Ing. dipl. CATALINA IOANA OLIVIA

UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI LA GENUL TULIPA

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

Conducător ştiin Ńific: Prof. Dr. PAMFIL DORU

Cluj-Napoca 2009

UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE HORTICULTURĂ

Ing. dipl. CATALINA IOANA OLIVIA

USE OF MOLECULAR MARKERS IN TULIPA GENUS

SUMMARY OF THE Ph.D. THESIS

Scientific coordinator: Prof. Dr. PAMFIL DORU

Cluj-Napoca 2009

UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE HORTICULTURĂ

CUPRINS

INTRODUCERE ………………………………………………………………….... CAPITOLUL I. CONSIDERAłII GENERALE ALE GENULUI TULIPA……………………………….

1.1. IMPORTANłA GENULUI TULIPA…………………………………………………… 1.2. ÎNCADRAREA BOTANICĂ A GENULUI TULIPA. TAXONOMIA SPECIILOR DIN GENUL TULIPA …………………………………………………………………. 1.3. CARACTERIZAREA BOTANICĂ A GENULUI TULIPA…………………………… 1.4. SPECII BOTANICE ……………………………………………………………………. 1.5. CLASIFICAREA SOIURILOR…………………………………………………………. CAPITOLUL II. MARKERII MOLECULARI UTILIZA łI LA GENUL TULIPA………………………. 2.1.UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI ÎN AMPRENTAREA GENETICĂ ŞI ÎN IDENTIFICAREA VARIABILITĂłII GENETICE A GENULUI TULIPA ............. 2.2. MARKERII RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA )– POLIMORFISME DE ADN AMPLIFICATE ALEATOR........................................... 2.3. MARKERII AFLP-(AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM)– POLIMORFISME DE LUNGIME ALE FRAGMENTELOR AMPLIFICATE............. 2.4.MARKERII DAF -(DNA AMPLIFICATION FINGERPRINTING) – AMPRENTA GENETICĂ OBłINUTĂ PRIN AMPLIFICAREA ADN……………………………… 2.5.MARKERII AP-PCR(ARBITRARY PRIMED PCR)…………………………………… 2.6.MARKERII SSR-MICROSATELIT(SIMPLE SEQUENCE REPEATS) –SECVENłE SIMPLE REPETATE……………………………………………………………………. 2.7.MARKERII ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE REPEATS)………………………… 2.8.MARKERII SCAR (SEQUENCE CHARACTERIZED AMPLIFIED REGIONS)- SECVENłE CARACTERISTICE REGIUNILOR AMPLIFICATE…………………… CAPITOLUL III. MATERIAL ŞI METOD Ă…………………………………………………………………. 3.1. OBIECTIVELE CERCETĂRII…………………………………………………………. 3.2. MATERIALUL BIOLOGIC UTILIZAT……………………………………………….. 3.2.1. Izolarea şi purificarea ADN–ului ………………………………………………... 3.2.2. Amplificarea ADN-ului prin tehnica PCR……………………………………….. 3.2.2.1 Tehnica PCR- reacŃia în lanŃ a polimerazei (polymerase chain reaction).. 3.2.2.2.Caracteristici ale metodei PCR…………………………………………... 3.2.2.3. Utilizarea tehnicii PCR………………………………………………….. 3.3. METODELE DE LUCRU ……………………………………………………………… 3.3.1.Metoda RAPD .......................................................................................................... 3.3.7.1. Componentele amestecului de reacŃie…………………………………….. 3.3.7.2. Primerii utilizaŃi pentru analiza RAPD…………………………………… 3.3.7.3. DistanŃele genetice ale speciilor luate în studiu…………………………... 3.3.7.4. ConstrucŃia dendrogramei………………………………………………… 3.3.2.Tehnica AFLP…………………………………………………………………….. 3.3.2.1.Principiul tehnicii AFLP………………………………………………….. 3.3.2.2. Etapele tehnicii AFLP……………………………………………………. 3.3.2.2.1. ObŃinerea matriŃei primare: digestia ADN-ului (restricŃia) şi ataşarea adaptorilor……………………………………………………………………………………. 3.3.2.2.2. Preamplificarea…………………………………………………………

8 12 13 14 16 18 27 52 53 57 61 63 64 65 67 67 69 70 71 73 82 82 84 85 86 86 89 90 93 98 99 99 105 106 109

3.3.2.2.3. Verificarea preamplificării (calitatea produşilor PCR)………………... 3.3.2.2.4. Amplificarea selectivă cu primeri marcaŃi fluorescent cu IRD 700 şi IRD 800………………………………………………………………………………………. 3.3.2.2.5.CombinaŃiilor de enzime utilizate în amprentarea genetică ………… 3.3.2.2.6. Pregătirea gelului de poliacrilamidă…................ 3.4.VIRUSUL PĂTĂRII LALELELOR (MOZAICUL LALELOR) TULIP BREAKING VIRUS................................................................................................................................ 3.5 ANALOGI AI GENELOR DE REZISTENłĂ (RESISTANCE GENE ANALOGUES)... 3.6 IDENTIFICAREA UNOR MARKERI AFLP CARE SUNT ÎN LINKAGE CU REZISTENłA LA TBV..................................................................................................... 3.7 TEHNICA NBS AFLP....................................................................................................... 3.7.1.Amplificarea NBS mediată de adaptor…………………………………………….. 3.7.2.Construirea hărŃii genetice de linkage........................................................................ 3.7.3. Harta genetică (moleculară)..................................................................................... CAPITOLUL IV. TEHNOLOGIA OB łINERII SOIURILOR LA GENUL TULIPA- HIBRIDAREA ....... 4.1. BAZELE GENETICE ALE AMELIORĂRII GENULUI TULIPA…………………….. 4.2. SPECIILE BOTANICE DE LALELE PE CALE DE DISPARITIE …………………… 4.3. INDUCEREA MUTATIILOR PENTRU OBTINEREA DE NOI SOIURI LA LALELE………………………………………………………………………………… CAPITOLUL V REZULTATE ŞI DISCUłII ………………….……………………………………………. 5.1. REZULTATE PRIVIND UTILIZAREA TEHNICII RAPD LA GENUL TULIPA……. 5.2. REZULTATE PRIVIND UTILIZAREA TEHNICII AFLP LA GENUL TULIPA ……. 5.3. REZULTATE PRIVIND IDENTIFICAREA UNOR MARKERI AFLP CARE SUNT ÎN LINKAGE CU REZISTENłA LA TBV.................................................................... 5.4. REZULTATE PRELIMINARE PRIVIND UTILIZAREA TEHNICII NBS AFLP LA GENUL TULIPA………………………………………………………………………... CAPITOLUL VI CONCLUZII SI RECOMAND ĂRI……………………………………………………….. BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ……..……………………………………………………….. SUMMARY…………………………….…………………………………………………….

111 113 116 119 125 131 136 137 141 143 145 146 150 153 155 157 158 167 177 181 185 191 201

TABLE OF CONTENTS

INTRODUCTION.………………………………………………………………….... CHAPTER I. GENERAL INTRODUCTION OF TULIPA GENUS…………………………………….

1.1. THE IMPORTANCE OF TULIPA GENUS……………………………………………. 1.2. BOTANICAL CLASSIFICATION OF TULIPA GENUS. TAXONOMICAL CLASSIFICATION OF THE SPECIES OF THE GENUS TULIPA ……………………….. 1.3. BOTANICAL CHARACTERISATION OF GENUS TULIPA………………………… 1.4. BOTANICAL SPECIES……………………………………………………………….... 1.5. CULTIVARS CLASSIFICATION……………………………………………………. CHAPTER II. MOLECULAR MARKERS USED IN GENUS TULIPA………………………. 2.1.DNA FINGERPRINTING AND IDENTIFICATION OF GENETIC VARIABILITY IN TULIPA GENUS BY MEANS OF MOLECULAR MARKERS........................................ 2.2. RAPD MARKERS (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA )........................... 2.3. AFLP MARKERS -(AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM)............. 2.4. DAF MARKERS -(DNA AMPLIFICATION FINGERPRINTING................................... 2.5. AP-PCR MARKERS (ARBITRARY PRIMED PCR)…………………………………… 2.6. SSR-MICROSATELIT MARKERS (SIMPLE SEQUENCE REPEATS) …………….. 2.7. ISSR MARKERS (INTER SIMPLE SEQUENCE REPEATS)…………………………. 2.8. SCAR MARKERS (SEQUENCE CHARACTERIZED AMPLIFIED REGIONS)………. CHAPTER III. MATERIAL AND METHOD ……………………………………………………………. 3.1. OBJECTIVES OF THE RESEARCH WORK …………………………………………. 3.2. BIOLOGICAL MATERIAL…………..……………………………………………….. 3.2.1. DNA isolation and purification…………………………………………………... 3.2.2. Amplification of DNA by PCR………………………………………………….. 3.2.2.1 PCR technique (polymerase chain reaction)…………………………….. 3.2.2.2.Characteristics of PCR………………………………………….………. 3.2.2.3. The use of PCR…………………………………………………………. 3.3. WORKING METHODS.. ……………………………………………………………… 3.3.1. RAPD markers technique........................................................................................ 3.3.7.1. Components of mastermix.................…………………………………….. 3.3.7.2. Primers used in RAPD analysis………………………………………….. 3.3.7.3. Genetic distances of species considered in this study ..…………………... 3.3.7.4. Dendrogram construction ………………………………………………… 3.3.2. AFLP markers technique………………………………………………………… 3.3.2.1.The principle of AFLP……………………………………………………. 3.3.2.2. Flow chart of AFLP process ……………………………………………. 3.3.2.2.1. Preparation of primary template: restriction and ligation……………… 3.3.2.2.2. Preamplification……………………………………………………….. 3.3.2.2.3. Verification of preamplification …………………………..…………... 3.3.2.2.4. Selective PCR-amplification with IRD 700 or IRD 800 labelled primers……………………………………………………………………………………….. 3.3.2.2.5.Enzyme primer combination used for DNA fingerprinting…. ………… 3.3.2.2.6. Acrylamide gel preparation and electrophoresis……………................ 3.4. TULIP BREAKING VIRUS.............................................................................................

8 12 13 14 16 18 27 52 53 57 61 63 64 65 67 67 69 70 71 73 82 82 84 85 86 86 89 90 93 98 99 99 105 106 109 111 113 116 119 125

3.5 RESISTANCE GENE ANALOGUES................................................................................... 3.6 IDENTIFICATION OF AFLP MARKERS IN LINKAGE WITH TBV RESISTANCE.......................................................................................................................... 3.7 NBS AFLP.......................................................................................................................... 3.7.1. NBS adapter mediated amplification..…………………………………………….. 3.7.2. Construction of linkage molecular map................................................................... 3.7.3. Genetic map.............................................................................................................. CHAPTER IV. BREEDING OF TULIPS TO CREATE NEW CULTIVARS- HYBRIDI ZATION ........ 4.1. GENETIC ASPECTS OF BREEDING TULIPA GENUS……….…………………….. 4.2. BOTANICAL TULIPS ON THE WAY TO DISSAPPEARING… …………………… 4.3. MUTATION INDUCTION TO CREATE NEW TULIP CULTIVARS……………….. CHAPTER V RESULTS AND DISSCUTIONS…………….……………………………………………. 5.1. RESULTS REGARDING RAPD TECHNIQUE USED IN GENUS TULIPA………… 5.2. RESULTS REGARDING AFLP TECHNIQUE USED IN TULIPA GENUS…..……. 5.3. RESULTS REGARDING IDENTIFICATION OF AFLP MARKERS IN LINKAGE WITH TBV RESISTANCE...................................................................................................... 5.4. PRELIMINARY RESULTS OF NBS AFLP TECHNIQUE USED IN TULIPS……………………………….……………………………………………………... CHAPTER VI CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS ………………………………………… SELECTIVE BIBLIOGRAPHY……………………………………………………………. SUMMARY…………………………….…………………………………………………….

131 136 137 141 143 145 146 150 153 155 157 158 167 177 181 185 191 201

INTRODUCERE

Prezenta teza de doctorat are ca obiectiv de studiu utilizarea markerilor moleculari în studiul

variabilităŃii genetice cu scopul selecŃiei şi ameliorării genului Tulipa. Dintre speciile bulboase ornamentale lalelele ocupa locul cel mai important.De-a lungul timpului, lalelele au stârnit adevărate pasiuni, între anii 1634-1637 ajungându-se la o adevarată tulipomanie. Fondul genetic al acestei specii este foarte bogat, speciile luate în cultură au beneficiat şi beneficiază în continuare de atenŃia amelioratorilor la crearea de noi soiuri, fapt ce rezultă într-o largă diversitate, ajungându-se la flori cu calităŃi inedite ca forma, vigoare, culoare, parfum. Specia T. gesneriana şi lalele din grupa Darwin hybrid reunesc mai mult de 1100 de cultivaruri (van Scheepen, 1996).

PrestanŃa şi eleganŃa acestei flori au făcut ca ea sa fie considerată o adevarată regină a grădinilor sau a interioarelor, în sezonul de primavară.Drept dovadă a importanŃei ce se acordă acestei plante, în Olanda- cea dea doua patrie a lalelelor- funcŃionează instituŃii şi activităŃi de notorietate mondială., aceasta Ńară producând 70% din producŃia mondială de bulbi. Aici funcŃionează SecŃia de Bulbicultură a UniversităŃii din Wageningen, Centrul International de Bulbicultură, AsociaŃia Regală a Bulbicultorilor, AsociaŃia Olandeza a Exportatorilor de Bulbi, Bursa Bulbilor. La Limmen a fost înfiinŃat Muzeul -Hortus Bulborum-, unde sunt expuse numeroase specii şi hibrizi de plante bulboase. Aici pot fi văzute soiuri datând din anul 1595 sau soiul Zomerschoon, din perioade tulipomaniei (1634-1637). La iniŃiativa bulbicultorilor din regiunea Lisse, s-a înfiinŃat în anul 1949 forul Keukenhof (între Haarlem şi Leyde), o mare expoziŃie de plante bulboase, unde vedetele consacrate sunt lalelele. Această teză reprezintă un studiu inedit, caracterizat prin originalitate şi aplicabilitate practică. Originalitatea proiectului constă în faptul că permite dezvoltarea şi utilizarea metodelor bazate pe utilizarea markerilor moleculari (AFLP şi RAPD) pentru amprentarea genetică a speciilor şi soiurilor de lalele, precum şi identificarea unor markeri moleculari AFLP specifici care sunt în linkage cu rezistenŃa la TBV (Tulip Breaking Virus). Tematica abordată este de actualitate şi ea vine să completeze lipsa de informaŃii din literatura de specialitate referitoare la analizele bazate pe markeri moleculari la genul Tulipa. Obiectivele cercetării noastre şi-au propus să rezolve problematica privind:

� Testarea protocolului de extracŃie ADN la speciile de Tulipa � Identificarea rapidă a speciilor şi soiurilor prin amprentare genetică utilizând analizele

moleculare AFLP cu scopul protecŃiei noilor soiuri create � Stabilirea combinaŃiilor de enzime capabile să determine apariŃia polimorfismului între

specii şi cultivare � Realizarea unei amprente genetice clare, � Identificarea unor markeri moleculari AFLP care sunt în linkage cu rezistenŃa la TBV,

putându-se face astfel selecŃia încă din stadii timpurii � Analiza ADN a speciilor şi cultivarelor luate în studiu utilizând tehnica RAPD şi

realizarea dendrogramelor cuprinzând speciile şi cultivarele analizate � Testarea unei noi tehnici NBS AFLP care să permită amplificarea secvenŃelor specifice

NBS (nucleotide binding site) care pot fi astfel utilizate ca şi markeri moleculari pentru genele analoage ale genelor de rezistenŃă

� Construirea hărŃilor de linkage. PrezenŃa markerilor AFLP a fost detectată la întreg genomul lalelei şi la toate cele 12 grupuri de linkage (Van Heusden şi colab. 2002). Studiul recent efectuat de catre Jaap M.Van Tuyl şi Marjan G.M. van Creij a demonstrat importanŃa markerilor AFLP în identificarea rapidă a speciilor şi soiurilor de lalele, precum şi asocierea acestora cu rezistenŃa la virusul TBV (Virusul mozaicului lalelelor), demonstrată şi de Van Heusden şi colab. (2002). În viitor, aplicaŃiile markerilor moleculari în vederea identificării diferitelor caractere vor accelera procesul de hibridare la genul Tulipa şi va determina o schimbare de esenŃă în programele de ameliorare pentru că în locul selecŃiei fenotipice pentru caracterul dorit se va face selecŃia genelor care controlează respectivul caracter. Acest tip de selecŃie permite identificarea genei importante urmărite încă fazele timpurii de creştere a plantelor, fapt ce asigură eficientizarea întregului program de ameliorare.

CAPITOLUL I. CONSIDERA łII GENERALE ALE GENULUI TULIPA 1.1. IMPORTAN łA GENULUI TULIPA Lalelele au fost introduse în Europa prin Turcia. Au fost cultivate pentru prima dată în Olanda, în anul 1594, ajungând foarte populare în anul 1630, astfel că în anul 1637 preŃul unui singur bulb de lalea a fost de 5200 florini (Dash, 1999). Primul centru genic al speciei Tulipa L. este localizat în munŃii Pamir Alai şi Tien Shan din Asia Centrală (Hoog, 1973). Al doilea centru de origine a fost localizat în Caucazi. Lalelele, flori cu o gamă extrem de variată de culori, se întrebuinŃează primăvara pentru decorarea parcurilor şi grădinilor, în ghivece şi ca floare tăiată, la înfrumuseŃarea mediului ambiant, în buchete şi în aranjamente florale. Dintre speciile bulboase ornamentale cel mai important loc îl ocupă lalelele. În Olanda în perioada 2001-2003 acestea s-au cultivat pe o suprafaŃă de 10 700 hectare, din care doar 7% este cultivată cu specii, în special cu T. fosteriana, T. greigii şi T. kaufmanniana, restul fiind ocupat de cultivaruri. Specia T. gesneriana şi lalele din grupa Darwin hybrid reunesc mai mult de 1100 de cultivaruri (Van Scheepen, 1996). Fondul genetic al acestei specii este foarte bogat, speciile luate în cultură au beneficiat şi beneficiază în continuare de atenŃia amelioratorilor la crearea de noi soiuri, fapt ce rezultă într-o largă diversitate, ajungându-se la flori cu calităŃi inedite ca formă, vigoare, culoare, parfum. ExistenŃa unei asemenea diversităŃi a materialului genetic introdus în cultură şi caracterul său deja ameliorat explică, probabil, faptul că nu a fost posibil să se stabilească cu certitudine care specii au furnizat aceste caractere, şi care în final au fost regrupate sub denumirea de Tulipa gesneriana. 1.2. ÎNCADRAREA BOTANIC Ă A GENULUI TULIPA. TAXONOMIA SPECIILOR DIN GENUL TULIPA Genul Tulipa aparŃine clasei Monocotiledonate, familia Liliaceae, cu un număr de specii variind de la 45 (Stork, 1984) pana la 100 (Hall,1940 ; Botschantzeva, 1962) . Din totdeauna definirea şi clasificarea speciilor de lalele a constituit o problemă pentru botanişti. Primul care a căutat să facă o anume ordine în numărul şi denumirea acestor specii a fost englezul A. D. Hall, care a apelat la examenul citologic al plantelor de lalele. Aceste cercetări minuŃioase au permis să stabilească anumite relaŃii între diversele specii, care au stat la baza stabilirii numeroaselor sinonime. Astfel, în monografia pe care a publicat-o, genul Tulipa apare cu un număr redus de specii, 72. Acest gen este divizat în 2 subgenuri principale : (Hall, 1940).

Eriostemones, la care filamentele staminale sunt pubescente la bază Leiostemones, la care filamentele staminale sunt lipsite de pilozitate la bază

După clasificarea taxonomică a lui Van Raamsdonk şi De Vries(1992, 1995) şi a lui Van Raamsdonk şi colab., 1997, genul Tulipa cuprinde 2 subgenuri, Tulipa şi Eriostemones, care sunt divizate în secŃii şi care cuprind mai multe specii (tab.1).

Tabelul 1 Clasificarea taxonomică a genului Tulipa

(Van Raamsdonk şi colab., 1997) Subgenul SecŃia Speciile

Tulipa armena, didieri, gesneriana, hungarica, suaveolens

Tulipanum agenensis, aleppensis, julia, kuschkensis, praecox, systola Clusianae clusiana, linifolia, montana Eichleres albertii, dubia, eichleri, fosteriana, greigii, ingens,

kaufmanniana, lanata, praestans, subpraestans, sosnovskyi, tubergeniana, tschimganica

TULIPA

Kolpakowskianae altaica, lehmanniana, tetraphylla Australes australis, biebersteniana, hageri,orphanidea, primulina,

sylvestris, whittallii

Biflores biflora, dasystemon, neustruevae, polychroma, sogdiana, tarda, turkestanica

ERIOSTEMONES

Saxatiles aucheriana, bakeri, humilis, pulchella, saxatilis

1.3. CARACTERIZAREA BOTANIC Ă A GENULUI TULIPA Partea subterană a plantei, bulbul , de formă ovoidă sau piriformă are diametrul cuprins între 2 şi 4 cm şi este alcătuit dintr-o tulpină lăŃită, discoidală, plasată la bază, numită disc şi câteva frunze metamorfozate, cărnoase, de culoare albă, în care sunt depozitate rezerve de substanŃe nutritive, plus câteva tunici pergamentoase care le protejează pe celelalte. Culoarea bulbului depinde de coloritul tunicilor care îl acoperă şi poate fi brun-negru, brun-roşiatic sau castaniu-roşcat. Discul, ca orice tulpină, prezintă muguri. Din aceştia, în urma proceselor de creştere şi dezvoltare, rezultă bulbi. În centrul bulbului se formează floarea. Rădăcinile groase şi relativ puŃine la număr pornesc de la partea inferioară a discului, fiind plasate pe marginea acestuia. Tulpina aeriană, aceeaşi cu tija florală, este de formă cilindrică, rectă având o înălŃime cuprinsă între 5 cm şi 1 m, în funcŃie de specie şi soi. Ea este prezentă numai la bulbii mari, floriferi. Frunzele se formează în număr de 2-6 şi sunt lipsite de peŃiol. Cele de la baza tulpinii sunt mai mari, oval-lăŃite, uneori alungite, cu marginea dreaptă şi uşor ondulată. Frunzele superioare sunt mai mici şi înguste. Limbul are culoarea verde-închis cu nuanŃe albăstrui, acoperit de cele mai multe ori de o pruină (ceară) groasă. La bulbii mici frunzele apar direct din bulbi. O plantă fără floare are frecvent o singură frunză care este mai mare, mai lată decât cele ale plantelor cu flori. Baza acestei frunze înconjoară bulbul. Floarea apare în vârful tulpinii. Poate fi simplă sau involtă (bătută), asemănătoare unei cupe de diferite forme: ovoidă, cilindrică, conică, globuloasă. Are 6 diviziuni din care 3 externe şi 3 interne, ovale, rotunde sau ascuŃite la vârf, dispuse în cupă regulat erectă de culori şi nuanŃe diferite, uneori în combinaŃie.

