UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINǍ VETERINARǍ
CLUJ-NAPOCA
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII
ŞCOALA DOCTORALĂ
Ing. LAVINIA IOANA BĂRNUŢIU (cǎs. TOMOŞ)
EVALUAREA PROPRIETĂŢILOR BIOLOGICE ALE
MARKERILOR DE CALITATE DIN
LĂPTIŞORUL DE MATCĂ ŞI APILARNIL(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC
Prof. Univ. Dr. Ing. Liviu Alexandru MĂRGHITAŞ
CLUJ-NAPOCA
2013
2
CUPRINS
INTRODUCERE............................................................................................................. 3
OBIECTIVE.................................................................................................................... 5
CAPITOLUL I. LĂPTIŞORUL DE MATCĂ ŞI APILARNILUL – GENERALITĂŢI... 6
1.1. IMPORTANŢA LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ ŞI A APILARNILULUI ......... 6
1.1. COMPOZIŢIA FIZICO-CHIMICĂ A LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ ŞI A
APILARNILULUI ....................................................................................................... 6
CAPITOLUL II. MARKERI DE CALITATE DIN LĂPTIŞORUL DE MATCĂ ŞI
APILARNIL.................................................................................................................... 6
CAPITOLUL III. EFECTELE TERAPEUTICE ALE LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ ŞI
APILARNILULUI .......................................................................................................... 7
CAPITOLUL IV. METODE DE DETERMINARE ALE CAPACITǍŢILOR
ANTIOXIDANTE ŞI ANTIMICROBIENE ALE LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ ŞI
APILARNILULUI .......................................................................................................... 7
CAPITOLUL V. MATERIAL ŞI METODĂ.................................................................. 8
5.1. MATERIALUL BIOLOGIC ................................................................................. 8
5.2. ANALIZE EFECTUATE ...................................................................................... 8
CAPITOLUL VI. REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND ANALIZELE ....................... 8
FIZICO-CHIMICE.......................................................................................................... 8
CAPITOLUL VII. REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND ANALIZELE
SPECTROFOTOMETRICE UV-VIS............................................................................ 11
CAPITOLUL VIII. REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND ANALIZA HPLC............. 14
CAPITOLUL IX. REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND CAPACITATEA
ANTIMICROBIANĂ A LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ ŞI A APILARNILULUI ....... 19
CAPITOLUL X. CONCLUZII GENERALE................................................................. 24
ELEMENTE DE ORIGINALITATE............................................................................. 26
RECOMANDǍRI ŞI PERSPECTIVE........................................................................... 26
BIBLIOGRAFIE ........................................................................................................... 27
REZUMAT
3
INTRODUCERE
Lăptişorul de matcă şi apilarnilul sunt produse apicole biologic active cu
proprietăţi biotrofice, energizante, vitalizante, tonifiante și psihotonice care ajută la
refacerea sistemului imunitar. Deşi nu este un produs tradiţional al stupului, ca şi mierea,
polenul, propolisul şi ceara, apilarnilul se distinge prin proprietăţile lui organoleptice
specifice, prin proprietăţile lui fizico-chimice şi microbiologice care îl recomandă ca un
produs veritabil, de valoare al stupului.
Lăptişorul de matcă a fost acceptat şi adesea folosit ca o substanţă care sprijină
sănătatea. Cercetările arată că proteinele din lăptişorul de matcă ar putea avea funcţii
fiziologice immunostimulative, supresive de reacţii alergice, dar şi antihipertensive,
precum şi de stimulare a proliferării celulelor. Toate aceste constatări au deschis o nouă
eră în ceea ce priveşte utilizările lăptişorului de matcă.
Ţinând seama de caracteristicile organoleptice, fizico-chimice, precum şi de
anumite condiţii de recoltare, apilarnilul se deosebeşte esenţial de lǎptişorul de matcǎ.
Este bine ca apicultorii sǎ ţinǎ seama de aceste deosebiri în procesul şi tehnologia de
recoltare ale acestor produse, respectând întotdeauna principiul rǎspunderii, corectitudinii
profesionale şi al onestitǎţii în activitatea lor de producǎtori.
Lăptişorul de matcă prezintă calităţi biologice şi fiziologice de excepţie, motiv
pentru care este comercializat pe scară largă, fiind utilizat în diferite industrii, precum cea
farmaceutică, alimentară (suplimente nutritive), cosmetică. Datorită diversităţii şi
multitudinii de utilizări pe care le are, în ţările unde producţia este insuficientă în raport
cu cererea, lăptişorul de matcă este importat în cantităţi mari. De aceea, cercetarea în
acest domeniu trebuie extinsă şi dezvoltată pentru a permite o evaluare calitativă şi
cantitativă, corectă, a diferitelor componente. Pe de altă parte, cercetarea permite
implementarea unor teste de evaluare a calităţii produselor disponibile pe piaţă care
includ lăptişorul de matcă fie ca atare, fie ca aditiv. Cercetarea acestui domeniu are un
rol important şi în optimizarea procesului de identificare a lăptişorul de matcă
contrafăcut.
Cunoscând faptul că în ţara noastră, precum şi în majoritatea ţărilor (exceptând
Brazilia), nu există un standard al calităţii lăptişorului de matcă, realizarea unui astfel de
REZUMAT
4
standard sau cel puţin implementarea unor metode sigure pentru stabilirea funcţionalităţii
şi a calităţii acestui produs, prezintă interes pentru cercetare. Cercetările vor contribui la
elaborarea tehnologiei de determinare a acidului 10-hidroxi-2-decanoic în scopul
determinării autenticităţii lăptişorului de matcă, precum şi stabilirea unor markeri de
calitate pentru lăptişorul de matcă şi apilarnil.
