UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
“GRIGORE T. POPA” IAŞI
FACULTATEA DE FARMACIE
CERCETĂRI PRIVIND DEZVOLTAREA DE NOI COMPUŞI
CU STRUCTURĂ HETEROCICLICĂ CU POTENŢIAL
BIOLOGIC
Rezumatul tezei de doctorat
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC
PROF. DR. Lenuţa PROFIRE
DOCTORAND
Maria WOLSZLEGER (DRĂGAN)
Investeşte în oameni !
Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007 – 2013
Axa prioritară 1 „Educaţie şi formare în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe
cunoaştere”
Domeniul major de intervenţie 1.5 „Programe doctorale și post-doctorale în sprijinul cercetării”
Titlul proiectului: Parteneriat strategic pentru creșterea calității cercetării științifice din universitățile
medicale prin acordarea de burse doctorale și postdoctorale – DocMed.Net_2.0
Contract nr.: POSDRU/159/1.5/S/136893
Beneficiar: Universitatea de Medicină şi Farmacie ”Iuliu Hatieganu” Cluj-Napoca
IAŞI, 2015
Componenţa comisiei de doctorat:
PREŞEDINTE: Decan Prof. univ. dr. Monica Hăncianu
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa”, Iaşi
CONDUCĂTOR STIINŢIFIC: Prof. univ. dr. LenuţaProfire
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa”, Iaşi
REFERENŢI OFICIALI:
Prof. univ. dr. Ileana Chiriţă
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila”, Bucureşti
C.S.I. Dr. Cornelia Vasile
Institutul de Chimie Macromoleculară „Petru Poni” Iaşi
Conf. univ. dr. Cătălina Daniela Stan
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa”, Iaşi
Teza de doctorat conţine 149 de pagini, 40 de tabele şi 77
de figuri în teză.
Numerotarea figurilor, tabelelor şi cuprinsul, din cadrul
rezumatului se păstrează în aceeaşi formă ca în teză.
Rezultatele ştiinţifice obţinute pe parcursul studiilor
doctorale sunt datorate şi statutului de bursier în cadrul proiectului
„Parteneriat strategic pentru creșterea calității cercetării științifice
din universitățile medicale prin acordarea de burse doctorale și
postdoctorale – DocMed.Net_2.0” POSDRU/159/1.5/S/136893,
statut pe care l-am avut în perioada aprilie 2014 - iunie 2015.
1
CUPRINS
ABREVIERI v
MULŢUMIRI viii
STADIUL CUNOAŞTERII 1
Capitolul 1 1
ACIDUL FERULIC 1
1.1. Generalități 1
1.2. Acid ferulic din surse vegetale 2
1.3. Aportul zilnic de acid ferulic 3
1.4. Proprietăți farmacocinetice 3
1.4.1. Absorbția acidului ferulic 3
1.4.2. Metabolizarea acidului ferulic 4
1.4.3. Distribuţia acidului ferulic 4
1.4.4. Eliminarea şi excreţia acidului ferulic 4
1.5. Proprietăți farmacodinamice 5
1.5.1. Acidul ferulic şi radicalii liberi 5
1.5.2. Acidul ferulic şi enzimele antioxidante 6
1.5.3. Noi formulări ale acidului ferulic 6
1.6. Acidul ferulic şi potenţiale aplicații terapeutice 7
1.6.1. Boala Alzheimer 7
1.6.2. Afecţiuni neoplazice 8
1.6.3. Afecţiuni cardiovasculare 10
1.6.4. Diabet zaharat 11
1.6.5. Fotoprotecţie 12
Capitolul 2 13
STRESUL OXIDATIV ŞI BOLILE
NEURODEGENERATIVE
13
2.1. Rolul stresului oxidativ în procesul de îmbătrânire 13
2.2. Stresul oxidativ şi bolile neurodegenerative 14
2.3. Stresul oxidativ şi boala Parkinson 14
2.4. Stresul oxidativ şi boala Huntington 15
2.5. Stresul oxidativ şi scleroza amiotrofică laterală 16
2.6. Stresul oxidativ şi boala Alzheimer 17
Capitolul 3 19
DERIVAŢI DE HIDRAZONĂ CU POTENŢIAL
TERAPEUTIC
19
3.1. Generalităţi 19
2
3.2. Metode de sinteză a derivaţilor de hidrazonă 20
3.3. Efecte biologice ale derivaţilor de hidrazonă 22
3.3.1. Efect anticonvulsivant 22
3.3.2. Efect antidepresiv 23
3.3.3. Efect analgezic, antiinflamator şi antiplachetar 23
3.3.4. Efect antimalaric 25
3.3.5. Efect antimicrobian 26
3.3.6. Efect antimicobacterian 27
3.3.7. Efect antitumoral 28
3.3.8. Efect vasodilatator 28
3.3.9. Efect antiviral 29
Capitolul 4 30
DERIVAŢI CU STRUCTURĂ DE TIAZOLIDIN-4-ONĂ
ŞI ROLUL LOR TERAPEUTIC
30
4.1. Generalităţi 30
4.2. Metode de sinteză a derivaţilor cu structură de tiazolidin-
4-onă
31
4.3. Efecte biologice ale derivaţilor cu structură de tiazolidin-
4-onă
32
4.3.1. Efect antioxidant 33
4.3.2. Efect antimicrobian şi antifungic 33
4.3.3. Efect antiinflamator şi analgezic 35
4.3.4. Efect anticonvulsivant 36
CONTRIBUŢII PERSONALE 38
Capitolul 5 38
MOTIVAŢIA ALEGERII TEMEI ŞI OBIECTIVELE
CERCETĂRII PERSONALE
38
Capitolul 6 42
SINTEZA ŞI CARACTERIZAREA UNOR NOI
DERIVAŢI DE ACID FERULIC
42
6.1. Material şi metode 42
6.1.1. Sinteza derivaţilor de acid ferulic cu structură de
hidrazonă
42
6.1.1.1.Procedeu de sinteză a clorurii acidului 3-(4-
hidroxi-3-metoxi-fenil)acrilic
42
6.1.1.2.Procedeu de sinteză a 3-(4-hidroxi-3-metoxi-
fenil)acriloil hidrazinei
42
3
6.1.1.3.Procedeu general de sinteză a hidrazonelor
acidului 3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)acrilic
43
6.1.2. Sinteza derivaţilor de acid ferulic cu structură de
tiazolidin-4-onă
43
6.1.2.1. Procedeu general de sinteză a derivaţilor
acidului 3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)acrilic cu
structură de tiazolidin-4-onă
43
6.1.3. Caracterizarea fizico-chimică a derivaţilor de acid
ferulic
44
6.2. Rezultate şi discuţii 44
6.2.1.Sinteza şi caracterizarea unor derivaţi de acid
ferulic
45
6.2.1.1.Sinteza şi caracterizarea clorurii acidului 3-
(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)acrilic
45
6.2.1.2.Sinteza şi caracterizarea 3-(4-hidroxi-3-
metoxi-fenil)acriloil hidrazinei
46
6.2.1.3.Sinteza şi caracterizarea derivaţilor de N-[3-
(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)acriloil]-N-(R-
benziliden)hidrazină
47
6.2.2.Sinteza şi caracterizarea derivaţilor 2-(R-fenil)-3-
[3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)acrilamido]-
tiazolidin-4-one
49
6.3. Concluzii 50
Capitolul 7 52
CONFIRMAREA STRUCTURII CHIMICE A
DERIVAŢILOR DE ACID FERULIC
52
7.1. Material şi metode 52
7.1.1. Spectrometria în infraroşu (IR) 52
7.1.2. Spectrometria de rezonanţă magnetică nucleară
(RMN)
53
7.2. Rezultate şi discuţii 53
7.2.1. Spectrometria în infraroşu (IR) 53
7.2.1.1. Spectrul IR al clorurii acidului 3-(4-
hidroxi-3-metoxi-fenil) acrilic
53
7.2.1.2. Spectrul IR al 3-(4-hidroxi-3-metoxi-
fenil)acriloil hidrazinei
54
7.2.1.3. Spectrul IR al N-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acriloil]-N-(R-
55
4
benziliden)hidrazină
7.2.1.4. Spectrul IR al 2-(R-fenil)-3-[3-(4-
hidroxi-3-metoxifenil) acrilamido]-tiazolidin-
4-onă
60
7.2.2. Spectrometria de rezonanță magnetică nucleară
(RMN)
7.2.2.1. Spectrul 1H-RMN al N-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acriloil]-N-
(R-benziliden)hidrazină
7.2.3.Spectrul 1H-RMN al 2-(R-fenil)-3-[3-(4-
hidroxi-3-metoxifenil)
acrilamido]-tiazolidin-4-onă
Capitolul 8
64
64
67
EVALUAREA BIOLOGICĂ A DERIVAŢILOR DE
ACID FERULIC
71
8.1. Evaluarea ponteţialului antioxidant 71
8.1.1. Material şi metode 71
8.1.1.1. Determinarea efectului antiradicalic faţă de
radicalul DPPH
71
8.1.1.2. Determinarea efectului antiradicalic faţă de
radicalul cation ABTS.+
72
8.1.1.3. Determinarea capacităţii totale antioxidante 73
8.1.1.4. Determinarea puterii reducătoare 73
8.1.2. Rezultate şi discuţii 74
8.1.2.1. Determinarea efectului antiradicalic faţă de
radicalul DPPH
74
8.1.2.2. Determinarea efectului antiradicalic faţă de
radicalul cation ABTS.+
79