Formele cele mai cunoscute şi apreciate sunt cele în formă de cupă, ovală, de pahar, bilă, asemănătoare unui crin, bujor (are peste 6 petale), papagal (petalele sunt larg deschise, tăiate, crestate sau cu un fel de

ace de culoare verde-deschis pe partea exterioară). În mod obişnuit ,lalele prezintă terminal o singură floare, dar sunt şi specii (de exemplu Tulipa praestans) care au inflorescenŃa alcătuită din 2-3 sau mai multe flori, fiecare cu pedicelul său propriu, ce creşte din axila unei frunze. Învelişurile florale, numite tepale, sunt aşezate în două cercuri grupate câte trei. Coloritul acestora este foarte variat, cuprinzând o gamă bogată de nuanŃe ale tuturor culorilor de bază. Androceul este alcătuit din 6 stamine cu anterele foarte mari de culoare galbenă, brun deschis, albastră sau neagră. Gineceul cuprinde un ovar superior, tricarpelar, stilul şi stigmatul trilobat. Stigmatul are marginea franjurată din momentul deschiderii florii. Aceste franjuri devin moi şi lipicioase când floarea este matură, aptă pentru fecundare. Coloritul florii lalelei poate fi de la alb pur până la aproape negru, cuprinzând în această gamă nuanŃe de roz, galben, roşu, orange, mov, maro. Centrul florii are adeseori aspectul unei stele cu raze ascuŃite sau rotunjite sau aspectul unui cerc cu sau fără contur. Fructul este o capsulă trimuchiată,

triloculară şi multispermă. SeminŃele sunt monocotiledonate, mari, turtite, de culoare cafenie sau gălbuie, aşezate în fruct ca monezile într-un fişic. 1.5. CLASIFICAREA SOIURILOR Numărul imens de soiuri obŃinute la această plantă a pus problema clasificării lor. Din totalul criteriilor analizate, cel care se referă la epoca de înflorire stă la baza grupării soiurilor de lalele. Lalelele au fost clasificate în 14 grupe, după epoca de înflorire, forma, coloritul, tipul florii: simplă sau bătută, origine, durata de înflorire, înălŃimea plantei, forma florilor. Astfel, în lista oficială publicată de AsociaŃia bulbicultorilor olandezi, speciile de lalele se clasifică după cum urmează: LALELE TIMPURII (înflorire între 1 şi 15 aprilie) Duc Van Thol - înflorire foarte timpurie, 15-20 cm, flori variat colorate Simple timpurii - T. gesneriana x T. suaveolens- flori solitare, frumos colorate de la roşu la alb, parfumate; tije florale înalte de 25-40 cm; folosire largă în culturile forŃate; înflorire la începutul lunii aprilie. Duble timpurii - florile mari, larg deschise, se aseamănă cu cele de bujor; înălŃimea tijelor este de 20-35 cm, durata florilor este mare. LALELE SEMITIMPURII (înflorire între 1 5 şi 30 aprilie) Mendel - Duc Van Tol x lalele Darwin-talia plantelor este de 35-40 cm; înflorirea către sfârşitul lunii aprilie; folosite mult în cultura forŃată. Triumph - Simple timpurii x lalele Darwin – talia plantelor atinge 50-60 cm; colorit foarte variat; vigurozitate sporită; înfloreşte către sfârşitul lunii aprilie. LALELE TÂRZII (înflorire în luna mai) Darwin – au apărut ca o selecŃie din grupa lalelelor Cottage; cuprinde cele mai renumite soiuri ale genului; tijele sunt foarte viguroase, lungi până la 60 cm; pata bazală a florii are un contur rectangular Darwin hybrid – lalele Darwin x T. fosteriana; soiurile din această grupă reprezintă cele mai frumoase realizări din istoria horticolă a genului; tijele sunt înalte, atingând 1m; foarte viguroase, purtătoare de flori enorme, cu un luciu caracteristic. Breeder - cuprinde soiuri cu talia înaltă, cel mai adesea florile sunt bicolore. Lilium (cu flori de crin) – T. retroflexa x lalele Cottage – lungimea tijelor variază între 50-60 cm iar florile sunt lungi, graŃioase, cu tepalele îngustate mult spre vârf până la ascuŃite

Fig.1. Morfologia T.sylvestris (Otto Wilhelm Thomé, 1885 în www.wikipedia.org)

Cottage – este o grupă puŃin omogenă, florile sunt foarte mari , mai mult sau mai puŃin alungite, înălŃimea plantelor atinge 75 cm. Rembrandt – reuneşte lalele Darwin , panaşate, zebrate, striate. Bizare – cuprinde soiuri din grupele Breeder şi Cottage, care au florile panaşate sau zebrate, adesea florile sunt pătate de bronz sau purpuriu pe fond galben. Bigbloemen – însumează lalele Breeder şi Cottage, pătate sau zebrate de roşu, roz sau violet pe fondul alb. Papagal – tepalele sunt franjurate, dantelate sau încreŃite iar tijele de vigoare slabă nu reuşesc să-şi susŃină bine întotdeauna florile. Duble târzii (cu flori de bujor) – au înălŃimea tijelor de 40-60 cm, înfloresc în partea a doua a lunii mai iar florile enorme amintesc de bujor. LALELELE FRANJURATE Din ce în ce mai mulŃi oameni devin interesaŃi de acest tip de lalele, atât de mulŃi încât acestea au acum propriul lor grup. Trebuie reamintit însă că, deoarece aceste lalele sunt obŃinute prin mutaŃii din variate alte grupuri, înălŃimile şi perioadele de înflorire variază între ele. Singura caracteristică pe care o au în comun sunt petalele lor fin tăiate. LALELELE VIRIDIFLORA Aceste lalele, împreună cu cele franjurate, au fost îndepărtate din grupul lalelelor simple târzii, alcătuind acum, după noua clasificare adoptată în 1996 de "Royal General Bulbgrowers Association" din Olanda, grupuri separat. MulŃi cultivatori care caută plante neobişnuite, găsesc rapid ceea ce doresc printre lalelele acestui grup, deşi acesta este cel mai puŃin important. Ele sunt strâns înrudite cu lalelele simple târzii şi au moştenit, de asemenea, unele din caracteristicile acestora. Conturul floral este asemănător lalelei cu floare în formă de crin. Ceea ce face ca aceste lalele să fie atât de fascinante este faptul că petalele lor include şi culoarea verde, cel mai cultivat soi fiind Greenland. O altă trăsătură a acestor lalele este că florile lor rămân frumoase un timp îndelungat, 2-3 săptămâni, putându-se folosi cu succes ca flori tăiate. Lalele din grupa Darwin Lalelele din grupa Darwin provin din grupa Breeder de care se deosebesc prin colorit. Sunt foarte deosebite şi apreciate pretutindeni. Sunt soiuri cu epoci târzii de înflorire. Florile sunt foarte mari, bine formate, cu petale rotunjite la vârf, de culori strălucitoare, care merg de la alb până la o tonalitate aproape neagră şi cuprinde nuanŃe fine de roz, roşu-închis, orange-roşu, liliachiu. Petalele sunt foarte dense. Tijele florale sunt viguroase, atingând înălŃimea de 65-75 cm. Înflorirea are loc la mijlocul lunii mai, când cele timpurii si-au încheiat perioada de înflorire. Soiurile pentru forŃat din această grupă produc flori pentru tăiat toată iarna. Se folosesc cu succes, de asemenea, la amenajarea parcurilor şi grădinilor şi în cultură liberă pentru flori tăiate. Lalele din grupa Darwin hybrid

Acest grup a fost dezvoltat în Olanda, D.W. Lefeber a fost cel care a supravegheat începuturile timpurii ale acestui tip. El a încrucişat faimoasa Tulipa fosteriana "Madam Lefeber" cu variate soiuri din grupul de lalele cunoscut la acea dată sub denumirea de lalele Darwin. Rezultatul acestor înmulŃiri încrucişate a fost o serie de lalele care excelau datorită mărimii florilor şi tulpinilor robuste şi lungi. Când mugurii sunt încă imaturi, ei arată aproape ca mici piramide. Datorită acestor calităŃi şi-au făcut un nume în rândul florilor tăiate şi sunt cultivate intens în acest scop. Sunt foarte folosite şi în grădini. Aceste lalele preferă locurile adăpostite de vânt datorită înălŃimii lor. La început, singurele culori ale florilor erau portocaliu şi roşu, dar acum, există varietăŃi galbene, roz, precum şi varietăŃi cu petale pistruiate şi dungate în diverse culori. Lalele din grupa Breeder În această grupă intră soiurile vechi olandeze cu înflorirea târzie. Ele au florile colorate diferit, predominând galbenul, portocaliul, violetul şi brunul.Tija florală este viguroasă, înaltă de 65-75 cm, purtând în vârf flori.Are aceeaşi epocă de înflorire cu lalele Darwin cu care se aseamănă. Se ofilesc repede la soare iar înflorirea în anii cu primăvară călduroasă este scurtă. Se recomandă pentru amenajarea parcurilor la semiumbră şi pentru flori tăiate.

Lalele din grupa Cottage Soiurile din această grupă au forma florilor ovoidă, cupiformă sau de ceaşcă. Majoritatea soiurilor au flori galbene de diferite nuanŃe Soiurile se caracterizează printr-o epocă târzie de înflorire şi se folosesc pentru parcuri şi în cultură liberă pentru flori tăiate. Lalele cu flori în formă de crin Soiurile din această grupă au rezultat din încrucişarea lalelei Retroflexa, care are forma florii de crin, cu soiurile din grupa lalelelor Darwin. Petalele sunt înguste, cu vârful ascuŃit, îndoit în afară. Înflorirea are loc odată cu lalelele Darwin. Au tija flexibilă şi rezistentă, iar înălŃimea poate atinge 65 cm. Sunt foarte decorative, datorită formei curioase a petalelor şi a coloritului lor aprins şi pur: alb, roz, roşu-galben. Se folosesc în parcuri, în cultură liberă, pentru flori tăiate şi în cultură forŃată. Lalele din grupa papagal Au florile mari, foarte interesante datorită formelor lor fantastice, neregulate. Au efect deosebit în grădini şi parcuri unde înfloresc în luna mai. Soiurile care se pretează la forŃat pot fi introduse în sere între 10 şi 15 ianuarie. Florile au, la început, forma ovoid alungită apoi, când se deschid petalele, acestea ajung să aibă în medie 10 cm lungime, sunt ondulate, iar pe margine franjurate. Culoarea florilor variază de la roşu-luminos la cel mai curat galben-închis; uneori, unicolore, bălŃate sau striate, marginate sau colorate cu desene în formă de flăcări, de un verde ca iarba, verde-gălbui sau portocaliu. Frunzele sunt lat-ovale, de un verde-palid-albăstrui, foarte ondulate. Datorită greutăŃii florilor, tulpina flexibilă şi înaltă (60-70 cm) se încovoaie. Florile din această grupă nu înfloresc însă în fiecare an. Florile tăiate creează un decor elegant. Această grupă cuprinde atât soiuri pentru parcuri şi cultură liberă cât şi pentru cultura forŃată. LALELE DUBLE TÂRZII SAU LALELE CU FLORI ÎN FORM Ă DE BUJORI Datorită aspectului pe care-l au, aceste lalele sunt cunoscute şi sub denumirea de lalele cu flori în formă de bujor. Florile, care sunt întotdeauna largi şi duble, pot ajunge la un diametru de 13 cm. Deoarece florile pot fi afectate de condiŃiile extreme climaterice (ploaie şi vânt), este de recomandat plantarea lor în locuri adăpostite. Lalele duble târzii se comportă excepŃional în regiunile cu ierni reci şi primăveri târzii. Unele soiuri se pretează la cultura forŃată. În această grupă întră soiurile cu flori bătute de provenienŃe diferite, care înfloresc mai târziu decât lalele bătute timpurii, în medie cu 10 zile. Culoarea florii este variată: roz, roşu, alb-pur, orange, liliachiu. LALELE DIN GRUPA REMBRANDT Aceste lalele sunt o categorie specială de lalele târzii. Cu mult timp în urmă, în secolele XVII şi XVIII, lalelele cu petale ce dispun modele de flacără costau extrem de mult. Acum ştim că aceste modele sunt rezultatul anumitor infecŃii virotice, dar, în acele timpuri conceptul de virus era complet necunoscut. Câteva din aceste lalele clasice Rembrandt pot fi încă văzute în faimoasa grădină "Hortus Bulborum" din oraşul olandez Limmen. Sunt pprovenite din lalele Darwin si Breeder, de care se deosesbesc printr-o talie mai mică şi coloritul combinat al florilor. LALELE MULTIFLORE Unele lalele au mai mult de o floare pe tulpină. De fapt, o singură tulpină se dezvoltă din bulb care apoi se divide în mai multe tulpini mai mici, fiecare cu câte o floare. Depinzând de mărimea bulbului şi de cultură, fiecare bulb va produce 3-7 flori. Lalelele multiflore variază larg în înălŃime şi mărimea florii. Trebuie, de asemenea, menŃionat că mai multe lalele din seria botanică T. tarda , T. turkestanica sunt, de asemenea, multiflore, dar nu sunt luate în considerare aici. Aceste lalele dau un efect spectaculos în grădină şi ca flori tăiate. Caracteristicile principale sunt faptul că au perioada de înflorire târziu iar înălŃimea medie a plantei este de 35-37 cm.

CAPITOLUL II. MARKERII MOLECULARI UTILIZA łI LA GENUL TULIPA

2.1.UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI ÎN AMPRENTAREA GENETICĂ ŞI ÎN IDENTIFICAREA VARIABILIT ĂłII GENETICE A GENULUI TULIPA Utilizarea markerilor moleculari, prin analiza genomurilor, a determinat o ascensiune puternică a eficienŃei activităŃilor de ameliorare atât la plante cât şi la animale, precum şi aplicabilitatea practică în : identificarea şi taxonomia genetică a indivizilor, realizarea hărŃilor genetice, clonarea unor gene importante, realizarea studiilor de filogenie (Vos P. şi colab.,1995). InterrelaŃiile de la nivel molecular generează funcŃiile de ereditate, variabilitate şi de determinare a caracterelor, ansamblu de funcŃii care asigură partea intrinsecă a existenŃei, heterogenităŃii şi continuităŃii materiei vii, în condiŃiile perpetuu variabile ale mediului ca parte extrinsecă de interacŃiune. Modul de comportare a caracterelor fenotipice reflectă întocmai modul de comportare a genelor corespunzătoare, motiv pentru care proprietăŃiile genelor pot fi studiate indirect prin analiza caracterelor fenotipice care devin astfel markeri. Markerii moleculari pun în evidenŃă diferenŃele dintre secvenŃele de nucleotide din ADN extras din indivizi diferiŃi, diferenŃe care nu sunt neapărat vizibile în fenotip. O singură nucleotidă diferită, dintr-o genă sau chiar din ADN repetitiv, poate determina formarea sau dispariŃia unui marker molecular (Jones

Fig.3 Lalele multiflore. 1),Soiul Happy Family; 2) Soiul OrangeBouquetteSoiul Georgette

1 2

3

Fig.2 Lalele Rembrandt

şi colab., 1997). Markerii moleculari spre deosebire de cei morfologici (controlează caractere morfologice uşor de evidenŃiat controlate genetic simplu -de o singură genă-) prezintă marele avantaj că sunt mult mai numeroşi şi nu perturbă fiziologia organismului. Markerii moleculari prezintă numeroase caracteristici importante, faptul că pot fi obŃinuŃi din orice Ńesut în orice etapă de dezvoltare a plantei, pot fi obŃinuŃi în număr nelimitat, sunt independenŃi de expresia fenotipică a genei, nu prezintă epistazie şi pleiotropie, se transmit mendelian dominant sau codominant, sunt independenŃi de condiŃiile de mediu şi sunt indiferenŃi fată de presiunea de selecŃie. Utilizarea tehnicilor moleculare nu implică renunŃarea la metodele şi tehnicile clasice de ameliorare, chiar dimpotrivă, fără observaŃiile fenotipice făcute în câmpul experimental este practic imposibilă stabilirea corelaŃiilor dintre rezultatele obŃinute la nivel molecular şi materialul biologic utilizat. În genetica populaŃiilor, utilizarea metodelor moleculare are ca scop detectarea diferenŃelor ereditare dintre indivizi. Simpla punere în evidenŃă a unui polimorfism genetic, este un scop în sine, geneticianul având marele rol de a interpreta rezultatul obŃinut şi de a demonstra stabilitatea ereditară a caracteristicii observate pentru a arăta, de exemplu că prin simpla prezenŃă a unei izoenzime migrate până la un nivel dat, intervin mai multe gene. Biologia moleculară cunoaşte în momentul actual o evoluŃie foarte rapidă şi consecinŃele pentru practica resurselor genetice şi difuzarea din ce în ce mai largă a acestui mijloc de analiză, impun o cunoaştere temeinică a acestei metode, a cărei actualitate imediată o justifică pe deplin (Stroe, 2005). Markerii prezintă următoarele utilizări extrem de importante :

�posibilitatea de a defini în mod eficient, într-o descendenŃă, starea alelică a unui locus al cărui studiu presupune observarea plantelor care trebuie eliminate (sterilitate masculă genică : trebuie eliminate plantele fertile înainte ca ele să antreneze polenizări) sau a cărei alelă cercetată este recesivă şi nu se evidenŃiază direct în fenotip (genele nanismului pe care dorim să-l conservăm printr-un lanŃ de retroîncrucişări în care părintele recurent este purtător al alelei dominante pentru talia normală). �analiza alogamiei şi în general, a schimburilor genice între populaŃiile vecine (cazul purităŃii porumbului hibrid realizat în parcele izolate, în principiu, de culturile vecine). Este suficientă prezenŃa uneia sau mai multor gene marker a căror stare alelică nu poate proveni decât de la donorii de polen exteriori şi de a găsi frecvenŃa acestor alele în populaŃiile de boabe produse de planta căreia dorim să îi analizăm procentul de alogamie sau la varietăŃile cărora dorim să le garantăm puritatea. �în cadrul shemelor de selecŃie care utilizează retroîncrucişări pentru a integra starea alelică a unei anumite gene într-un genotip dat (părintele recurent), fiecare retroîncrucişare diminuează jumătate din genomul încă heterozigot. Dacă se dispune de mai mulŃi markeri, dispersaŃi în mai multe zone ale genomului, se poate accelera procesul de izogenizare prin alegerea dintre plantele obŃinute din retroîncrucişare – dintre cele care conŃin alela donorului pentru caracterul selecŃionat (de exemplu, rezistenŃa verticală la un parazit inoculat)-pe acelea care sunt deja homozigote pentru starea alelică a părintelui recurent. �pentru protecŃia comercială a liniilor nou obŃinute, markerii moleculari constituind instrumente excelente în realizarea profilului genetic al unui soi.

EvidenŃierea diversităŃii genetice permite alegerea corectă şi rapidă a încrucişărilor pentru care se încearcă punerea în evidenŃă a efectelor reciproce şi găsirea în descendenŃă a eventualelor caracteristici cu ereditate maternă (sterilitatea masculă citoplasmatică). Studiul distanŃelor genetice între populaŃiile unei colecŃii poate permite descoperirea vigorii hibride prin încrucişarea unor forme îndepărtate, ştiind că un heterozis important este adesea asociat cu bogăŃia alelică a hibrizilor. Punerea în evidenŃă a organizării diferite la nivelul cromozomilor, în special prin studiul hibridărilor in situ cu sonde de cADN (ADN complementar ) marcate, permite vizualizarea anumitor sterilităŃi (mici inversii, translocaŃii) legate de diferenŃierile structurale ale genomului şi deci să se orienteze programul de selecŃie în direcŃia eliminării combinaŃiilor defectuoase prin restituirea homozigoŃiei structurale – programe de poliploidizare sau de creare a liniilor de adiŃie sau de substituŃie. În vederea unei gestionări corecte a resurselor genetice, în primul rând trebuie să se asigure o identificare riguroasă, fapt ce presupune o analiză taxonomică a diversităŃii, mai întâi la nivel intrespecific şi apoi, în mod special la nivel intraspecific. Studiul diversităŃii intraspecifice impune realizarea mai multor analize:

�fenotipice, bazate pe caracteristicile morfologice, fiziologice ale plantelor.

�genotipice, axate pe analize hibridologice, studii asupra variabilităŃii genetice a indivizilor şi populaŃiilor utilizând metode specifice (pedigree). �moleculare (analiza izoenzimatică, tehnici bazate pe analiza ADN, secvenŃializarea ADN, tehnicile moleculare utilizând markerii AFLP,RFLP, RAPD).

Aplicarea acestor metode permit obŃinerea unor date şi informaŃii detaliate şi cunoaşterea amănunŃită a fondului de resurse genetice existent şi a valorii sale de utilizare.

Variabilitatea fenotipică se bazează pe analiza morfologiei plantelor, cea genetică pe markerii moleculari. Markerii genetici sunt reprezentaŃi de orice diferenŃă genetică sau fenotipică care este specifică individului şi se transmite la descendenŃi, putând fi urmărită de-a lungul generaŃiilor şi sunt grupaŃi în trei categorii: markeri morfologici, markeri proteici şi markeri moleculari.

Markerii ADN evidenŃiază polimorfismul la nivelul ADN-ului nuclear şi citoplasmati iar markerii moleculari nu sunt influenŃaŃi de condiŃiile de mediu, fiind o măsură obiectivă a variabilităŃii, existând în intregul genom în numar nelimitat. Una dintre cele mai importante etape ale analizei moleculare se bazează pe stabilirea primerilor necesari pentru a evidenŃia diferenŃierile moleculare ale ADN şi gradul de înrudire a genotipurilor luate în studiu. In final, folosirea markerilor genetici va conduce la înlocuirea selecŃiei fenotipice pentru un caracter dorit cu selecŃia genelor care controlează respectivul caracter. Noile tehnici folosind markeri moleculari sunt utile pentru identificarea hibridului după o încrucişare interspecifică, putându-se face preselecŃia încă din stadii timpurii. În viitor, aplicaŃiile markerilor moleculari în vederea identificării diferitelor caractere vor accelera procesul de hibridare la genul Tulipa şi va determina o schimbare de esenŃă în programele de ameliorare pentru că în locul selecŃiei fenotipice pentru caracterul dorit se va face selecŃia genelor care controlează respectivul caracter. Acest tip de selecŃie permite identificarea genei importante urmărite încă fazele timpurii de creştere a plantelor, fapt ce asigură accelerarea şi eficientizarea întregului program de ameliorare.

2.2. MARKERII AFLP- (Amplified Fragment Length Polymorphism) – Polimorfisme de lungime ale fragmentelor amplificate

AFLP reprezintă o combinaŃie între metoda RFLP si tehnica PCR (Vos şi colab.,1995). După digestia ADN-ului cu enzime de restricŃie la capetele fragmentelor rezultate se ataşează secvenŃe dublu catenare specifice (adapters) cu ajutorul ADN ligazelor. Aceste secvenŃe împreună cu secvenŃele alăturate reprezentând situsul de restricŃie al enzimei vor constitui locurile de fixare ale primerilor în vederea amplificării prin PCR. La capetele 3' ale primerilor se vor adăuga anumite nucleotide care vor permite amplificarea selectivă a unei categorii de secvenŃe din setul de fragmente de restricŃie. Nu vor fi amplificate decât acele fragmente de restricŃie care au nucleotidele ce flanchează situsul de restricŃie complementare cu nucleotidele selective ale primerilor. Separarea produşilor de amplificare se realizează prin electroforeză în geluri de poliacrilamidă şi evidenŃiere prin autoradiografie. Mai recent se utilizează şi marcajul cu fluorescenŃă şi utilizarea secvenŃiatoarelor automate. Fragmentele de restricŃie care urmează să fie amplificate se obŃin cu ajutorul a două enzime de restricŃie EcoR I şi MseI (la una dintre ele situsul de restricŃie apare cu o frecvenŃă redusă în cadrul genomului –rare cutter, la cealaltă frecvenŃa este mare-frequent cutter). Prin metoda AFLP are loc amplificarea predominantă a acelor fragmente de restricŃie care au la unul din capete o secvenŃă rezultată ca urmare a fragmentării cu o enzimă “ frequent cutter ” şi la celălalt capăt cu o enzimă “ rare cutter ”. Numărul fragmentelor amplificate poate fi controlat prin alegerea enzimei şi prin numărul bazelor care se adaugă la capătul 3' al primerului. Cu o singură combinaŃie de enzime (una care taie la 6 baze şi cealaltă la 4 baze) este posibilă amplificarea a 100 000 de fragmente din care se pot selecta pentru fiecare reacŃie AFLP între 50 şi 100 de fragmente, fapt ce permite elaborarea unor hărŃi genetice cu o densitate mare şi într-un timp relativ scurt. De asemenea, la speciile cu un genom mare şi cu o rată redusă a polimorfismelor-cum este orzul- poate ajuta la realizarea unei hărŃi genetice mult mai complexe (Becker şi colab., 1995). Ca şi în cazul markerilor RAPD fragmentele de interes pot fi izolate în gel, purificate, clonate, secvenŃiate şi transformate în markeri SCAR cu ajutorul unor primeri specifici. Spre deosebire de metoda RAPD metoda AFLP are un grad mai ridicat de reproductibilitate, iar rezoluŃia fragmentelor este mult mai bună. Cel mai mare avantaj al metodei este sensibilitatea cu care poate depista polimorfismele ADN.

Faptul că permite identificarea mai multor puncte în care s-au produs mutaŃii este unul dintre motivele pentru care este preferată în defavoarea RFLP. La ora actuală, metoda este utilizată la identificarea markerilor genetici legaŃi de diferite gene ce determină rezistenŃa la agenŃi fitopatogeni (Thomas C. şi colab., 1995 ; Meksem K. şi colab., 1995 ;Schiemann A. şi colab., 1999) sau la stabilirea diversităŃii genetice dintre diferiŃi îndivizi (Russel şi colab.,1997 ; Fuentes şi colab.,1999 ; Abdalla şi colab.,2000).

2.3. MARKERII RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) – Polimorfisme de ADN amplificate

aleator În 1990 mai multe laboratoare au introdus o strategie nouă pentru amplificarea PCR a unor secvenŃe de ADN genomic. Ea utilizează unul sau doi primeri cu o secvenŃă arbitrară, bogaŃi în G şi C pentru a obŃine produşi de amplificare PCR din ADN genomic. Aceste tehnici care nu necesită informaŃii despre secvenŃă au fost numite : �analiza polimorfismelor ADN amplificate aleator (RAPD) (Williams şi colab.,1990); �amprenta obŃinută prin amplificarea ADN (DAF) (Caetano- Annolés şi cobab., 1991) ; �PCR cu primeri arbitrari (AT-PCR) (Welsh şi McClelland, 1990).