Prezenta tezǎ de doctorat doreşte sǎ aducǎ o contribuţie importantǎ în ceea ce
priveşte studiul lăptişorului de matcă şi a apilarnilului prin analize chimice de actualitate
cu scopul de a se investiga calitatea acestora. Calitatea acestor produse este data de
componentele cu valori nutriţionale (glucide, lipide si proteine), de conţinutul în compuşi
biologic activi (10-HDA, compuşi polifenolici şi peptide), precum şi de capacitatea
antioxidantă şi antimicrobiană a acestora.
Lucrarea de faţǎ ”Evaluarea proprietǎţilor biologice ale markerilor de calitate
din lăptişorul de matcă şi apilarnil” este structuratǎ în doua pǎrţi. În prima parte,
intitulatǎ ”Studiu de literaturǎ” (Capitolele I -IV) este prezentat stadiul actual al
cunoaşterii privind obiectivele propuse, şi aspecte legate de compoziţia chimicǎ,
capacitǎţile antioxidantǎ şi antimicrobianǎ, metodele de analizǎ utilizate.
În cea de a doua parte „Cercetǎri proprii” (Capitolele V - X ) sunt prezentate
materialul biologic (14 probe de lăptişor de matcă şi 14 probe de apilarnil), metodele
experimentale aplicate (fizico-chimice, spectrofotometrice, cromatografice şi
microbiologice), rezultatele obţinute şi concluziile studiului efectuat.
REZUMAT
5
OBIECTIVE
Obiectivele urmǎrite în teza de doctorat sunt urmǎtoarele:
Cercetǎri privind compoziţia fizico-chimicǎ a lǎptişorului de matcǎ şi a
apilarnilului, prin determinarea umiditǎtii, a cenuşii, a aciditǎții şi a lipidelor.
Cercetǎri privind optimizarea unei metode de determinare a proteinelor totale din
lǎptişorul de matcǎ şi apilarnil – metoda Lowry.
Cercetǎri privind identificarea şi cuantificarea glucidelor din lǎptişorul de matcǎ şi
din apilarnil prin tehnica de Cromatografie Lichidǎ de Înaltǎ Performanţǎ cu
detecţie în Indice de Refracţie (HPLC-IR).
Cercetǎri privind identificarea şi cuantificarea a acidului 10-hidroxi-2-decenoic
din lǎptişorul de matcǎ prin tehnica de Cromatografie Lichidǎ de Înaltǎ
Performanţǎ cu detecţie cu Şir de Fotodiode (HPLC-PDA).
Cercetǎri privind identificarea polifenolilor din lǎptişorul de matcǎ prin tehnica de
Cromatografie Lichidǎ de Înaltǎ Performanţǎ cu detecţie cu Şir de Fotodiode
(HPLC-PDA).
Cercetǎri privind capacitatea antioxidantǎ a lǎptişorului de matcǎ şi a apilarnilului
(metoda DPPH şi metoda FRAP) evaluatǎ in vitro prin metode spectrofotometrice
clasice.
Cercetǎri privind capacitatea antimicrobianǎ a lǎptişorului de matcǎ şi a
apilarnilului prin testarea acestora pe tulpini bacteriene de referinţǎ internaţionalǎ.
REZUMAT
6
CAPITOLUL I. LĂPTIŞORUL DE MATCĂ ŞI APILARNILUL –
GENERALITĂŢI
1.1. IMPORTANŢA LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ ŞI A APILARNILULUI
Cunoaşterea markerilor biologici ai lăptişorului de matcă proaspăt şi ai
apilarnilului responsabili de proprietăţile lor, este esenţială pentru a putea caracteriza
compoziţia şi calitatea produselor care se obţin ca urmare a înglobării în structura lor a
acestor produse valoroase ale stupului.
1.1. COMPOZIŢIA FIZICO-CHIMICĂ A LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ ŞI A
APILARNILULUI
Lăptişorul de matcă este singura sursă cunoscută de acid 10-hidroxi-2-decenoic
(10-HDA), un compus cu potenţial anticancerigen şi antibacterien. În componenţa
lăptişorului intră un număr însemnat de vitamine şi aminoacizi precum şi compuşi încă
neidentificaţi (în proporţie de 2,8%) (Boselli şi colab., 2003). În literatura de specialitate
se aminteşte despre importantele componente ale lăptişorului de matcă precum sunt:
proteinele, glucidele, lipidele (Takenaka, 1984; Portallier şi colab., 1990, Lerker şi
colab., 2003).
La examenul microscopic al produsului triturat şi centifugat s-au observant detritusuri
celulare şi celule de polen. Pentru obţinerea substanţei active standardizate, apilarnilul
triturat şi filtrat se liofilizează, utilizându-se apoi ca pulbere (Ilieşiu, 1991). O primă
descriere a compoziţiei chimice a apilarnilului a fost prezentată de către Stângaciu
(1999) astfel: apǎ 65-75%, lipide 5-8%, proteine totale 9-12%, glucide totale 6-10%,
conţinut de substanţe uscate 25-35%, substanţe nedeterminate 3%, cenuşǎ 2%.
CAPITOLUL II. MARKERI DE CALITATE DIN LĂPTIŞORUL DE MATCĂ ŞI
APILARNIL
Literatura de specialitate prezintă ca fiind markeri de calitate ai lăptişorului de
matcă şi ai apilarnilului următoarele clase de substanţe: proteine, glucide, lipide,
polifenoli, aminoacizi, vitamine, substanţe minerale. De asemenea un interes deosebit îl
REZUMAT
7
prezintă acidul 10-HDA găsit în compoziţia lăptişorului de matcă, având proprietăţi
anticancerigene şi antimicrobiene.
CAPITOLUL III. EFECTELE TERAPEUTICE ALE LĂPTIŞORULUI DE
MATCĂ ŞI APILARNILULUI
Datoritǎ compoziţiei chimice bogate precum şi a proprietǎţilor lor, lǎptişorul de
matcǎ şi apilarnilul, sunt folosite în medicină, în stare purǎ sau liofilizatǎ, precum şi în
cosmeticǎ, în compoziţia unor creme de faţă şi unguente . Tratamentele cosmetice cu
creme pe bazǎ de lǎptişor de matcǎ oferǎ pielii elasticitate, flexibilitate, în timp ce
produsele pentru îngrijirea pǎrului oferǎ acestuia un aspect şi o strǎlucire naturalǎ.
