Analiza cromozomilor Analiza cromozomilor
umaniumani
CitogeneticaCitogenetica
• Studiul cromozomilor si a anomaliilor Studiul cromozomilor si a anomaliilor cromozomiale:cromozomiale:
- in metafaza - in metafaza /interfază (FISH)/interfază (FISH)
- Normal 46 cromozomi: 22 perechi - Normal 46 cromozomi: 22 perechi cromozomi somatici +2 cromozomi sexuali cromozomi somatici +2 cromozomi sexuali XX sau XYXX sau XY
CCiitogenetictogeneticaa
1/3 din sarcini sunt avortate spontan1/3 din sarcini sunt avortate spontan
• 50% din avorturile de trim I 50% din avorturile de trim I au ca etiologie o au ca etiologie o
anomalie cromozomialăanomalie cromozomială
1% 1% din n.n. vii sunt purtători ai unei aberaţii din n.n. vii sunt purtători ai unei aberaţii
cromozomialecromozomiale
• Prezenţa a 3 sau mai multe avorturi spontane Prezenţa a 3 sau mai multe avorturi spontane
→→ analiza cromozomilor la genitori analiza cromozomilor la genitori
CCarariiototipip –ordonarea –ordonarea cromozomilor metafazici cromozomilor metafazici în funcţie de mărime, în funcţie de mărime, poziţia centromerului , poziţia centromerului , prezenţa constricţiilor prezenţa constricţiilor secundare şi a sateliţilor secundare şi a sateliţilor şi a altor caracteristici şi a altor caracteristici morfologicemorfologice
Metode de cariotipareMetode de cariotipare• Tipuri de ţesuturi utilizateTipuri de ţesuturi utilizate
– făt/embrionfăt/embrion: amniocentesis: amniocentesis– biopsia de vilozităţi corialebiopsia de vilozităţi coriale
– Adult : Adult : sânge perifericsânge periferic ( (limfocitelimfocite))– ccelule din mucoasa elule din mucoasa
bucalăbucală– fibroblastefibroblaste – celule din măduva celule din măduva
osoasăosoasă
Metode de cariotipareMetode de cariotipare• 5 ml of 5 ml of sânge recoltat pe heparinăsânge recoltat pe heparină. . /10ml lichid amniotic obţinut prin /10ml lichid amniotic obţinut prin
amniocentezăamniocenteză..• Etapă de centrifugare în vederea Etapă de centrifugare în vederea
obţinerii unui sedimrnt celularobţinerii unui sedimrnt celular• Cultivarea celulelor pe medii de cultură Cultivarea celulelor pe medii de cultură
speciale în prezenţa antibioticelor şi a speciale în prezenţa antibioticelor şi a unor stimulente mitotice unor stimulente mitotice (fitohemaglutinina)(fitohemaglutinina). .
• Oprirea diviziunilor celulare în mOprirea diviziunilor celulare în metafazaetafaza prin adăugarea colchicinei (distruge prin adăugarea colchicinei (distruge fusul de diviziune)fusul de diviziune)..
• Etape de fixare şi hipotonizare. Etape de fixare şi hipotonizare. • Colorarea preparatelor metafazice şi Colorarea preparatelor metafazice şi
vizualizarea lor la microscopul opticvizualizarea lor la microscopul optic. .
Prepararea cariotipuluiPrepararea cariotipului
Metode de cariotipare
• cultivarea celulelor pt.48-72h zile• oprirea diviziunilor in metafază cu colchicină ;•distrugerea celulelor cu soluţii fixator.