8.1.2.3. Determinarea capacităţii totale antioxidante 82
8.1.2.4. Determinarea puterii reducătoare 86
8.1.3. Concluzii 90
8.2. Evaluarea potenţialului antiinflamator in vitro 92
8.2.1. Material şi metode 92
8.2.1.1. Inhibarea denaturării albuminei serice 92
8.2.1.2. Testul de stabilizare a membranei
eritrocitare
93
8.2.2. Rezultate şi discuţii 93
8.2.2.1. Inhibarea denaturării albuminei serice 93
5
8.2.2.2. Testul de stabilizare a membranei
eritrocitare
96
8.2.3. Concluzii 98
8.3. Screening toxicologic. Determinarea toxicităţii acute in
vivo
99
8.3.1. Material şi metode 99
8.3.2. Rezultate şi discuţii 100
8.3.3. Concluzii 101
8.4. Evaluarea potenţialului antiinflamator in vivo 102
8.4.1. Material şi metode 102
8.4.1.1. Model de inflamație acută, indusă cu
carrageenan la şobolani
102
8.4.1.2. Model de inflamație cronică, indusă la
şobolani - testul
granulomului
105
8.4.2. Rezultate şi discuţii 106
8.4.2.1. Efect antiinflamator pe model de
inflamație acută
106
8.4.2.2. Efect antiinflamator pe model de
inflamație cronică
108
8.4.2.3. Concluzii 114
8.5. Evaluarea unor parametri biochimici şi hematologici pe
model de inflamaţie cronică
115
8.5.1. Material şi metode 115
8.5.1.1. Evaluarea parametrilor biochimici 115
8.5.1.2. Evaluarea parametrilor hematologici 120
8.5.2. Rezultate şi discuţii 121
8.5.2.1. Evaluarea parametrilor biochimici 121
8.5.2.2. Evaluarea parametrilor hematologici 127
8.5.3. Concluzii 129
Capitolul 9 130
Concluzii generale 130
BIBLIOGRAFIE 134
ANEXĂ - LISTĂ LUCRĂRI 148
6
ABREVIERI
ABTS
Aβ
ACE
AD
ADN
ADNmt
AF
AINS
AMPc
Apaf-1
ApoE
APP
CAG
CAT
CA1
CEP2
CCNA2
CCNB1
CCl4
cdk5
CE50
COX
COX-1
COX-2 13C-RMN
CSS
DCM
DL50
DM
DMFA
DPPH
DMSO
DYRK1A
EFVR
ERK1/2
FAEE
FA-SLN
GABA
GMPc
GSK3β
Acid 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic)
Beta-amiloid
Enzima de conversie a angiotensinei
Boala Alzheimer
Acid dezoxiribonucleic
ADN-ul mitocondrial
Acid ferulic
Antiinflamatoare nesteroidiene
Adenozin-3,5-monofosfatul ciclic
Factorul 1 activator al proteazei apoptotice
Apolipoproteina E
Proteine precursoare amiloide
Citozina-adenina-guanina
Catalaza
Anhidraza carbonică
Proteină centrozomală 2
Gena Cyclina A2
Gena Cyclina B1
Tetraclorura de carbon
Kinaza 5 Cyclin-dependentă
Concentraţie eficientă 50
Ciclooxigenaza
Ciclooxigenaza-1 constitutivă
Ciclooxigenaza-2 inductibilă
Rezonanţa magnetică nucleară de carbon
Cromatografie pe strat subţire
Diclormetan
Doza letală 50
Diabet zaharat
Dimetilformamidă
2,2-difenil-1-picrilhidrazil
Dimetilsulfoxid
Kinaza 1A reglatoare cu specificitate duală tirozin-
fosforilare
EfavirenzR
Kinaza 1/2 reglatoare a semnalului extracelular
Esterul etilic al acidului ferulic
Nanoparticule lipide solide de acid ferulic
Acid gamma-aminobutiric
Guanozin monofosfat ciclic
Kinaza glicogen-sintetaza 3 beta
7
i.c.v.
ICI-H460
IL
i.p.
ipPIC
IR
iNOS
HAART
HAV
HELA
HIN
HIV
HIV-1RT
HO-1
HO/BVR 1H-RMN
Hsp-70
HSV
k562
LASSBio-294
LASSBIO-785
LASSBIO-788
LOX
LPS
MAO
MCF-7
MeOH
MES
MIC
MYC
NADPH
NF-kB
NNRTI
NO
NOS
eNOS
O2-
ODC1
PAF
PBMC
pKa
PKB
Intracerebroventricular
Celule de cancer uman
Interleukina
Intraperitoneal
Picrotoxină administrată intraperitoneal
Infraroșu
Nitric oxid sintetaza inductibilă
Terapie antiretrovirală foarte activă
Virusul hepatitei-A
Celule umane de cancer
Izoniazidă
Virusul imunodeficienței umane
Revers transcriptaza virusului HIV tip 1
Hem-oxigenaza 1
Sistemul hem oxigenaza / biliverdin reductaza
Rezonanța magnetică nucleară de proton
Proteine - 70 kilodalton implicate în șocul termic
Virusul herpes simplex
Linie celulară umană de tip eritroleucemic
3,4-metilen dioxibenzoil-2-tieniliden hidrazina
N-metil-2-tieniliden-3,4-benzoil hidrazina
N-alil-2-tieniliden-3,4-metilendioxi-benzoil hidrazina
Lipooxigenaza
Lipopolysaccharide (endotoxine) din peretele celular al
bacteriilor Gram-negative
Monoaminoxidaza
Linii celulare maligne de cancer mamar
Metanol
Maximal electroshock seizure (eng.)
Concentrație minimă inhibitorie
Gena oncologică de mielocitomatoză
Nicotinamid adenin dinucleotid fosfat
Factorul nuclear kappa de activare a celulelor B
Inhibitori non-nucleozidici ai reverstranscriptazei
Monoxidul de azot
Nitric oxid sintetaza
Nitric oxid sintetaza endotelială
Anionul superoxid
Ornitin-decarboxilaza 1
Factorul de activare plachetară
Celule sanguine mononucleare periferice
Constanta de aciditate
Protein-kinaza B
8
ppm
PS/APP
PSEN
PTZ
RABGAP1
ROS
RNS
RT
SAL
SIDA
scPTZ
scSTY
SF
SF-SLN
SLN
SMC1L1
SNC
SOD
TNF
ZR-75-1
Y181C
Părţi per milion
Model de șoarece transgenic ps/app cu boală Alzheimer
Presenil
Pentetrazol
Rab gtpase activating protein 1-like (eng.)
Specii reactive de oxigen
Specii reactive de azot
Reverstranscriptaza
Scleroza amiotrofică laterală
Sindromul imunodeficienței umane dobândite
Pentetrazol administrat subcutanat
Stricnină administrată subcutanat
Stearil ferulat
Nanoparticule lipide solide de stearil ferulat
Nanoparticule lipide solide
Structural maintenance of chromosomes 1-like 1 (eng.)
Sistemul nervos central
Superoxid dismutaza
Factorul de necroză tumorală
Linii celulare maligne de cancer mamar
Mutație de la Y la C la poziția 181 a HIV-1RT
9
MULŢUMIRI
Finalizarea tezei de doctorat reprezintă momentul în care se încheie o
etapă importantă din pregătirea mea profesională şi este rezultatul efortului
susţinut pe parcursul a patru ani de activitate de cercetare. Ea se datorează
totodată şi celor care m-au ajutat, susținut, mi-au fost alături, formând
împreună o echipă pe plan profesional şi colegial.
Deosebită recunoştinţă datorez doamnei Prof. Univ. dr. Lenuţa
Profire, în calitate de coordonator ştiinţific, pentru efortul depus şi pentru
răbdarea de care a dat dovadă în îndrumarea competentă şi permanentă pe
parcursul elaborării şi realizării acestei teze de doctorat.
Sincere mulţumiri doamnei Prof. Univ. dr. Monica Hăncianu -
Decanul Facultăţii de Farmacie, pentru sprijinul oferit pe parcursul acestor
ani.
Mulţumesc distinselor doamne referenţi oficiali: doamna Prof. Univ.
Dr. Ileana Chiriţă – Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila”
Bucureşti, doamnei Prof. Dr. Cornelia Vasile – Institutul de Chimie
Macromoleculară „Petru Pon” Iaşi şi doamnei Conf. Univ. Dr. Cătălina
Daniela Stan – Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa”
Iaşi.
Doresc să aduc mulţumiri deosebite doamnei Prof. dr. Rodica
Cuciureanu, de la disciplina de Chimia Mediului şi Alimentului, doamnei
Prof. dr. Anca Miron, de la disciplina de Farmacognozie şi domnului Conf.
dr. Dan Lupaşcu, de la disciplina de Chimie farmaceutică, ca membri în
comisia de îndrumare, pentru sugestiile şi suportul moral oferit, care au
contribuit la finalizarea acestui demers ştiinţific.
Sincere mulţumiri doamnei Prof. dr. Elena Cătălina Lupuşoru, de la
disciplina de Farmacologie, Facultatea de Medicină, pentru sprijinul acordat
în realizarea studiilor toxicologice şi farmacologice.
Mulţumesc, în mod special, echipei de management a proiectului
„Parteneriat strategic pentru creșterea calității cercetării științifice din
universitățile medicale prin acordarea de burse doctorale și postdoctorale –
DocMed.Net_2.0” POSDRU/159/1.5/S/136893, pentru suportul ştiinţific şi
material acordat.