Natura polimorfă a secvenŃelor de ADN amplificate este la rândul ei redată de o nomenclatură polimorfă. S-a propus totuşi un termen unic, MAAP (multiple arbitrary amplicon profiling), care să descrie caracteristicile comune tehnicilor menŃionate mai sus.

Toate cele trei tehnici au în comun faptul că fragmentele de ADN necunoscute sunt amplificate cu primeri având o secvenŃă de nucleotide aleatoare. Fragmentele de ADN amplificate, numite în PCR ampliconi, rezultă prin fixarea primerilor la situsuri parŃial sau total complementare fiecărei catene de ADN. În timp ce nu se cunoaşte nimic despre identitatea şi contextul secvenŃei din care provine un anumit produs de amplificare, prezenŃa sau absenŃa lui în diferite organisme constituie o informaŃie importantă pentru evaluarea diversităŃii genetice şi a relaŃiilor de înrudire. În unele cazuri rezultă modele caracteristice unui anumit genotip, care sunt o adevărată amprentă genetică reprezentată asemănător codului de bare.

Analiza RAPD a fost prima dată descrisă de Williams şi colab. în anul 1990. Tehnic este cea mai simplă variantă a metodei PCR cu primeri arbitrari. În general se folosesc primeri cu 10 nucleotide şi cu un conŃinut în GC de cel puŃin 50%. Produşii de amplificare sunt separaŃi într-un gel de agaroză şi apoi sunt vizualizaŃi prin colorare cu bromură de etidiu.

Marcarea RAPD se bazează pe polimorfismul formelor parentale la nivel alelic în ceea ce priveşte produşii de amplificare obŃinuŃi prin utilizarea unui primer oligonucleotidic decamer ce îşi găseşte întâmplător la nivelul ADN-ului genomal situs de fixare într-o poziŃie care să permită realizarea amplificării.Pentru amplificare primerii trebuie să fie orientaŃi în poziŃie inversă, la o distanŃă nu prea mare, aproximativ 2-3 kb unul de celălalt. Optimizarea protocolului RAPD poate fi o problemă extrem de dificilă, modificarea componentelor de reacŃie sau a programului utilizat la amplificare putând avea consecinŃe imprevizibile. Cel mai mare impact asupra rezultatelor în au atât tipul de polimerază şi thermocycler-ul utilizat cât şi primerul şi temperatura de fixare a acestuia. Metoda RAPD a fost foarte mult criticată în privinŃa reproductibilităŃii ei. Ca şi în cazul altor metode bazate pe tehnica PCR, RAPD necesită menŃinerea constantă a condiŃiilor de reacŃie. Uneori pentru mărirea specificităŃii şi eficienŃei reacŃiei în amestecul de reacŃie se poate adăuga DMSO, Tween, BSA. În urma cercetărilor s-a descoperit că cel puŃin 95% din fragmentele RAPD se comportă ca markeri dominanŃi, în timp ce procentul rămas de 5% se comportă codominant, ca două alele de mărimi diferite.Pentru depăşirea acestor limite, markerii RAPD de tip dominant pot fi convertiŃi în markeri RFLP de tip codominanŃi prin utilizarea benzilor polimorfe ca şi sonde în hibridarea moleculară. Markerii RAPD pot fi convertiŃi şi în markeri SCAR de tip PCR codominant, banda polimorfă poate să fie secvenŃiată iar pe această bandă se construiesc primeri specifici care să realizeze amplificarea de tip PCR Nivelul polimorfismelor depistate prin analiza RAPD este în general similar cu acela obŃinut prin analiza RFLP (polimorfisme de lungime ale fragmentelor de restricŃie). În general s-a ajuns la un consens în ceea ce priveşte reproductibilitatea analizei RAPD, acceptându-se că aceasta este mai mare în cadrul aceluiaşi laborator. Rezultatele devin îngrijorătoare atunci când datele trebuie transferate de la un laborator la altul. Din această cauză trebuie acordată o deosebită atenŃie standardizării analizei între colaboratori.

CAPITOLUL III. MATERIAL ŞI METOD Ă 3.2. MATERIALUL BIOLOGIC UTILIZAT

Materialul biologic utilizat în efectuarea analizelor moleculare este extrem de valoros fiind reprezentat de 21 de specii unice pe plan mondial, 6 hibrizi, 13 cultivare , precum şi de cei mai importanŃi doi genitori utilizaŃi în programele de ameliorare Kees Nelis (sensibil la virusul TBV dar rezistent la Fusarium) şi Cantata (rezistent la TBV dar sensibil la Fusarium) şi descendenŃii F1 (111) ai acestei combinaŃii hibride (Kees Nelis x Cantate). Principalele specii şi cultivare au provenit de la institutul Plant Research International din Wageningen, care are cea mai vastă colecŃie de specii de lalele din lume iar 11 probe au fost recoltate de la Grădina Botanică ″Alexandru Borza″ din Cluj-Napoca : SPECII:

• T. praestans Romania • T. kaufmanniana ‘’ Stresa’’ Romania • T. kaufmanniana ‘G. Verdi’’ (81129) • T. greigii ‘’Zampa’’ Romania • T. fosteriana ‘’ Sweetheart’’ Romania • T. fosteriana ‘’ Golden Emperor’’ Romania • T. fosteriana ‘’’Purissima’’ Romania • T. fosteriana ‘’ Juan’’ • T. fosteriana ‘’Princeps’’ • T. fosteriana ‘’ Madame Lefeber’’ • T. fosteriana 102 Juan x Cantate • T. fosteriana 112 Juan x Cantate • T. fosteriana 122 Cantate x Juan • T. fosteriana 144 Princeps x ML • T. fosteriana 148 Cantate x Princeps • T. tubergeniana 97419 • T. hungarica 97423 • T. albertii 97274-3 • T. turkestanica 97297-1 • T. aitchisonii 20425 • T. tarda 73125-4

HIBRIZI: • Apeldoorn Romania • 76261-24 Cantate x Verdi • Praestans x Albertii (030121) • Kess Nelis x Cantate 9 • Kess Nelis x Cantate 64 • 89191 KN x Cantate

CULTIVARE: • Ile de France • Christmas Marvel • Leen vd Mark • Bellona • Kees Nelis • Ballerina Romania • Spring Green Romania • Queen of Night Romania • Monte Carlo Romania • Alliance • Escape • Yellow Flight

Frunzele recoltate au fost aduse în laborator, s-au ambalat în pungi speciale de plastic, s-au etichetat şi s-au stocat la temperatura – 800 C în congelator. Izolarea ADN-ului am realizat-o pe baza protocolului de extracŃie ADN descris de Pieter VOS şi colab. 1995 utilizată pentru fingerprinting.

Cuantificarea şi verificarea calităŃii ADN-ului din fiecare probă a fost realizată prin migrare în gel de agaroză de concentraŃie 0.8% în prezenŃa bromurii de Etidiu (1 µl / 100 ml gel agaroză), într-o soluŃie tampon de 0,5 x TBE, timp de 1.30 h la 60 V. Vizualizarea fragmentelor de ADN din gel, s-a realizat în lumina UV cu aparatul UV Alpha Innotech Imager.

Pentru probele în care s-a constatat prezenŃa ARN-ului, s-a optat pentru repetarea izolării ADN-ului pe baza aceluiaşi protocol de extracŃie ADN descris de Pieter VOS şi colab. 1995 utilizat pentru fingerprinting. Aceste probe au fost din nou cuantificate prin migrare în gel de agaroză de concentraŃie 0.8% în prezenŃa bromurii de Etidiu (1 µl / 100 ml gel agaroză) , într-o soluŃie tampon de 0,5 x TBE, timp de 1.30 h la 60 V.

Prin utilizarea acestui protocol de izolare a ADN-ului se poate aprecia faptul că toate probele analizate au prezentat o puritate foarte bună, în unele probe fiind chiar necesară diluŃia prin adăugarea suplimentară de TE ,aşa cum a fost prezentată anterior. Din cercetările efectuate până în prezent se poate constata faptul că protocolul de extracŃie ADN descris de Pieter VOS şi colab. 1995 este cel mai eficient în cazul speciei Tulipa.

3.3. METODELE DE LUCRU

3.3.1.Metoda RAPD -random amplified polymorphic DNA (ADN polimorfic amplificat la întâmplare)

Materialul biologic utilizat în analizele moleculare a fost constituit din 10 specii si 5 cultivare. Principalele specii şi cultivare au provenit de la institutul Plant Research International din Wageningen, care are cea mai vastă colecŃie de specii de lalele din lume iar 3 probe au fost recoltate de la Grădina Botanică ″Alexandru Borza″ din Cluj-Napoca :

• T. fosteriana ‘’Princeps’’ • T. praestans R • T. kaufmanniana ‘’ Stresa’’ R • T. greigii ‘’Zampa’’ R • T. tubergeniana 97419 • T. hungarica 97423 • T. albertii 97274-3 • T. turkestanica 97297-1 • T. aitchisonii 20425 • T. tarda 73125-4 • Kess Nelis • Cantate • Ile de France • Christmas Marvel • Leen vd Mark

Verificarea cantităŃii de ADN din probe s-a realizat cu ajutorul markerului ADN “λ Phage”.

Pentru aceasta au fost pregătite două concentraŃii diferite ale markerului ADN “λ Phage” (100ng /µl). Proba 1 - 10µl marker λ Phage = 10 µl ⇒ 100ng Proba 2 - 5µl marker λ Phage + 5µl apa bidistilată sterilă = 10µl total ⇒ 50ng 2 µl din fiecare probă de ADN au fost mixaŃi cu 10µl Loading Buffer (Loading Dye 1: 6).

Cuantificarea şi verificarea calităŃii ADN-ului din fiecare probă a fost realizată prin migrare în gel de agaroză de concentraŃie 0.8% în prezenŃa bromurii de Etidiu (1 µl / 100 ml gel agaroza) , într-o soluŃie tampon de 0,5 x TBE , timp de 1.30 h la 60 V.

Prin utilizarea acestui protocol de izolare a ADN-ului descris de Pieter VOS şi colab. 1995 utilizată pentru fingerprinting, se poate aprecia faptul că toate probele analizate au prezentat o puritate foarte bună. 3.3.7.1. Componentele amestecului de reacŃie

Amestecul de reacŃie RAPD a fost preparat în hota sterilă, (pentru a evita contaminarea cu ADN străin), pe gheaŃă şi repartizat în tuburi Eppendorf de 0.5 ml. Amestecul de reacŃie de 25 de µl conŃine: Supertaqbuffer (10x) 2.5 µl Supertaq 0.02 µl (5U/ µl) dNTP(10m) 0.25 µl ADN 2.5 µl Primer (OPERON) 0.30 µl (100ng/ µl) miliQ H2O 19.5 µl 1 mM DTT 50% glicerol 3.3.7.2. Primerii utilizaŃi pentru analiza RAPD

Tabelul 2 PRIMERII UTILIZAłI PENTRU ANALIZA RAPD

Nr. Primer OPERON

SecvenŃa nucleotidică (5’-3’)

Numărul de benzi polimorfice

1 OPH-09 TGTAGCTGGG 15

2 OPH-18 GAATCGGCCA 7-15

3

OPC-08 TGGACCGGTG Nu au existat produşi de amplificare

Amplificarea s-a realizat cu Mastercycler, utilizând un program PCR optimizat pentru speciile

cu genom mare (elaborat de Laboratory of Plant Breeding, Plant Research International, Wageningen 2004) care durează aproximativ 7 ore: 45 cicluri 1 min. la 92OC 2 min. 35OC de la 35OC la 72OC temperatura creşte cu 0.2OC/secundă. 2 min. 72OC Ataşarea primerilor 10 min. la 72OC Păstrarea probelor ∞ 10OC

După amplificare, 10 µl din fiecare probă au fost mixaŃi cu 2 µl tampon de încărcare (Blue Load Dye) şi încărcate cu o micropipetă în godeuri. 5 µl Marker 1 KB (Invitrogen) s-a încărcat în primul godeu. Migrarea produşilor de amplificare s-a realizat într-un gel de agaroză de concentraŃie 1%, timp de 2.30 h la 50 V, într-o soluŃie tampon de 0,5 x TBE.

Având în vedere că migrarea fragmentelor liniare de ADN la voltaj redus este proporŃională cu voltajul aplicat, pentru o mai bună diferenŃiere a fragmentelor, în următoarele analize RAPD s-a optat pentru migrarea produşilor PCR într-un gel de agaroză de o concentraŃie mai mare, 1.5%, la un voltaj redus 30 V, timp de 6 ore, într-o soluŃie tampon 0,5 x TBE.

Este esenŃial ca din acelaşi volum total preparat să se folosească tamponul de electroforeză atât pentru prepararea gelului, cât şi cel destinat cuvei pentru migrare, deoarece mici diferenŃe de pH sau concentraŃie ionică pot creea fronturi în gel, care afectează puternic mobilitatea fragmentelor de ADN.

Colorarea gelului s-a făcut într-o soluŃie de bromură de etidiu 1 µl/100ml gel, iar vizualizarea gelului s-a realizat în lumină UV iar imaginea gelului a fost preluată cu sistemul ALPHA IMAGE şi salvată în baza de date a calculatorului.

Primerul OPC-08 a fost eliminat din studiu, datorită faptului că în urma amplificării repetate cu acest primer,nu am obŃinut produşi de amplificare.

Atât cu primerul OPH-09 cât şi cu primerul OPH-18 , de la care ne-am fi aşteptat să obŃinem rezultate compatibile cu cele deja obŃinute în cazul genului Lilium (tot o specie cu genom mare) numărul produşilor de amplificare a variat extrem de mult la fiecare migrare.

Pentru realizarea dendrogramei cu programele Mega3.1 si FreeTree au fost utilizate distanŃele genetice calculate cu ajutorul coeficientului lui Jaccard si lui Nei Li (Saitou şi Nei, 1987).

Benzile polimorfice au fost marcate în programul special de prelucrare a datelor. Cu primerul OPH-09 s-au evidenŃiat un număr de 15 benzi polimorfice iar primerul OPH-18 a pus în evidenŃă 7-15 benzi polimorfice în funcŃie de amplificare.

Rezultatele au fost analizate cu programul Microsoft Excel.DistanŃele genetice sunt reprezentate în tabelele următoare iar indicii de similaritate direct pe figura dendrogramei obŃinute. Speciile sunt mai strâns înrudite cu cât valorile distanŃelor genetice sunt mai mici.

Apropierea genetică între speciile luate in studiu, stabilită pe baza matricei distanŃelor genetice şi a algoritmului Neighbor Joining Tree, sunt reprezentate sub forma unei dendrograme.

3.3.7.4. ConstrucŃia dendrogramei ConstrucŃia dendrogramei s-a realizat cu ajutorul programului MEGA 3.1 si a programului

FreeTree. În cadrul dendrogramei s-au evidenŃiat 2 grupuri principale. Primul grup (A) cuprinde speciile

Tulipa tarda 73125-4, Tulipa albertii 97274-3 şi Tulipa praestans iar cel de al II-lea grup (B) cuprinde speciile T. fosteriana ‘’Princeps’’, T. kaufmanniana ‘’ Stresa’’ R, T. greigii ‘’Zampa’’ R, T. tubergeniana 97419, T. hungarica 97423, T. turkestanica 97297-1, T. aitchisonii 20425 şi cultivarele Kess Nelis, Cantate, Ile de France, Christmas Marvel, Leen vd Mark .

În ceea ce priveşte acest studiu comparativ a celor zece specii cu unele dintre cele mai importante cinci cultivare se poate remarca faptul că cele mai apropiate genetic sunt Ile de France şi Christmas Marvel cu o distantă genetică de 0,2.

Între restul speciilor luate în studiu s-au constatat distanŃe genetice mari şi foarte mari. Între specia T. fosteriana ‘’Princeps’’şi Tulipa praestans, T. kaufmanniana ‘’ Stresa’’, T. greigii ‘’Zampa’’, Tulipa tubergeniana 97419, Tulipa albertii 97274-3, Tulipa turkestanica 97297-1, Tulipa tarda, Kess Nelis existând distanŃe genetice chiar de 1.

Acest lucru se datorează în principal originii diferite a materialului biologic luat în studiu şi a fondului genetic extrem de diferit al acestei specii.

O problemă majoră o constituie faptul că primerii utilizaŃi amplifică doar ADN-ul de la anumite specii şi cultivare, niciodată amplificând ADN-ul de la toate variantele luate în studiu. Acest lucru se datorează, credem noi, şi datorită faptului că doar un număr foarte redus de primeri (s-au testat un numar de peste 50 primeri OPERON care nu amplificat, van Heusden şi colab, 2003) au amplificat şi au generat benzi polimorfe, astfel că la realizarea dendrogramelor s-au putut utiliza doar 2 primeri.

Toate aceste probleme majore ale analizei RAPD pe care le-am întâmpinat au determinat focalizarea cercetărilor noastre spre markerii AFLP. 3.3.2.Tehnica AFLP(Amplified Fragment Lenght Polimorphism)- Polimorfisme de lungime ale fragmentelor amplificate 3.3.2.1.Principiul tehnicii AFLP

AFLP reprezintă o combinaŃie între metoda RFLP şi tehnica PCR (Vos şi colab.,1995). Metoda a fost elaborată în compania privată olandeză KEYGENE de către Pieter VOS şi colaboratorii în anul 1995. Tehnica AFLP se bazează pe selecŃia unor fragmente de restricŃie prin digestia ADN-ului genomal care este pusă în evidenŃă prin amplificare utilizând tehnica PCR. Principalul avantaj al metodei este gradul ridicat de reproductibilitate,având capacitatea de a depista prezenŃa sau absenŃa fragmentelor de restricŃie indiferent de complexitatea ADN-ului (mărimea genomului) iar rezoluŃia fragmentelor este foarte bună. Cel mai mare avantaj al metodei este sensibilitatea cu care poate depista polimorfismele ADN datorită numărului mare al fragmentelor de restricŃie vizualizate simultan.

Tehnica AFLP presupune parcurgerea următoarelor etape: • digestia ADN-ului cu enzime de restricŃie. • atasarea la capetele fragmentelor rezultate a secvenŃelor dublu catenare specifice (adapters) cu

ajutorul ADN ligazelor. Aceste secvenŃe împreună cu secvenŃele alăturate reprezentând situsul de restricŃie al enzimei vor constitui locurile de fixare ale primerilor în vederea amplificării prin PCR. La capetele 3' ale primerilor se vor adăuga anumite nucleotide care vor permite amplificarea selectivă a unei categorii de secvenŃe din setul de fragmente de restricŃie.

Fig.4 Principiul tehnicii AFLP Nu vor fi amplificate decât acele fragmente de restricŃie care au nucleotidele ce flanchează situsul de restricŃie complementare cu nucleotidele selective ale primerilor.

Separarea produşilor de amplificare se realizează prin electroforeză în geluri de poliacrilamidă şi evidenŃiere prin autoradiografie. Recent se utilizează marcajul cu fluorescenŃă şi utilizarea secvenŃiatoarelor automate, metoda care a fost aplicată şi în prezenta teză realizată în cadrul Laboratorului de Genetică moleculară (LI-COR Laboratory, Departamentul de ameliorarea plantelor) de la Plant Research International, Wageningen. Avantajul utilizării primerilor marcaŃi fluorescent este determinat de creşterea eficienŃei prin reducerea timpului total până la obŃinerea rezultatelor şi prin reducerea costurilor.

Fragmentele de restricŃie care urmează să fie amplificate se obŃin cu ajutorul a două enzime de restricŃie EcoRI şi MseI (la una dintre ele situsul de restricŃie apare cu o frecvenŃă redusă în cadrul genomului –rare cutter, la cealaltă frecvenŃa este mare-frequent cutter). Utilizarea numai a enzimelor ce generează fragmente scurte (frecquent cutter) ar determina apariŃia unui număr mult prea mare de fragmente pentru electroforeza în gel. Ulterior, o secvenŃa de ADN specifică este legată la unul din capetele fragmentelor de ADN şi o alta la capătul celălalt. Aceste secvenŃe, împreună cu locurile de restricŃie adiacente, servesc ca loc de ataşare pentru primerii PCR. Primerii sunt în asa fel sintetizaŃi pentru a putea identifica secvenŃele adăugate. Prin metoda AFLP are loc amplificarea predominantă a acelor fragmente de restricŃie care au la unul din capete o secvenŃă rezultată ca urmare a fragmentării cu o enzimă “ frequent cutter ” şi la celălalt capăt cu o enzimă “rare cutter ”. Numărul fragmentelor amplificate poate fi controlat prin alegerea enzimei şi prin numărul bazelor care se adaugă la capătul 3' al primerului.

Cu o singură combinaŃie de enzime (una care taie la 6 baze şi cealaltă la 4 baze) este posibilă amplificarea a 100 000 de fragmente din care se pot selecta pentru fiecare reacŃie AFLP între 50 şi 100 de fragmente, fapt ce permite elaborarea unor hărti genetice cu o densitate mare şi într-un timp relativ scurt. De asemenea, la speciile cu un genom mare şi cu o rată redusă a polimorfismelor-cum este orzul- poate ajuta la realizarea unei hărŃi genetice mult mai complexe (Becker şi colab., 1995). Ca şi în cazul markerilor RAPD fragmentele de interes pot fi izolate în gel, purificate, clonate, secvenŃiate şi transformate în markeri SCAR cu ajutorul unor primeri specifici. Faptul că permite identificarea mai multor puncte în care s-au produs mutaŃii este unul dintre motivele pentru care este preferată în defavoarea RFLP. Un alt avantaj il constituie şi faptul că nu necesită neapărat informaŃii anterioare privind structura ADN. La ora actuală, metoda este utilizată la identificarea markerilor genetici legaŃi de diferite gene ce determină rezistenŃa la agenŃi fitopatogeni (Thomas şi colab., 1995 ; Meksem şi colab., 1995; Schiemann şi colab., 1999) sau la stabilirea diversităŃii genetice dintre diferiŃi îndivizi (Russel şi colab., 1997 ; Fuentes şi colab., 1999 ; Abdalla şi colab., 2000). Tehnica AFLP prezinta doar cateva dezavantaje, dupa cum urmeaza :

• metoda este dificil de realizat tehnic. • metoda este destul de laborioasă. • analiza AFLP implică costuri ridicate.

În cazul speciilor cu genom mare cum este şi genul Tulipa utilizarea celorlalŃi markeri moleculari nu şi-au dovedit utilitatea din următoarele considerente: Markerii RFLP au avut o rată redusă a polimorfismelor iar din cauză că în gel nu poate fi încarcată o cantitate suficientă de ADN, este foarte dificil de realizat detectarea locilor aflaŃi într-o singură copie (De Jong, 1997). Markerii RAPD prezintă dezavantajul că au o reproductibilitate redusă din cauza utilizării unor primeri decameri care generează polimorfisme ADN amplificate aleator. Markerii SSR constituie repetiŃii în tandem ale unor secvenŃe di, tri sau tetra nucleotidice. Prezintă numeroase avantaje datorită faptului că sunt foarte polimorfici, sunt codominanŃi, permiŃând identificarea tuturor alelelor. În cazul speciilor cu genom mare, principalul dezavantaj al acestor markeri microsatelit constă în faptul că identificarea microsateliŃilor şi sinteza primerilor se face destul de greu si cel mai adesea nu se poate face asocierea cu anumite caracteristici. Tehnica AFLP constă în principal în parcurgerea următoarelor faze:

• pregătirea matriŃei ADN. • amplificarea fragmentelor. • analizarea gelului.

Un aspect deosebit de important este calitatea ADN-ului utilizat în analizele AFLP. Pentru a avea reproductibilitate şi a elimina "falsele" polimorfisme este foarte important ca ADN-ul să fie complet digerat de enzimele de restricŃie în toate situsurile specifice. În caz contrar poate apărea un profil polimorf care poate să se datoreze unei digestii incomplete a ADN-ului. 3.3.2.2.1. ObŃinerea matriŃei primare: digestia ADN-ului (restricŃia) şi ataşarea adaptorilor

Digestia ADN-ului cu ajutorul celor două enzime de restricŃie rare- cutter (EcoRI) şi frequent –cutter (MseI), urmată de ataşarea la capetele fragmentelor rezultate a secventelor dublu catenare specifice (adapters) cu ajutorul ADN ligazelor constituie matri Ńa primară. RestricŃia ADN a fost efectuată utilizându-se enzimele EcoRI (G/AATTC) şi MseI (T/TAA) provenite de la compania GIBCO Life Technologies.

