BIOSENZORI

Istoric

• primul electrod – electrod de oxigen� Clark şi Lyons, 1962�folosind detectarea electrochimica

• Conceptul de biosenzor, a fost lansatpentru prima dată sub denumirea de“electrod enzimatic” de către Updikeşi Hicks (1967)

• Senzor fizic

– detectează sau măsoară proprietaţi fizice

– înregistrează, indică sau răspunde la aceste proprietăţi.

• Senzor chimic

– transformă informaţia chimică, (concentraţia unui analitspecific până la analiza completă a compoziţiei unei probe)într-un semnal analitic.

– Sunt constituiţi din două componente, conectate în serie: unsistem chimic (molecular) de recunoaştere şi un traductor

fizico-chimic.

TRADUCTOR

MEDIUL DE ANALIZA

Semnal electric sau optic

STRAT SENSIBIL

Recunoastere moleculara

Semnal biochimic

SCHEMA GENERALA

S

P

ANALIT

BIORECEPTOR

TRADUCTOR

AMPLIFICATOR DE SEMNAL

• elemente cu activitate biologica(enzime, anticorpi, acizi nucleici, tesuturi, celule,

microorganisme)

• traductori fizico-chimici (optici, electrochimici, termici, piezoelectrici sau magnetici)

• Semnalul traductorului este proportional cu

concentratia analitului

Biosenzor

Reprezentarea schematică şi principiul de funcţionare

Biosenzorii prezinta un deosebit interes pentrulumea ştiinţifică

•sunt capabili să detecteze analitul de interesîntr-o matrice naturală, fără o separareanterioară, în mod continuu, selectiv şireversibil

•prin componenta biologică, ii conferă oselectivitate superioară, comparativ cu metodelemicrobiologice (informaţii calitative despreprocesul fizico-chimic, neputând determinacantitativ analitul sau analiţii din proba de lucru)

Generaţii de biosenzori• Prima generaţie de biosenzori

produsul de reacţie necesită difuziune pânăla nivelul traductorului pentru a genera impulsulelectric;

· A doua generaţie de biosenzoriimplică mediatori specifici, care fac legătură

între produsul de reacţie şi traductor, pentru agenera răspuns;

• A treia generaţie de biosenzori

reacţia insăşi generează răspuns, fără a mainecesita difuziunea produsului sau amediatorului până la traductor.

• În comparaţie cu tehnicile clasice de analiză (cromatografia, spectroscopia), biosenzorii permit detecţia rapidă, sensibilă şi selectivă a analitului şi reprezintă o alternativă la tehnicile clasice de analiză care, deşi sunt sensibile şi precise, sunt costisitoare şi nu permit analize în timp real şi direct, la faţa locului (Suzuki, 2000).

• Performanţele analitice ale biosenzoruluidepind de natura bioreceptorului, detraductorul folosit, dar şi de capacitateaacestuia de a transforma semnalul biologicîn semnal fizic, care poate fi ulteriormăsurat şi cuantificat.

Caracteristicile unui biosenzor

1. Bioreceptorul trebuie să fie specific pentru scopulanalizei, să fie stabil în condiţii normale depăstrare şi, exceptând cazul benzilor enzimaticecolorimetrice, să aibă o bună stabilitate la un numărmare de analize (de ex. mai mult de 100).

2. Reacţia trebuie să fie independentă de parametrifizici precum viteza de agitare, pH şi temperatură.Aceasta ar permite analiza mostrei cu un minim deprelucrare. Dacă reacţia ar necesita cofactori saucoenzime, acestea ar trebui imobilizate la rândul lor,alături de enzimă.

Caracteristicile unui biosenzor

3. Răspunsul trebuie să fie rapid, precis,reproductibil şi în domeniul liniar de interesanalitic, fără a fi necesară diluarea sau concentrareaprobei.

4. Dacă biosenzorul este folosit pentru monitorizareclinică invazivă, proba trebuie să fie mică şibiocompatibilă, fără să aibă efecte toxice sauantigenice. Trebuie să fie steril. Sterilizarea se faceprin autoclavare, de preferinţa, dar nici o enzima nueste capabilă să reziste la căldura umedă atratamentului.

5. Biosenzorul trebuie să fie ieftin, mic, portabil şi săpoată fi folosit de către personal semi-calificat.

6. Suprafaţa biosenzorului să nu fie supusă

fenomenului de pasivare în timp.