Cele mai calde mulţumiri se îndreaptă către colectivele disciplinei de
Industria Medicamentelor şi Biotehnologii Farmaceutice și Chimie
farmaceutică pentru ajutorul şi înţelegerea de care au dat dovadă pe
parcursul acestor patru ani.
Îmi manifest cu drag recunoştinţa faţă de soţul, copilul şi familia mea
pentru înţelegerea şi suportul moral acordat în toţi aceşti ani, când am fost
nevoită să acord exclusivitate muncii mele profesionale.
10
CAPITOLUL 5
MOTIVAŢIA ALEGERII TEMEI ŞI OBIECTIVELE
CERCETĂRII PERSONALE
Acidul ferulic (acid 4-hidroxi-3-metoxi-cinamic) este un compus
fenolic larg răspândit în lumea vegetală; printre cele mai bogate
surse numărându-se tărâţele de grâu, cerealele integrale, citricele,
cafeaua, vinetele, lăstarii de bambus, sfecla de zahăr, varza, spanacul
şi brocoli. El este cunoscut, în primul rând, ca un puternic
antioxidant, fiind capabil de a proteja ADN-ul şi lipidele biologice
de stresul oxidativ.
Dacă ne referim strict la bolile neurodegenerative, precum boala
Alzheimer, Parkinson, Huntington şi scleroza laterală amiotrofică,
care în Europa afectează peste zece milioane de oameni, cifră care
probabil se va dubla în deceniile următoare, potențiala utilizare a
acidului ferulic în tratamentul acestor afecțiuni este deosebit de
importantă.
O caracteristică importantă în boala Alzherimer este inflamaţia
mediată de activarea celulelor microgliale şi astrogliale (astrocite) şi
care este o importantă sursă de stres oxidativ prin inducerea formării
de anion superoxid. Inflamatia este localizată în jurul plăcilor de
amiloid şi se caracterizează prin eliberarea de substanţe
proinflamatorii din celulele microgliale activate. Cele mai
importante molecule eliberate în procesul inflamator sunt speciile
reactive de oxigen alături de prostaglandine, interleukina 1 (IL-1),
interleukina 6 (IL-6) şi factorul de necroză tumorală (TNF)-.
Totodată stresul oxidativ este considerat un factor declanşator
important pentru bolile autoimune, cancer, procesul de îmbătrânire,
inflamaţie şi în ultimul timp tot mai multe studii sugerează că acesta
joacă un rol important şi în patologia bolilor neurodegenerative.
Nu se ştie cu certitudine dacă stresul oxidativ este factor
declanşator al neurodegenerării sau apare ca un efect secundar a
altor afecţiuni, dar există suficiente dovezi ştiinţifice care susţin
implicarea acestuia în evoluţia afectării celulare.
Deşi ROS pot cauza moarte celulară prin trei mecanisme
principale - peroxidare lipidică, oxidare proteică şi oxidarea ADN-
ului, celulele şi-au dezvoltat mecanisme proprii de apărare împotriva
stresului oxidativ şi reparare celulară. Antioxidanţii endogeni
11
reprezintă prima linie de apărare a celulelor şi includ enzime
antioxidante de tipul superoxid dismutaza, catalaza, glutation
peroxidaza, dar şi molecule mici ca vitaminele E şi C. Date din
literatură susţin însă că eficacitatea antioxidanţilor naturali se reduce
cu vârsta în timp ce stresul oxidativ se intensifică jucând astfel un rol
major în procesul neurodegenerativ.
Comparativ cu alte ţesuturi, SNC este extrem de vulnerabil la
acţiunea radicalilor liberi de oxigen deoarece este un mare
consumator de oxigen, are un conţinut mare de lipide şi totadată are
un deficit relativ în sistemul antioxidant.
Pe de altă parte, structura de hidrazonă și cea de tiazolidin-4-onă
sunt unele dintre cele mai exploatate structuri în sinteza organică.
Datele din literatura de specialitate evidenţiază pentru derivaţii cu
structură de hidrazonă respectiv tiazolidin-4-onă importante efecte
biologice ca efect antioxidant, antiinflamator, analgezic,
antimicrobian, antimicobacterian şi antifungic, precum și efect
anticonvulsivant, antiviral şi anti-HIV, antitumoral şi
hipoglicemiant.
Scopul principal al cercetărilor personale a fost reprezentat de
sinteza unor noi derivaţi ai acidului ferulic cu structură de
hidrazonă (4a-k) și tiazolidin-4-onă (5a-l), derivaţi rezultaţi prin
modularea structurală a acidului ferulic, la nivelul grupării carboxil
libere. Compușii dezvoltați prezintă premize teoretice pentru
utilizarea lor ca potențiali agenți terapeutici în tratamentul
afecțiunilor în care inflamația și stresul oxidativ joacă un rol major,
printre acestea un loc important ocupând și afecțiunile
neurodegenerative.
Fig. 5.1. Derivaţi de acid ferulic cu structură de hidrazonă (4a-k) și
tiazolidin-4-onă (5a-l).
Pentru realizarea cercetărilor personale s-a avut în vedere
următoarele obiective:
12
Sinteza şi caracterizarea unor derivaţi de acid ferulic cu
structură de hidrazonă şi tiazolidin-4-onă, obiectiv în cadrul căruia
s-a urmărit:
optimizarea metodelor de sinteză a derivaţilor intermediari
şi finali, în vederea obţinerii lor în randament ridicat şi
puritate avansată;
purificarea compuşilor sintetizaţi prin diferite metode:
precipitare sau recristalizare cu/din solvenţi adecvaţi,
separare pe coloană de silicagel;
caracterizarea fizico-chimică a compuşilor intermediari şi
finali sintetizaţi (formulă moleculară, temperatură de topire,
randament, solubilitate în diferiţi solvenţi);
confirmarea structurii chimice a compușilor sintetizați prin
metode spectrometrice (IR, RMN).
Evaluarea potenţialului biologic al derivaţilor de acid
ferulic obiectiv în cadrul căruia s-a urmărit:
evaluarea potenţialului antioxidant al derivaţilor sintetizaţi,
prin determinarea efectului antiradicalic faţă de DPPH şi
ABTS, a capacităţii totale antioxidante şi a puterii
reducătoare;
evaluarea gradului de toxicitate al compuşilor sintetizaţi,
prin determinarea dozei letale 50 (DL50);
evaluarea potenţialului antiinflamator in vitro, prin care s-a
urmărit efectul compușilor sintetizați asupra inhibării
denaturării albuminei serice bovină și asupra stabilității
membranei eritrocitare.
evaluarea potenţialului antiinflamator in vivo al compușilor
sintetizați pe model de inflamație acută indusă cu
carrageenan și model de inflamație cronică – testul
granulomului;
evaluarea parametrilor biochimici și hematologici, pe
model de inflamație cronică indusă la șobolan – testul
granulomului. Rezultatele ştiinţifice obţinute pe parcursul studiilor doctorale sunt datorate şi
statutului de bursier în cadrul proiectului „Parteneriat strategic pentru creșterea
calității cercetării științifice din universitățile medicale prin acordarea de burse doctorale și postdoctorale – DocMed.Net_2.0” POSDRU/159/1.5/S/136893, statut pe
care l-am avut în perioada aprilie 2014 - iunie 2015.
13
CAPITOLUL 6
SINTEZA ŞI CARACTERIZAREA UNOR NOI DERIVAŢI DE
ACID FERULIC
Sinteza derivaţilor acidului ferulic (acid 3-(4-hidroxi-3-metoxi-
fenil)acrilic) cu structură de hidrazonă şi tiazolidin-4-onă s-a realizat
în mai multe etape (Fig. 6.1 şi 6.2).
R = 4-F(a), 4-Br(b), 4-Cl(c), 2-NO2(d), 3-NO2(e), 4-NO2(f), 2-OH(g), 3-OH(h), 4-OH(i), 2-OCH3(j), H(k)
Fig. 6.1. Schema generală de obţinere a derivaţilor de acid ferulic
cu structură de hidrazonă.
R = H(a), 4-Cl(b), 4-F(c), 4-Br(d), 4-NO2(e), 2-NO2(f), 2-OCH3(g), 2-OH(h),
2,6-diCl(i), 4-N(CH3)2(j), 2,3-diOH(k), 4-OH-3-OCH3(l)
Fig. 6.2. Schema generală de obţinere a derivaţilor de acid ferulic
cu structură de tiazolidin-4-onă.
Sinteza derivaţilor intermediari şi finali a fost monitorizată prin
cromatografie pe strat subţire (CSS), cu strat de silicagel depus pe
suport de aluminiu, folosind ca eluent următoarele sisteme de
solvenți: acetat de etil:metanol:acetonă:apă şi diclormetan:metanol,
în diferite proporţii, în funcţie de polaritatea compuşilor.
Vizualizarea spoturilor de pe cromatograme s-a realizat în lumină
UV, la lungimea de undă 254 nm.
Caracterizarea fizică-chimică a compuşilor intermediari şi finali
a inclus stabilirea formulei moleculare, a masei relative, a
14
temperaturii de topire, a solubilităţii în apă şi în diferiţi solvenţi
organici şi a randamentului de reacţie (tabel 6.3, 6.4).
Tabel 6.3. Caracteristicile fizico-chimice ale derivaţilor N-[3-(4-
hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-N-(R-benziliden)hidrazină (4a-k)
Compus
R
Formula
moleculară
Mr
(g/mol)
P.t.