În amestecul de reacŃie pentru digestia ADN-ului-ataşarea adaptorilor este necesar utilizarea unei soluŃii tampon denumită RL-buffer (Restriction Ligation buffer) care este mai mult sau mai puŃin similară cu “ One-Phor-All “buffer şi conŃine următoarele :

• 10 mM Tris.HAc pH 7.5 • 10 mM MgAc • 50 mM KAc • 5 mM DTT • 50ng/µl BSA • MilliQ H 2O

RestricŃia ADN- ataşarea adaptorilor are loc simultan. Legarea adaptorilor între ei nu poate să apară deoarece aceştia nu sunt fosforilati. Dacă fragmentele omoloage, tăiate de enzimele de restricŃie se reataşează, unul cu altul, ele sunt tăiate din nou de către enzimele de restricŃie. CombinaŃiile fragment-adaptori nu pot fi niciodata tăiate pentru că secvenŃa acestei combinaŃii nu mai conŃine situsul de restricŃie specific enzimei.

A fost pregătit un Master plate (cu 96 godeuri) în care au fost adăugati 10.0 µl ADN (50 ng/µl) din fiecare probă şi 40.0 µl mastermix care conŃine următoarele componente: 5 UEcoRI 0.5 µl EcoRI (10 U/µl) 5 UMseI 0.5 µl MseI (10 U/µl) adaptor EcoRI 1.0 µl EcoRI adaptor (5 pMol/µl) adaptor MseI 1.0 µl MseI adaptor (50 pMol/µl) 10mM ATP 1.0 µl Buffer 10 µl 5 x RL-buffer Enzime 1.0 µl 1UT4 DNA ligase(Gibco 1Uµl) MilliQ H 2O 25.0 µl VOLUMUL TOTAL 40 µl Se incubează timp de 3 ore la temperatura de 37°C. Matri Ńa primară se diluază de 10 ori cu T0.1E buffer înainte de preamplificare.

Structura adaptorilor utilizaŃi, proveniŃi de la compania Keygene ,este urmatoarea: EcoRI adaptor : 5’- biotina- CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5’ MseI adaptor: 5’-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5’ Pentru a se diferenŃia mai vizibil amprenta ADN la specia Tulipa s-a impus utilizarea unor probe cu ADN provenit de la tomate si orz. 3.3.2.2.2. Preamplificarea

Preamplificarea are scopul de a genera o sursă aproape nelimitată a ADN-ului din matriŃa secundară, care apoi urmează a fi utilizat în amplificarea selectivă. În plus, preamplificarea are rolul de a verifica calitatea produsilor PCR (în sensul că produşii de amplificare trebuie să se situeze până la 500 bp).

În cazul speciilor cu genom mare, se vor utiliza la preamplificare primeri cu o nucleotidă selectivă, fapt ce vizează o reducere a numărul fragmentelor precum şi reducerea fundalului nespecific.

În cazul plantelor cu genom mic şi foarte mic (< 500bp) preamplificarea se poate realiza cu

primeri nespecifici care nu conŃin nucleotide selective. A fost pregătit un Master Plate în care au fost adăugaŃi 5 µl ADN din matriŃa primară (diluat de 10 ori cu T0.1E buffer) din fiecare probă şi 15 µl din mastermixul care conŃine: PRIMER / dNTP MIX : 30 ng primer Eco 01 nemarcat 0.6 µl (50 ng/µl) 30 ng primer Mse 16 nemarcat 0.6 µl (50 ng/µl) 5 mM dNTPs 0.8 µl (Invitrogen) 10 x Super buffer 2.0 µl (SphaeroQ) SuperTaq (5 U/µl) 0.08 µl (SphaeroQ) MilliQ H 2O 11.0 µl VOLUMUL TOTAL 15.0 µµµµl SecvenŃa nucleotidică a primerilor utilizaŃi a fost:

E 01: 5’- GAC TGC GTA CCA ATT C A- 3’ M 16: 5’- GAT GAG TCC TGA GTA ACC- 3’

Programul de Termocycler utilizat pentru preamplificare :

(24 de cicluri): Denaturare - 30 secunde la 94oC Ataşarea primerilor - 30 secunde la 56oC Extensia - 60 secunde la 72oC La terminarea ciclurilor, probele au fost menŃinute timp de 5 minute la 72oC. 3.3.2.2.3. Verificarea preamplificării (calitatea produşilor PCR) 10 µl de produs de preamplificare din fiecare probă au fost mixaŃi cu 2 µl Loading Buffer (Orange G). 5 µl de 1 kb DNA Ladder (Invitrogen) au fost încarcati în gel după fiecare a 10-a probă. Probele de ADN, se prepară în tampon de încărcare colorat, pentru a ajuta încărcarea gelului şi pentru a urmări vizual procesul de migrare.Colorantul folosit migrează electroforetic spre anod. Produşii de preamplificare optimi pentru analiza AFLP trebuie să se situeze între 100-500bp .Albastru de bromfenol migrează de circa 2,2 ori mai repede decât xilen-cianolul FF, indiferent de concentraŃia agarozei. Raportat la ADN, albastru de bromfenol migrează aproximativ cu aceeaşi viteză ca şi fragmentele de ADN dublu catenare liniare de 300 pb în 0,5 TBE.

Din acest considerent se va utiliza ca şi tampon de încărcare Orange G deoarece acest colorant migreaza cu o viteză mai mare de 500 bp.

Verificarea calităŃii produşilor PCR din fiecare probă a fost realizată prin migrare în gel de agaroză de concentraŃie 0.8% în prezenŃa bromurii de Etidiu (1 µl / 100 ml gel agaroză), într-o soluŃie tampon de 0,5 x TBE , timp de 1.30 h la 60 V. Vizualizarea fragmentelor de ADN din gel, s-a realizat în lumina UV cu aparatul UV Imager. Produşii de preamplificare s-au încadrat în valorile optime de până la 500 bp.

3.3.2.2.4. Amplificarea selectivă cu primeri marcaŃi fluorescent cu IRD 700 şi IRD 800 Amplificarea selectivă a fost efectuată cu ajutorul primerilor care conŃineau 3 si 4 nucleotide selective adiŃionale. Primerul EcoRI+3 a fost marcat fluorescent cu IRD 700 sau IRD 800 (MWG Biotech) la capătul 5’. Fiecare dintre coloranŃi a fost "vizibil" numai pentru unul dintre laserele care au asigurat preluarea imaginii gelului. Pentru această amplificare selectivă a fost utilizat ADN rezultat din etapa anterioară după ce a fost diluat în proporŃie de 1/10 cu MilliQ H2O. Din fiecare probă amplificată au fost luaŃi câte 5 µl ADN. A fost pregatit următorul mastermix necesar reacŃiei de amplificare: IRD 700 IRD800 primer Mse nemarcat (50 ng) 0.3 µl 0.3 µl primer Eco marcat fluorescent (1 pmol/µl) 0.5 µl 0.6 µl dNTPs ( 5 mM) 0.4 µl 0.4 µl 10 X SB (Super buffer, SphaeroQ) 1.0 µl 1.0 µl MilliQ H 2O 2.8 µl 2.7 µl Taq-polimeraza (SuperTaq 5 U/µl) 0.04 µl 0.04 µl 5.0 µl 5.0 µl Din acest mastermix au fost luaŃi câte 5 µl şi adăugaŃi peste cei 5 µl ADN pipetaŃi iniŃial. Programul de Termocycler utilizat pentru amplificarea selectivă (Name program PCR: Li-cor): (12 de cicluri): Denaturare - 30 secunde la 94oC Ataşarea primerilor - 30 secunde la 650-56oC (temperatura scade cu 0.70C la fiecare ciclu) Extensia - 60 secunde la 72oC Se continuă cu 24 cicluri : Denaturare - 30 secunde la 94oC Ataşarea primerilor - 30 secunde la 56oC Extensie - 60 secunde la 72oC

În fiecare probă au fost adaugaŃi 10 µl Loading Buffer Li-Cor(100 ml): • 98 ml formamidă • 2 ml 0.5 EDTA pH 8.0 • 100 mg Bromo Phenol Blue

şi au fost menŃinute timp de 5 minute la 90 oC pentru denaturare. 1.5µl 10 BP Marker IRD 800 şi 1.5µl 10 BP Marker IRD 700 şi 0.7µl din fiecare probă au fost migrate în gel de poliacrilamidă 6% (Long Ranger, Ready to use Gel Matrix, KB Plus, Westburg) într-un secvenŃiator ADN (Li-Cor DNA Gene Readir 4200). Numai unul din cei 2 primeri trebuie sa fie marcat fluorescent, de preferinŃă cel care se ataşeaza la capatele situsului de restricŃie produs de către enzimele rare-cutter. Deoarece mărimea şi compoziŃia nucleotidei determină mobilitatea electroforetică a fragmentelor de ADN monocatenare, trebuie avut grijă în momentul în care se vor compara rezultatele obŃinute cu diferiŃi primeri marcaŃi (primeri Eco versus primeri Mse).

Numărul fragmentelor amplificate prin tehnica AFLP poate fi controlat prin alegerea numărului de nucleotide selective care se adaugă la capătul 3’ al primerului. Vos şi colaboratorii, în anul 1995, a testat tehnica AFLP la nivelul genomului uman iar rezultatele au indicat faptul că se pot obŃin amprente genetice clare numai prin creşterea numărului de nucleotide selective adaugate la capătul 3’ al primerului. În cazul speciilor cu genom mare, cum este şi genul Tulipa, este nevoie de o alegere foarte riguroasă a primerilor precum şi de o atenŃie deosebită în parcurgerea tuturor etapelor, pentru a se putea obŃine amprente genetice clare şi cu o reproductibilitate ridicată. 3.3.2.2.5. CombinaŃiilor de enzime utilizate în amprentarea genetică Pe baza acestor cercetari şi după realizarea unui screening, în cazul genului Tulipa, s-a optat pentru utilizarea a doar 3 combinaŃii de primeri care sunt capabile să genereze amprente genetice clare şi anume combinaŃii de primeri cu 7 nucleotide selective. CombinaŃiile de primeri selectate şi utilizate în amprentarea genetică sunt prezentate în tabelul următor. Amplificarea selectivă a fost efectuată conform protocolului descris de Vos şi colab. 1995 utilizând primerii menŃionaŃi în tabelul anterior, mai exact combinaŃia de primeri EcoRI+3/MseI+4. Primerul EcoRI+3 a fost marcat fluorescent cu IRD 700 sau IRD 800 (MWG Biotech) la capatul 5’. Fiecare dintre coloranŃi a fost " vizibil " numai pentru unul dintre laserele care au asigurat preluarea imaginii gelului.

Situsul de restricŃie al enzimelor utilizate, secvenŃa nucleotidică a adaptorilor şi structura primerilor (compania Keygene) necesari analizelor AFLP sunt redate mai jos. În fiecare probă au fost adaugaŃi 10 µl Loading Buffer Li-Cor (100 ml):

• 98 ml formamidă • 2 ml 0.5 EDTA pH 8.0 • 100 mg Bromo Phenol Blue

Şi au fost menŃinute timp de 5 minute la 90 oC pentru denaturare.

Tabelul 3 CombinaŃiile de primeri selectate şi utilizate în amprentarea genetică

Tabelul 4 Situsul de restricŃie al enzimelor utilizate şi secvenŃa nucleotidică a adaptorilor

Enzima de restricŃie

Situsul de restricŃie SecvenŃa nucleotidică a adaptorului

EcoRI

5’- biotina- CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5’

MseI

5’-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5’

Tabelul 5 Numărul nucleotidelor selective şi secvenŃa primerilor

Enzima de

restricŃie

Numărul nucleotidelor selective

SecvenŃa primerului

EcoRI +3 5′-GAC TGC GTA CCA ATT C׀ NNN

MseI +4 5′-GAT GAG TCC TGA GTA A׀ NNNN

NNN,NNNN sunt nucleotidele selective specifice fiecărui primer.

1.5µl 10 BP Marker IRD 800 şi 1.5µl 10 BP Marker IRD 700 iar 0.7µl din fiecare probă au fost migrate în gel de poliacrilamidă 6%(Long Ranger, Ready to use Gel Matrix, KB Plus, Westburg) într-un secvenŃiator ADN (Li-Cor DNA Gene Readir 4200). Migrarea produşilor de amplificare s-a realizat timp de 2.30 h, la o tensiune de 1500 V, la o intensitate a curentului de 35 mA, temperatura de 48 oC.

PRIMER M52G

SecvenŃa nucleotidică a primerului şi compoziŃia în nucleotide selective

5′-GAT GAG TCC TGA GTA A+CCCG-3′

E33 5′-GAC TGC GTA CCA ATT C+AAG-3′

combinaŃia de primeri E33M52G marcată fluorescent cu IRD 800

PRIMER M52C

SecvenŃa nucleotidică a primerului şi compoziŃia în nucleotide selective

5′-GAT GAG TCC TGA GTA A+CCCC-3′

E37 5′-GAC TGC GTA CCA ATT C +ACG-3′

combinaŃia de primeri E37M52C marcată fluorescent cu IRD 700

PRIMER M52G

SecvenŃa nucleotidică a primerului şi compoziŃia în nucleotide selective

5′-GAT GAG TCC TGA GTA A+CCCG-3′

E45 5′-GAC TGC GTA CCA ATT C +ATG-3′

combinaŃia de primeri E45M52G marcată fluorescent cu IRD 700

Încărcarea probelelor s-a făcut de la stânga la dreapta, probele fiind pregătite într-o anumită ordine, care este aceeaşi în toate gelurile migrate. Primele au fost încarcate combinaŃiile de primeri EcoRI+3 marcate 5′ IRD 800. După 15 minute de la iniŃierea migrării, se încarcă combinaŃiile care conŃin EcoRI +3 primeri marcaŃi cu 5′ IRD 700.Godeurile se spală cu soluŃie tampon 1xTBE. Aparatul LI-COR Automated Sequencer Gene Readir 4200, permite focalizarea migrării ADN-ului simultan pentru cele două tipuri de combinaŃii. Practic, ADN-ul este vizualizat doar de unul din cele două fascilole laser ale aparatului, în funcŃie de tipul marcării fluorescente IRD 700 sau IRD 800. Probele marcate fluorescent cu IRD 800 trebuie încarcate primele, pentru a ne asigura că imaginea frontului de Brom Phenol Blue migrează în spatele probelor marcate fluorescent cu IRD 700. (Protocol for High-Throughput AFLP Analysis using Li-Cor IR2 Automated Sequencers-Alexander A. Myburg and David L. Remington, North Carolina State University). 3.4.VIRUSUL PĂTĂRII LALELELOR (MOZAICUL LALELOR) TULIP BREAKING VIRUS Face parte din grupa Potyvirus. Simptome identice cu ale pătării lalelelor poate produce tulip chlorotic blotch virus, identificat în Australia. Descrisă în Europa în 1928, pătarea lalelelor este o boală păgubitoare răspandită peste tot unde se cultivă aceasta plantă, virusul infectând, de asemenea, plantele de Lilium, unde produce marmorări slabe sau moderate pe frunze, iar în complex cu alte virusuri simptome mozaicale şi necroze, şi Fritillaria , dar nu a fost semnalat încă la celelalte specii bulboase (Asjes şi Elbertsen, 1982).

Virusul produce dungi, pete sau linii de culoare mai închisă decât normal (tip aditiv ), sau pete care se formează prin dispariŃia culorii normale (tip suprimativ ) afectând astfel cantitatea de antocian din vacuolele celulelor epidermice , la speciile şi soiurile de lalele roşii şi purpurii. În unele cazuri decolorarea este uniformă pe toată suprafaŃa petalelor. Soiurile albe şi galbene nu prezintă simptome florale. Pe frunzele plantelor infectate pot apărea pete clorotice, ducând la marmorarea acestora sau pot fi translucide din cauza conŃinutului scăzut de clorofilă (Laboratorium voor bloembollen onderzoek, 1971). Totuşi sunt frecvente cazurile când frunzele nu manifestă nici un simptom. Numărul bulbilor este redus, florile prezintă aspect mozaicat (Eikelboom şi colab., 1992), creşterea plantelor este oprită, înrădacinarea slabă iar înflorirea are loc cu 7-10 zile mai târziu. La plantele tinere, virusul poate fi transmis prin inoculare de suc şi prin injecŃii hipodermale. În cultură, este transmis în mod nepersistent prin afide, principalii vectori fiind Aphis fabae, Macrosiphum euphorbiae şi Myzus persicae.

După producerea infecŃiei în câmp în mai sau iunie, virusul poate fi detectat în bulb pe parcursul perioadei de păstrare. Viitoarea cultură va fi infectată în totalitate plantele manifestând simptome florale şi foliare. Zonele infectate apar în stadiu iniŃial pe frunze şi tulpini, apoi virusul va fi răspândit în floare şi bulb.

Măsurile de prevenire constau în eliminarea plantelor infectate din cultură inainte de apariŃia vectorilor, dezinfectarea uneltelor de tăiat şi combaterea vectorilor în câmp, în sere şi în depozitele de păstrare a bulbilor. Răspândirea virusului în cultură poate fi oprită prin stropirea plantelor cu uleiuri minerale sau cu insecticide piretroid sintetice care necesită costuri ridicate. Cea mai eficientă metodă ar fi utilizarea cultivarelor rezistente la TBV (Straathof şi colab, 1996). Hibrizii din grupa Darwin prezintă un grad înalt de rezistenŃă în câmp iar soiul Princeps şi Cantate (Tulipa fosteriana) este rezistent în urma inoculărilor artificiale. În urma încrucişării dintre T. gesneriana şi T. fosteriana s-au obŃinut genotipuri care aveau o rezistenŃă ridicată la TBV. DescendenŃii acestei încrucişări se numesc Darwin hybrids, care în marea lor majoritate sunt triploizi şi care în generaŃia F1 sunt sterili. Pe viitor, se speră ca prin dublarea artificială a numărului de cromozomi această problemă să-şi găsească rezolvarea (Van Tuyl, 1996; Van Tuyl şi De Jeu, 1997).

Pentru screening-ul rezistenŃei, identificarea virusului se poate realiza, uneori, prin testul imunoenzimatic DAS-ELISA. InfecŃia primară nu poate fi detectată la nivelul frunzelor pe parcursul perioadei de vegetaŃie. Van Eijk şi Eikelboom (1983) au realizat evidenŃierea infecŃiilor primare după doar câteva săptămâni dupa inoculare, prin apariŃia efectului mozaicat al florilor cultivarurilor sensibile. SelecŃia asistată de markeri (MAS) reprezintă o metodă modernă de ameliorare care presupune selecŃia indirectă cu ajutorul markerilor moleculari, fiind posibilă selecŃia în mai multe etape într-un an şi fără a depinde de incidenŃa naturală a bolii sau a dăunătorilor şi mai ales în absenŃa patogenului. Markerii moleculari linkaŃi cu genele de interes pot fi utilizaŃi cu succes în programele de selecŃie asistată de markeri (MAS). Acestia au un aport considerabil in strategiile de ameliorare convenŃională a plantelor printr-o selecŃie indirectă a caracterelor de interes cu care sunt linkaŃi.

Utilizarea markerilor moleculari în analiza genomurilor, a determinat creşterea spectaculoasă a eficienŃei activităŃilor de ameliorare atât la plante cât şi la animale, precum şi multiplele aplicaŃii practice ca: identificarea indivizilor, realizarea hărŃilor genetice (care facilitează, în mod indirect, activitatea de selecŃie), clonarea unor gene importante, realizarea unor studii de filogenie (Vos şi colab, 1995).

Găsirea markerilor moleculari linkaŃi cu gene de rezistenŃă reprezintă o etapă importantă a ameliorarii eficacităŃii programelor de selecŃie. În ameliorarea rezistenŃei la boli, populaŃiile rezultate din încrucişarea dintre genitori rezistenti, genotipuri productive sau cu alte caractere dorite sunt selectate în condiŃii de atac natural al agentului patogen sau sunt infectate artificial. Aceste tehnici necesită mult timp şi costuri ridicate. Există chiar şi posibilitatea că unele plante sensibile să poată scăpa atacului.

Găsirea markerilor linkaŃi cu genele de rezistenŃă va înlătura aceste dezavantaje şi va ajuta la identificarea plantelor care posedă aceste gene simultan. Alt avantaj ar fi că nu necesită cantităŃi mari de ADN pentru fiecare plantă individual iar testarea se realizează fără distrugerea plantelor şi fără a le supune la atacului cu patogeni sau insecte în generaŃiile timpurii.

Utilizând seturi de primeri AFLP, produşii de reacŃie vor fi migraŃi în gel de poliacrilamidă iar genotipizarea plantelor individuale pentru rezistenŃă poate fi asigurată de prezenŃa sau absenŃa benzii marker în gel.

La ora actuală sunt disponibile numeroase tehnici de analiză moleculară. Alegerea tipului de analiză moleculară depinde de obiectivul propus, de mijloacele disponibile şi de competenŃele necesare.

Pe parcursul perioadei de vegetaŃie, s-a determinat rezistenŃa la TBV a genitorilor Kees Nelis (sensibil la TBV) şi Cantate (rezistent la TBV), a descendenŃilor acestei combinaŃii (111) şi a unor plante test sensibile prin efectuarea infecŃiilor utilizând ca vectori afidele. Deoarece se presupune că acest caracter- rezistenŃa la TBV –este determinat de o singură genă- rezistenŃă monogenică- se va urmări raportul de segregare al hibrizilor F1 pentru acest caracter. Plantele triploide şi tetraploide au fost identificate şi excluse din analiză, astfel că populaŃia testată a fost de 89 plante (Plant Research International, 2005).

În perioada de vegetaŃie, s-au utilizat ca şi vectori ai virusului TBV afide private de hrană care apoi au fost plasate 15 secunde pentru a se hrăni cu plante infectate cu TBV şi astfel devin vectori ai acestui virus. În anul următor simptomele acestui virus vor fi vizibile prin aparaŃia aspectului mozaicat al

Fig.5 Simptomatologia virusului pătării lalelelor -Tulip Breaking Virus A. pătarea de tip mozaic B. tip aditiv de pătare C.tip suprimativ de pătare

A. B. C.

florilor şi prin apariŃia aspectului marmorat (pete clorotice) al frunzelor. Simptomele foliare şi simptomele florale au fost evaluate separat, cu zero notându-se prezenŃa simptomelor (plantele sensibile) iar cu unu absenŃa simptomelor (plantele rezistente la TBV).

Simptomele foliare şi florale au fost evaluate înainte şi pe parcursul perioadei de înflorire. Simptomele florale sunt mult mai evidente decât cele foliare, care adeseori nu sunt prezente.Totuşi, simptomele foliare sunt evaluate cu scopul de a preîntâmpina valorile lipsă cauzate de posibilele accidente climate sau de imposibilitatea înfloririi din cauza unei infecŃii prea mari. Plantele care nu prezintă nici o simptomă nici foliară nici florală sunt considerate rezistente.

Raportul de segregare plante sensibile/plante rezistente a fost de 37:46. Acest raport nu este distinct semnificativ faŃă de raportul de segregare de 1:1, deci se poate concluziona faptul că rezistenŃa la TBV este determinată de o singură genă- rezistenŃă monogenică. 3.5 ANALOGI AI GENELOR DE REZISTEN łĂ (RESISTANCE GENE ANALOGUES).

RezistenŃa monogenică specifică depinde de interacŃiunea dintre gena de rezistenŃa a plantei şi gena avirulentă a patogenului. Modelul acesta se numeşte relaŃie genă-pentru-genă (gene-for-gene relationships) şi a fost propus pentru multe patosisteme care implică viruşi, micoplasme, bacteri, ciuperci şi nematozi (Takken, 1999). SecvenŃele genei de rezistenŃă R clonate de la o gamă mare de specii cu gene de rezistenŃă de tip genă-pentru-genă au arătat o omologie a secvenŃei şi a regiunilor înalt conservate (Kanazin şi colab., 1996). Comparând şi clasificând proteinele R care au fost prevăzute ca produse ale genei de rezistenŃă acestea formează grupe de proteine cu structură comună a domeniului (regiunea înalt conservată): situs de legare a nucleotidei (Nucleotide Binding Site; NBS), domeniu bogat în fragmente repetate de leucină (Leucine Rich Repeats; LRR), domenii transmembrane (transmembrane domains; TM) şi kinaza cu proteina a serinei/treoninei (serine/threonine protein kinases; PK). ExcepŃie face gena Pto izolată din tomate, în rest toate genele conŃin un fragment LRR cu lungime variată în combinaŃie cu alte regiuni ale proteinei (Ellis şi Jones, 1998). LRR-ul este o regiune asociată cu interacŃiunea proteină-proteină şi cu ligand binding (situsul de legare a nucleotidei)(Speulman şi colab., 1998). Regiunile acestea sunt constituite din molecule de leucină separate de fragmente neconservate ale ADN-ului (Mes, personal communication). Fig.6 Genele de rezistenŃă cu regiunile înalt conservate A) LRR: leucine rich repeat, NBS: nucleotide binding site, TM: trans-membrane domain, PK: protein kinase, TIR: Toll and IL-1 receptor, LZ: leucine zipper. B) regiuni conservate în NBS: Ploop, Kinase2, MHD.