7. Biosenzorul trebuie să permită miniaturizarea şi să

poată fi integrat în aparate portabile de analiză.

8. Biosenzorul trebuie să permită analiza continuă,

direct pe teren dar la un preţ de cost mic.

Caracteristicile unui biosenzor

Clasificarea biosenzorilor

• Biosenzori calorimetrici

• Biosenzori potentiometrici

• Biosenzori amperometrici

• Biosenzori optici

• Biosenzori piezoelectrici

• Imunosenzori

Biosenzori calorimetrici

• Biosenzorii calorimetrici au fost utilizaţi pentrudeterminarea glicemiei (Harborn şi col. 1997) şiureei din ser (Bjarnason şi col. 1998).

• Ramanathan şi colab. au contribuit la dezvoltareaaplicaţiilor biosenzorilor termici pentrumonitorizarea bioproceselor (1999) şi au formulatprincipii şi aplicaţii ale senzorilor termici (2001).

Biosenzori calorimetrici

• Multiple reacţii, catalizate enzimatic, suntexogene � poate fi folosit ca bază pentrumăsurarea vitezei reacţiei şi pentrudeterminarea concentraţiei analitului.

• Este unul din cele mai folosite tipuri debiosenzori.

Entalpia molară a reacţiilor catalizate enzimatic

Reactant Enzimă Entalpia

-∆H (kJ mol-1)Colesterol Colesterol oxidază 53

Esteri Chimotripsină 4 - 16

Glucoză Glucozoxidază 80

Apă oxigenată Catalază 100

Penicilina G Penicilinază 67

Peptide Tripsină 10 - 30

Amidon Amilază 8

Sucroză Invertază 20

Uree Urează 61

Acid uric Uricază 49

Biosenzori potentiometrici• folosesc electrozi selectivi pentru ioni, pentru a

traduce reacţia biologică în răspuns electric

• sunt constituiţi dintr-o membrană subţire, de sticlă,

pe care este imobilizată enzima, care delimitează

proba de un pH-metru, unde reacţia catalizată,

produce sau absoarbe ioni de hidrogen

• Reacţia se desfăşoară în apropierea membranei de

sticlă, şi produce o modificare a pH-ului.

Biosenzori

potentiometrici

• Membrana semipermeabilă (a)înconjuară biocatalitul (b)imobilizat în apropiereamembranei de sticlă (c) asenzorului de pH (d).

• Potenţialul electric (e) estegenerat între electrodul intern, deAg/AgCl (f) scufundat în soluţiede HCl diluat, (g) şi un electrodextern, de referinţă (h).

• 1. Electrozi din sticlă pentru cationi în care elementul deanaliză este reprezentat de o membrană de sticlă, foarte subţire,care generează un potenţial electric transvers, datorită competiţieidependente de concentraţie dintre cationi pentru situsuri specificede legare. Selectivitatea acestei membrane este determinata decompoziţia sticlei. Sensibilitatea pentru H+ este mai mare decâtpentru NH4

+.

• 2. Electrozi din sticlă pentru pH acoperiţi cu o membranăpermeabilă pentru gaze, selectivă pentru CO2, NH3 sau H2S.Difuzia gazelor prin această membrană determină modificareapH-ului în soluţia dintre membrană şi electrod care este, apoi,calculată.

• 3. Electrozi în stare solidă, unde membrana de sticla esteinlocuită de o membrană subţire dintr-un conductor pentru ioni,alcatuită dintr-un amestec dintre sulfura de argint şi clorura deargint.

MECANISME DE FUNCTIONARE

Funcţionarea biosenzorilor enzimatici are la baza douatipuri de mecanisme:

- Direct - transformarea catalitica a unui substratintr-un produs de reactie care poate fi detectat la suprafaţa traductorului fizic

- Indirect - prin detectia unui produs care inhiba sau activeaza enzima.

ELECTROD ENZIMATIC

• Conceptul de biosenzor, a fost lansat pentru

prima dată sub denumirea de “electrod

enzimatic” de către Updike şi Hicks (1967) şi

s-a dezvoltat în ultimii 30 de ani datorită

multiplelor aplicaţii în diverse domenii.

CARACTERISTICI

• COST SCAZUT

• PORTABIL

• UNICA FOLOSINTA

• REPRODUCTIBILITATE

• USURINTA DE MANUIRE

• PERSONAL CU CALIFICARE MEDIE

• DETECTIE RAPIDA

APLICATII

• analizele clinice,

• controlul medicamentelor,

• industria agroalimentară,

• monitorizarea poluanţilor din mediu(apa freatică, aer, sol).