(0C)
ɳ
(%) Solubilitate
4a -F(4) C17H15FN2O3 314,31 189-194 66,35
compuşii sunt
uşor solubili în
DMFA şi DMSO, parţial solubili în
alcool etilic
absolut, metanol, cloroform,
acetonă, dioxan şi
insolubili în apă distilată şi eter
etilic
4b -Cl(4) C17H15ClN2O3 330,08 203-205 69,18
4c -Br(4) C17H15BrN2O3 375,22 210-213 68,81
4d -NO2(2) C17H15N3O5 341,32 196-198 52,04
4e -NO2(3) C17H15N3O5 341,32 185 61,38
4f -NO2(4) C17H15N3O5 341,32 223 60,17
4g -OH(2) C17H16N2O4 312,32 186 55,89
4h -OH(3) C17H16N2O4 312,32 236 25,85
4i -OH(4) C17H16N2O4 312,32 179 84,56
4j -OCH3(2) C18H18N2O4 326,35 200 48,83
4k -H C17H16N2O3 296,32 110 80,53
Tabel 6.4. Caracteristicile fizico-chimice ale derivaţilor 2-(R-
fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-ona (5a-l)
Comp
us
R Formula
moleculară
Mr
(g/mo
l)
P.t.
(0C)
ɳ
(%) Solubilitate
5a -H C19H18N2O4S 370.24
102 15.96
compuşii sunt uşor solubili în
DMFA, DMSO şi acetonă,
parţial solubili
în alcool etilic
absolut,
metanol,
cloroform, acetonă, dioxan
şi insolubili în
apă distilată şi eter etilic
5b -Cl(4) C19H17ClN2O4S 404.0
6
190 31.63
5c -F(4) C19H17FN2O4S 388.09
106-110
19.95
5d -Br(4) C19H17BrN2O4S 449.3
2
173-
176
41.24
5e -NO2(4) C19H17N3O6S 415.08
98-102 9.31
5f -NO2(2) C19H17N3O6S 415.0
8
140-
142
36.31
5g -OCH3(2) C20H20N2O5S 400.45
118-122
29.01
5h -OH(2) C19H18N2O5S 386.4
2
211-
215
50.97
5i -Cl(2,6) C19H16Cl2N2O4S 439.3 229- 82.82
15
1 230
5j -
N(CH3)2(
4)
C21H23N3O4S 413.1
4
160 30.94
5k -OH(2,3) C19H18N2O6S 402.42
212 11.13
5l -OH(4),-
OCH3(3)
C20H20N2O6S 416.4
5
140 15.49
16
CAPITOLUL 7
CONFIRMEA STRUCTURII CHIMICE A DERIVAŢILOR
DE ACID FERULIC
Structura compuşilor sintetizaţi, intermediari și finali cu structură
de hidrazonă și de tiazolidin-4-onă, a fost confirmată prin metode
spectrale: spectrometrie în infraroşu (IR) și spectrometrie de
rezonanţă magnetică nucleară de proton (1H-RMN).
Spectrometria în infraroşu (IR)
Obţinerea clorurii acide a acidului ferulic a fost confirmată în
spectrul IR prin identificarea benzilor caracterisice structurii de bază
(acid ferulic). Gruparea (CO-Cl) din structura clorurii acide apare în
spectrul IR ca o bandă de absorbţie de intensitate mare, îngustă la
lungimea de undă de 1724 cm-1. Nucleul aromatic a fost pus în
evidenţă prin benzile de absorbţie de la lungimea de undă 2949 cm-1
şi 854 cm-1, caracteristice vibraţiilor de întindere, respectiv de
deformare a legăturii =CH- şi prin benzile de la lungimea de undă
1599 cm-1 şi 1508 cm-1 atribuite vibraţiilor de întindere a legăturii -
C=C-.
Formarea hidrazidei acidului ferulic, este confirmată în spectrele
IR prin prezenţa grupării -NH-NH2 care este susţinută de apariţia în
spectru a benzilor de absorbţie, de lăţime şi intensitate medie,
caracteristice grupării -NH2 (3304 cm-1, 3252 cm-1) şi grupării -NH-
(3182 cm-1, 3149 cm-1). Gruparea amidică (-CO-NH) a fost
evidenţiată prin benzile de absorbţie de la 1634 cm-1,
corespunzătoare legăturii C=O, şi 1537 cm-1, caracteristică vibraţiei
de deformare a legăturii -NH-.
În spectrul compuşilor cu structură de hidrazonă s-a observat
dispariţia benzilor de absorbţie caracteristice grupării -NH2,
evidenţiindu-se doar vibraţiile caracteristice grupării -NH-,
identificate în regiunea 3065 cm-1 – 3263 cm-1 şi a legăturii C-N care
apare la 1227 cm-1 – 1286 cm-1. O altă diferenţă faţă de hidrazidă o
reprezintă apariţia benzii de absorbţie caracteristice legăturii
azometinice -C=N-, identificată, în funcţie de compus, în regiunea
1508 cm-1 – 1607 cm-1. Banda de absorbţie specifică grupării ceto
(CO) din legătura amidică (-CO-NH-) a fost evidenţiată în regiunea
1564 cm-1 –1651 cm-1. Halogenii au fost evidenţiaţi prin benzile de
17
absorbţie de la 1095 cm-1 (F), 814 cm-1 (Cl) şi 858 cm-1 (Br).
Grupările nitro s-au evidenţiat prin vibraţiile de valenţă simetrice în
intervalul 1330 cm-1 – 1353 cm-1 şi asimetrice în regiunea 1380 cm-1
– 1569 cm-1. Întrucât banda de absorbţie caracteristică grupării
hidroxil fenolice se suprapune peste vibraţia specifică legăturii –NH-
, în spectru s-a obsevat doar banda caracteristică legăturii C-O la
lungimea de undă 1195 cm-1 (2-hidroxi), 1197 cm-1 (3-hidroxi),
respectiv 1164 cm-1 (4-hidroxi). Gruparea metoxi s-a identificat prin
apariţia vibraţiei specifice legăturii C-O la 1155 cm-1 (2-metoxi).
Condensarea hidrazidei acidului ferulic cu acidul tioglicolic şi
diferite aldehide aromatice a condus la obţinerea derivaţilor de
tiazolidin-4-onă corespunzători (5a-l). Această ciclizare a fost
confirmată prin apariţia în spectrul IR al compuşilor a benzilor
caracteristice legăturii C-S (650 cm-1– 704 cm-1) şi a grupării
cetonice (1620 cm-1– 1715 cm-1) din ciclul de tiazolidin-4-onă nou
format.
Fig. 7.7. Spectrul IR al N-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-N-
(benziliden)hidrazina(4k).
Fig. 7.11. Spectrul IR al 2-(2,3-dihidroxi-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-ona (5i).
18
7.2.2. Spectrometria de rezonanță magnetică nucleară (RMN)
7.2.2.1. Spectrul 1H-RMN a derivaţilor N-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acriloil]-N-(R-benziliden)hidrazină
Analiza spectrelor 1H-RMN înregistrate pentru hidrazonele acidului
ferulic (4a-k) a furnizat următoarele informaţii (tabel 7.3):
protonul grupării azometinice (CH=N), apare ca singlet în
intervalul 8,57 – 9,01 ppm, având integrala 1.
semnalele protonilor aromatici au apărut în intervalul 6,55 – 8,57
ppm sub formă de dublet (d), triplet (t), dublet de dublet (dd),
triplet de dublet (td) sau multiplet, în funcţie de structura
hidrazonei.