NBS-ul conŃine multe regiuni conservate: kinaza-1a (Ploop) şi kinaza-2 care au carateristice cunoscute decât alte regiuni conservate cu rolul necunoscut.Clasa cu NBS şi LRR constituie cel mai mare grup dintre genele de rezistanŃă. Din grupul acesta, putem să recunoaştem 2 grupe diferite:

1. cu regiunea terminală NH3 (amino terminal) (TIR domain)cu secvenŃa similară cu cea din regiunile citoplasmatice evidenŃiate la gena Toll de la Drosophila şi la receptorul interleukin-1 (IL-1)

LRR TM2

PK

LRR TM PK

LRR

TIR NBS LRR

LZ NBS LRR

1

3A

LRR

4

NBS

3B

5A

5B

Ploop Kinase2 MHD

A

B

2. care conŃine regiunea cu leucine zipper (LZ) la domeniul terminal frecvent implicată în dimerizarea proteinelor (Collins şi colab., 1998; Ellis şi Jones, 1998; Leister şi colab., 1998; Shen şi colab., 1998; Richter şi Ronald, 2000). Din câteva specii care aparŃin ambelor grupe mono şi dicotiledone, gene de rezistenŃă NBS au

fost clonate şi conferă rezistenŃă la bacterii, ciuperci şi la viruşi. Astfel se poate concluziona faptul că genele de tip NBS sunt larg distibuite în plante şi conferă rezistenŃă la o gamă variată de patogeni ai plantelor (Collins şi colab., 1998).

Izolarea genelor de rezistenŃă a fost până acum şi încă mai este o procedură dificilă şi complicată, care implică clonarea bazată pe cartografie sau strategii bazate pe transpozon tagging. Poate fi posibil utilizarea similaritatii genelor de rezistenŃă pentru identificarea de noi gene de rezistenŃă prin utilizarea primerilor PCR, care au fost astfel construiŃi prin omologia secvenŃelor ca şi model (Kanazin si colab., 1996). Hibridarea încrucişată a secvenŃelor cunoscute a genelor de rezistenŃă poate fi o opŃiune. Metoda care utilizează PCR-ul cu primeri cu nucleotide degenerate e mai sensibilă la izolarea secvenŃelor conservate, această metodă fiind mai eficientă pentru o izolare a genelor de rezistenŃă NBS potenŃiale. SecvenŃele identificate prin această metodă se numesc analogi ai genelor de rezistenŃă (Resistance Gene Analogs; RGA) deoarece secvenŃa este analoagă cu a secvenŃei genelor de rezistenŃă, dar poate şi să nu prezinte nici o legătură cu caracterul rezistenŃă. Cosegregarea şi analiza mutanŃilor poate fi utilizată pentru a determina un posibil linkage între RGA şi caraterul de interes.

Cartografia bazată pe markeri NBS poate fi o metodă rapidă şi directă pentru a găsi markeri linkaŃi cu caractere de rezistenŃă, în prezentul studiu,cu rezistenŃa la TBV la genul Tulipa. Genele de rezistenŃă care conŃin regiuni NBS sunt în majoritate dominante, astfel că există o anumită rezervă în aplicabilitatea metodei pentru rezistenŃa poligenică.

Obiectivul acestui studiu a fost de a amprenta genetic speciile şi soiurile de lalele precum şi de a identifica markeri moleculari în linkage cu rezistenŃa la TBV, ca un sistem rapid şi avantajos în ameliorarea rezistenŃei la noile cultivare de lalele.

Prima etapă în identificarea unui marker în linkage cu TBV este determinarea rezistenŃei plantelor de lalele la TBV în câmp. Caracterele morfologice, care segregă în această populaŃie au fost evaluate pentru a le asocia cu markeri moleculari cunoscuti.

Bazată pe markeri AFLP, o cartografie moleculară a fost construită, în care, au fost localizate locusuri ale genei de rezistenŃă la TBV (van Heusden şi colab. 2004). Pentru a depista RGA-uri, ca o metodă rapidă de a evidenŃia markeri în linkage cu rezistenŃa la TBV, van Heusden şi colab. de la Plant Research International au ajuns la concluzia că un protocol pentru amplificarea mediată cu un adaptor trebuie să fie elaborat.

Metoda trebuie sa fie înalt selectivă pentru secvenŃe ale genei de rezistenŃă. Cu această amplificare mediată cu adaptor s-a dorit să se găsească dacă există în genomul lalelei cel puŃin o genă de rezistanŃă la TBV şi dacă există RGA-uri care pot fi asociate cu rezistenŃa la TBV. Kees Nelis şi Cantate sunt genitorii descendenŃilor F1 utilizaŃi în construirea hărŃii genetice şi în depistarea unor markeri în linkage cu rezistenŃa la TBV.

Kees Nelis este un cultivar cu floarea de culoare roşie care prezintă o bordură galbenă pe marginea florii şi o pată bazală circulară de culoare închisă în jurul centrului florii. Cantate este un cultivar cu floare tot de culoare roşie, fără bordură pe marginea florii dar care prezintă un contur galben în jurul centrului de culoare închisă al florii.

Fig.7 T. fosteriana Cantate

Kess Nelis este sensibil la virusul TBV dar rezistent la Fusarium iar Cantate prezintă rezistenŃă la TBV şi sensibilitate la Fusarium. Din încrucişarea Kees Nelis x Cantate au rezultat un numar de 111 descendenŃi F1 la care s-a urmărit raportul de segregare pentru rezistenŃa la TBV precum şi alte caracteristici de interes precum culoarea florilor care a fost evaluată după trei clase separate(culoarea roşie, culoarea portocalie şi culoarea roşu/portocaliu).Plantele triploide şi tetraploide au fost identificate şi excluse din

analiză, astfel că populaŃia testată a fost de 89 plante.

În prezentul studiu realizat, s-a putut identifica prin tehnica AFLP ,în cadrul descendenŃilor F1 a combinaŃiei hibride Kees Nelis x Cantate, prezenŃa a 4 descendenŃi F1 care prezintă rezistenŃa la TBV şi anume hibrizii numărul 68, 69, 75, 77 precum şi identificarea speciilor rezistente la TBV: T. fosteriana ‘’Princeps’’, T. fosteriana 102 Juan x Cantate, T. fosteriana 112 Juan x Cantate, T. fosteriana 122 Cantate x Juan, T. fosteriana 144 Princeps x ML, T. fosteriana 148 Cantate x Princeps.

Această tehnică constituie un instrument valoros şi extrem de util în procesul de ameliorare a eficacităŃii programelor de selecŃie ajutând la identificarea plantelor purtătoare de gene de rezistenŃă la TBV si înlăturând deficienŃele cauzate de timpul şi costurile ridicate ale procesului de ameliorare clasic, cu atât mai mult cu cât seminŃele hibride parcurg o perioadă de 5 ani până la înflorire, iar pe parcursul acesteia trebuie avută o grija permanentă, plantele fiind extrem

de sensibile. Odată cu identificarea acestor markeri moleculari linkaŃi cu rezistenŃa la TBV selecŃia asistată poate fi realizată încă din stadii timpurii fără a depinde de incidenŃa naturală a bolii şi mai ales în absenŃa patogenului, mentinându-se doar genotipurile dorite.

Prezintă o aplicabilitate practică extrem de utilă în special pentru realizarea unor hibrizi cu calităŃi extrem de valoroase care pot fi utilizaŃi în vederea înfiinŃării unei colecŃii de germoplasmă la genul Tulipa precum şi selecŃionarea unor indivizi care pot fi incluşi în programele de amelioare şi în programele de cartare a genelor de rezistenŃă la diferite boli şi virusuri.

În viitor, aplicatiile markerilor moleculari în vederea identificării diferitelor caractere vor accelera procesul de hibridare la genul Tulipa şi va determina o schimbare de esenŃă în programele de ameliorare pentru că în locul selecŃiei fenotipice pentru caracterul dorit se va face selecŃia genelor care controlează respectivul caracter.

Tehnica AFLP este foarte utilă în amprentarea genetică în special, în cazul descendenŃilor unei combinaŃii hibride (segregating populations) şi pentru diferenŃierea unei varietăŃi.Pentru multe specii de plante markerii AFLP sunt utili în construirea hărŃilor genetice şi în cazul studiilor filogenetice, unde este esenŃial generarea unui mare număr de benzi ale fragmentelor de retricŃie facilitând detecŃia polimorfismelor.

În cazul genului Tulipa, o specie cu un genom mare ,rezultatele obŃinute demonstrează faptul că fondul de germoplasmă aparŃinând speciilor de lalele studiate este extrem de diferit,existând foarte multe fragmente polimorfe (Bondrea Ioana şi colab., 2007; 2008). 3.7 TEHNICA NBS AFLP

Tehnica NBS AFLP a fost elaborată pentru a mări şansele de a găsi markeri care sunt în linkage cu rezistenŃa la TBV. NBS AFLP-ul se bazează pe protocolul specific AFLP (Vos et al., 1995) cu precizarea că primerii standard au fost înlocuiŃi cu primeri specifici NBS. Amplificarea cu primerii Ploop, în marea majoritate a cazurilor, determină o vizualizare de intensitate mai redusă însă profilul electroforetic are reproductibilitate. CombinaŃia Ploop1/Eco a generat 100 benzi din care 6% au segregat în cadrul populaŃiei testate iar combinaŃia Ploop1/Mse a generat 120 benzi cu o segregare de 19%. Ambii primeri Eco şi Mse utilizaŃi au prezentat o nucleotidă selectivă.

Se presupune că secvenŃele Ploop şi Kinase2 sunt prezente în întreg genomul lalelelor în număr mare. La Arabidopsis se preconizează că ar exista 300-400 omologi NBS (Mes, personal communication). Întreg genomul speciei Arabidopsis se constituie din 120.000 Kb (Paterson,

Fig. 8 Triumph Kees Nelis

1996).Genomul speciei Tulipa este de 5000 de ori mai mare decât al Arabidopsis-ului, deci se poate aprecia prezenŃa a circa 1.500.000 NBS-uri în genomul acestei specii (Mes, personal communication).

Prin utilizarea unei combinaŃii diferite enzimă/adaptor sau prin modificarea secvenŃei primerului Ploop nedegenerat numărul fragmentelor amplificate ar putea creşte. Mărimea relativ mică a fragmentelor Eco/Mse şi faptul că primerii NBS se localizează în interiorul fragmentului ar putea cauza probleme prin reducerea mediei mărimilor fragmentelor. Utilizând primeri nested se va reduce şi mai mult mărimea fragmentelor. Mărimea fragmentelor amplificate este limitată de perioada de elongaŃie din timpul PCR-ului. Protocolul PCR generează în mod normal fragmente cu o mărime cuprinsă între 50-500 bp, fragmentele mai mari vor putea fi amplificate prin extinderea perioadei de elongaŃie.

Pentru a optimiza amplificarea fragmentelor omoloage NBS s-a recurs la un PCR liniar în care s-a utilizat numai un primer NBS.Utilizarea unui PCR liniar a determinat obŃinerea unor benzi nereproductibile, cel mai probabil din cauza prezenŃei unui număr foarte mare de fragmente omoloage care în timpul amplificării au multiplicat diferite fragmente. Creşterea concentraŃiei primerilor pe parcursul amplificării marcate ar putea fi o soluŃie în creşterea numărului fragmentelor şi îmbunătaŃirea vizualizării.

Pentru a amplifica mai multe fragmente specifice în timpul amplificării liniare primerii ar trebui să fie şi mai specifici secvenŃei NBS, astfel că s-au utilizat primeri degeneraŃi. Acei primeri pot fi divizaŃi în primeri nedegeneraŃi pentru a creşte specificitatea amplificării. Pentru o amplificare cât mai relevantă şi fidelă ar fi necesar amplificarea numai a unei porŃiuni de fragment. Pentru a selecta un subset de fragmente în scopul unei amplificări optime nested PCR se utilizează primeri AFLP cu nucleotide selective în timpul etapei de extra preamplificare.Cele mai multe amplificări selective pot fi obŃinute utilizând doi primeri. CombinaŃia de primeri Nsi selectiv – Ploop specific urmată de o a doua amplificare utilizând combinaŃia Nsi- Kinaza 2 nested generează profile electroforetice reproductibile dar nu se vizualizează foarte clar, dar se poate îmbunătăŃii prin creşterea concentraŃiei primerului NBS în timpul amplificării marcate.

Prin utilizarea mai multor primeri specifici Nsi în timpul preamplificării se va creşte numărul benzilor care segregă (se separă). Utilizând combinaŃia de primeri Nsi/Ploop la preamplificare mai mult de 50% din benzi au segregat. Exact cu aceeaşi combinaŃie de primeri când s-a testat întreaga populaŃie, cele mai multe benzi nu s-au mai separat. Acest lucru poate fi explicat prin faptul că nu toate polimorfismele se bazează pe un polimorfism adevarat al ADN-ului.

Din experimentele efectuate de către van Heusden şi colab. pe parcursul mai multor ani de cercetare în care s-au îmbunătăŃit parametrii PCR, s-au testat diferite temperaturi de ataşare a primerilor, numărul ciclurilor de amplificare şi timpul de elongaŃie, a rezultat faptul ca acel fundal închis care apare evident ar putea fi estompat prin utilizarea mai multor primeri selectivi sau specifici.

În prezentul studiu pe baza rezultatelor obŃinute anterior, rezultate care sunt rodul unei munci desfăşurate pe parcursul multor ani de cercetări efectuate în laboratorul de Genetică Moleculară de la Plant Research International de către van Heusden şi colab., s-a optat pentru realizarea unei extra amplificări, după preamplificare cu scopul de a amplifica toate fragmentele care conŃin o structură omoloagă NBS-ului. Acest mastermix sau amestec de reacŃie conŃine :

• 30ng de primeri specifici NBS-ului (Ploop) • 2.0ul 10x Promega buffer • 1.2ul MgCl2 • 0.1ul pTaq polimeraza • 0.004mmol dNTP-uri şi • 10ul produs de preamplificare diluat într-un volum total de reacŃie de 20ul.

Amplificarea s-a realizat utilizând un program specific de amplificare folosit pentru amplificarea liniară: 30 secunde la 95°C, 60 secunde la 60°C, 180 secunde la 72°C şi 10 minute la 72°C.

Amplificarea după această etapă a fost realizată utilizând aceeaşi concentraŃie şi componente, numai că volumul total de reacŃie a fost crescut până la 30.0µl din considerentul că 20µl sunt reprezentaŃi de produşii de amplificare. După preamplificarea cu primeri specifici NBS-ului (Ploop), amplificarea „markată” a fost elaborată cu primeri ’’nested’’ (Kinaza 2). Nested se referă la faptul că secvenŃa primerului se ataşează mai specific la fragmentul NBS-ului. Ploop-ul a fost localizat în partea stângă a secvenŃei şi kinaza 2 în partea dreaptă a ploop-ului (tabelul de mai jos prezintă secvenŃele primerilor specifici NBS-ului).

În toate experimentele realizate, primerii specifici NBS au fost markaŃi. Pentru fiecare experiment ADN-ul genitorilor, Kees Nelis şi Cantate, a fost izolat, preamplificat şi amplificat de două ori, evaluându-se în acest fel reproductibilitatea. 3.7.1.Amplificarea NBS mediată de adaptor

Pentru a amplifica fragmentele la ambele capele ale structurii NBS (la dreapta şi la stânga), EcoR1 şi MseI au fost înlocuite cu NsiI. Situsul de restricŃie al NsiI-ului se localizează în secvenŃa MHD (Munc Homologous Domain) la capătul drept al structurii NBS. La capătul stâng, au fost ataşaŃi primerii Ploop şi Kinaza 2. ADN-ul (475ng) a fost repartizat în 4ul de tampon de reacŃie 2 cu 5U NsiI după protocolul AFLP a lui Vos şi colab., 1995. După repartizare a fost adăugat amestecul de ligare, care conŃine 4pmol de adaptor NsiI.

Preamplificarea a fost elaborată cu primerii Ploop1, 2 sau Kinaza 2 în combinaŃie cu Nsi0. Dacă un primer a fost folosit la amplificare al doilea primer a fost înlocuit cu milliQ. Programul PCR a fost optimizat pentru a amplifica fragmente mai mari care să corespundă cu lungimea prevazută fragmentului NBS.

Primul ciclu

30secunde la 94°C, 30secunde la 65°C, 180secunde la 72°C

urmat de 12 cicluri cu temperatura de ataşare mai mică cu 0.7°C în fiecare ciclu şi 23 cicluri 30 secunde la 94°C, 30 secunde la 56°C si 180 secunde la 72°C.

A fost elaborat un program PCR la care etapa de elongaŃie s-a realizat timp de 60 secunde la 72°C. Produşii de preamplificare au fost diluaŃi de 40 ori, 100 ori sau 400 ori înainte de amplificare.

Primerul Kinaza2 a fost markat pentru amplificare utilizându-se combinaŃia cu primerul Nsi cu 1-4 nucleotide selective . 3.7.2.Construirea hărŃii genetice de linkage

Laleaua este o specie alogamă. Markerii rezultaŃi din analizele AFLP, a descendenŃilor F1 luaŃi în studiu, au fost utilizaŃi pentru a construi harta de linkage cu ajutorul programul JOINMAP 2.0 (Stam şi van Ooijen, 1995).

Numai markerii care segregă pentru ambii părinŃi pot fi utilizaŃi pentru a integra forma maternă şi cea paternă în grupurile de linkage. Din cauză că există numai câŃiva asemenea markeri utili s-au construit hărŃi genetice de linkage pentru a putea separa forma maternă de cea paternă.

Markerii au fost repartizaŃi în grupurile de linkage pe baza frecvenŃei de recombinare dintre markeri. Markerii care au o frecvenŃă de recombinare de 0,5 nu sunt in linkage. Daca markerii sunt in linkage frecvenŃa de recombinare trebuie să fie mai mică de 0,5. Pentru a se determina mai exact dacă markerii sunt linkaŃi s-a utilizat indicele LOD. Acest indice LOD este 10log din raportul dintre probabilitatea ca doi markeri sa fie linkati sau să nu fie în linkage.

Setul de informaŃii al formei paterne (aaxab) a fost divizat în 11 grupuri cu o limită importanta LOD 6. Setul de date al formei materne (abxaa) a fost divizat dar a prezentat o limită scazută (LOD 4), rezultând 20 de grupuri. DistanŃele de pe harta genetică au fost calculate folosind funcŃia de cartare a lui Kosambi, care converteşte unităŃile de recombinare în distanŃe genetice.

Markerii obŃinuŃi în urma analizelor AFLP şi în urma analizelor AFLP cu primeri nested NBS au fost utilizaŃi pentru întocmirea hărŃii de linkage AFLP. Din combinaŃiile de primeri utilizate două combinaŃii au generat markeri evidenŃi. Analizele realizate cu combinaŃia de primeri Eco01- Ploop1 au generat 14 markeri evidenŃi iar combinaŃia de primeri M02-Ploop1 a generat 6 markeri evidenŃi. Markerii Eco01-Ploop1nu sunt în linkage cu markerii hărŃii genetice iar markerii M02-Ploop1 se regăsesc în diferite grupuri de linkage. M02Seq1-3 sunt localizaŃi în grupul 1 de linkage pe harta genetică a formei materne (Cantate) (Plant Research International, 2006). 3.7.3. Harta genetică (moleculară)

În urma analizelor AFLP, utilizându-se combinaŃia Eco/Mse, din 595 markeri rezultaŃi 394 au fost utilizaŃi în construirea hărŃii (cartografiaŃi) şi cartaŃi pe cromozomi în grupurile de linkage. Pentru a putea integra forma maternă şi cea paternă în harta genetică trebuie integraŃi markerii codominanti. O modalitate de a construi punŃi de legatură şi asocieri între hărŃi este crearea unor primeri construiŃi pe secvenŃele cunoscute (van Heusden, 2000). Pentru a genera mai mulŃi markeri moleculari în vecinătatea

genei de rezistenŃă la TBV se poate utiliza o cartografiere fină odată cu analiza bulk segregant (Paterson, 1996). Bulked segregant analysis (analiza segregării în amestec care presupune alegerea a două forme parentale extreme: una rezistentă şi una sensibilă care s-au dovedit a fi polimorfe la nivel molecular şi compararea a două amestecuri –bulkuri- de probe de ADN de la indivizii unei generaŃii segregante) este o metoda rapidă pentru screening-ul markerilor moleculari în linkage cu diferite caractere. CAPITOLUL IV. TEHNOLOGIA OB łINERII SOIURILOR LA GENUL TULIPA- HIBRIDAREA Hibridarea artificială se realizează, în solar sau în seră pentru a facilita toate operaŃiile tehnologice care trebuie parcurse până la obŃinerea seminŃei hibride. Alegerea genitorilor are o importanŃă deosebită, având în vedere dificultăŃile pe care le întâmpină uneori hibridarea interspecifică la genul Tulipa. RezistenŃă absolută (imunitate) la virusul mozaicului lalelelor TBV (Tulip breaking virus) o au multe cultivaruri ale speciei T. fosteriana cum sunt Cantata şi Princeps.

Fondul genetic al acestei specii este foarte bogat, speciile luate în cultură au beneficiat şi beneficiază în continuare de atenŃia amelioratorilor la crearea de noi soiuri, fapt ce rezultă într-o largă diversitate, ajungându-se la flori cu calităŃi inedite ca forma, vigoare, culoare, parfum Sortimentul comercial a fost completat, pe lângă cultivarurile speciei T. gesneriana şi cu Darwin hybrids care sunt în marea majoritate a lor triploizi, deci imposibil de folosit la crearea de soiuri datorită sterilităŃii lor în generaŃia F1. Totuşi, între T. gesneriana şi celelalte specii din aceeaşi secŃie (Tulipa) s-a constatat compatibilitate. Soiuri noi pot fi obŃinute şi prin inducerea mutaŃiilor. La lalele apar mutaŃii spontane în mod frecvent. VariaŃiile mugurale apar sub forma schimbării habitusului plantei, a mărimii şi culorii florilor, a formei cupelor, multe dintre aceste mutaŃii au devenit soiuri. Aşa de exemplu, numai la soiul Apeldoorn au apărut multe mutaŃii valoroase devenite soiuri, ca: Golden Apeldoorn, Striped Apeldoorn, Orange Apeldoorn, Beauty of Apeldoorn. În consecinŃă, alegerea genitorilor se face în funcŃie de obiectivul de ameliorare, cel mai adesea rezistenŃa la boli, în special la TBV (tulip breaking virus). Alegerea plantelor în cadrul genitorilor se face pe baza unor criterii, respectiv: Tipicitatea de soi Starea de sănătate Vigoarea plantelor. Castarea florilor la genitorul matern (emascularea) constă în eliminarea elementelor sexuale mascule cu scopul de a se evita polenizarea. Recoltarea polenului la genitorul patern se desfăşoară în paralel cu castrarea florilor genitorului matern. Se aleg flori aflate în stadiu de boboc avansat. Se detaşează anterele Se colectează într-o cutie Petri Se etichetează Se păstrează în desicator 3-4 zile cu capacul întredeschis până se eliberează polenul. Polenizarea artificială constă în depunerea polenului recoltat de la florile genitorului patern pe stigmatul florilor castrate existente genitorului matern.

Polenizarea artificială trebuie executată în momentul în care atât polenul cât şi stigmatul au ajuns la maturitatea fiziologică.Reuşita polenizării- prezenŃa ovarului uşor bombat- se verifică după aproximativ 10 zile. Etichetarea se efectuează imediat după polenizare, notându-se combinaŃia hibridă, data polenizării, numele celui care a realizat polenizarea.

Recoltarea seminŃelor se va face toamna, se vor semăna în ghivece în primii 2 –3 ani, apoi se vor planta în câmpul de hibrizi.

De menŃionat este faptul că în cazul acestei specii, seminŃele hibride parcurg o perioadă de 5 ani până la înflorire, iar pe parcursul acesteia trebuie avută o grija permanentă, altfel multe dintre plante vor pieri. Astfel că , noile tehnici folosind markeri moleculari sunt extrem de utile pentru identificarea hibridului după o încrucişare, preselecŃia realizându-se încă din stadii timpurii.