CAPITOLUL IV. METODE DE DETERMINARE ALE CAPACITǍŢILOR
ANTIOXIDANTE ŞI ANTIMICROBIENE ALE LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ ŞI
APILARNILULUI
Activitatea antioxidantǎ se datoreazǎ în mare parte polifenolilor, aceştia fiind
compuşi chimici din compoziţia lǎptişorului de matcă şi a apilarnilului. Literatura de
specialitate face puţine referiri în ceea ce priveşte capacitatea antioxidantă şi compoziţia
chimicǎ a lǎptişorului de matcǎ (Nagai şi colab., 2001).
Metodele care stau la baza determinǎrii capacitǎţii antioxidante a lǎptişorului de
matcǎ şi a apilarnilului sunt: metoda de captare a radicalilor liberi (DPPH) (Liu şi colab.,
2008), potenţialul antioxidant total (FRAP) (Gao şi colab.,2011).
Capacitatea antimicrobianǎ a lăptişorului de matcǎ şi a apilarnilului este
determinatǎ prin metode difuzimetrice şi metode bazate pe diluţii successive. Existǎ
numeroase studii care demonstreazǎ capacitatea antimicrobianǎ a lǎptişorului de matcǎ pe
diferite culturi bacteriene (Eshraghi şi Seifollahi, 2003).
REZUMAT
8
CAPITOLUL V. MATERIAL ŞI METODĂ
5.1. MATERIALUL BIOLOGIC
Materialul biologic supus studiului de faţǎ a fost constituit din 14 probe de lǎptişor
de matcǎ şi 14 probe de apilarnil. Probele au fost obţinute direct de la apicultori în
perioada mai 2011 – august 2012, fiind pǎstrate în congelator la temperatura de -20°C
pânǎ în momentul începerii analizelor.
5.2. ANALIZE EFECTUATE
Partea experimentalǎ a constat în urmatoareale analize: analize fizico-chimice,
analize spectrofotometrice, analize cromatografice şi analize microbiologice.
CAPITOLUL VI. REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND ANALIZELE
FIZICO-CHIMICE
Cu ajutorul analizelor fizico-chimice efectuate pe probele de lǎptişor de matcǎ şi
apilarnil s-a realizat o caracterizare primarǎ a acestora din punct de vedere al umiditǎţii,
aciditǎţii, conţinutului de cenuşǎ şi conţinutului de lipide totale.
Pentru interpretarea primară a datelor obţinute şi pentru a avea o imagine clară a
conţinutului de apǎ al lăptişorului de matcǎ şi apilarnilului, s-a realizat graficul boxplot a
valorilor obţinute pentru fiecare matrice. Diagrama boxplot (figura 1) rezumă grafic cele
cinci valori specifice distibuţiei valorilor din fiecare zonă (minimul, prima quartilă,
mediana, a treia quartilă şi maximul) şi valorile extreme. Din acest grafic se poate
observa pentru fiecare boxplot o linie centrală care reprezintă mediana valorilor măsurate
pentru fiecare zonă. În cazul în care mediana este mai apropiată de marginea de jos,
distribuţia valorilor este înclinată spre stânga, iar dacă e mai apropiată de marginea
superioară distribuţia este înclinată spre dreapta. Valoarea maximă a medianei în cazul
lǎptişorului de matcǎ a fost găsită 63.59, în cazul apilarnilului de 71.08. Boxplot-ul
reprezintă distribuţia a 50% dintre valori şi mărimea acestuia reprezintă variabilitatea
rezultatelor.Valorile extreme sunt situate în exteriorul boxplotului şi sunt marcate prin
REZUMAT
9
mici *-uri. În cazul determinării conţinutului de apă, la cele douǎ matrici luate în studiu s-
a identificat o singurǎ valoare extremǎ, proba de apilarnil A9.
Figura 1. Graficul boxplot privind conţinutul de apă al probelor
de lǎptişor de matcǎ şi apilarnil
Valoarea maximă a medianei în cazul lǎptişorului de matcǎ a fost găsită 1.11, în
timp ce în cazul apilarnilului a fost de 0.90. În cazul determinării conţinutului de cenuşă,
la cele douǎ matrici luate în studiu s-a identificat o singurǎ valoare extremǎ, înregistrată
pentru matricea lăptişor de matcă la proba L5 (figura 2).
Figura 2. Graficul boxplot privind conţinutul de cenuşă al probelor
de lǎptişor de matcǎ şi apilarnil
Apilarnil/ApilarnilLaptisor de matca/Royal jelly
75
70
65
60
55
Cont
inut
ulde
apa
(%)/
Wat
erco
nten
t(%
)
Apilarnil/ApilarnilLaptisor de matca/Royal Jelly
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
Cenu
sa(%
)/A
sh(%
)
REZUMAT
10
Valoarea maximă a medianei în cazul lǎptişorului de matcǎ a fost găsită 3.76, în
cazul apilarnilului de 3.18. În cazul determinării acidităţii, la cele douǎ matrici luate în
studiu nu s-au identificat valori extreme.
Figura 3. Graficul boxplot privind aciditatea probelor
de lǎptişor de matcǎ şi apilarnil
Valoarea maximă a medianei privind conţinutul de lipide în cazul lǎptişorului de
matcǎ a fost găsită 4.62, în cazul apilarnilului de 3.44. În cazul determinării conţinutului
de lipide totale, la cele douǎ matrici luate în studiu nu s-au identificat valori extreme.
Figura 4. Graficul boxplot privind conţinutul de lipide al probelor
de lǎptişor de matcǎ şi apilarnil
Apilarnil/ApilarnilLaptisor de matca / Royal Jelly
6
5
4
3
2
1
Aci
dita
tea
(mlN
aOH
0.1N
)/A
cidi
ty(m
lNaO
H0.