semnalul corespunzător celor 3 protoni ai grupării OCH3
(metoxi), caracteristică structurii acidului ferulic a fost identificat
în intervalul 3,74 – 3,85 pm, sub formă de singlet cu integrala 3;
Tabel 7.3. Caracteristicile spectrale 1H-RMN ale derivaţilor N-[3-(4-
hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-N-(R-benziliden)hidrazină (4a-k)
Nr. R 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
4a 4-F 3.83 (s, 3H, OCH3), 6.79-6.89 (m, 2H, Ar-H), 6.99-7.03 (m, 1H,
Ar-H), 7.11 (s, 1H, Ar-H), 7.29-7.37 (m, 3H, Ar-H), 7.81 (dt, 2H,
Ar-H), 8.83 (s, 1H, CH=N)
4b 4-Cl 3.82 (s, 3H, OCH3), 6.80-6.85 (m, 2H, Ar-H), 6.95-7.04 (m, 1H, Ar-H), 7.19 (s, 1H, Ar-H), 7.37 (dd, 1H, Ar-H), 7.52 (dd, 2H, Ar-
H), 7.77 (dd, 2H, A-H), 8.84 (s, 1H, CH=N)
4c 4-Br 3.85 (s, 3H, OCH3), 6.77-6.85 (m, 2H, Ar-H), 6.93-6.99 (m, 1H,
Ar-H), 7.13 (s, 1H, Ar-H), 7.30-7.37 (m, 1H, Ar-H), 7.58-7.63 (m,
2H, Ar-H), 7.72-7.75 (m, 2H, A-H), 8.81 (s, 1H, CH=N)
4d 2-NO2 3.83 (s, 3H, OCH3), 6.69-6.75 (m, 1H, Ar-H), 6.88-6.93 (m, 1H,
Ar-H), 6.99 (dd, 1H, Ar-H), 7.16 (s, 1H, Ar-H), 7.35-7.43 (m, 1H, Ar-H), 7.59-7.64 (m, 1H, Ar-H), 7.91-7.98 (m, 2H, Ar-H), 8.09
(dd, 1H, Ar-H), 8.78 (s, 1H, CH=N)
4e 3-NO2 3.81 (s, 3H, OCH3), 6.75-6.84 (m, 1H, Ar-H), 6.89-6.99 (m, 2H,
Ar-H), 7.11 (s, 1H, Ar-H), 7.32-7.36 (m, 1H, Ar-H), 7.78-7.85 (m, 1H, Ar-H), 8.15-8.22 (m, 2H, Ar-H), 8.52-8.57 (m, 1H, Ar-H),
8.80 (s, 1H, CH=N)
19
Nr. R 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ ppm)
4f 4-NO2 3.82 (s, 3H, OCH3), 6.79-6.85 (m, 1H, Ar-H), 6.89-7.00 (m, 2H, Ar-H), 7.12 (s, 1H, Ar-H), 7.30-7.39 (m, 1H, Ar-H), 8.09-8.14 (m,
2H, Ar-H), 8.33-8.39 (m, 2H, Ar-H), 8.70 (s, 1H, CH=N)
4g 2-OH 3.81 (s, 3H, OCH3), 6.55-6.59 (m, 1H, Ar-H), 6.80-6.87 (m, 1H,
Ar-H), 7.00-7.08 (m, 1H, Ar-H), 7.20-7.29 (m, 2H, Ar-H), 7.33-
7.35 (m, 1H, Ar-H), 7.60-7.65 (m, 1H, Ar-H), 7.72-7.79 (m, 1H, Ar-H), 7.94 (s, 1H, Ar-H), 9.01 (s, 1H, CH=N)
4h 3-OH 3.83 (s, 3H, OCH3), 6.79-6.89 (m, 2H, Ar-H), 6.99-7.05 (m, 2H, Ar-H), 7.16 (s, 1H, Ar-H), 7.25-7.30 (m, 1H, Ar-H), 7.37-7.46 (m,
3H, Ar-H), 8.59 (s, 1H, CH=N)
4i 4-OH 3.79 (s, 3H, OCH3), 6.79-6.83 (m, 1H, Ar-H), 6.86-6.90 (m, 3H,
Ar-H), 6.99 (dd, 1H, Ar-H), 7.12 (s, 1H, Ar-H), 7.34-7.42 (m, 1H,
Ar-H),7.78 (dd, 2H, Ar-H), 8.57 (s, 1H, CH=N)
4j 2-OCH3 3.83 (s, 6H, OCH3), 6.79-6.84 (m, 1H, Ar-H), 6.89-6.99 (m, 2H, Ar-H),7.08-7.15 (m, 2H, Ar-H), 7.37-7.42 (m, 1H, Ar-H), 7.58-
7.64 (m, 2H, Ar-H), 7.72-7.79 (m, 1H, Ar-H), 9.01 (s, 1H, CH=N)
4k -H 3.74 (s, 3H, OCH3), 6.79-6.82 (m, 1H, Ar-H), 6.98-7.12 (m, 2H,
Ar-H), 7.39-7.43 (m, 1H, Ar-H), 7.48-7.52 (m, 1H, Ar-H), 7.54-
7.60 (m, 3H, Ar-H), 7.65-7.68 (m, 2H, Ar-H), 8.71 (s, 1H, CH=N)
7.2.2.2. Spectrul 1H-RMN al derivaţilor 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-
3-metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-ona
Confirmarea structurii derivaţilor 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-ona (5a-l) este susţinută prin
evideţierea în spectrul 1H-RMN a semnalelor protonilor din
secvenţele de tiazolidin-4-onă, nucleul aromatic şi cea de acid
ferulic (tabel 7.4).
Semnalele protonilor ciclului de tiazolidin-4-onă au fost
identificate la următoarele frecvenţe:
Protonul grupării CH-N (metin) a fost identificat în domeniul
5,74-5,95 ppm sub forma unui semnal de tip singlet sau
dublet, cu o constantă de cuplaj de 1,05-2,5 Hz sau multiplet,
având integrala 1;
Protonii grupării CH2S (tiometilen) au fostidentificaţi în
domeniul 3,62 –4,03 ppm sub formă de dublet, dublet de
dublet, dublet de triplet sau multiplet, având integrala 2.
Semnalele protonilor din nucleul aromatic din poziția 2 a ciclului
de tiazolidin-4-onă s-au suprapus peste semnalele protonilor
aromatici din structura acidului ferulic şi au fost identificate în
20
intervalul 6,64–8,33 ppm. Deplasările chimice ale protonilor au fost
influenţate de substituenţii grefaţi pe nucleul aromatic.
Semnalul corespunzător celor 3 protoni ai grupării OCH3
(metoxi), caracteristică structurii acidului ferulic a fost identificat în
intervalul 3,69 – 4,04 ppm, sub formă de singlet cu integrala 3.
Tabel. 7.4. Caracteristicile spectrale 1H-RMN ale derivaţilor2-(R-
fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-ona(5a-l)
Nr.
R 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δppm)
5a -H 3.83 (s, 3H, OCH3), 3.85-3.95 (m, 2H, CH2-S), 5.92 (s, 1H, CH-
N), 6.79 (dt, 1H, Ar-H), 6.89-6.93 (m, 1H, Ar-H), 6.99-7.04 (m,
1H, Ar-H), 7.16 (s, 1H, Ar-H), 7.36-7.49(m, 5H, Ar-H), 7.82-7.91 (m, 1H, NH-N)
5b 4-Cl 3.76-3.80 (m, 2H, CH2-S), 3.83 (s, 3H, OCH3), 5.92 (s, 1H, CH-N), 7.17 (t, 1H, Ar-H), 7.16 (p, 1H, Ar-H), 7.34-7.39 (m, 3H, Ar-
H), 7.41 (p, 1H, Ar-H), 7.51-7.55 (m, 2H, Ar-H), 7.62 (t, 1H, Ar-
H), 7.82-7.91 (m, 1H, NH-N)
5c 4-F 3.62-3.75 (m, 2H, CH2-S), 4.04 (s, 3H, OCH3), 5.74-5.80 (m, 1H,
CH-N), 7.13 (t, 1H, Ar-H), 7.16 (p, 1H, Ar-H), 7.23 (t, 1H, Ar-H), 7.31 (p, 1H, Ar-H), 7.37 (t, 1H, Ar-H), 7.42 (t, 1H, Ar-H), 7.44-
7.50 (m, 2H, Ar-H), 7.58 (dt, 1H, Ar-H), 7.88-7.95 (m, 1H, NH-N)
5d 4-Br 3.80 (s, 3H, OCH3), 3.85-3.95 (m, 2H, CH2-S), 5.92 (s, 1H, CH-
N), 6.79 (t, 1H, Ar-H), 6.89 (p, 1H, Ar-H), 6.97 (t, 1H, Ar-H), 7.12 (dt, 2H, Ar-H), 7.16-7.20 (m, 1H, Ar-H), 7.37 (dd, 1H, Ar-
H), 7.85 (dt, 2H, Ar-H), 8.15-8.25 (m, 1H, NH-N)
5e 4-NO2 3.69 (s, 3H, OCH3), 3.85-3.92 (m, 2H, CH2-S), 5.81-5.97 (m, 1H,
CH-N), 6.69 (s, 1H, Ar-H), 7.12-7.25 (m, 1H, Ar-H), 7.58-7.72
(m, 2H, Ar-H), 7.87(dd, 1H, Ar-H), 8.14-8.18 (m, 2H, Ar-H), 8.22 (s, 1H, Ar-H), 8.33 (s, 1H, Ar-H)
5f 2-NO2 3.83 (s, 3H, OCH3), 3.84-3.91 (m, 2H, CH2-S), 5.92 (s, 1H, CH-N), 6.79 (t, 1H, Ar-H), 6.85-6.89 (m, 1H, Ar-H), 6.99-7.04 (m,
1H, Ar-H), 7.16 (s, 1H, Ar-H), 7.37 (dd, 1H, Ar-H), 7.45-7.49 (m,
1H, Ar-H), 7.52-7.58 (m, 1H, Ar-H), 7.72-7.78 (m, 1H, Ar-H), 7.96-8.01 (m, 1H, Ar-H), 8.09-8.15 (m, 1H, NH-N)
5g 2-OCH3 3.83 (s, 3H, OCH3), 3.90 (s, 3H, OCH3), 3.95-4.03 (m, 2H, CH2-
S), 5.95 (s, 1H, CH-N), 6.77-6.84 (m, 2H, Ar-H), 6.89-6.92 (m,
3H, Ar-H), 6.98-7.06 (m, 1H, Ar-H), 7.12 (s, 1H, Ar-H), 7.16 (dd, 1H, Ar-H), 7.37 (dd, 1H, Ar-H), 8.02-8.09 (m, 1H, NH-N)
21
Nr. R 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δppm)
5h 2-OH 3.83 (s, 3H, OCH3), 3.82-3.89 (m, 2H, CH2-S), 5.92 (s, 1H, CH-
N), 6.69-6.80 (m, 5H, Ar-H), 6.89-7.00 (m, 2H, Ar-H), 7.16 (s, 1H, Ar-H), 7.35-7.39 (m, 1H, Ar-H), 8.02 (s, 1H, NH-N)
5i 2,6-diCl 3.80 (s, 3H, OCH3), 3.75-3.84 (m, 2H, CH2-S), 5.87 (s, 1H, CH-N), 6.69-6.83 (m, 4H, Ar-H), 6.89-6.95 (m, 1H, Ar-H), 6.99-7.03
(m, 1H, Ar-H), 7.15 (s, 1H, Ar-H), 7.32-7.37 (m, 1H, Ar-H), 7.86-
7.91 (m, 1H, NH-N)
5j 4-N(CH3)2 3.06 (s, 6H, N-(CH3)2, 3.80 (s, 3H, OCH3), 3.84-3.93 (m, 2H,
CH2-S), 5.86-5.92 (m, 1H, CH-N), 6.64-6.79 (m, 3H, Ar-H), 6.80-
6.88 (m, 1H, Ar-H), 6.93-7.05 (m, 3H, Ar-H), 7.16(s, 1H, Ar-H),
7.34-7.40 (m, 1H, Ar-H), 8.33 (s, 1H, Ar-H)
5k 2,3-diOH 3.83 (s, 3H, OCH3), 3.84-3.90 (m, 2H, CH2-S), 5.90 (s, 1H, CH-
N), 6.59-6.72 (m, 3H, Ar-H), 6.79-6.84 (m, 1H, Ar-H), 6.89-6.93 (m, 1H, Ar-H), 6.99-7.05 (m, 1H, Ar-H), 7.16(s, 1H, Ar-H), 7.37-
7.40 (m, 1H, Ar-H), 8.15 (s, 1H, NH-N)
5l 3-OCH3-
4-OH
3.83 (s, 3H, OCH3), 3.85 (s, 3H, OCH3), 3.88-3.94 (m, 2H, CH2-
S), 5.95 (s, 1H, CH-N), 6.72-6.79 (m, 2H, Ar-H), 6.89-6.95 (m,
1H, Ar-H), 6.99-7.07 (m, 1H, Ar-H), 7.16 (s, 1H, Ar-H), 7.34-7.37(m, 2H, Ar-H), 7.45-7.48 (m, 1H, Ar-H), 8.02-8.09 (m, 1H,
NH-N)
22
CAPITOLUL 8
EVALUAREA BIOLOGICĂ
A DERIVAŢILOR DE ACID FERULIC
8.1. Evaluarea ponteţialului antioxidant Activitatea antioxidantă a fost evaluată prin două metode
antiradicalice faţă de radicalii DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) şi
ABTS·+ (acid 2,2´-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic)), iar
exprimarea rezultatelor s-a realizat prin calcularea procentelor de
inhibiţie (I%), reprezentarea grafică a procentelor de inhibiţie şi prin
calcularea valorilor CE50. Celelalte două teste au inclus determinarea
capacităţii totale antioxidante şi a puterii reducătoare, rezultatele
obţinute fiind exprimate prin reprezentarea grafică a absorbanţelor şi
prin calcularea valorilor CE50.