4.1. BAZELE GENETICE ALE AMELIOR ĂRII GENULUI TULIPA Marea majoritate a amelioratorilor s-au concentrat pe crearea de soiuri în cadrul speciei T. gesneriana. Dar, multe caracteristici pe care amelioratorul le doreşte pentru un nou soi sau hibrid comercial nu pot fi identificate în colecŃiile de soiuri şi cultivaruri ale speciei cu care lucrează, şi deci, nu pot fi valorificate cu ajutorul hibridărilor intraspecifice. În schimb, astfel de caracteristici pot fi depistate la indivizi aparŃinând unei specii înrudite. În astfel de cazuri, o modalitate de incorporare a acestor caracteristici în noile soiuri o constituie hibridarea interspecifică şi cea intergenerică. Există, însă, unele particularităŃi ale hibridărilor îndepărtate care se referă , în primul rând, la dificultăŃile mari pe care le întâmpină, adesea, realizarea unor astfel de hibridări , precum şi faptul că, de foarte multe ori, hibrizii îndepărtaŃi sunt parŃial sau total sterili (M. Ardelean, R. Sestraş,1999). Din aceste considerente, una dintre cele mai importante metode în ameliorarea lalelelor rămâne hibridarea interspecifică, care exploatând variabilitatea genetică a celorlalte specii a dus la îmbogăŃirea sortimentului comercial şi obŃinerea unor soiuri cu caractere dorite-rezistenŃă la diverse boli. RezistenŃă absolută (imunitate) la virusul mozaicului lalelelor TBV (Tulip breaking virus) o au multe cultivaruri ale speciei T. fosteriana cum sunt Cantata şi Princeps. În urma încrucişării dintre T. gesneriana şi T. fosteriana s-au obŃinut genotipuri care aveau o rezistenŃă ridicată la TBV. DescendenŃii acestei încrucişări se numesc Darwin hybrids, care în marea lor majoritate sunt triploizi şi care în generaŃia F1 sunt sterili. Pe viitor, se speră ca prin dublarea artificială a numărului de cromozomi această problemă să-şi găsească rezolvarea (Van Tuyl, 1996; Van Tuyl şi De Jeu, 1997). În ceea ce priveşte rezistenŃa la mucegaiul cenuşiu al lalelelor (Botrytis tulipae) imunitate are specia T. tarda. Dar, această specie nu poate fi încrucişată cu nici un soi al speciei T. gesneriana. RezistenŃă parŃială s-a descoperit la unele cultivaruri de T. gesneriana şi T. kaufmanniana. Van Eijk şi colab., s-au ocupat de ameliorarea rezistenŃei la Fusarium (Van Eijk şi colab., 1983; Romanov şi colab.,1991) şi în urma cercetărilor efectuate s-a constatat faptul că pentru a obŃine plante rezistente este necesar ca doar un părinte să fie rezistent la putregaiul uscat al bulbilor (Fusarium oxysporum). Încrucişări între cultivaruri de T. gesneriana şi specii din toate cele 8 secŃii ale genului Tulipa au fost realizate de Van Eijk şi colab. (1991) şi Van Raamsdonk şi colab. (1995). Sortimentul comercial a fost completat, pe lângă cultivarurile speciei T. gesneriana, şi cu Darwin hybrids care sunt în marea majoritate a lor triploizi, deci imposibil de folosit la crearea de soiuri datorită sterilităŃii lor în generaŃia F1. Şi totuşi, între T. gesneriana şi celelalte specii din aceeaşi secŃie (Tulipa) s-a constatat compatibilitate. Încrucişările între T. gesneriana şi specii din secŃia Kolpakowskianae şi Clusianae şi cu cele din subgenul Eriostemones nu au avut succes (Van Eijk şi colab., 1991; Van Raamsdonk şi colab., 1995). De altfel, nici hibridările dintre T. systola şi câteva specii ale secŃiei Eichleres nu au avut succes (Van Raamsdonk şi colab., 1995) şi nici încrucişările între T. gesneriana şi speciile subgenului Eriostemones, cum sunt T. tarda, T. pulchella, T. turkestanica. Hibridări în interiorul subgenului Tulipa sunt posibile, cum sunt hibrizii obŃinuŃi între T. gesneriana şi T. fosteriana (Darwin hybrids), cei obŃinuŃi între T. gesneriana şi T. kaufmanniana, T. greigii, T. eichleri, T. ingens, T. albertii, T. didieri. Asupra numărului de cromozomi s-au făcut cercetări ,atât la cultivaruri cât şi la specii de Tulipa (Zeilinga şi Schouten, 1968). Marea majoritate a speciilor de lalele sunt diploide 2n=2x=24 cromozomi, unele triploide (majoritatea Darwin hybrids) şi mai rar tetraploide (2n=2x=48 cromozomi). Cultivarurile tetraploide de T. gesneriana care au fertilitate ridicată şi tetraploizii speciilor T. fosteriana şi T. kaufmanniana au fost lansaŃi de companiile olandeze în anul 1989 şi 1991 (Straathof şi Eikelboom, 1997). Recent, folosind tehnici de poliploidizare in vitro, ca şi la Lilium, s-au obŃinut cultivaruri tetraploide de lalele (Eikelboom şi colab., 2001; Van Tuyl şi colab., 2002). Pe viitor, aceste tehnologii vor avea, fără îndoială, un rol important în depăşirea limitelor hibridărilor interspecifice pentru crearea de noi soiuri. Deoarece tetraploizii sunt mai robuşti şi mai fermi decât diploizii, cercetarea s-a axat pe obŃinerea mai multor tetraploizi. AlŃi noi tetraploizi au fost obŃinuŃi prin încrucişări între indivizi tetraploizi. CâŃiva dintre aceşti tetraploizi au fost lansaŃi de PRI (Plant Research International-Centre for Plant Breeding and Reproduction Research) în 1974, dintre care cel mai cunoscut este Judith Leyster. O problemă pe care au avut-o tetraploizii a fost înflorirea târzie a descendenŃilor, fapt ce i-a făcut nepotriviŃi la forŃarea timpurie, astfel că pentru obŃinerea acestora s-au utilizat alte tehnici (polenizare,

utilizarea N2O, hibridări reciproce). Astfel s-au obŃinut soiuri tetraploide cu o fertilitate ridicată atât la specia T. gesneriana cât şi la speciile T. fosteriana şi T. kaufmanniana, care apoi au fost lansate de PRI în 1989. SelecŃia practicată de om, ca proces ce exploatează variabilitatea naturală şi artificială, duce în mod inevitabil la sărăcirea (îngustarea) patrimoniului genetic al speciilor la care se aplică, la o pierdere considerabilă a variabilităŃii. De fapt, aceasta înseamnă că treptat, populaŃiile şi soiurile locale sunt înlocuite de soiuri moderne, dar cu o bază genetică tot mai restrânsă. Un astfel de proces riscă să erodeze complet variabilitatea genetică pe care se bazează amelioratorul în munca sa, cu consecinŃe greu de prevăzut pentru viitor. 4.2. SPECIILE BOTANICE DE LALELE PE CALE DE DISPARI łIE În FranŃa, protecŃia nu se extinde şi la cele care se cultivă în câmp, poate şi datorită faptului că sunt unele specii care au dispărut din habitatul lor, dar au supravieŃuit în cultură. În FranŃa există 16 specii de lalele. În centrele lor genice aceste specii de lalele fac parte din cultură. Lalele sălbatice sunt în marea lor parte necunoscute. De exemplu, există un areal preferat, în Savoie, unde acestea fac parte din cultura regiunii, apar adesea ca motive florale pe broderii şi pe xilogravurile vechi. Din păcate, pe cale de dispariŃie se află şi alte specii de plante. Lalelele sunt de asemenea şi victime ale urbanizării, cu consecinŃe asupra restrângerii habitatului natural, astfel T. aximensis a dispărut din ecosistemele naturale din 1974 iar T. didieri a dispărut din Terantaise în 1987 ca urmare a construirii unei zone industriale. The National Alpine Botanical Conservation , a instituit un program în 1991 - "Saving and Conserving wild tulips in France" care are ca scop inventarierea speciilor botanice şi a numărului lor; reintroducerea în habitat a speciilor care sunt pe cale de dispariŃie sau periclitate, după ce acestea au fost, in prealabil, multiplicate vegetativ în sere. Din păcate, situaŃia nu este simplă deloc, la unele specii după reintroducerea în cultură au apărut fie simptome evidente de virusuri pe diferite părŃi ale plantei, fie virusuri care reduc vigoarea plantei. Prima măsură luată de National Alpine Botanical Conservatory a privit grupul de lalele cunoscut sub numele de Neotulipae din care face parte T. didieri, T. mauritana, T. aximensis, T. planifolia, T. platystigma, T. billietiana, T. merjoletti, T. montisandrei.

Înlocuirea diverselor cultivaruri sau rase cu o bază ereditară heterozigotă reprezintă una din cele mai importante cauze ale vulnerabilităŃii genetice. Eroziunea genetică reprezintă fenomenul de pierdere a diferitelor diversităŃi genetice în cadrul unei populaŃii, inclusiv pierderea strictă a unor gene sau combinaŃii de gene aflate în organisme adaptate de fapt la anumite habitate zonale. Eroziunea genetică de fapt este asociată cu sărăcirea bazei genetice, pierderea de gene sau altele, iar în sens larg, ca pierdere a unor soiuri.

Obiectul fundamental al conservării biodiversităŃii este asigurarea supravieŃuirii speciilor, cultivarurilor şi a altor forme pe plan mondial pentru generaŃiile viitoare. ProtecŃia biodiversităŃii înseamnă pe plan mondial, conservarea şi păstrarea genofondului.

4.3. INDUCEREA MUTAłIILOR PENTRU OB łINEREA DE NOI SOIURI LA LALELE Soiuri noi pot fi obŃinute şi prin inducerea mutaŃiilor. La lalele apar mutaŃii spontane în mod frecvent. VariaŃiile mugurale apar sub forma schimbării habitusului plantei, a mărimii şi culorii florilor, a formei cupelor, multe dintre aceste mutaŃii au devenit soiuri. Aşa de exemplu, numai la soiul Apeldoorn au apărut multe mutaŃii valoroase devenite soiuri, ca: Golden Apeldoorn, Striped Apeldoorn, Orange Apeldoorn, Beauty of Apeldoorn. În 1975, 1977 şi 1978, PRI a lansat câteva soiuri rezultate în urma mutaŃiilor artificiale (datorate radiaŃiilor), cum este soiul Santina , o mutaŃie artificială suferită de Lustige Witwe. Identificarea cultivarurilor de lalele, bazată pe utilizarea markerilor proteici, este posibilă încă din faza de bulb uscat- dry bulb-, utilizând extract din acesta cultivarurile pot fi identificate după profilul electroforetic. Noile tehnici folosind markeri moleculari sunt utile pentru identificarea hibridului după o încrucişare interspecifică, putându-se face preselecŃia încă din stadii timpurii. În viitor, aplicatiile markerilor moleculari în vederea identificării diferitelor caractere vor accelera procesul de hibridare la genul Tulipa şi va determina o schimbare de esenŃă în programele de ameliorare

pentru că în locul selecŃiei fenotipice pentru caracterul dorit se va face selecŃia genelor care controlează respectivul caracter. Acest tip de selecŃie permite identificarea genei importante urmărite încă fazele timpurii de creştere a plantelor, fapt ce asigură accelerarea şi eficientizarea întregului program de ameliorare. CAPITOLUL V. REZULTATE ŞI DISCUłII 5.1. REZULTATE PRIVIND UTILIZAREA TEHNICII RAPD LA GENUL TULIPA

Izolarea ADN-ului am realizat-o pe baza protocolului de extracŃie ADN descris de Pieter VOS şi colab. 1995 utilizată pentru fingerprinting. Din cercetările efectuate până în prezent se poate constata faptul că protocolul de extracŃie ADN descris de Pieter VOS şi colab. 1995 este cel mai eficient în cazul speciei Tulipa.

Prin utilizarea acestui protocol de izolare a ADN-ului se poate aprecia faptul că toate probele analizate au prezentat o puritate foarte bună, în unele probe fiind chiar necesară diluŃia prin adăugarea suplimentară de TE. Materialul biologic utilizat în analizele moleculare a fost constituit din 10 specii extrem de valoroase şi cele mai importante 5 cultivare.

În cazul speciilor cu genom mare,cum este şi genul Tulipa, este nevoie de o alegere foarte riguroasă a primerilor precum şi de o atenŃie deosebită în parcurgerea tuturor etapelor necesare obŃinerii unor rezultate relevante.

Dorim să evidenŃiem faptul că amplificarea probelor pentru analizele RAPD s-a realizat cu un program PCR optimizat pentru speciile cu genom mare (elaborat de Laboratory of Plant Breeding, Plant Research International, Wageningen 2004) care durează aproximativ 7 ore .

Din studiile efectuate până în prezent la Plant Research International de către van Heusden şi colab., 2003 s-a constat faptul că în urma testării unui număr de 50 primeri OPERON care nu au amplificat cu toate că s-a utilizat un program de amplificare optimizat pentru speciile cu genom mare, cercetăriile nostre s-au orientat pe utilizarea a doar 3 primeri care au generat produşi de amplificare la specia Lilium, tot o specie cu genom mare ,şi anume primerul OPC-08 ,OPH-09 şi primerul OPH-18.

Primerul OPC-08 a fost eliminat din studiu, datorită faptului că în urma amplificării repetate cu acest primer,nu am obŃinut produşi de amplificare.

Atât cu primerul OPH-09 cât şi cu primerul OPH-18, de la care ne-am fi aşteptat să obŃinem rezultate compatibile cu cele deja obŃinute în cazul genului Lilium numărul produşilor de amplificare a variat extrem de mult la fiecare migrare.

Profilul elecroforetic al amplificării cu primerul OPH-09 şi cu primerul OPH-18 este prezentat în figurile următoare:

Fig. 9 Produşii de amplificare obŃinuŃi cu primerul OPH-09 Fig. 9 Amplification products obtained with primer OPH-09

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

500 pb

1000 pb

Legenda (Legend)

Benzile polimorfice au fost marcate în programul special de prelucrare a datelor. Cu primerul OPH-09 s-au evidenŃiat un număr de 15 benzi polimorfice iar primerul OPH-18 a pus în evidenŃă 7-15 benzi polimorfice în funcŃie de amplificare. Fragmentele rezultate prin amplificarea cu primerii OPH-09 şi cu OPH-18 au avut lungimea cuprinsă între 300 şi 1600 pb. Rezultatele au fost analizate cu programul Microsoft Excel.DistanŃele genetice sunt reprezentate în tabelele următoare iar indicii de similaritate direct pe figura dendrogramei obŃinute. Speciile sunt mai strâns înrudite cu cât valorile distanŃelor genetice sunt mai mici.

Apropierea genetică între speciile luate in studiu, stabilită pe baza matricei distanŃelor genetice şi a algoritmului Neighbor Joining Tree, sunt reprezentate sub forma unei dendrograme. ConstrucŃia dendrogramelor s-a realizat cu ajutorul programului MEGA 3.1 si a programului FreeTree.

În cadrul dendrogramei s-au evidenŃiat 2 grupuri principale. Primul grup (A) cuprinde speciile Tulipa tarda 73125-4, Tulipa albertii 97274-3 şi Tulipa praestans iar cel de al II-lea grup (B) cuprinde speciile T. fosteriana ‘’Princeps’’, T. kaufmanniana ‘’ Stresa’’ R, T. greigii ‘’Zampa’’ R, T. tubergeniana 97419, T. hungarica 97423, T. turkestanica 97297-1, T. aitchisonii 20425 şi cultivarele Kess Nelis, Cantate, Ile de France, Christmas Marvel, Leen vd Mark . Grupul B cuprinde patru subgrupe notate cu B1, B2, B3 şi B4.

Grupul A cuprinde speciile Tulipa albertii 97274-3 şi Tulipa praestans care aparŃin aceleaşi secŃii Eichleres iar Tulipa tarda 73125-4 aparŃine subgenului Eriostemones, fiind încadrate greşit în dendrogramă în acelaşi grup.

L -Marker ADN 1 KB (Invitrogen)

1. T. fosteriana ‘’Princeps’’

2. T. praestans R

3. T. kaufmanniana ‘’Stresa’’ R

4. T. greigii ‘’Zampa’’ R

5. T. tubergeniana 97419

6. T. hungarica 97423

7. T. albertii 97274-3

8. T. turkestanica 97297-1

9. T. aitchisonii 20425

10. T. tarda 73125-4

11. Cantate

12. Kees Nelis

13. Ile de France

14. Christmas Marvel

15. Leen vd Mark

Fig.10 Produşii de amplificare obŃinuŃi cu primerul OPH-18 Fig. 10 Amplification products obtained with primer OPH-18

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

500 pb

Subgrupul B1 cuprinde speciile T. hungarica 97423 şi T. greigii ‘’Zampa’’ R care aparŃin unor secŃii diferite, respectiv secŃiei Tulipa şi secŃiei Eichleres şi speciile Ile de France, Christmas Marvel care aparŃin aceleaşi secŃii dar nu aparŃin secŃiei Tulipa.

Subgrupul B2 cuprinde specia T. aitchisonii 20425, T. fosteriana ‘’Princeps’’şi cultivarul Leen vd Mark care nu sunt încadrate în secŃiile la care aparŃin.

Subgrupul B3 cuprinde speciile T. turkestanica 97297-1 şi T. kaufmanniana ‘’ Stresa’’ R care aparŃin la două subgenuri diferite respectiv subgenului Tulipa şi subgenului Eriostemones şi care sunt încadrate greşit în acelaşi subgrup.

Subgrupul B4 cuprinde specia T. tubergeniana 97419 şi cultivarurile Kess Nelis, Cantate care aparŃin aceleaşi secŃii şi sunt încadrate corect.

În ceea ce priveşte acest studiu comparativ a celor zece specii cu unele dintre cele mai importante cinci cultivare se poate remarca faptul că cele mai apropiate genetic sunt Ile de France şi Christmas Marvel cu o distantă genetică de 0,2. Între restul speciilor luate în studiu s-au constatat distanŃe genetice mari şi foarte mari. Între specia T. fosteriana ‘’Princeps’’şi Tulipa praestans, T. kaufmanniana ‘’ Stresa’’, T. greigii ‘’Zampa’’, Tulipa tubergeniana 97419, Tulipa albertii 97274-3, Tulipa turkestanica 97297-1, Tulipa tarda, Kess Nelis existând distanŃe genetice chiar de 1. Acest lucru se datorează în principal originii diferite a materialului biologic luat în studiu şi a fondului genetic extrem de diferit al acestei specii.

Reproductibilitatea analizei rămâne încă o problemă mult discutată, de altfel Weising şi colab.(1995) subliniază faptul că relaŃiile filogenetice care rezultă din analiza RAPD se bazează pe două presupuneri:

� IndependenŃa caracterelor analizate (benzilor) în cadrul fiecărei specii. Sunt foarte rare situaŃiile în care ştim cu certitudine dacă benzile considerate ca şi caractere independente reprezintă de fapt fragmente linkate sau alele. Dacă fragmentele linkate sau alelice sunt folosite la estimarea gradului de înrudire înseamnă că acelaşi caracter va fi numărat de două ori.

�Omologia caracterelor (benzilor) la comparaŃile între specii Se bazează pe faptul că fragmentele care au migrat în aceeasi poziŃie în gel, reprezintă secvenŃe omoloage. Unii autori afirmă ca dacă erorile privind omologia benzilor care au migrat în aceeaşi poziŃie în gel sunt aleatoare, atunci ele vor avea un efect foarte scăzut asupra gradului de similaritate şi asupra modului de reprezentare grafică a relaŃiilor de înrudire ( Adams şi Rieseberg, 1998).

Rezultatele arată faptul că ,după amplificări şi migrări repetate, unele specii care conform taxonomiei botanice sunt considerate ca fiind apropiate genetic ,Tulipa albertii, T. kaufmanniana‘’ Stresa’’ 97274-3, Tulipa praestans, T. fosteriana ‘’Princeps’’ şi T. tubergeniana 97419 sunt încadrate ,conform dendrogramei obŃinute în urma amplificării cu primeri RAPD, în alte grupuri decât în grupul secŃiei căreia îi aparŃin. Mai exact, nu există o dendrogramă identică cu acelaşi încadrări, în condiŃiile în care s-au utilizat aceleaşi specii, acelaşi protocol de extracŃie, acelaşi program PCR , aceleaşi condiŃii de electroforeză, şi chiar s-a utilizat simultan pentru migrare ADN amplificat provenit din acelasi tub Eppendorf. O problemă majoră o constituie faptul că primerii utilizaŃi amplifică doar ADN-ul de la anumite specii şi cultivare, niciodată amplificând ADN-ul de la toate variantele luate în studiu. Acest lucru se datorează , credem noi, şi datorită faptului că doar un număr foarte redus de primeri (s-au testat un numar de peste 50 primeri OPERON care nu amplificat, van Heusden şi colab, 2003) au amplificat şi au generat benzi polimorfe, astfel că la realizarea dendrogramelor s-au putut utiliza doar 2 primeri.

Toate aceste probleme majore ale analizei RAPD pe care le-am întâmpinat au determinat focalizarea cercetărilor noastre spre markerii AFLP.

Dendrograma obŃinută pe baza analizei tip neighbour joining utilizând coeficientul Nei Li

5.2. REZULTATE PRIVIND UTILIZAREA TEHNICII AFLP LA GENUL TULIPA

Un aspect deosebit de important este calitatea ADN-ului utilizat în analizele AFLP. Pentru a avea reproductibilitate şi a elimina "falsele" polimorfisme este foarte important ca ADN-ul să fie complet digerat de enzimele de restricŃie în toate situsurile specifice. În caz contrar poate apărea un profil polimorf care poate să se datoreze unei digestii incomplete a ADN-ului. Izolarea ADN-ului am realizat-o pe baza protocolului de extracŃie ADN descris de Pieter VOS şi colab. 1995 utilizată pentru fingerprinting. Din

T . T A RDA

T . A L B E R T II 9 727 4-3

T . P R A E S T A NS

T . HU NGA RICA 97 42 3

T .GRE IGII Zam p a

C HRIS T MA S MA RV E L

IL E DE FR A NCE 6 7

31

23

T . A ICH IS ONII 2 04 25

L E E N vd MA RK

T . FOS T E RIA NA P rinc e 3 8

10

22

T . K A UFMA NN IA NA S tre

T . T U RK E S T A N IC A 97 29 5 3

8

C A NT A T E

K E S S N E LIS

T . T U B E R GE NIA N A 97 41 4 8

44

46

14

2 8

1 00

A

B

Fig.11 Dendrograma obŃinută la cele 10 specii si 5 cultivare analizate

B1

B2

B3

B4

cercetările efectuate până în prezent se poate constata faptul că protocolul de extracŃie ADN descris de Pieter VOS şi colab. 1995 este cel mai eficient în cazul speciei Tulipa.

Materialul biologic utilizat în efectuarea analizelor moleculare este extrem de valoros fiind reprezentat de 21 de specii unice pe plan mondial, 6 hibrizi, 13 cultivare , precum şi de cei mai importanŃi doi genitori utilizaŃi în programele de ameliorare Kees Nelis (sensibil la virusul TBV dar rezistent la Fusarium) şi Cantata (rezistent la TBV dar sensibil la Fusarium) şi descendenŃii F1 (111) ai acestei combinaŃii hibride (Kees Nelis x Cantate).

Tehnica AFLP se bazează pe selecŃia unor fragmente de restricŃie prin digestia ADN-ului genomal care este pusă în evidenŃă prin amplificare utilizând tehnica PCR.În prezenta teză realizată în cadrul Laboratorului de Genetică moleculară (LI-COR Laboratory, Departamentul de ameliorarea plantelor) de la Plant Research International s-a utilizat marcajul cu fluorescenŃă şi secvenŃiatorul automat ADN Li-Cor DNA Gene Readir 4200 iar separarea produşilor de amplificare s-a realizat prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 6% Long Ranger şi evidenŃiere prin autoradiografie. Avantajul utilizării primerilor marcaŃi fluorescent este determinat de creşterea eficienŃei prin reducerea timpului total până la obŃinerea rezultatelor şi prin reducerea costurilor.

Avantajul utilizării primerilor marcaŃi fluorescent este determinat de creşterea eficienŃei prin reducerea timpului total până la obŃinerea rezultatelor şi prin reducerea costurilor. La capetele 3' ale primerilor se vor adăuga anumite nucleotide care vor permite amplificarea selectivă a unei categorii de secvenŃe din setul de fragmente de restricŃie. Nu vor fi amplificate decât acele fragmente de restricŃie care au nucleotidele ce flanchează situsul de restricŃie complementare cu nucleotidele selective ale primerilor. Fragmentele de restricŃie care urmează să fie amplificate s-au obŃinut cu ajutorul a două enzime de restricŃie EcoRI şi MseI (la una dintre ele situsul de restricŃie apare cu o frecvenŃă redusă în cadrul genomului –rare cutter, la cealaltă frecvenŃa este mare-frequent cutter).

Utilizarea numai a enzimelor ce generează fragmente scurte (frecquent cutter) ar determina apariŃia unui număr mult prea mare de fragmente pentru electroforeza în gel. Ulterior, o secvenŃa de ADN specifică este legată la unul din capetele fragmentelor de ADN şi o alta la capătul celălalt. Aceste secvenŃe, împreună cu locurile de restricŃie adiacente, servesc ca loc de ataşare pentru primerii PCR. Primerii sunt în asa fel sintetizaŃi pentru a putea identifica secvenŃele adăugate.Prin metoda AFLP are loc amplificarea predominantă a acelor fragmente de restricŃie care au la unul din capete o secvenŃă rezultată ca urmare a fragmentării cu o enzimă “ frequent cutter ” şi la celălalt capăt cu o enzimă “rare cutter ”.Enzimele frequent cutter vor genera fragmente mici de ADN care se vor amplifica bine şi vor avea o mărime optimă pentru separarea în gelurile denaturante (geluri de secvenŃieri).