1N)
Apilarnil/ApilarnilLaptisor de matca/Royal Jelly
8
7
6
5
4
3
2
1
Cont
inut
delip
ide
(%)/
Lipi
dsco
nten
t(%)
REZUMAT
11
CAPITOLUL VII. REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND ANALIZELE
SPECTROFOTOMETRICE UV-VIS
Conţinutul de proteine totale al probelor de lǎptişor de matcǎ luate în acest studiu
înregistreazǎ o medie de 12.70±0.53 %. Sabatini şi colab. (2009) stabileşte pentru acest
parametru valori cuprinse între 9-18%, astfel cǎ în cazul de faţǎ toate probele se situează
între valorile propuse pentru un standard internaţional.
Valoarea maximă a medianei în cazul lǎptişorului de matcǎ a fost găsită 12.79, în cazul
apilarnilului de 6.61. În cazul determinării conţinutului de proteine totale, la cele douǎ
matrici luate în studiu s-a identificat o singurǎ valoare extremǎ, proba de lăptişor de
matcă L2.
Figura 5. Graficul boxplot privind conţinutul de proteine al probelor
de lǎptişor de matcǎ şi apilarnil
Domeniul valorilor obţinute pentru conţinutul de polifenoli totali variazǎ în limite
foarte largi, mai ales în ceea ce priveşte apilarnilul acesta prezentând valori cuprinse între
25.05±0.68 mg GAE/g (A9) şi 65.72±0.93 mg GAE/g (A11).
Pentru lǎptişorul de matcǎ conţinutul de polifenoli nu variazǎ la fel de mult ca şi în
cazul apilarnilului, valorile fiind între 20.78±0.33 (LM 13) mg GAE/g şi 30.76±0.98 mg
GAE/g (LM 1).
Apilarnil/ApilarnilLaptisor de matca/Royal Jelly
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
Proi
tene
tota
le(%
)/To
talp
rote
in(%
)
REZUMAT
12
Figura 6. Graficul boxplot privind conţinutul de polifenoli totali
al probelor de lǎptişor de matcǎ şi apilarnil
Valoarea maximă a medianei în cazul lǎptişorului de matcǎ a fost găsită de 23.35,
în timp ce în cazul apilarnilului a fost de 42.05. În cazul determinării conţinutului de
polifenoli totali, la cele douǎ matrici luate în studiu nu s-au identificat valori extreme.
(figura 6).
Literatura de specialitate raportează o medie a potenţialului antioxidant total
(FRAP) de 8 μmoli Fe / g în lǎptişorul de matcǎ liofilizat (Ross, 2009). Prin convertirea
lǎptişorului de matcǎ crud în liofilizat, rezultă că valorile obţinute de noi prin aplicarea
prezentei metode sunt similare cu acestea.
În ceea ce priveşte activitatea antioxidantă a apilarnilului evaluată prin metoda
FRAP putem afirma faptul că acesta prezintă o puternica activitate, valorile fiind
superioare lăptişorului de matcă.
Valoarea maximă a medianei în cazul lǎptişorului de matcǎ a fost găsită 3.56, în
cazul apilarnilului de 15.74. Boxplot-ul reprezintă distribuţia a 50% dintre valori şi
mărimea acestuia reprezintă variabilitatea rezultatelor.Valorile extreme sunt situate în
exteriorul boxplotului şi sunt marcate prin mici *-uri. În cazul determinării potenţialului
antioxidant total, la cele douǎ matrici luate în studiu s-a identificat o singurǎ valoare
extremǎ, proba de apilarnil A12 (figura 7).
Apilarnil/ApilarnilLaptisor de matca/Royal Jelly
70
60
50
40
30
20
Polif
enol
itot
ali(
%)/
Tota
lpol
yphe
nols
(%)
REZUMAT
13
Figura 7. Graficul boxplot privind potenţialul antioxidant total al probelor
de lǎptişor de matcǎ şi apilarnil
Capacitatea antioxidantǎ cea mai micǎ s-a înregistrat pentru probele L1 şi L3 (0.11
mmoli Trolox/g lǎptişor de matcǎ), în timp ce valoarea cea mai mare a fost atinsǎ la
proba L6 (0.30 mmoli Trolox/g lǎptişor de matcǎ).
În cazul apilarnilului au fost înregistrate valori mai mari, astfel cǎ valoarea cea mai
micǎ a fost înregistratǎ la proba A4 (0.12±0.01 mmoli Trolox/g apilarnil), iar valoarea
cea mai mare la proba A7 (0.78±0.06 mmoli Trolox/g apilarnil).
Diagrama boxplot (figura 8) rezumă grafic cele cinci valori specifice distibuţiei
valorilor din fiecare zonă (minimul, prima quartilă, mediana, a treia quartilă şi maximul)
şi valorile extreme. Valoarea maximă a medianei în cazul lǎptişorului de matcǎ a fost
găsită 0.19, în cazul apilarnilului de 0.22. În cazul determinǎrii capacitǎţii antioxidante
(metoda DPPH), la cele douǎ matrici luate în studiu s-au identificat douǎ valoari extreme,
probele de apilarnil A7 şi A8.
Apilarnil/ApilarnilLaptisor de matca/Royal Jelly
40
30
20
10
0
Pote
ntia
lula
ntio
xida
nt(µ
mol
iFeI
I/g)/A
ntio
xida
ntpo
tent
ial(
µmol
iFeI
I/g)
REZUMAT
14
Figura 8. Graficul boxplot privind capacitatea antioxidantă a probelor
de lǎptişor de matcǎ şi apilarnil
CAPITOLUL VIII. REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND ANALIZA HPLC
Identificarea şi cuantificarea zaharurilor reprezintǎ un pas important în vederea
determinǎrii autenticitǎţii probelor atât din punct de vedere cantitativ cât şi calitativ. În
multe cazuri cele douǎ monozaharide glucoza şi fructoza reprezintǎ împreunǎ pânǎ la
80% din zaharurile existente în lǎptişorul de matcǎ, celelalte glucide fiind prezente dar în
cantitǎţi mult mai mici.