8.1.2. Rezultate şi discuţii
8.1.2.1. Determinarea efectului antiradicalic faţă de radicalul
DPPH
În seria derivaţilor N-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-N-(R-
benziliden)hidrazină (4a-k), s-a observat că cei mai mulți dintre
compuşi studiaţi sunt mai activi decât acidul ferulic (AF) la toate
diluțiile obținute din soluție stoc de 2 mg/mL (fig. .8.2a).
Fig. 8.2a. Capacitatea de inhibare (I%) a radicalilor liberi DPPH de către
hidrazonele acidului ferulic (4a-k), la diferite concentraţii, după 30 minute.
23
Dintre aceştia cei mai activi s-au dovedit a fi hidrazonele
rezultate în urma reacţiei de condensare dintre hidrazida acidului
ferulic cu benzaldehida (4k), 4-nitrobenzaldehida (4f), 2-
hidroxibenzaldehida (4g) și 4-hidroxibenzaldehida (4i). Procentul de
inhibiție înregistrat pentru acești compuși la concentrația de 133
g/mL a fost de I% = 98,44 ± 0,06% după 30 minute şi I% = 98,55 ±
0,09% după 60 minute pentru 4k, I% = 98,31 ± 0,15% după 30
minute şi I% = 99,07 ± 0,17% după 60 minute, pentru 4f, I% = 98,30
± 0,01% după 30 minute şi I% = 98,42 ± 0,03% după 60 minute,
pentru 4g şi I% = 98,04 ± 0,06% după 30 minute şi I% = 98,39 ±
0,07% după 60 minute, pentru 4i.
În seria derivaților de 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)
acrilamido]-tiazolidin-4-ona (5a-l) (fig. 8.3a) s-a evidenţiat faptul că
grefarea nucleului de tiazolidin-4-onă pe molecula acidului ferulic,
prin intermediul unei legături amidice, a avut drept rezultat
intensificarea acțiunii antioxidante a acestuia. Şi în cazul acestor
derivați, similar hidrazonelor acidului ferulic, efectul de reducere al
radicalilor liberi de DPPH creşte direct proporţional cu concentraţia
compusului şi, de asemenea, se intensifică în timp.
La toate diluțiile obținute din soluția stoc de concentrația 2
mg/mL, cei mai mulți dintre compușii testați au avut o activitate
similară sau mai intensă decât acidul ferulic. Spre exemplu la
concentrația de 133 g/mL (în probă), pentru compusul de bază al
seriei, 5a, rezultat în urma reacției de condensare dintre hidrazida
acidului ferulic, acidul tioglicolic și benzaldehida procentul de
inhibiție a radicalilor liberi DPPH a fost de I% = 95,76 ± 0,03%
după 30 minute şi I% = 97,00 ± 0,03% după 60 minute. În condiții
similare, efectul antiradicalic al acidului ferulic exprimat de procent
de inhibiție a radicalilor DPPH a fost de I% = 94,56 ± 0,12 la 30
minute, respectiv I% = 95,72 ± 0,1 la 60 minute. Referitor la
influența radicalului ce substituie nucelul aromatic din structura de
tiazolidin-4-onă, s-a constatat ca cea mai favorabilă influenă o au
substituenții: 2,3-dihidroxi (5k), 4-hidroxi-3-metoxi (5l), 4-nitro (5f)
și 4-floro (5c); pentru compușii corespunzători efectul antioxidant
fiind ușor mai intens decât al derivatului nesubstituit 5a. Pentru
acești compuși procentele de inhibiție au fost de I% = 98,46 ± 0,06%
după 30 minute şi I% = 98,66 ± 0,02% după 60 minute (5k), I% =
97,85 ± 0,07% după 30 minute şi I% = 98,22 ± 0,019% după 60
24
minute (5l), I% = 97,68 ± 0,03% după 30 minute şi I% = 98,28 ±
0,01% după 60 minute (5f) și I% = 96,60 ± 0,06% după 30 minute şi
I% = 97,54 ± 0,07% după 60 minute (5c).
De remarcat este faptul că pentru derivații 5k și 5l efectul
antiradicalic se păstrează și la concentrația de 0,5 mg/mL, fiind
singurii din serie au au prezentat efect la această concentrație. Datele
obținute susțin influența pozitivă a substituenilor hidroxi și metoxi
asupra acțiunii antiradicalice a derivaților acidului ferulic cu
structură de tiazolidin-4-onă.
Fig. 8.3a. Capacitatea de inhibare (I%) a radicalilor liberi DPPH de către
derivaţii de acid ferulic cu structură de tiazolidin-4-onă (5a-l), la diferite
concentraţii, după 30 minute.
8.1.2.2. Determinarea efectului antiradicalic faţă de radicalul cation
ABTS.+
Pentru ambele serii de compuși s-a constatat că modularea
structurală a acidului ferulic la nivelul grupării carboxil libere a avut
drept rezultat pastrarea și chiar intensificarea acțiunii antiradicalice a
acestuia. Compuşii analizaţi sunt cu atât mai activi cu cât procentul
de inhibiţie este mai mare şi CE50 este mai mică.
Astfel în seria derivaţilor N-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)
acriloil]-N-(R-benziliden) hidrazină (4a-k), s-a observat că pentru
toți compușii testați activitatea antiradicalică creşte direct
proporţional cu concentraţia (fig. 8.5).
La concentrația de 133 µg/mL compușii rezultați în urma reacției
de condensare cu 4-nitrobenzaldehida (4f, I% = 93,33 ± 0,56%) și
2-hidroxibenzaldehida (4g, I% = 96,89 ± 0,06%) au prezentat o
activitate mai intensă decât acidul feulic (AF, I% = 89,31 ± 0,09%).
Mai activi s-au dovedit compușii rezultați în urma reacției de
25
condensare cu benzaldehida (4k, I% = 99,44 ± 0,03%) și 4-hidroxi-
benzaldehida (4i, I% = 99,59 ± 0,02%).
Fig. 8.5. Activitatea antiradicalică faţă de ABTS.+ (% inhibiţie) a
derivaţilor N-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-N-(R-
benziliden)hidrazină (4a-k), la diferite concentraţii.
În seria derivaţilor de 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxi-
fenil)acrilamido]-tiazolidin-4-onă (5a-l) (fig. 8.6), la concentraţia de
2 mg/mL (diferite diluții), cel mai activ s-a dovedit a fi derivatul
rezultat în urma reacției de condensare dintre hidrazida acidului
ferulic, acidul tioglicolic și 2,3-dihidroxibenzaldehida (5k).
Fig. 8.6. Activitatea antiradicalică faţă de ABTS.+ (% inhibiţie) a derivaţilor
2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-ona (5a-
l), la diferite concentraţii.
La concentrația de 133 µg/mL, procentul de inhibiție înregistrat
de compusul 5k a fost de I% = 97,67 ± 0,15%, în timp ce în condiții
experimentale similare acidul ferulic (AF) a prezentat un procent de
26
inhibiție de I% = 88,61 ± 0,09%). Activitate antiradicalică
superioară acidului ferulic a prezentat și derivatul substituit pe
nucleul aromatic cu substituentul 4-hidroxi-3-metoxi, pentru care I%
= 93,89 ± 0,20%).