Folosind enzimele rare cutter are loc o reducere a numărului de fragmente amplificate, de vreme ce fragmentele mici şi mari care rezultă vor fi amplificate. Aceasta limitează numărul nucleotidelor selective necesare pentru reacŃia AFLP. Genomul multor plante poate fi analizat folosind combinaŃia E+3/M+3sau E+3/M+4 cum este şi cazul speciei Tulipa. Folosirea a 2 enzime de restricŃie face posibilă marcarea unei singure catene din cele două ale produsului PCR, ceea ce previne apariŃia ’’dublurilor’’ în gelurile denaturante datorită mobilităŃii inegale a celor 2 catene ale fragmentelor amplificate. Folosind 2 tipuri de enzime de restricŃie diferite ne oferă posibilitatea de a putea controla numărul de fragmente care vor fi amplificate. În afară de aceste consideraŃii tehnice situsurile enzimei rare cutter pot sa servească ca şi repere pentru studii de cartare fizică a genomului.Numărul fragmentelor amplificate prin tehnica AFLP poate fi controlat prin alegerea numărului de nucleotide selective care se adaugă la capătul 3’ al primerului.

Vos şi colaboratorii , în anul 1995, au testat tehnica AFLP la nivelul genomului uman iar rezultatele au indicat faptul că se pot obŃin amprente genetice clare numai prin creşterea numărului de nucleotide selective adaugate la capătul 3’ al primerului. În cazul speciilor cu genom mare , cum este şi genul Tulipa, este nevoie de o alegere foarte riguroasă a primerilor precum şi de o atenŃie deosebită în parcurgerea tuturor etapelor, pentru a se putea obŃine amprente genetice clare şi cu o reproductibilitate ridicată.

Cercetările efectuate la genul Alstroemeria (Tae-Ho Han, 2001), tot o specie cu genom mare, au arătat faptul că în urma testării unor primeri marcaŃi fluorescenŃi care conŃin un număr diferit de nucleotide selective, respectiv cu 6, 7 şi 8 nucleotide selective, s-au obŃinut următoarele rezultate:

� în cazul utilizării combinaŃiilor de primeri cu 6 nucleotide selective, respectiv EcoRI+3/MseI+3, s-a obŃinut o medie a fragmentelor amplificate de 109 (66-154).

� în cazul utilizării combinaŃiilor de primeri cu 7 nucleotide selective, EcoRI+3/MseI+4, numărul fragmentelor amplificate s-a redus semnificativ, obtinându-se o medie a fragmentelor amplificate de doar 87 (47-158). Similar şi în cazul utilizării combinaŃiilor de primeri cu 8 nucleotide selective, EcoRI+4/MseI+4, 91 de fragmente (36-135) au fost amplificate. Aceste rezultate arată faptul că numărul produşilor de amplificare preconizaŃi a fost apropiat valoric cu cel vizualizat în cazul utilizării a 8 nucleotide selective. Efectul determinat de lipsa unei nucleotide selective asupra numărului de benzi generate a fost în detaliu studiat (Tae-Ho Han,2001) prin compararea amprentelor genetice vizualizate utilizând 7 nucleotide selective cu 4 amprente genetice similare generate de către primeri cu 8 nucleotide selective, precum şi amprenta unui amestec de volum egal cu 7, respectiv 8 nucleotide selective. Identic, au fost comparate amprentele genetice obŃinute cu 6 nucleotide selective cu 4 amprente genetice similare generate de către primeri cu 7 nucleotide selective. Rezultatele au arătat faptul că amprentele genetice obŃinute din amestec de volum egal din aceleasi 2 combinaŃii de primeri au fost în mare parte identice, relevant fiind faptul că o reducere a numărului de nucleotide selective nu generează artifacte. Pe baza acestor cercetări şi după realizarea unui screening, în cazul genului Tulipa, s-a optat pentru utilizarea a doar 3 combinaŃii de primeri care sunt capabile să genereze amprente genetice clare şi anume combinaŃii de primeri cu 7 nucleotide selective . CombinaŃiile de primeri selectate şi utilizate în amprentarea genetică au fost E33M52G marcată fluorescent cu IRD 800, E37M52C marcată fluorescent cu IRD 700 şi E45M52G marcată fluorescent cu IRD 700 .Preamplificarea s-a realizat utilizându-se primeri cu o nucleotidă selectivă- E01 şi M16- fapt ce a vizat o reducere a numărului fragmentelor precum şi reducerea fundalului nespecific, tehnică care se utilizează în cazul speciilor cu genom mare, cum este şi Tulipa.

Produşii de preamplificare optimi pentru analiza AFLP trebuie să se situeze între 100-500bp. Albastru de bromfenol migrează de circa 2,2 ori mai repede decât xilen-cianolul FF, indiferent de concentraŃia agarozei. Din acest considerent se va utiliza ca şi tampon de încărcare Orange G deoarece acest colorant migrează cu o viteză mai mare de 500 bp. Produşii de preamplificare s-au încadrat în valorile optime de până la 500 bp.

Amplificarea selectivă a fost efectuată cu ajutorul primerilor care conŃineau 3 si 4 nucleotide selective adiŃionale. Primerul EcoRI+3 a fost marcat fluorescent cu IRD 700 sau IRD 800 (MWG Biotech) la capătul 5’. Fiecare dintre coloranŃi a fost " vizibil " numai pentru unul dintre laserele care au asigurat preluarea imaginii gelului.Pentru această amplificare selectivă a fost utilizat ADN rezultat din etapa anterioară după ce a fost diluat în proporŃie de 1/10 cu MilliQ H2O. Programul de Termocycler utilizat pentru amplificarea selectivă a fost cel descris de Pieter VOS şi colab. 1995. Numai unul din cei 2 primeri trebuie sa fie marcat fluorescent, de preferinŃă cel care se ataşeaza la capatele situsului de restricŃie produs de către enzimele rare-cutter. Deoarece mărimea şi compoziŃia nucleotidei determină mobilitatea electroforetică a fragmentelor de ADN monocatenare, trebuie avut grijă în momentul în care se vor compara rezultatele obŃinute cu diferiŃi primeri marcaŃi (primeri Eco versus primeri Mse). 1.5µl 10 BP Marker IRD 800 şi 1.5µl 10 BP Marker IRD 700 iar 0.7µl din fiecare probă au fost migrate în gel de poliacrilamidă 6%(Long Ranger, Ready to use Gel Matrix, KB Plus, Westburg) într-un secvenŃiator ADN (Li-Cor DNA Gene Readir 4200). Migrarea produşilor de amplificare s-a realizat timp de 2.30 h, la o tensiune de 1500 V, la o intensitate a curentului de 35 mA, temperatura de 48 oC. Aparatul LI-COR Automated Sequencer Gene Readir 4200, permite focalizarea migrării ADN-ului simultan pentru cele două tipuri de combinaŃii. Practic, ADN-ul este vizualizat doar de unul din cele două fascilole laser ale aparatului, în funcŃie de tipul marcării fluorescente IRD 700 sau IRD 800. Probele marcate fluorescent cu IRD 800 trebuie încarcate primele, pentru a ne asigura că imaginea frontului de Brom Phenol Blue migrează în spatele probelor marcate fluorescent cu IRD 700. (Protocol for High-Throughput AFLP Analysis using Li-Cor IR2 Automated Sequencers-Alexander A. Myburg and David L. Remington, North Carolina State University). Cercetările efectuate în prezenta teză au concluzionat faptul că pentru a se putea obŃine amprente genetice clare şi cu o reproductibilitate ridicată recomandăm utilizarea combinaŃiilor de primeri cu 7 nucleotide selective, EcoRI+3/MseI+4 (Bondrea Ioana şi colab.,2007,2008 ) respectiv combinaŃiile

E33M52G marcată fluorescent cu IRD 800, E37M52C marcată fluorescent cu IRD 700 şi E45M52G marcată fluorescent cu IRD 700 (Bondrea Ioana şi colab., 2007, 2008).

Tehnica AFLP este foarte utilă în amprentarea genetică în special, în cazul descendenŃilor unei combinaŃii hibride (segregating populations) şi pentru diferenŃierea unei varietăŃi.Pentru multe specii de plante markerii AFLP sunt utili în construirea hărŃilor genetice şi în cazul studiilor filogenetice, unde este esenŃial generarea unui mare număr de benzi ale fragmentelor de retricŃie facilitând detecŃia polimorfismelor. În cazul genului Tulipa, o specie cu un genom mare ,rezultatele obŃinute demonstrează faptul că fondul de germoplasmă aparŃinând speciilor de lalele studiate este extrem de diferit, existând foarte multe fragmente polimorfe (Bondrea Ioana şi colab., 2007, 2008).

5.3. REZULTATE PRIVIND IDENTIFICAREA UNOR MARKERI A FLP CARE SUNT ÎN LINKAGE CU REZISTEN łA LA TBV Descrisă în Europa în 1928, pătarea lalelelor (Tulip Breaking Virus) este o boală păgubitoare răspandită peste tot unde se cultivă aceasta plantă, virusul infectând, de asemenea, plantele de Lilium, unde produce marmorări slabe sau moderate pe frunze, iar în complex cu alte virusuri simptome mozaicale şi necroze, dar nu a fost semnalat încă la celelalte specii bulboase (Asjes şi Elbertsen, 1982). Totuşi sunt frecvente cazurile când frunzele nu manifestă nici un simptom. Numărul bulbilor este redus, florile prezintă aspect mozaicat (Eikelboom şi colab., 1992), creşterea plantelor este oprită, înrădacinarea slabă iar înflorirea are loc cu 7-10 zile mai târziu. Găsirea markerilor moleculari linkaŃi cu gene de rezistenŃă reprezintă o etapă importantă a ameliorarii eficacităŃii programelor de selecŃie. În ameliorarea rezistenŃei la boli, populaŃiile rezultate din încrucişarea dintre genitori rezistenti, genotipuri productive sau cu alte caractere dorite sunt selectate în condiŃii de atac natural al agentului patogen sau sunt infectate artificial. Aceste tehnici necesită mult timp şi costuri ridicate. Există chiar şi posibilitatea că unele plante sensibile să poată scăpa atacului. Identificarea markerilor linkaŃi cu genele de rezistenŃă va înlătura aceste dezavantaje şi va ajuta la identificarea plantelor care posedă aceste gene simultan. Alt avantaj ar fi că nu necesită cantităŃi mari de ADN pentru fiecare plantă individual iar testarea se realizează fără distrugerea plantelor şi fără a le supune la atacului cu patogeni sau insecte în generaŃiile timpurii.Utilizând seturi de primeri AFLP, produşii de reacŃie vor fi migraŃi în gel de poliacrilamidă iar genotipizarea plantelor individuale pentru rezistenŃă poate fi asigurată de prezenŃa sau absenŃa benzii marker în gel. Pe parcursul perioadei de vegetaŃie, s-a determinat rezistenŃa la TBV a genitorilor Kees Nelis (sensibil la TBV) şi Cantate (rezistent la TBV), a descendenŃilor acestei combinaŃii (111) şi a unor plante test sensibile prin efectuarea infecŃiilor utilizând ca vectori afidele. Deoarece se presupune că acest caracter- rezistenŃa la TBV –este determinat de o singură genă- rezistenŃă monogenică- se va urmări raportul de segregare al hibrizilor F1 pentru acest caracter. Plantele triploide şi tetraploide au fost identificate şi excluse din analiză, astfel că populaŃia testată a fost de 89 plante (Plant Research International, 2005).Raportul de segregare plante sensibile/plante rezistente a fost de 37:46. Acest raport nu este distinct semnificativ faŃă de raportul de segregare de 1:1, deci se poate concluziona faptul că rezistenŃa la TBV este determinată de o singură genă- rezistenŃă monogenică.

Izolarea ADN-ului si analizele AFLP am realizat-o pe baza protocolului de extracŃie ADN descris de Pieter VOS şi colab. 1995 utilizată pentru fingerprinting.

Analizele AFLP au generat markeri pentru fiecare combinaŃie de primeri, rezultând identificarea a 595 de markeri. 394 markeri au fost cartaŃi iar în urma cercetărilor efectuate s-a putut identifica 3 markeri care sunt în linkage cu rezistenŃa la TBV :

• cu combinaŃia de primeri E45M52G markerul care este în linkage cu rezistenŃa la TBV a fost identificat la 96bp.

• cu combinaŃia de primeri E33M52G markerul care este în linkage cu rezistenŃa la TBV a fost identificat la 175 bp.

• cu combinaŃia de primeri E37M52C markerul care este în linkage cu rezistenŃa la TBV a fost identificat la 385 bp.

1 2........ 56

Fig.12 Amprenta genetică obŃinută cu combinaŃia de primeri E33M52G marcată fluorescent cu IRD 800

Legenda (Legend) 1, 2,…56 de la stânga la dreapta

În prezentul studiu realizat, s-a putut identifica prin tehnica AFLP, în cadrul descendenŃilor F1 a combinaŃiei hibride Kees Nelis x Cantate, prezenŃa a 4 descendenŃi F1 care prezintă rezistenŃa la TBV şi anume hibrizii numărul 68, 69, 75, 77 precum şi identificarea speciilor rezistente la TBV: T. fosteriana ‘’Princeps’’, T. fosteriana 102 Juan x Cantate, T. fosteriana 112 Juan x Cantate, T. fosteriana 122 Cantate x Juan, T. fosteriana 144 Princeps x ML, T. fosteriana 148 Cantate x Princeps.

Markerii rezultaŃi din analizele AFLP, a descendenŃilor F1 luaŃi în studiu, au fost utilizaŃi pentru a construi harta de linkage cu ajutorul programul JOINMAP 3.0 (Stam şi van Ooijen, 1995). Markerii au fost repartizaŃi în grupurile de linkage pe baza frecvenŃei de recombinare dintre markeri. Markerii care au o frecvenŃă de recombinare de 0,5 nu sunt in linkage. Dacă markerii sunt in linkage frecvenŃa de recombinare trebuie să fie mai mică de 0,5. Pentru a se determina mai exact dacă markerii sunt linkaŃi s-a utilizat indicele LOD.Acest indice LOD este 10log din raportul dintre probabilitatea ca doi markeri sa fie linkati sau să nu fie în linkage.

Setul de informaŃii al formei paterne (aaxab) a fost divizat în 11 grupuri cu o limită importanta LOD 6. Setul de date al formei materne (abxaa) a fost divizat dar a prezentat o limită scazută (LOD 4), rezultând 20 de grupuri. DistanŃele de pe harta genetică au fost calculate folosind funcŃia de cartare a lui Kosambi, care converteşte unităŃile de recombinare în distanŃe genetice. Această tehnică constituie un instrument valoros şi extrem de util în procesul de ameliorare a eficacităŃii programelor de selecŃie ajutând la identificarea plantelor purtătoare de gene de rezistenŃă la TBV si înlăturând deficienŃele cauzate de timpul şi costurile ridicate ale procesului de ameliorare clasic, cu atât mai mult cu cât seminŃele hibride parcurg o perioadă de 5 ani până la înflorire, iar pe parcursul acesteia trebuie avută o grija permanentă, plantele fiind extrem de sensibile. Odată cu identificarea acestor markeri moleculari linkaŃi cu rezistenŃa la TBV selecŃia asistată poate fi realizată încă din stadii timpurii fără a depinde de incidenŃa naturală a bolii şi mai ales în absenŃa patogenului, mentinându-se doar genotipurile dorite. Aceşti markeri identificaŃi şi utilizaŃi în analizele moleculare din prezenta teză se utilizează în prezent ca şi markeri de selecŃie pentru rezistenŃa la TBV în programele de ameliorare întreprinse de Plant Research International cu marile companii olandeze (van Heusden – personal communication).

1. T. praestans Romania 2. T. kaufmanniana ‘’ Stresa’’ Romania 3. T. kaufmanniana ‘G. Verdi’’ (81129) 4. T. greigii ‘’Zampa’’ Romania 5. T. fosteriana ‘’ Sweetheart’’ Romania 6. T. fosteriana ‘’ Golden Emperor’’ Romania 7. T. fosteriana ‘’’Purissima’’ Romania 8. T. fosteriana ‘’ Juan’’ 9. T. fosteriana ‘’Princeps’’ 10. T. fosteriana ‘’ Madame lefeber’’ 11. T. fosteriana 102 Juan x Cantate 12. T. fosteriana 112 Juan x Cantate 13. T. fosteriana 122 Cantate x Juan 14. T. fosteriana 144 Princeps x ML 15. T. fosteriana 148 Cantate x Princeps 16. T. tubergeniana 97419 17. T. hungarica 97423 18. T. albertii 97274-3 19. T. turkestanica 97297-1 20. T. aitchisonii 20425 21. T. tarda 73125-4 22. Apeldoorn Romania 23. 76261-24 Cantate x Verdi 24. Praestans x Albertii (030121) 25. Kess Nelis x Cantate 9 26. Kess Nelis x Cantate 64 27. 89191 KN x Cantate 28. Ile de France

29. Christmas Marvel 30. Leen vd Mark 31. Bellona 10 BP Marker IRD 800 32. Kees Nelis 33. Ballerina Romania 34. Spring Green Romania 35. Queen of Night Romania 36. Monte Carlo Romania 37. Alliance 38. Escape 39. Yellow Flight 40. Martor 41. Orz 42. Tomate 43. T. praestans Romania 44. T.fosteriana‘’Sweetheart’’ Romania 45. Probă lipsă 46. T. fosteriana ‘’ Juan’’ 47. T. fosteriana ‘’Princeps’’ 48. T. fosteriana 102 Juan x Cantate 49. T. fosteriana 144 Princeps x ML 50. T. fosteriana 148 Cantate x Princeps 51. T. tarda 73125-4 10 BP Marker IRD 800 52. Apeldoorn Romania 53. Leen vd Mark 54. Ballerina Romania 55. Spring Green Romania 56. Queen of Night Romania

5.4. REZULTATE PRELIMINARE PRIVIND UTILIZAREA TEHNI CII NBS AFLP LA GENUL TULIPA

Tehnica NBS AFLP a fost elaborată pentru a mări şansele de a găsi markeri care sunt în linkage cu rezistenŃa la TBV. NBS AFLP-ul se bazează pe protocolul specific AFLP (Vos et al., 1995) cu precizarea că primerii standard au fost înlocuiŃi cu primeri specifici NBS. Amplificarea cu primerii Ploop, în marea majoritate a cazurilor, determină o vizualizare de intensitate mai redusă însă profilul electroforetic are reproductibilitate.CombinaŃia Ploop1/Eco a generat 100 benzi din care 6% au segregat în cadrul populaŃiei testate iar combinaŃia Ploop1/Mse a generat 120 benzi cu o segregare de 19%.Ambii primeri Eco şi Mse utilizaŃi au prezentat o nucleotidă selectivă.Se presupune că secvenŃele Ploop şi Kinase2 sunt prezente în întreg genomul lalelelor în număr mare. La Arabidopsis se preconizează că ar exista 300-400 omologi NBS (Mes, personal communication). Întreg genomul speciei Arabidopsis se constituie din 120.000 Kb (Paterson, 1996).

Genomul speciei Tulipa este de 5000 de ori mai mare decât al Arabidopsis-ului, deci se poate aprecia prezenŃa a circa 1.500.000 NBS-uri în genomul acestei specii (Mes, personal communication). Prin utilizarea unei combinaŃii diferite enzimă/adaptor sau prin modificarea secvenŃei primerului Ploop nedegenerat numărul fragmentelor amplificate ar putea creşte. Mărimea relativ mică a fragmentelor Eco/Mse şi faptul că primerii NBS se localizează în interiorul fragmentului ar putea cauza probleme prin reducerea mediei mărimilor fragmentelor. Utilizând primeri nested se va reduce şi mai mult mărimea fragmentelor. Mărimea fragmentelor amplificate este limitată de perioada de elongaŃie din timpul PCR-ului.Protocolul PCR generează în mod normal fragmente cu o mărime cuprinsă între 50-500 bp, fragmentele mai mari vor putea fi amplificate prin extinderea perioadei de elongaŃie. Pentru a optimiza amplificarea fragmentelor omoloage NBS s-a recurs la un PCR liniar în care s-a utilizat numai un primer NBS. Utilizarea unui PCR liniar a determinat obŃinerea unor benzi nereproductibile, cel mai probabil din cauza prezenŃei unui număr foarte mare de fragmente omoloage care în timpul amplificării au multiplicat diferite fragmente. Creşterea concentraŃiei primerilor pe parcursul amplificării marcate ar putea fi o soluŃie în creşterea numărului fragmentelor şi îmbunătaŃirea vizualizării. Cele mai multe amplificări selective pot fi obŃinute utilizând doi primeri. CombinaŃia de primeri Nsi selectiv – Ploop specific urmată de o a doua amplificare utilizând combinaŃia Nsi- Kinase 2 nested generează profile electroforetice reproductibile dar nu se vizualizează foarte clar, dar se poate îmbunătăŃii prin creşterea concentraŃiei primerului NBS în timpul amplificării marcate.

Prin utilizarea mai multor primeri specifici Nsi în timpul preamplificării se va creşte numărul benzilor care segregă (se separă). Utilizând combinaŃia de primeri Nsi/Ploop la preamplificare mai mult de 50%din benzi au segregat.Din experimentele efectuate de către van Heusden şi colab. pe parcursul mai multor ani de cercetare în care s-au îmbunătăŃit parametrii PCR, s-au testat diferite temperaturi de ataşare a primerilor, numărul ciclurilor de amplificare şi timpul de elongaŃie, a rezultat faptul ca acel fundal închis care apare evident ar putea fi estompat prin utilizarea mai multor primeri selectivi sau specifici. În prezentul studiu pe baza rezultatelor obŃinute anterior, în laboratorul de Genetică Moleculară de la Plant Research International de către van Heusden şi colab., s-a optat pentru realizarea unei extra amplificări, după preamplificare cu scopul de a amplifica toate fragmentele care conŃin o structură omoloagă NBS-ului. Preamplificarea a fost elaborată cu primerii Ploop1, 2 sau Kinaza 2 în combinaŃie cu Nsi0. Dacă un primer a fost folosit la amplificare al doilea primer a fost înlocuit cu milliQ. Programul PCR a fost optimizat pentru a amplifica fragmente mai mari care să corespundă cu lungimea prevazută fragmentului NBS. După preamplificarea cu primeri specifici NBS-ului (Ploop), amplificarea „markată” a fost elaborată cu primeri ’’nested’’ (Kinaza 2). Nested se referă la faptul că secvenŃa primerului se ataşează mai specific la fragmentul NBS-ului. Ploop-ul a fost localizat în partea stângă a secvenŃei şi kinaza 2 în partea dreaptă a ploop-ului.

Pentru a amplifica fragmentele la ambele capele ale structurii NBS (la dreapta şi la stânga), EcoR1 şi MseI au fost înlocuite cu NsiI. Situsul de restricŃie al NsiI-ului se localizează în secvenŃa MHD (Munc Homologous Domain) la capătul drept al structurii NBS. La capătul stâng, au fost ataşaŃi primerii Ploop şi Kinaza 2. Dacă se va utiliza o a doua enzimă creştere riscul distrugerii secvenŃei NBS datorită restricŃiei. Cu o enzimă rare cutter ar fi posibil generarea mai multor fragmente amplificate certe fără a tăia secvenŃa NBS. După prima amplificare mediată de adaptor ar putea fi posibilă selectarea pentru omologia NBS-ului. SecvenŃierea fragmentelor amplificate poate determina dacă acestea sunt intr-adevăr analogi ai genelor de rezistenŃă (Plant Research International, 2006). Pentru a putea îmbunătăŃii amplificarea NBS mediată de adaptor, recomandăm testarea cu o specie a cărei genă de rezistenŃă este

deja identificată. Primerii Ploop şi Kinase 2 se vor înlocui cu primeri construiŃi după secvenŃa genei, astfel că markerii obŃinuŃi în urma amplificării ar putea fi linkaŃi cu gena de rezistenŃă (Plant Research International, 2006).