metaphase
• Cromozomii metafazici sunt Cromozomii metafazici sunt numerotaţi de la 1-22 în ordinea numerotaţi de la 1-22 în ordinea descrescătoare a talieidescrescătoare a taliei
Braţul scurt
p
q (braţul lung)
Centromer
CentromerulCentromerul
Centromerul conţine o secvenţa de 171pb repetată de 100000 ori denumită secvenţă alpha satelit
• TelomereTelomere : :
Extremităţile cromozomilor
Repetiţii TTAGGG
Subtelomerele conţin secvenţe repetate variabile
Metode de bandareMetode de bandare• Se folosesc preparatele cromozomiale obţinute prin tehnica Se folosesc preparatele cromozomiale obţinute prin tehnica clasicăclasică•Cromozomii sun supuşi unor tratamente termice,cu Cromozomii sun supuşi unor tratamente termice,cu acizi/baze/tratamente enzimatice şi coloraţi cu diferiţi acizi/baze/tratamente enzimatice şi coloraţi cu diferiţi coloranţi.coloranţi.
•Metode citogenetice clasiceMetode citogenetice clasice• Metoda de bandare Metoda de bandare G – G – Soluţie Soluţie GiemsaGiemsa; evidenţiază ; evidenţiază heterocromatina, regiunile de ADN bogate în G-Cheterocromatina, regiunile de ADN bogate în G-C• Bandarea Bandarea QQ – – subsanţe fluorescente (subsanţe fluorescente (FluoresceFluoresceina)ina)• Bandarea Bandarea R – R – benzi de rbenzi de reverseversie benzilor G; evidenţiază ie benzilor G; evidenţiază telomerele şi eucromatinatelomerele şi eucromatina•Bandarea C-pt zona centromericăBandarea C-pt zona centromerică•Bandarea NOR pt regiunile organizator nucleolar de la nivelul Bandarea NOR pt regiunile organizator nucleolar de la nivelul constricţiilor secundare ale cromozomilor acrocentrici.constricţiilor secundare ale cromozomilor acrocentrici.
•Cariotipare molecularăCariotipare moleculară• Fluorescence In Situ HybridizationFluorescence In Situ Hybridization (FISH) (FISH)
Bandarea G a cromozomilor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Modelul de benzi este Modelul de benzi este cromozom-specificcromozom-specific
Aranjarea cromozomilor in Aranjarea cromozomilor in cariotipcariotip
Clasificarea cromozomilor în Clasificarea cromozomilor în funcţie de poziţia funcţie de poziţia centromeruluicentromerului
Se vizualizează 350-400 benzi dacă se folosesc cromozomi metafazici şi respectiv 800 benzi dacă se folosesc cromozomi în prometafază
Met
acen
tric
Sub
met
acent
ric
Acr
ocen
tric
Metode de bandareMetode de bandare
• Clasificarea Clasificarea cromozomilor în cromozomilor în funcţie de:funcţie de:
• 1. 1. talietalie
• 2. pattern2. pattern de de bandarebandare
• 3. 3. poziţia poziţia centromeruluicentromerului
ClasificaClasificarearea ccromoromozomilorzomilor
02_15.jpg02_15.jpg
Metode de bandareMetode de bandare
• ExampExamplu-1q24. lu-1q24.
cromozomul 1, braţul q, regiunea cromozomul 1, braţul q, regiunea 2, banda 42, banda 4
Numerotarea cromozomilor de la 1-22+X/Y
Fiecare braţ este împărţit în regiuni a căror numerotare se face de la centromer către extremităţi
Fiecare regiune în benzi a căror numerotare se face de la centromer către extremităţile regiunii
Heterochromatin vs Heterochromatin vs EuchromatinEuchromatin
Stabilirea poziţiei unor Stabilirea poziţiei unor gene pe cromozomigene pe cromozomi
•Gena intoleranţei la Gena intoleranţei la glucoză se află pe glucoză se află pe 3q263q26
FISHFISH
Proba locus-specifică hibridizează cu o secvenţă unică de pe un anumit cromozom. Proba este marcată prin încorporarea în
structura unui anumit nucleotid (Ex: timina) a unei subsranţe flurescente (fluoresceină, Texas-red, rodaminăetc.).
Numărul punctelor fluorescente dintr-o metafază indică indică numărul punctelor de hibridizare.