Rezultatele obţinute sunt comparabile cu cele ale lui Sesta (2006) care a
determinat conţinutul zaharurilor majoritare în probele de lǎptişor matcǎ, şi anume
glucoza, fructoza şi zaharoza.
Apilarnil/ApilarnilLaptisor de matca/Royal Jelly
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
Cap
acita
tea
antio
xida
nta
(mm
oliT
rolo
x/g)
/Ant
ioxi
dant
capa
city
(mm
oliT
rolo
x/g)
REZUMAT
15
5 10 15 20 25 30 35
0
10000
20000
30000
40000
zaharo
za / su
crose
Abso
rban
ta (m
AU)
Abso
rban
ce (m
AU)
Timp de retentie (min)Retention time (min)
Proba L1 / Sample L1
fructo
za / fr
uctose
glucoz
a /glu
cose
turano
za / tu
ranose
erloza
/ erlo
se
maltoza
/ malt
ose
trehal
oza / t
rehalo
se
Figura 9. Cromatograma HPLC – IR a probei de lăptișor de matcă (L1)
Profilul glucidic al probei de lǎptişor de matcǎ L1 provenind din judeţul Cluj este
prezentat în figura 9, unde se poate observa şi timpul de retenţie pentru fiecare glucid
identificat. Cromatogramele înregistrate pentru toate celelalte probe de lǎptişor de matcǎ
şi apilarnil luate în studiu sunt prezentate în anexele 4 şi 5.
Complexul de zaharuri este unul foarte important pentru lǎptişorul de matcǎ, iar
cuantificarea lor este de un mare interes pentru detectarea unei posibile falsificǎri cu
miere sau zahǎr.
Literatura de specialitate este destul de sǎracǎ în ceea ce priveşte conţinutul de
glucide din apilarnil pânǎ la ora actualǎ neexistând studii care sǎ identifice şi sǎ
cuantifice individual fiecare glucid, o comparaţie fiind posibilǎ doar cu valorile obţinute
la lǎptişorul de matcǎ, astfel că zaharoza este prezentă doar într-o singură probă şi cu un
conţinut mai mic decât la lăptişorul de matcă A1- 0.14%.
Dacă în cazul lăptişorului de matcă, fructoza a fost în toate probele cuantificată în
cantitate mai mare decât glucoza, în cazul probelor de apilarnil nu s-a mai înregistrat
aceeaşi uniformitate. Astfel din cele 14 probe analizate, majoritatea au prezentat cantităţi
mai mari de glucoză în detrimentul fructozei: 10 probe au prezentat cantităţi sub 1% de
REZUMAT
16
fructoză în timp ce glucoza era peste 2%, o probă a prezentat conţinut de glucoză peste
1%, 2 probe au avut cantităţi apropiate de fructoză şi glucoză, iar o singură probă a
prezentat o concentraţie mai mare de fructoză faţă de conţinutul de glucoză.
În ceea ce priveşte valoarea maximă a medianei în cazul apilarnilului pentru
glucidele majoritare, s-au înregistrat: pentru fructoză 0.56, iar pentru glucoză 3.40
(figura 58). Faptul că mediana este situată în grafic foarte aproape de una dintre
extremităţi indică deasemenea faptul că probele de apilarnil analizate nu sunt omogene ca
şi compoziţie. Pentru glucidul zaharoză nu avem o imagine foarte clară deoarece aceasta
a fost identificată doar într-o singură probă de apilarnil, iar comparativ cu lăptişorul de
matcă prezintă valori mai mici.
Figura 10 reprezintǎ profilul glucidic şi timpul de retenţie pentru fiecare glucid
identificat al probei de apilarnil A1 provenind din judeţul Cluj.
5 10 15 20 25
0
5000
10000
15000
20000
Abso
rban
ta (m
AU)
Abso
rban
ce (m
AU)
Timp de retentie (min)Retention time (min)
Proba A1 / Sample A1
glucoz
a /glu
cose
zaharo
za / su
crose
turano
za / tu
ranose
maltoza
/ malto
se
izomalto
za / is
omalto
sefru
ctoza
/ fruct
ose
Figura 10. Cromatograma HPLC – IR a probei de apilarnil (A1)
Rezultatele obţinute în urma identificării şi cuantificării acidului 10-hydroxy -2-
decenoic acid sunt prezentate în figura 11. Aceste rezultate au fost înregistrate cu ajutorul
softului LC-solution, pe baza similitudinii spectrului UV-VIS şi a timpului de retenţie.
REZUMAT
17
Figura 11. Conţinutul de acid 10-hydroxy-2-decenoic în probele de
lăptişor de matcă
Referitor la conţinutul de 10-HDA din probele de lǎptişor de matcǎ acesta prezintă
valori cuprinse între 0.75 – 3.80%. Literatura de specialitate face câteva referiri la
identificarea şi cuantificarea acestui compus astfel că Garcia Amoedo şi Almeida
Muradian, (2007) au obţinut pentru lǎptişorul de matcǎ din Brazilia valori cuprinse între
1.58-3.39%. Kim şi Lee 2010, au obţinut pentru lăptişorul de matcă din SUA o medie de
2.02%, ceea ce se situează puţin peste media obţinută în lucrarea de faţă 1.88%.
Cromatograma comparativǎ a unui standard de 10 – HDA şi a probei de lǎptisor
de matcǎ L1 este prezentatǎ în figura 12 unde putem observa şi timpul de retenţie la
minutul 5.28.