Amplificarea NBS mediată de adaptor a avut rezultate promiŃătoare utilizând combinaŃia de primeri NsiC/Ploop la preamplificare şi combinaŃia NsiCTG/Kinase 2 în amplificarea marcată. Mai mulŃi markeri ar putea fi generaŃi dacă se vor înlocui nucleotidele selective cu altele. Lungimea fragmentelor amplificate a fost mai mică decât s-ar fi preconizat să fie, astfel că se recomandă testarea omologiei fragmentelor amplificate cu secvenŃa NBS.ÎmbunătăŃirea rezultatelor se poate realiza prin optimizarea condiŃiilor PCR şi a testării unui număr mai mare de primeri. ObŃinerea unui fundal electoforetic mai clar s-ar putea realiza prin creşterea ciclurilor de amplificare şi prin modificarea concentraŃiei Mg2+ sau a dNTP-ului.Astfel că recomandăm testarea mai multor parametrii pentru a determina factorul care înfluenŃează în ceea mai mare proporŃie amplificarea. Din combinaŃiile de primeri utilizate două combinaŃii au generat markeri evidenŃi. Analizele realizate cu combinaŃia de primeri Eco01- Ploop1 au generat 14 markeri evidenŃi iar combinaŃia de primeri M02-Ploop1 a generat 6 markeri evidenŃi.Markerii Eco01-Ploop1nu sunt în linkage cu markerii hărŃii genetice iar markerii M02-Ploop1 se regăsesc în diferite grupuri de linkage. M02Seq1-3 sunt localizaŃi în grupul 1 de linkage pe harta genetică a formei materne –Cantate- (Plant Research International, 2006). CAPITOLUL VI. CONCLUZII ŞI RECOMAND ĂRI

Din cercetările efectuate până în prezent se poate constata faptul că protocolul de extracŃie ADN descris de Pieter VOS şi colab. 1995 este cel mai eficient în cazul speciei Tulipa. Un aspect deosebit de important este calitatea ADN-ului utilizat în analizele AFLP şi RAPD iar prin utilizarea acestui protocol de izolare a ADN-ului toate probele analizate au prezentat o puritate foarte bună.

Materialul biologic utilizat în efectuarea analizelor moleculare este extrem de valoros fiind reprezentat de 21 de specii unice pe plan mondial, 6 hibrizi, 13 cultivare, precum şi de cei mai importanŃi doi genitori utilizaŃi în programele de ameliorare Kees Nelis (sensibil la virusul TBV dar rezistent la Fusarium) şi Cantata (rezistent la TBV dar sensibil la Fusarium) şi descendenŃii F1 (111) ai acestei combinaŃii hibride (Kees Nelis x Cantate).

Dorim să evidenŃiem faptul că amplificarea probelor pentru analizele RAPD s-a realizat cu un program PCR optimizat pentru speciile cu genom mare (elaborat de Laboratory of Plant Breeding, Plant Research International, Wageningen 2004).

O problemă majoră o constituie faptul că primerii utilizaŃi amplifică doar ADN-ul de la anumite specii şi cultivare, niciodată amplificând ADN-ul de la toate variantele luate în studiu. Acest lucru se datorează, credem noi, şi datorită faptului că doar un număr foarte redus de primeri au amplificat şi au generat benzi polimorfe, astfel că la realizarea dendrogramelor s-au putut utiliza doar 2 primeri. Toate aceste probleme majore ale analizei RAPD pe care le-am întâmpinat au determinat focalizarea cercetărilor noastre spre markerii AFLP şi nu recomandăm utilizarea în cazul speciilor cu genom mare ci doar pentru determinarea unui nivel informativ polimorfismului.

În cazul analizelor AFLP la genul Tulipa este nevoie de o alegere foarte riguroasă a primerilor precum şi de o atenŃie deosebită în parcurgerea tuturor etapelor, pentru a se putea obŃine amprente genetice clare şi cu o reproductibilitate ridicată.

Tehnica AFLP este foarte utilă în amprentarea genetică în special, în cazul descendenŃilor unei combinaŃii hibride (segregating populations) şi pentru diferenŃierea unei varietăŃi. Pentru multe specii de plante markerii AFLP sunt utili în construirea hărŃilor genetice şi în cazul studiilor filogenetice, unde este esenŃial generarea unui mare număr de benzi ale fragmentelor de retricŃie facilitând detecŃia polimorfismelor. În cazul genului Tulipa, o specie cu un genom mare, rezultatele obŃinute demonstrează faptul că fondul de germoplasmă aparŃinând speciilor de lalele studiate este extrem de diferit,existând foarte multe fragmente polimorfe. Analizele AFLP au generat markeri pentru fiecare combinaŃie de primeri, rezultând identificarea a 595 de markeri. 394 markeri au fost cartaŃi iar în urma cercetărilor efectuate s-a putut identifica 3 markeri care sunt în linkage cu rezistenŃa la TBV:

• cu combinaŃia de primeri E45M52G markerul care este în linkage cu rezistenŃa la TBV a fost identificat la 96bp.

• cu combinaŃia de primeri E33M52G markerul care este în linkage cu rezistenŃa la TBV a fost identificat la 175 bp.

• cu combinaŃia de primeri E37M52C markerul care este în linkage cu rezistenŃa la TBV a fost identificat la 385 bp. În prezentul studiu realizat, s-a putut identifica prin tehnica AFLP, în cadrul descendenŃilor F1 a

combinaŃiei hibride Kees Nelis x Cantate, prezenŃa a 4 descendenŃi F1 care prezintă rezistenŃa la TBV şi anume hibrizii numărul 68, 69, 75, 77 precum şi identificarea speciilor rezistente la TBV: T. fosteriana ‘’Princeps’’, T. fosteriana 102 Juan x Cantate, T. fosteriana 112 Juan x Cantate, T. fosteriana 122 Cantate x Juan, T. fosteriana 144 Princeps x ML, T. fosteriana 148 Cantate x Princeps.

Aceşti markeri identificaŃi şi utilizaŃi în analizele moleculare din prezenta teză se utilizează în prezent ca şi markeri de selecŃie pentru rezistenŃa la TBV în programele de ameliorare întreprinse de Plant Research International cu marile companii olandeze (van Heusden – personal communication).

Pentru a putea îmbunătăŃii amplificarea NBS mediată de adaptor, recomandăm testarea cu o specie a cărei genă de rezistenŃă este deja identificată. Primerii Ploop şi Kinase 2 se vor înlocui cu primeri construiŃi după secvenŃa genei, astfel că markerii obŃinuŃi în urma amplificării ar putea fi linkaŃi cu gena de rezistenŃă (Plant Research International, 2006).

Amplificarea NBS mediată de adaptor a avut rezultate promiŃătoare utilizând combinaŃia de primeri NsiC/Ploop la preamplificare şi combinaŃia NsiCTG/Kinase 2 în amplificarea marcată.

Mai mulŃi markeri ar putea fi generaŃi dacă se vor înlocui nucleotidele selective cu altele. Lungimea fragmentelor amplificate a fost mai mică decât s-ar fi preconizat să fie, astfel că se recomandă testarea omologiei fragmentelor amplificate cu secvenŃa NBS.

ÎmbunătăŃirea rezultatelor se poate realiza prin optimizarea condiŃiilor PCR şi a testării unui număr mai mare de primeri. ObŃinerea unui fundal electoforetic mai clar s-ar putea realiza prin creşterea ciclurilor de amplificare şi prin modificarea concentraŃiei Mg2+ sau a dNTP-ului.

Astfel că recomandăm testarea mai multor parametrii pentru a determina factorul care înfluenŃează în ceea mai mare proporŃie amplificarea. Din combinaŃiile de primeri utilizate două combinaŃii au generat markeri evidenŃi. Analizele realizate cu combinaŃia de primeri Eco01- Ploop1 au generat 14 markeri evidenŃi iar combinaŃia de primeri M02-Ploop1 a generat 6 markeri evidenŃi .Markerii Eco01-Ploop1nu sunt în linkage cu markerii hărŃii genetice iar markerii M02-Ploop1 se regăsesc în diferite grupuri de linkage. M02Seq1-3 sunt localizaŃi în grupul 1 de linkage pe harta genetică a formei materne (Cantate) (Plant Research International, 2006).

BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă (Selective Bibliography)

1. Ardelean, M. , Sestraş , R. (1999)Ameliorarea plantelor horticole, Editura Osama, Cluj-Napoca 2. Asjes, C.J., M. Elbertsen.(1982).Tulpemozaiek virus in tulpen; de symptomen en het ziekte beeld.

Folder 3. Bondrea Ioana Olivia, D. Pamfil, A. W. Van Heusden, J. Van Tuyl, M. Bondrea, Lucaci Meda,

A. Taoutaou.(2008). AFLP markers as a powerful tool for fingerprinting and breeding Tulipa genus, Homagial international Symposium, Bucureşti

4. Bondrea Ioana Olivia, D. Pamfil, A. W. Van Heusden, J. Van Tuyl, Lucaci Meda, A. Taoutaou (2008). AFLP analysis:A modern technique to speed up TBV resistance breeding. Bulletin of USAMV-CN, International Symposium- Prospects for the IIIrd Millenium in Agriculture.

5. Botschantzeva, Z.P.(1962) Tulips. Taxonomy, morphology, cytology, phytogeography and physiology, (russian edn), English translation: Varekamp, H.Q. (1982) Balkema, Rotterdam, The Netherlands, pp.23

6. Eikelboom, W., J.P. van Eijk, D. Peters and J.M. van Tuyl. (1992). Resistance to tulip breaking virus (TBV) in tulip. Acta Horticulturae 325: 631-636.

7. Le Nard, M and De Hertogh, A.A. (1993). Tulipa, in A.A. De Hertogh and M. Le Nard (eds), The physilogy of flower bulbs, elsevier, Amsterdam, The Netherlands, pp. 617-682

8. Plant Research International (2005). LI-COR AFLP protocol released by Laboratory of Plantbreeding, Wageningen University, Wageningen.

9. Plant Research International. (2005). Tulip Breeding at PRI 10. Tae-Ho Han. (2001). Use of genetic markers in Alstroemeria .Ph.D. Thesis Wageningen

Agricultural University, Wageningen, The Netherlands 11. Van Heusden, A.W., J.W. van Ooijen, R. Vrielink-van Ginkel, W.H.J. Verbeek, W.A. Wietsma

and C.Kik. (2000). A genetic map of interspecific cross in Allium based on amplified fragment length polymorphism (AFLPTM) markers. Theor. Appl. Genet. 100:118-126.

12. Van Heusden, A.W.- personal communication. 13. Van Tuyl, J.M., (1996). Interspecific hybridization of flower bulbs: A review, Acta Hortic. 430,

pp. 465-476. 14. Van Tuyl, J.M. and De Jeu, M.J. (1997). Methods for overcoming interspecific crossing barriers.

Chapter 13 in : Biotechnology and Crop Improvement (ed.K.R. Sawhney and Shivanna) pp. 273-293, Cambridge University press, Cambridge.

15. Van Tuyl M.J., Marjan G.M. van Creij. (2007). Tulip. Tulipa gesneriana and Tulipa hybrids, in Anderson (Ed.) Flower Breeding and Genetics issues, challenges and opportunities for the 21st

century. Springer. Dordrecht, The Netherlands. Pp: 623-644. 16. Vos, P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Hornes, A. Frijters, J. Pot, J.

Peleman, M. Kuiper and M. Zabeau. (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23 (21): 4407-4414.

17. www.wikipedia.org 18. http://www.liliumbreeding.nl/tulipa 19. www.tulipessauvages.org 20. http://eu.wikipedia.org/wiki/Tulip

1 2

SUMMARY

Introduction Tulip is one of the most important flower bulbs of spring days, mostly created by Dutch breeders.

More than six thousands Tulip varieties are cultivated worldwide. Production of the bulbs is mostly done in the Netherlands, even though the bulbs are used all over the world. Tulips are grown for bulb production as well as for cut flower production and gardening crop. More than 70% of the flowers and bulbs are exported from the Netherlands. All together the Netherlands are responsible for 85% of the world bulb production.

Actually, tulip breeding is a necessary step to reduce the input of chemicals used for crop protection and improve the quality. So, the main targets for breeding are resistance, shorter cold requirement and forcing period, improvement of flower longevity, growing power, new flower shapes and colours. Tulips are monocotyledonous plants from the family of Liliaceae. The primary gene centre of the genus Tulipa is located in central Asia from where distribution took place from Morocco to West Europe and West China. A secondary gene centre is found in the Caucasus.

Tulips were brought to Europe from Turkey in 1594. The original species were not determined and were named T. gesneriana. A second famous group of cultivars is the Darwin hybrids, the products of T. gesneriana x T. fosteriana, obtained by interspecific crosses. Together the groups of cultivars comprise about 1100 cultivars (Van Creij, 1997). Tulips are classified according to their time of outdoor flowering, the morphology of the perianth parts, and their botanical origin (Le Nard and De Hertogh, 1993). Both the size of the genome and the great diversity in hybrids of tulip make research difficult. The genome of tulip is 5000x bigger as the genome of Arabidopsis (120.000 Kb) and consists of 12 chromosomes. Little information about genes and their position on the chromosomes is available.

Tulips are very heterogeneous because they are cross-pollinated. Besides that, the period from seedling to flower producing bulb takes a long time, which makes selfing for inbredlines difficult. Tulips are propagated vegetatively; seeds are only used for breeding. Sowing must be done at a low temperature to induce germination and initiate the bulb primordium. The embryo produces one cotyledonary leaf, a primary root, and a hollow diverticulum, which is called a ”dropper”. The bulb primordium is positioned at the tip of the dropper. The dropper grows further into the soil and at the end of the dropper, a bulblet is produced. This small tulip bulb needs 4 to 5 years of additional growth before minimal size for flowering is reached.

The production of tulips is affected by the environment. Light temperature and many pathogenes make it difficult to produce good quality bulbs and healthy flowers. For commercial flower production simulation of temperature and length of cold treatments are used to prolong harvesting periods. It is even possible to make the bulbs produce flowers in a totally different season and almost throughout the whole year (Van Creij, 1997). Research objectives

The purpose of our research consisted in the improvement of the studies regarding Tulipa genus using molecular markers for the assessment of genetic variability in selection and breeding tulips.The main objectives joined in the following goals:

�DNA fingerprinting of species and cultivars of Tulipa genus for protection the new cultivars �to check the suitable DNA isolation protocol for species with large genome as Tulip �to find en efficient enzyme primer combination to obtain reproductible AFLP patterns, clear

and labor saving fingerprints �to find molecular markers linked with TBV resistance as a quick and cheap selection system

for breeding new resistant cultivars. �to develop a method to amplify NBS specific sequences that can be use as molecular markers for resistance gene analogues. Many resistance genes, which provide resistance to a variety of plant pathogenes have been isolated in the last few years. These genes showed sequence homologies and structural themes: Nucleotide binding sites, leucine rich repeats, transmembrane domains and

serine/threonine protein kinases. The main group of resistance genes contains a nucleotide binding site (NBS), which consists of several conserved motives.

�to start a molecular study to explore the genetic variability of botanical species and to help the conservation of rare and endangered species, including the Romanian one using RAPD analyses and AFLP markers.

Botanical tulips are on their way to disappearing and almost unknown to the public.Tulip are also victims of urbanization which nibbles away constantly at de natural spaces (Tulipa aximensis disappeared from the wild in 1974). Botanical plants are adapting themselves to a particular and natural environment over a long period of time, more stable and furthermore resistant, contributing to natural balance Tulip breaking virus is a serious problem in growing and forcing tulips. The virus causes breaking of the flower colour and reduction of the bulb yield (Eikelboom et al., 1992). Classical breeding to obtain such multiple resistance will take a long time. The long juvenile phase from seed to flowering plants and the long period needed for vegetative propagation are the main reasons for this. Important characteristics in tulip can only be tested 7 to 8 years after seed production. To keep and propagate the seedlings until they can be tested and selected is a high cost in the breeding process. Testing on clone level during the selection phase or for usage-value research is also expensive because of the high demands for test facilities and conditions. Spraying with mineral oils or synthetic pyrethroid insecticides controls the virus, but is very expensive. A better solution would be to use TBV-resistant cultivars (Straathof et al., 1996), a very high degree of resistance was found in the cultivars "Cantata" and "Princeps" (Eikelboom et al., 1992), members of the T. fosteriana cultivar group To speed up selection and reduce costs during the breeding process, selection with molecular markers for the trait of interest could be usefull. Testing plant material for resistances or quality characteristics with molecular markers could have several advantages. Selection would be possible in an early stage of the breeding process, which makes it possible to start a next generation sooner. No propagation needed to perform biotests and more traits could be tested in one season.

Marker assisted breeding is a breeding method where indirect selection through molecular markers is used. The genome is reflected on a polyacrylamide gel as a pattern of bands that are DNA fragments with different lengths. Some of the fragments can be linked to genes with a specific function by arithmetic computer programs. If this fragment is present in the plant genome the characteristic that the linked gene codes for is also present. Selection through molecular markers has several advantages:

�Defining the DNA pattern for a plant is independent of the environment the plant grows in, contrary to the bio tests, which are very environment dependent

�DNA can be isolated from young seedlings, which makes selection possible in a very early stage of the breeding process.

�Selection for different characteristics can be done in one test Different kinds of molecular markers are available, which can be divided in two groups. The first

group is Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Most of the time those are co-dominant markers. The markers are based on differences in DNA fragment lengths between two individuals. The differences occur by mutation of a restriction site of an enzyme that is added to the DNA solution. The DNA change becomes visible by southern blotting with a probe, which hybridizes with the restriction-fragments. Important disadvantages are the low degree of polymorphisms by several species and the fact that with large genomes like tulip and lily not enough DNA can be brought on to the gel, which makes it difficult to detect single copy loci (De Jong, 1997).

The second marker group uses Polymerase Chain Reaction (PCR). Among this group we can distinguish several markers: Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Co-dominant PCR markers (microsatelites/SSR) and Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). All those markers are based upon amplification of a DNA fragment, which is recognized by a primer or adapter. The polymorphism is based upon point mutations, deletions or insertions.

RAPDs make use of a random primer without labeling of DNA fragments. An important disadvantage is the reproduce-ability, which is difficult because of the use of short primers Microsatelites are often very polymorphic. The most important SSR markers originate by amplification with primers, which are complementary to flanking microsatelite-sequences. These markers often show multi-allelism and are co-dominant, which makes them very popular. Unfortunately it takes a lot of work to identify sequences for primers, while connection to specific characteristics is not always found.

AFLP markers are random amplified restriction fragments, most of the time cut with EcoRI and MseI. Short adapters are connected to all restriction sites. The fragments are selected and amplified during PCR by primers, which are complementary to the adapters. By extension of the primers with selective nucleotides a subset of all fragments can be amplified and visualized by using (radioactive) labeled primers. For AFLP no sequence information is needed, but the markers can be reproduced better than RAPDs. Usability of AFLP markers depends on the distance to the actual gene and the amount of recombination in the specific area of the genome (De Jong, 1997). A good improvement would be if the markers were based on the actual active genes. For large scale practical use AFLP markers should be transferred into SCARs, because these are less laborious in use. In that case isolation of the fragment from gel is needed after which the fragment should be cloned in a plasmid and sequenced. Primers based on the sequence can then be used to amplify the same AFLP polymorphism with a single PCR.

The plant material consisted on 21 species, 6 hybriden and 13 cultivars and progenity of cross between Kees Nelis and Cantate. 11 samples are from Botanical Garden″Alexandru Borza″ Cluj-Napoca and the most important species and cultivars are provided from Plant Reseach International collection.

DNA isolation was performed on frozen tissue. The leaf was grinded in an eppendorftube with liquid nitrogen. 0.5 mg of leaf tissue was incubated at 65°C in 750 µl extractionmixture with 41.7 mg sodiumbisulfiet. [extractionmixture = lysis buffer: extractionbuffer: 5% sarkosyl (3.5: 3.5: 0.97); lysis buffer = 0.2 M Tris-HCl pH 7.5, 0.05 M EDTA, 2 M NaCl 2%; extractionbuffer = 0.35 M sorbitol, 0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 5 mM EDTA.]

After incubation for 1.30 hours 800 µl chlorophorm/isoamylalcohol (24:1) was added, tubes were inverted some times before centrifuging for 4 minutes at 15000 rpm. Supernatant was transferred to a new tube and DNA was precipitated by addition of 800 µl isopropanol (-20°C). After incubation of the supernatant at -20°C for 20 minutes it was centrifugated at 13 000 rpm for 1 minute to collect DNA. DNA pellets were washed with 70% cold ethanol, dried at room temperature and resuspended in 100 µl milliQ. DNA concentration was determined by running in a agarose gel 0.8%.

The AFLP method was performed as described by Vos et al. (1995). 300-500 ng DNA was restricted at 37° C for 1.5 hours, with 5 U EcoRI and 5 U MseI in 4 µl of NEB4 buffer in a total volume of 40 µl. Ligation was done at 37° C overnight in the same solution after adding 5 pmol EcoRI adapter and 5pmol MseI adapter together with 0.01mmol ATP, 2 U T4DNA ligase and 1 µl NEB4 buffer in a total reaction volume of 50 µl. Digestion product was diluted 5 times of which 10 µl was used for AFLP. First step in the AFLP protocol was selective pre amplification of adapter ligated DNA in a Polymerase Chain Reaction (PCR). One starting cycle of 30 s 94°C, 30 s 65°C, 60 s 72°C followed by 12 cycles 0.7°C lower annealing temperature each cycle and 24 cycles of 30 s 94°C, 30 s 56°C and 60 s 72°C. Reaction mixture consisted of 30 ng EcoRI00 primer and 30 ng MseI00, 0.004 mmol dNTP, 2.0 µl 10x Promega buffer, 1.2 µl MgCl2, 0.1 µl pTaq polymerase and milliQ in a total volume of 25 µl. For labeling of one primer 0.1 µl T4 kinase, 0.5 µl kinase buffer, 50 ng primer and 1.0 µl [P33] ATP was brought together in a total volume of 5.0 µl.

The amplification product was mixed with one volume loading buffer (98% formamide, 10 mM EDTA pH 8.0, Broomphenol blue en Xylene cyanol) and denatured for 5 minutes at 90°C. To separate fragments reaction products were loaded on a 6% acrylamide gel in 1x TBE electrophoresis buffer and put at 1500 Volts for 2.30 hours.

Tulip is a non-inbred species. Markers obtained from AFLP experiments on a F1 population were analyzed for linkage with JOINMAP 3.0 (Stam and van Ooijen, 1995). 394 of the 595 markers resulting from AFLP analysis with Eco and Mse primers were mapped. To integrate the male and female map co-dominant markers should be integrated. Only markers segregating in both parents can be used to integrate the male and female linkage groups. Because there were only few such markers available, separate male and female linkage groups were constructed. Markers were divided in linkage groups based on the recombination frequencies between markers. Unlinked markers have a recombination frequency of 0.5, if markers are linked the recombination frequency will be smaller. To decide if markers are significantly linked the LOD score was used. The LOD score is the 10log of the ratio of the probability that two markers are linked against the probability they are not linked.(Plant Research International,2006).

The paternal dataset (aaxab) was divided in eleven groups with a threshold significance of LOD 6. The maternal dataset (abxaa) was divided with a lower threshold (LOD 4), here 20 groups were found. For determination of mapping distances, Kosambi's mapping function was used, which assumes one

crossing over prevents a second crossing over in direct surrounding area (Plant Research International, 2006).

With the enzyme primer combination M52G/E33 IRD 800 was identified a marker in linkage to the TBV resistance fragment175 bp, with enzyme primer combination E45M52G fragment 96 bp and with enzyme primer combination E37M52C fragment at 385bp and used for indirect selection (van Heusden, PRI 2005). The result indicated that 4 progenity of the cross Kees Nelis x Cantate -No. 68,69 ,75,77-are resistant at TBV and also we identified the species who are resistant at TBV: T. fosteriana ‘’Princeps’’, T. fosteriana 102 Juan x Cantate, T. fosteriana 112 Juan x Cantate, T. fosteriana 122 Cantate x Juan, T. fosteriana 144 Princeps x ML, T. fosteriana 148 Cantate x Princeps . For species with large genome as tulip ,RAPD analyses could be usefull only for an informative level of polymorphisms. AFLP is usefull for making DNA fingerprints in segregating populations.For many plants it is also usefull for phylogenetic studies, however to make AFLP patterns usefull for phylogenetic studies very clear patterns are essential.

In tulip, a plant with a very big genome it needs a lot of refinement of the non-radioactive procedure to get the required clear pictures. The initial results also show that too many polymorphic fragments are present between species as we expected because are genetically very different. The results indicated that obtain reproductible AFLP patterns, clear and labor saving fingerprints when seven selective nucleotides were used. We used en efficient enzyme primer combination M52G/E45 IRD 700(M+4/E+3), M52G/E33 IRD 800, E37M52C.

AFLP markers can be applied for species with large genome as long as the preamplification step and the final selective nucleotides are well defined by the users. NBS adapter mediated amplification gave promising results with primer combination NsiC/Ploop for pre amplification and NsiCTG/Kinase2 in labeled amplification. More markers can be generated when selective nucleotides are replaced by others (PRI, 2006)

To test if the NBS adapter mediated amplification method is performing; it could be tested with a species from which a resistance gene is already identified. The Ploop and Kinase2 primers can be replaced by primers designed to the sequence of the gene. Markers generated during amplification should be closely linked to the resistance gene (PRI, 2006)

To be able to use molecular marker as a selection marker in the future, the sequence of the amplified fragment should be identified. If the sequence is known a primer can be designed. The primer should be reliable enough to detect resistance by PCR in an early stage of the breeding process (PRI, 2006)