Determinarea glucozei din sange

PESTICIDE

Pesticide PLAMANICIRCULATIASANGUINA

PIELE

TRACTDIGESTIV

depozitare

biotransformare

eliminare

renala

tegumentara

respiratorieaerexpirat

depozitatin alveole

orala

hepatobiliara

urina

Intoxicatia cu pesticide

- sindrom muscarinic

diminuarea acuităţii vizuale, tulburări de acomodare, lăcrimare, hipersecreţie bronşică, bronhospasm, laringospasm, transpiraţii abundente, vărsături, diaree, colici abdominale, bradicardie, colaps

- sindrom nicotinic

astenie generală, slăbiciune musculară, fibrilaţii şicrampe musculare, faze avansate de paraliziimusculare

• Afectarea SNC

Insecticide organofosforice si carbamice

Colinesteraze

Fungicide ditiocarbamice

Aldehid dehidrogenaza

FenoliTirozinaza

Ioni ai metalelor grele

Ureaza

Glucozoxidaza

Toxine bacteriene Colinesteraze

Proteinfosfataza

Insecticide organofosforice si carbamice

Colinesteraze

Toxine bacteriene Colinesteraze

Proteinfosfataza

Structure of Structure of acetylcholinesteraseacetylcholinesterase

Acetylcholinesterase structure

STRATEGIE

Hipersensibilitate

Enzime - modificate genetic - sintetice

StabilitateEncapsulare Metoda sol-gel Metoda prin afinitate

Inhibitie enzimatica Screen printare

Inhibitie enzimatica Screen printare

STRATEGIE

University of Perpignan, BIOMEM, Franta

TRADUCTORUL

Element de masura

Element de referinta Ag/AgCl

Element auxiliar

StabilitateEncapsulare Metoda sol-gel Metoda prin afinitate

STRATEGIE

Hipersensibilitate

Enzime - modificate genetic - sintetice

STRATEGIE

Detectia insecticidelor carbamice si organofosforice

SURSE DE ENZIME

�Electric Eel

�Bovine erythrocytes

�Torpedo californica

�Drosophila melanogaster (Dm)

PESTICIDE

� Carbamice

� Organofosforice

• Celula de lucru

• Masurarea curentuluielectric generat deprocesul deoxidoreducere al unorspecii electrochimicactive, cand selucreaza la un potentialconstant

Analiza amperometrica

Principiul determinarii

Determinarea amperometrica a tiocolinei, produsa in urma hidrolizei enzimatice a substratului ATCh

+ R-COO- + H+Cl-

(CH3)3N+-CH2-CH2-SH

tiocolina

(CH3)3N+-CH2-CH2-S-CO-CH3

Cl-

acetiltiocolinaH2O

AChE

Rezultate experimentale

semnal

timp

inhibitie enzimatica

inaintea inhibitiei enzimatice

Iinitial

Idupa inhibitie

Teste de reactivare

(reactivata)

activaenzimareactivator

fosforilataenzima

EI + R EIR E + RI

C. Extractia pesticidelor din diverse matrice, folosind

repartitia lichid-lichid

Extractul in diclormetan, analizat la lungimea de unda 271nm

-Pentru probele de suc, in absenta contaminarii cu metil

paraoxon, s-a obtinut un pic la un timp de retentie nespecific

metil paraoxonului (1,75 minute), � alt compus extras din

matricea complexa a sucului analizat.

-Pentru timpul de retentie corespunzator metil paraoxonului

nu a aparut semnal in urma separarii cromatografice.

C. Extractia pesticidelor din diverse matrice, folosind

repartitia lichid-lichid

•s-a imbunatatit gradul de extractie al metil paraoxonului fata de cazul

testat anterior al extractiei in hexan.

•un dezavantaj al extractiei ar putea fi faptul ca acest solvent extrage si alti

compusi din matricele reale complexe, care ar putea sa explice unele

rezultate fals pozitive sau fals negative obtinute prin alte analize.

Traductori electrochimici

�manuire usoara,

� compatibilitate cu echipamente comerciale

standard,

�posibilitatea de miniaturizare,

�masurare automatizata.

Imunosenzori

- interactie Ag- Ac

SCHEMA GENERALA

S

P

ANALIT

BIORECEPTOR

TRADUCTOR

AMPLIFICATOR DE SEMNAL