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L14
Con
tinut
ul d
e 10
-HD
A (%
)10
-HD
A co
nten
t (%
)
Probe laptisor de matcaRoyal Jelly samples
REZUMAT
18
2 4 6 8 10 12
0
100000
200000
300000
400000
Abs
orba
nta (
mA
U)
Abso
rban
ce (m
AU)
Timp de retentie (min)Retention time (min)
10-HDA - s
tandar
d10-HDA - p
roba L
1
Figura 12. Cromatograma comparativă a unui standard 10 - HDA
și a unei probe de lăptișor de matcă (L1)
Din datele de literatură şi experienţa proprie se ştie că lăptişorul de matcă este un
agent antibacterian destul de putenic. Celelalte produse apicole pun pe seama compuşilor
polifenolici activitatea antibacteriană proprie. Pentru a vedea dacă şi în acest produs
apicol există aceste clase de compuşi, care pe lângă peptide ar putea fi “incriminaţi”
pentru activitatea antimicrobiană, am încercat să separăm prin analiza de cromatografie
lichidă de înaltă performanţă (HPLC) cuplată cu şir de fotodiode (PDA), posibilii
compuşi polifenolici. Aceasta a presupus extracţia compuşilor polifenolici de interes prin
metoda de extracţie şi analizǎ descrisă în capitolul “Material şi metodǎ”. Acestea au fost
înregistrate cu ajutorului soft-ului LC Solution pe baza similitudinii spectrului UV-VIS.
Fiecare compus polifenolic are un spectru de absorbţie UV-Vis caracteristic, ca
formă generală, ca diametru spectral, ca număr de maxime (denumite picuri sau
semnale), şi ca raport între intensităţile diferitelor semnale. Maximul de absorbţie se
caracterizează prin lungimea de undă care îi corespunde.
REZUMAT
19
Fiecare probă de lăptişor de matcă a fost supusă analizei HPLC – PDA,
cromatogramele fiind înregistrate la 280 nm şi 340 nm, lungimi de undă specifice acizilor
fenolici. Spectrele UV – Vis corespunzătoare fiecărui semnal au fost înregistrate în
domeniul 190-650 nm.
Figura 13 reprezintǎ spectrul caracteristic compuşilor polifenolici din proba L2 de
lăptişor de matcă. Pentru atribuirea corectă a acestor semnale este nevoie de o analiză
structurală mai în detaliu, sau aplicarea metodei LC-MS. Pe baza acestor spectre şi a
similitudinii lor cu standardele utilizate s-a apreciat tipul de compus care există în probele
de lăptişor de matcă analizate.
0 10 20 30 40 50
0
2000
4000
6000
8000
10000
Abso
rban
ta (m
AU)
Abso
rban
ce (m
AU)
Timp de retentie (min)Retention tine (min)
Figura 13. Cromatograma HPLC – PDA a probei de lăptişor de matcă L2
CAPITOLUL IX. REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND CAPACITATEA
ANTIMICROBIANĂ A LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ ŞI A APILARNILULUI
Activitatea antimicrobiană a celor două matrici de interes a fost apreciată pe baza
diametrului zonei de inhibiţie asupra a 6 tulpini de referinţă internaţională, dintre care 2
tulpini bacterii Gram pozitive: Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Bacillus cereus
ATCC 14579; 3 tulpini Gram negative: Escherichia coli ATCC 10536, Salmonella thyphi
REZUMAT
20
ATCC 14028, Pseudomonas aeruginoasa ATCC 27853 şi o tulpinǎ de levurǎ Candida
albicans ATCC 90028.
Referitor la activitatea antimicrobianǎ a extractelor de lǎptişor de matcǎ asupra
bacteriei Gram pozitive Staphylococcus aureus ATCC 6538P putem observa valori
cuprinse între 6.00 – 16.67 mm, în timp ce doar o singurǎ proba de apilarnil a prezentat
activitate antimicrobianǎ asupra acestei bacterii, proba A4 aceasta având cel mai mare
conţinut de glucozǎ 7.27%.
În ceea ce priveşte histograma distribuţiei probelor de lăptişor de matcă în funcţie
de diametrul zonei de inhibiţie asupra bacteriei Gram pozitive Staphylococcus aureus
ATCC 6538P aceasta este una normalǎ şi este prezentatǎ în figura 14.
Figura 14. Histograma distibuţiei probelor de lăptişor de matcă în funcţie de
activitatea antimicrobiană asupra bacteriei Stafilococcus aureus
Bacteria Gram-pozitivǎ Bacillus cereus ATCC 14579 a fost sensibilǎ la apilarnil,
asupra acestuia prezentând activitate doar opt probe, dintre care la unele probe s-au
înregistrat chiar şi diametre mai mari comparativ cu lǎptişorul de matcǎ.
161284
5
4
3
2
1
0
Diemetrul zonei de inhibitie (mm) / Inhibition zone diameter (mm)
Num
arde
prob
e/N
umbe
rofs
ampl
es
REZUMAT
21
Histograma distribuţiei probelor de lăptişor de matcă în funcţie de diametrul zonei
de inhibiţie asupra bacteriei Gram pozitive Bacillus cereus ATCC 14579 este una
normalǎ (figura 15), excepţie facând proba de lǎptişor de matcǎ L14 pentru care s-a
înregistrat un diametru de 11.67 mm.
Figura 15. Histograma distibuţiei probelor de lăptişor de matcă în funcţie de
activitatea antimicrobiană asupra bacteriei Bacillus cereus
În ceea ce priveşte bacteria Gram-negativǎ Escherichia coli ATCC 10536, aceasta
este mai rezistentǎ la acţiunea produselor apicole deoarece prezintǎ diametre de inhibiţie
mai mici la toate probele de lǎptişor de matcǎ, în timp ce pentru apilarnil nu prezintǎ
activitate antimicrobianǎ.
Diametrul mediu obţinut asupra bacteriei Gram -negative Escherichia coli este de
9.02 mm, în timp ce literatura de specialitate pentru un extract apos de 80%, prezintǎ un
diametru mediu de 7.7 mm (Garcia şi colab., 2010), ceea ce se situeazǎ puţin sub
valorile obţinute în prezenta tezǎ de doctorat.