Etapa 1: denaturarea dublului helix al ADN-ului probei şi al cromozomilor metafazici /interfazici în vederea obţinerii de monocatene prin încălzire la temperaturi ridicate într-o soluţie de formamidă.
Etapa 2- se adugă proba peste lama cu cromozomii metafazici obţinuţi prin tehnica clasică. Lama se acoperă cu o lamelă pentru a împiedica evaporarea şi se introduce la incubator la 37C în vederea obţinerii unei reacţii de hibridizare probă-secvenţă monocatenară cromozomială.
FISH ProbesFISH Probes
centromere
telomere
whole chromosome paint
locus
FISH
Cromozomii metafazici sunt coloraţi cu DAPI, o substanţă fluorescentă ce se leagă de ambele catene de ADN
Sindroame de Sindroame de MicrodeleMicrodeleţieţie: : probe probe llocus Specificocus Specificee
-diagnosticul -diagnosticul microduplicaţiilmicroduplicaţiilor/translocaţiilor/translocaţiiloror
Test FISH pt. a stabili rapid prezenţa unei aberaţii numerice
Cei 3 cromozomi 21 sunt vizualizaţi cu probe marcate cu roşu iar cromozomii 13 cu verde.
Identificarea sindromelor de microdeleţie utilizând probe-control.
William's SyndromeWilliam's Syndrome
• Normal KaryotypeNormal Karyotype
Williams del(7q11)
Prader-Willi del(15q12)
normal
Diagnosticul sindroamelor de microdeleţie
Aneuploidy 13, 18, 21, X and Y
Wolf Hurshorn 4p-Cri du Chat 5p-Williams 7q22-Retinoblastoma 13q14- Angelman 15q12-Prader-Willi 15q12-Miller-Dieker 17p13-Smith-Magenis 17p11-DiGeorge/VCF 22q11-STS Xp22.3-SRY Xp22.3- Kallmans Xp22.3-Sex X and Y
Subtelomeres (46 probes)M-FISH 23 chromosomes paints
Probe pt sdr. De Microdeletie
Centromere for X chromosome 48,XXXX
FISH: Fluorescent IN SITU hybridization green = probe for end of
chromosome 4
red = control probe for centromere of the X chromosome & another probe for end of chromosome X
• TranslocatiiTranslocatii
Figure 8.23Bx
Metoda FISH pe nuclei interfazici
verde = cromozomul 13rosu= cromozomul 21
bleu = cromozomul 18verde = Xrosu = Y
Nuclei de la acelasi produs de conceptie
Se folosesc probe oligonucleodidice marcate fluorecent pt. diagnosticul aneuplidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X, si Y
FISH cu probe marcate coresumzătoare cromozomului Y
Cromozomi metafazici şi interfazici
FISH pe nuclei interfazici cu probe pt X marcate cu verde şi pt Y marcate cu roşu.
Prezenţa de mozaicisme
Mozaicisme gonosomale 47,XYY/46XY/47,XXY
Diagnosticul genetic prenatal prin metodaDiagnosticul genetic prenatal prin metoda FISHFISH
M-FISH (SKY)
Cromozomul"Philadelphia " Cromozomul"Philadelphia " Translocatie 9:22 Translocatie 9:22
CML
Philadelphiatranslocation
Relatively good prognosis in CML Relatively poor prognosis in ALLAdditional chromosome changes: +8, iso(17q), +19,+Ph1, - blast crisis = poor prognosis
Indicatii clinice pentru Indicatii clinice pentru analiza cromozomiloranaliza cromozomilor• Deficitul cresterii pre-/postnatalDeficitul cresterii pre-/postnatalee
• Avort spontan/n.n. mortAvort spontan/n.n. mort
• Sterilitate/infertilitateSterilitate/infertilitate
• Istoric familial de rearanjament Istoric familial de rearanjament cromozomialcromozomial
• Valori anormale ale markerilor serici Valori anormale ale markerilor serici materni/anomalii fetale depistate ecograficmaterni/anomalii fetale depistate ecografic
• NeoplaziiNeoplazii