Compușii obținuți în urma reacției de condensare cu
benzaldehida (5a, I% = 91,85 ± 0,25%), 2,6-diclorbenzaldehida (5i,
I% = 91,31 ± 0,19%), 4-fluorbenzaldehida (5c, I% = 90,69 ±
0,24%), 4-nitrobenzaldehida (4f, I% = 90,64 ± 0,29%) au prezentat o
activitate antiradicalică comparabilă acidului ferulic (I% = 88,61 ±
0,09%). (Fig. 8.6).
8.1.2.3. Determinarea capacităţii totale antioxidante
Capacitatea totală antioxidantă este invers proporţională cu
valoarea CE50 şi direct proporţională cu absorbanţa. Se apreciază că
un compus are capacitate totală antioxidantă crescută dacă valoarea
CE50 este mai mică şi valoarea absorbanţei mai mare.
Referitor la rezultatele obţinute la diferite concentraţii se
observă că absorbanţa compuşilor testaţi creşte direct proporţional
cu concentraţia.
În seria derivaților de N-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-N-
(R-benziliden) hidrazină (4a-k) (fig. 8.7) se observă că, exceptând
compușii 4c și 4j, ce conțin pe nucleul aromatic substituenii 4-Br
respectiv 2-OCH3, toți ceilalți compuși au fost mai activi decât
acidul ferulic.
Fig. 8.7. Capacitatea totală antioxidantă a derivaţilor N-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acriloil]-N-(R-benziliden)hidrazină (4a-k), la diferite
concentraţii.
27
Cea mai mare creştere a absorbanţei, dependentă de concentraţie
(de la 9,09 µg/mL la 54,54 µg/mL), s-a înregistrat pentru compuşii
4a (R = 4-F, de la 0.2133 ± 0.0013 la 2.1519 ± 0.0032), 4b (R = 4-
Cl, de la 0.1658 ± 0.0027 la 1,7425 ± 0,013, 4d (R = 2-NO2, de la
0.3069 ± 0.00015 la 1.9635 ± 0.0113), 4e (R = 3-NO2, de la 0.252 ±
0.0017 la 1.9635 ± 0.0113), 4f (R = 4-NO2, de la 0.2985 ± 0.0013 la
1.4527 ± 0.0018), 4g (R = 2-OH, de la 0.4768 ±0.0009 la 1.8399 ±
0.00025), 4h (R = 3-OH, de la 0.2299 ± 0.00029 la 1.4577 ±
0.0005), 4i (R = 4-OH, de la 0.2683 ± 0,0004 la 1.6515 ± 0.0027),
4k (R = H, de la 0.1866 ± 0,0006). Pentru acești compuși valorile
absorbanţei au crescut de 4-10 ori la concentraţia de 54,54 µg/mL
faţă de valorile obţinute la concentraţia de 9,09 µg/mL.
În seria derivaţilor 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)
acrilamido]-tiazolidin-4-onă (5a-l) (fig. 8.8), cea mai mare creştere
a absorbanţei, dependent de concentrație (de la 9,09 µg/mL la 54,54
µg/mL) s-a înregistrat pentru compuşii 5c (R = 4-F, de la 0,1047 ±
0,0004 la 0,9487 ± 0,0006), 5h (R = 2-OH, de la 0,1052 ± 0,0008 la
0,9181 ± 0,0011), 5g (R = 2-OCH3, de la 0,1520 ± 0,0009 la 1,1615
± 0,0008), 5a (R = H, de la 0,1757 ± 0,0006 la 1,2742 ± 0,0012), 5k
(R = 2,3-diOH, de la 0,1772 ± 0,0006 la 1,1367 ±0,0011), 5b (R = 4-
Cl, de la 0,1493 ± 0,0004 la 0,9019 ± 0,0013), 5e (R = 2-NO2, de la
0,1793 ±0,0006 la 0,9917 ± 0,0017) şi 5l (R = 4-OH-3-OCH3, de la
0,2116 ± 0,0008 la 1.0699 ± 0,0003). Valorile absorbanţelor au
crescut de 4,3 – 9,4 ori la concentraţia de 54,54 µg/mL faţă de
valorile obţinute la concentraţia de 9,09 µg/mL.
Fig. 8.8. Capacitatea totală antioxidantă a derivaţilor 2-(R-fenil)-3-[3-(4-
hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-one (5a-l), la diferite
concentraţii.
28
8.1.2.4. Determinarea puterii reducătoare
Puterea reducătoare este invers proporţională cu valoarea CE50 şi
direct proporţională cu absorbanţa. Se apreciază că un compus are
activitare reducătoare intensă dacă valoarea CE50 este mai mică şi
valoarea absorbanţei mai mare.
Analiza rezultatelor, exprimate ca valori ale concentrației
eficiente 50 (CE50) a arătat faptul că modularea structurală a acidului
ferulic prin reacția de condensare a hidrazidei corespunzătoare cu
diferite aldehide aromatice a avut drept rezultat în marea majoritate a
cazurilor intensificarea puterii reducătoare a acidului ferulic (tabel
8.7). Cel mai puțin activ a fost derivatul rezultat în urma reacției de
condensare cu 4-brombenzaldehida (4c), evidențindu-se astfel
influența nefavorabilă a substituției nucleul aromatic cu brom in
poziția para.
Cei mai activi s-au dovedit compuşii 4h (R = 3-OH, CE50 =
0,1284 ± 0,01 mg/mL) și 4f (R = 4-NO2, CE50 = 0,1431 ± 0,01
mg/mL), compușii fiind de 1,5 ori (4h) și respectiv 1,3 ori mai activi
decât acidul ferulic (CE50 = 0,1898 ± 0,02 mg/mL). Activitate
apreciabilă au prezentat și compușii 4a (R = 4-F, CE50 = 0,1537 ±
0,04 mg/mL) şi 4d (R = 2-NO2, CE50 = 0,1539 ± 0,03 mg/mL), 4i (R
= 4-OH, CE50 = 0,1545 ± 0,04 mg/mL) și 4b (R = 4-Cl, CE50 =
0,1581 ± 0,03 mg/mL), aceștia fiind de aproximativ 1,2 ori mai
activi decât acidul ferulic.
Tabel 8.7. Valorile CE50 (mg/mL) pentru derivaţii N-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acriloil]-N-(R-benziliden)hidrazină (4a-k)
Compus R CE50 (mg/mL)* Compus R CE50 (mg/mL)
Acidul ferulic (AF) 0,1898 ± 0,02 4f -NO2(4) 0,1431 ± 0,01
4a -F(4) 0,1537 ± 0,04 4g -OH(2) 0,1834 ± 0,04
4b -Cl(4) 0,1581 ± 0,03 4h -OH(3) 0,1284 ± 0,01
4c -Br(4) 0,9310 ± 0,07 4i -OH(4) 0,1545 ± 0,04
4d -NO2(2) 0,1539 ± 0,03 4j -OCH3(2) 0,1631 ± 0,09
4e -NO2(3) 0,1685 ± 0,02 4k -H 0,1572 ± 0,02
Acid ascorbic 0,0517 ± 0,015
*valorile CE50 reprezintă media a trei determinări ± deviaţia standard.
Analiza rezultatelor exprimate ca valori ale concentrației
eficiente 50 (CE50) (tabel 8.8) a evidențiat faptul că cel mai activ
compus a s-o dovedit a fi cel rezultat în urma reacției de condensare
29
dintre hidrazida acidului ferulic cu acidul tioglicolic și 2,3-
dihidroxibenzaldehida; compusul corespunzător 5k (R = 2,3-OH,
CE50 = 0,0899 ± 0,001 mg/mL) dovedindu-se a fi de aproximativ
4,2 ori mai activ decât acidul ferulic (CE50 = 0,3812 ± 0,09 mg/mL).
Activitate semnificativă au demonstrat și derivații 5j (R = 4-
N(CH3)2, CE50 = 0,2571 ± 0,04 mg/mL), 5f (R = 4-NO2, CE50 =
0,2937 ± 0,02 mg/mL) și 5e (R = 2-NO2, CE50 = 0,3357 ± 0,09
mg/mL), compușii fiind de aproximativ 1,5 ori (5j), 1,3 ori (5f) și
respectiv 1,2 ori (5e) mai activi decât acidul ferulic.
Mai puțin activi s-au dovedit compușii 5l (R = 4-OH-3-OCH3,
CE50 = 0,37106 ± 0,65 mg/mL) şi 5a (R = H, CE50 = 0,3716 ± 0,3
mg/mL), activitatea lor fiind comparabilă cu cea a acidului ferulic
(CE50 = 0,3812 ± 0,09 mg/mL).
Tabel 8.8. Valorile CE50 (mg/mL) pentru derivaţii 2-(R-fenil)-3-[3-(4-
hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-one (5a-l) Compus R CE50 (mg/mL)* Compus R CE50 (mg/mL)
Acidul ferulic (AF) 0,3812 ± 0,09 5g -OCH3(2) 1,6725 ± 0,03
5a -H 0,3716 ± 0,03 5h -OH (2) 1,2106 ± 0,05
5b -Cl(4) 1,7269 ± 0,15 5i -Cl (2,6) 0,6923 ± 0,03
5c - F(4) 0,4228 ± 0,09 5j - N(CH3)2(4) 0,2571 ± 0,04
5d - Br(4) 1,823 ± 0,11 5k -OH(2,3) 0,0899 ± 0,001
5e - NO2(2) 0,3357 ± 0,09 5l -OH(4),OCH3(3) 0,37106 ± 0,05
5f - NO2(4) 0,2937 ± 0,02 Acid ascorbic 0,0516 ± 0,01
*valorile CE50 reprezintă media a trei determinări ± deviaţia standard.