1110987
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Diametrul zonei de inhibitie (mm) / Inhibition zone diameter (mm)
Num
arde
prob
e/N
umbe
rofs
ampl
es
REZUMAT
22
Figura 16. Histograma distibuţiei probelor de lăptişor de matcă în funcţie de
activitatea antimicrobiană asupra bacteriei Escherichia coli
Histograma distribuţiei probelor de lăptişor de matcă în funcţie de diametrul zonei
de inhibiţie asupra bacteriei Gram negative Escherichia coli ATCC 10536 este una
normalǎ şi este prezentatǎ în figura 16, excepţie facând douǎ probe de lǎptişor de matcǎ
pentru care s-au înregistrat valorile minime de 7.00 mm (L9) şi maxime de 11.00 mm
(L14).
În ceea ce priveşte bacteria Gram negativǎ Pseudomonas aeruginoasa, aceasta a
prezentat valori cuprinse între 8.33 mm şi 10.33 mm la probele de lǎptişor de matcǎ, în
timp ce la probele de apilarnil valorile se situeazǎ între 6.33 mm şi 7.33 mm (figura 17).
1110987
6
5
4
3
2
1
0
D iamet rul z onei de inhibit ie (mm) / Inhibit ion z one diameter (mm)
Num
arde
prob
e/N
umbe
rofs
ampl
es
REZUMAT
23
Figura 17. Histograma distibuţiei probelor de lăptişor de matcă în funcţie de
activitatea antimicrobiană asupra bacteriei Pseudomonas aeruginoasa
În ceea ce priveşte activitatea antimicrobianǎ asupra levurii Candida albicans,
doar 5 probe de lǎptişor de matcǎ au prezentat activitate antimicrobianǎ (figura18)
Probele de apilarnil nu au prezentat activitate antimicrobianǎ împotriva acestei levuri.
Figura 18. Histograma distibuţiei probelor de lăptişor de matcă în funcţie de
activitatea antimicrobiană asupra levurii Candida albicans
10,09,59,08,58,0
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Diametrul zonei de inhibitie (mm) / Inhibition zone diameter (mm)
Num
arde
prob
e/N
umbe
rofs
ampl
es
1211109876
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Diametrul zonei de inhibitie (mm) / Inhibition zone diameter (mm)
Num
arde
prob
e/N
umbe
rofs
ampl
es
REZUMAT
24
CAPITOLUL X. CONCLUZII GENERALE
În raport cu obiectivele generale ale tezei de doctorat intitulată “Evaluarea
proprietăţilor biologice ale markerilor de calitate din lăptişorul de matcă şi
apilarnil” se desprind următoarele concluzii:
1. Alegerea probelor în orb a prezentat o distribuţie normalǎ permiţând totodatǎ o
caracterizare generalǎ a lǎptişorului de matcǎ şi a apilarnilului.
2. S-a determinat compoziţia fizico - chimică a lăptişorului de matcă şi a
apilarnilului, prin evaluarea conţinutului de apă, cenuşă, aciditate şi lipide.
3. S-au determinat markerii de calitate ai lăptişorului de matcă şi ai apilarnilului,
prin evaluarea conţinutului de proteine totale, polifenoli, glucide.
4. Umiditatea este un prim indice al calitǎţii lǎptişorului de matcǎ şi a
apilarnilului, acestea fiind produse ale stupului cu cel mai mare conţinut de
apǎ.
5. Profilul proteic al fiecǎrei probe reprezintǎ amprenta caracteristicǎ a polenului
consumat de cǎtre albine şi indirect a speciei florale atât în cazul lǎptişorului de
matcǎ cât şi pentru apilarnil.
6. Tehnica HPLC-IR utilizatǎ la identificarea şi cuantificarea compuşilor
glucidici permite o caracterizare generalǎ a profilului glucidic al lǎptişorului de
matcǎ şi al apilarnilului.
7. Analizarea compuşilor glucidici a permis identificarea a şapte compuşi, dintre
care au predominat glucoza, fructoza şi zaharoza, aceasta din urmǎ fiind
prezentǎ doar într-o singurǎ probǎ de apilarnil.
8. Markerul cel mai important al calitǎţii lǎptişorului de matcǎ este acidul 10-
HDA, responsabil în cea mai mare măsurǎ de efectele terapeutice ale acestuia,
identificarea lui nefiind posibilǎ în apilarnil.
9. Toate probele de lǎptişor de matcǎ şi apilarnil luate în studiu în prezenta tezǎ
de doctorat au prezentat activitate antioxidantǎ evaluatǎ prin metoda captǎrii
radicalilor liberi din soluţie (DPPH), cât şi prin metoda potenţialului
antioxidant total (metoda FRAP).
REZUMAT
25
10. Variabilitatea conţinutului de polifenoli totali a celor două matrici luate în
studiu, precum şi a capacităţii antioxidante evaluată prin cele două metode
rezidă din specificitatea fiecărei probe.
11. Conţinutul de polifenoli totali nu poate fi considerat un criteriu în estimarea
primară a capacităţii antioxidante a probelor de lăptişor de matcă şi apilarnil.
Capacitatea antioxidantă a acestora nu se limitează doar la compuşii
polifenolici conţinuţi, la acesta putând să aducă o contribuţie suplimentară şi
alţi compuşi precum vitamine, compuşi volatili.
12. Studiul profilului polifenolic prin tehnici de cromatografie lichidă de înaltă
performanţă a permis identificarea a 11 compuşi polifenolici dintre care
predominaţi acidul p-cumaric şi acidul t-cinamic.
13. Toate probele de lǎptişor de matcǎ au prezentat activitate antimicrobianǎ in
vitro asupra bacteriilor Gram-pozitive analizate şi activitate selectivǎ asupra
tulpinilor Gram-negative.
14. Doar o parte din probele de lǎptişor de matcǎ (5 probe) au prezentat activitate
asupra levurii Candida albicans, în timp ce la apilarnil nici o probǎ nu a
prezentat activitate asupra acestei levuri.
