial
Idupa inhibitie
Teste de reactivare
(reactivata)
activaenzimareactivator
fosforilataenzima
EI + R EIR E + RI
C. Extractia pesticidelor din diverse matrice, folosind
repartitia lichid-lichid
Extractul in diclormetan, analizat la lungimea de unda 271nm
-Pentru probele de suc, in absenta contaminarii cu metil
paraoxon, s-a obtinut un pic la un timp de retentie nespecific
metil paraoxonului (1,75 minute), � alt compus extras din
matricea complexa a sucului analizat.
-Pentru timpul de retentie corespunzator metil paraoxonului
nu a aparut semnal in urma separarii cromatografice.
C. Extractia pesticidelor din diverse matrice, folosind
repartitia lichid-lichid
•s-a imbunatatit gradul de extractie al metil paraoxonului fata de cazul
testat anterior al extractiei in hexan.
•un dezavantaj al extractiei ar putea fi faptul ca acest solvent extrage si alti
compusi din matricele reale complexe, care ar putea sa explice unele
rezultate fals pozitive sau fals negative obtinute prin alte analize.
Traductori electrochimici
�manuire usoara,
� compatibilitate cu echipamente comerciale
standard,
�posibilitatea de miniaturizare,
�masurare automatizata.
Imunosenzori
- interactie Ag- Ac
SCHEMA GENERALA
S
P
ANALIT
BIORECEPTOR
TRADUCTOR
AMPLIFICATOR DE SEMNAL