15. Acidul 10-HDA este responsabil în cea mai mare mǎsurǎ de capacitatea
antimicrobianǎ a lǎptişorului de matcǎ evaluatǎ in vitro.
16. Probele de apilarnil au prezentat o activitate antimicrobianǎ selectivǎ asupra
bacteriilor Gram-pozitive şi aproape deloc faţǎ de bacteriile Gram-negative.
17. Metodele prezentate în lucrarea de faţǎ, sunt metode simple, nu foarte
costisitoare şi care oferǎ rezultate foarte exacte.
18. Caracterizarea fizico-chimicǎ a lǎptişorului de matcǎ şi a apilarnilului face
posibilǎ valorificarea ulterioarǎ a rezultatelor prin stabilirea unor criterii de
calitate din punct nutritiv şi terapeutic.
REZUMAT
26
ELEMENTE DE ORIGINALITATE
1. Caracterizarea profilului polifenolic al lǎptişorului de matcǎ şi al apilarnilului prin
utilizarea metodelor spectrofotometrice şi cromatograficede analizǎ HPLC - PDA.
2. Identificarea şi cuantificarea acidului 10-HDA în compoziţia lǎptişorului de matcǎ
prin utilizarea tehnicii cromatografice de analizǎ HPLC - PDA.
3. Evaluarea activitǎţii antioxidante la cele douǎ matrici determinatǎ prin metoda
captǎrii radicalilor liberi din soluţie (DPPH), şi prin potenţialul antioxidant total
(metoda FRAP).
4. Evaluare capacitǎţii antimicrobiene a lǎptişorului de matcǎ şi a apilarnilului
utilizând 6 tulpini de referinţǎ internaţionalǎ.
5. Indicarea markerilor de calitate (conţinutul de apǎ, cenuşǎ, lipide, glucide,
proteine, polifenoli, activitatea antioxidantǎ şi activitatea antimicrobianǎ) pentru
lǎptişorul de matcǎ şi apilarnil.
RECOMANDǍRI ŞI PERSPECTIVE
1. Extinderea studiului la nivelul întregii ţǎrii şi propunerea unor markeri de calitate
care sǎ fie analizaţi înaintea utilizǎrii acestor produse în industria cosmeticǎ şi
farmaceuticǎ.
2. Identificarea acidului 10-HDA în lǎptişorul de matcǎ este un marker de calitate
care trebuie neapǎrat analizat, fiind direct sau indirect responsabil de efectele
acestuia.
3. Utilizarea lǎptişorului de matcǎ şi a apilarnilului în scop terapeutic doar dupǎ ce
calitatea acestora a fost verificatǎ.
REZUMAT
27
BIBLIOGRAFIE
1. Boselli E. , Maria Fiorenza Caboni, Anna Gloria Sabatini, G. L. Marcazzan,
G. Lercker, 2003, Determination and changes of free amino acids in royal jelly
during storage, Apidologie 34, 129 – 137.
2. Eshraghi S., F. Seifollahi, 2003, Antibacterial Effects of Royal Jelly on Different
Strains of Bacteria Iranian J Publ Health, 32, (1) 25-30.
3. Gao H., N. Cheng, Q. Jia, B.N. Wang, J.J. Deng, W. Cao, (2011). In vitro
antioxidant activity of lyophilized rape royal Jelly. Food Science, 32(21), 52-55.
4. García Mariana Celeste, Mónica Silvia Finola, and J. M. Marioli, 2010,
Antibacterial activity of Royal Jelly against bacteria capable of infecting cutaneous
wounds Journal of ApiProduct and ApiMedical Science 2 (3): 93 – 99.
5. Garcia-Amoedo Luis Henrique and Ligia Bicudo de Almeida-Muradian, 2007,
Physicochemical composition of pure and adulterated royal jelly, Quim. Nova,
30:2, 257-259.
6. Ilieşiu N. V., 1991, Apilarnil, Editura Apimondia, Bucureşti.
7. Kim Joonyeong and Jongseok Lee, 2010, Quantitative analysis of trans–10-
hidroxy-2-decenoic acid in Royal Jelly products in USA by high performance
liquid cromatography, Jornal of Apicultural Science 54:1, 77-85.
8. Lercker G., E. Boselli, M. F. Caboni, Anna Gloria Sabatini, G. L. Marcazzan,
2003, Determination and changes of free amino acids in royal jelly during storage,
Apidologie, 34, 129-137.
9. Liu J-R, Y. C. Yang, L. S. Shi, C. C. Peng, 2008, Antioxidant Properties of
Royal Jelly Associated with Larval Age and Time of Harvest. J Agric Food Chem,
56: 11447–52.
10.Nagai T., M. Sakai, R. Inoue, H. Inoue, N. Suzuki, 2001, Antioxidative
activities of some commercially honeys, royal jelly, and propolis Food Chemistry,
75, 2, 237-240(4).
11.Pourtallier J., R. Davico, M. C. Rognone, 1990, Les analyses and le controle de
pureté de la geleé royale, L’Abeille de France, 753, 405-407.
REZUMAT
28
12.Ross L., 2009, An Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial Properties of
Bee Products Commercially Available in the UK. Masters
Dissertasion,http://chesterrep.openrepository.com/cdr/bitstream/10034/94567/4/cha
pter%203.pdf.
13.Sabatini Anna Gloria, L. G. Marcazzan, M. F. Caboni, S. Bogdanov and Ligia
Bicudo de Almeida-Muradian, 2009, Quality and Standardisation of Royal Jelly.
Journal of ApiProduct and ApiMedical Science 1(1):1-6.
14.Sesta, G., 2006, Determination of sugars in royal jelly by HPLC. Apidologie 37:
84-90.
15.Stângaciu S, 1999, Apiterapy course notes. Constanţa Apiterapy Research
Hospital, Bucuresti.
16.Takenaka, T., 1984, Studies on proteins and carboxilic acid in royal jelly. Bull.
Fac. Agr. Tamagawa Univ. 24: 101-149.