8.2. Evaluarea potenţialului antiinflamator in vitro
8.2.2.1. Inhibarea denaturării albuminei serice
Procentul de inhibare a denaturării albuminei serice pentru
derivaţii de acid ferulic studiați, cu structură de hidrazonă (4a-k) şi
de tiazolidin-4-onă (5a-l), la diferite concentrații (100 g/mL, 200
g/mL, 500 g/mL) obținute din soluția stoc de concentraţia 10
mg/mL sunt reprezentate grafic în fig. 8.11 şi 8.12. Se consideră că
derivatul testat prezintă o capacitate de inhibare a denaturării mai
bună cu cât valoarea absorbanţei este mai mică, ceea ce înseamnă un
procent de inhibare mai mare.
Din analiza rezultatelor obţinute se observă cu pentru toți
derivații studiați, inhibarea denaturării albuminei serice bovină
crește cu concentrația, respectiv cel mai mare procent de inhibare a
fost obținut la concentrația de 500 g/mL în probă.
30
Pentru seria derivaților N-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-
N-(R-benziliden)hidrazină (4a-k) s-a observat că cei mai mulți dintre
derivați au prezentat la concentrația de 500 g/mL în probă, un efect
comparabil cu cel al diclofenacului, utilizat ca și martor pozitiv,
pentru care procentul de inhibare a denaturării albuminei serice
bovină a fost de 98,61 ± 0,001% (fig. 8.11).
Referitor la influența substituentului de pe nucleul aromatic
asupra efectului de inhibare a denaturării proteice s-a observat că cea
mai favorabilă influență este exercitată de substituția nucleului
aromatic cu fluor în poziia para și cu nitro și hidroxi în pozițiile
meta și para. Pentru acești compuși procentele de inhibiție au fost de
98,23 ± 0,002% (4a, R = -F(4)), 98,76 ± 0,0045% (4e, R = -NO2(3)),
98,38 ± 0,0012% (4f, R = -NO2(4)), 98,38 ± 0,0017% (4h, R = -
OH(3)) și 98,23 ± 0,0023% (4i, R = -OH(4).
Fig. 8.11. Activitatea de inhibare a denaturării albuminei serice bovină a
derivaţilor N-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-N-(R-
benziliden)hidrazină (4a-k), la diferite concentraţii.
În seria derivaților 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)
acrilamido]-tiazolidin-4-onă (5a-l), s-a observat că cea mai intensă
capacitate de inhibare a denaturării proteice a fost prezentată de
compușii 5f și 5h, obținuți în urma reacției de condensare dintre
hidrazida acidului ferulic, acidul tioglicolic și 2-nitrobenzaldehida,
respectiv 2-hidroxibenzaldehida, evidențiindu-se astfel importanța
substituției nucleului aromatic din structura tiazolidin-4-onei în
poziția orto (fig. 8.12).
La concentrația de 500 µg/mL procentul de inhibiție pentru
acești compuși a fost de 98,38 ± 0,012% (5f) respectiv 99 ± 0,017%
(5h), comparativ cu valoarea de 97,88 ± 0,001, înregistrată pentru
31
diclofenac. Un efect comparabil diclofenacului sodic a prezentat și
compuşii rezultaţi în urma ciclizării cu 4-nitrobenzaldehida (5e,
96,32 ± 0,0098%) şi 2-metoxibenzaldehida (5g, 96,76 ± 0,023%).
Fig. 8.12. Activitatea de inhibare a denaturării a albuminei serice
bovină a derivaţilor 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-
tiazolidin-4-onă (5a-l), la diferite concentraţii.
8.2.2.2. Testul de stabilitate a membranei eritrocitare
Din analiza rezultatelor obţinute se observă cu pentru toți
derivații studiați, stabilitatea membranei eritocitare crește cu
concentrația, respectiv cea mai mare stabilitate a fost obținută la
concentrația de 500 g/mL în probă.
Capacitatea de stabilizare a membranei eritrocitare, exprimată
procentual, pentru derivaţii de acid ferulic, cu structură de hidrazonă
(4a-k) şi de tiazolidin-4-onă (5a-l), testaţi la diferite concentrații
(100 g/mL, 200 g/mL, 500 g/mL), obținute din soluția stoc de
concentraţia 10 mg/mL sunt reprezentate grafic în fig. 8.13 şi 8.14.
În seria deivaților de N-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-N-
(R-benziliden) hidrazină (4a-k), cea mai favorabilă înfluență asupra
stabilității membranei eritrocitare a fost observată pentru derivatul
4k, obținut în urma reacției de condensare a hidrazidei acidului
ferulic cu benzaldehida. Pentru acest compus stabilitatea membranei
eritocitare, exprimată procentual a fost comparabilă cu cea a
diclofenacului la 200 g/mL și 500 g/mL (99,1308 ± 0,0794 vs
99,39873 ± 0,0950 respectiv 99,4063 ± 0,0125 vs 99,5623 ± 0,0451)
și chiar ușor mai accentuată la concentrația de 100 g/mL (96,4874
± 0,09609 vs 95,9794 ± 0,0289. Pentru ceilalți derivați, deși stabilitatea membranei eritrocitare a
fost mai redusă comparativ cu diclofenacul, ea rămâne la valori
32
apreciabile, respectiv mai mare de 90% la toate concentrațiile testate
și net superioară acidului ferulic (AF), în special la concentrația de
200 g/mL și 500 g/mL.
Fig. 8.13. Procentul de stabilitate a membranei eritrocitare a derivaţilor de
N-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-N-(R-benziliden)hidrazină (4a-k), la
diferite concentraţii.
În seria derivaților 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)
acrilamido]-tiazolidin-4-onă (5a-l) (fig. 8.14) s-a observat că pentru
majoritatea derivaților studiați stabilitatea membranei eritocitate a
fost comparabilă sau mai intensă decât a diclofenacului și net
superioară acidului ferulic (AF), la toate cele trei concentrații testate
100 g/mL, 200 g/mL și 500 g/mL.
Fig. 8.14. Procentul de stabilitate al membranei eritrocitare a
derivaţilor 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-
4-onă (5a-l), la diferite concentraţii.
La concentrația de 100 g/mL și 200 g/mL, cu excepția
compușilor 5l (R = 4-OH, 3-OCH3), 5i (R = 2,6-diCl), 5h (R = 2-
OH) și 5e (R = 4-NO2), toți ceilalți compuși au prezentat o stabilitate
mai mare decât a diclofenacului (95,9794 ± 0,02886 la 100 g/mL
33
respectiv 99,3987 ± 0,0950 la 200 g/mL) și decât acidul ferulic
(93,1372 ± 0,0116 la 100 g/mL respectiv 93,4981 ± 0,0091 la 200
g/mL).
La concentrația de 500 g/mL toți compușii studiați, derivați de
tiazolidin-4-onă au prezentat o stabilitate a membranei eritrocitare
mai mare decât a diclofenacului (99,5623 ± 0,0451) și respectiv
decât acidului ferulic (95,2087 ± 0,0578).
8.3. Screening toxicologic. Determinarea toxicităţii acute in vivo
Stabilirea DL50 evidenţiază profilul toxicologic al substanţei
administrate, fiind invers proporţională cu toxicitatea ei. Cu cât
valoarea DL50 este mai mică cu atât compusul testat este mai toxic.
Valorile DL50 pentru derivaţii 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-onă sunt prezentate în tabelul
8.3.
Tabel 8.3. Valorile dozei letale 50 (DL50 în mg/kg corp) calculate pentru
compuşii 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-
onă (5a-l) comparativ cu acidul ferulic
Compus R DL50
(mg/kg corp) Compus R
DL50
(mg/kg corp)
5a -H 987,5 5g -OCH3(2) 1350
5b -Cl(4) 1590 5h -OH(2) 1250
5c -F(4) 4812,5 5i -Cl(2,6) 1550
5d -Br(4) 1490 5j -N(CH3)2(4) 1750
5f -NO2(2) 5000 5l -OH(4),OCH3(3) 925
Acid ferulic 2875
Din analiza rezultatelor obținute, prezentate în tabelul 8.2. se
poate aprecia că toți derivații studiați, pot fi incadrați în categoria
substanbțelor cu toxicitate moderată, având valori ale DL50 cuprinse
în intervalul 500-5000 mg/kg corp.
8.4. Evaluarea potenţialului antiinflamator in vivo
Pe baza rezultatelor obținute la evaluarea efectului antiinflamator
prin metode in vitro și la evaluarea gradului de toxicitate, în
continuarea studiilor, derivaţii 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-onă (5a-l), obţinuţi prin
modularea structurală a acidului ferulic, au fost incluşi într-un
34
screening farmacologic ce a urmărit determinarea efectului
antiinflamator in vivo:
pe model de inflamație acută indusă cu carrageenan la şobolan;
pe model de inflamație cronică, indusă la şobolan - testul
granulomului.
8.4.2.1. Efect antiinflamator pe model de inflamație acută În studiul intreprins derivaţii 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-onă (5a-l) au fost testaţi la o
doză de 1/10 din DL50, rezultatele obţinute fiind analizate în
comparație cu diclofenacul sodic și indometacinul, utilizate ca şi
substanţe de referinţă.
În Fig. 8.17 sunt reprezentate grafic rezultatele obținute,
respectiv volumul edemului inflamator acut indus la nivelul labei de
șobolan, la diferite intervale de timp (2 ore, 4 ore, 6 ore, 24 ore), atât
pentru loturile tratate cu compuşii studiați (5a-l) şi cu pentru loturile
tratate cu acid ferulic, diclofenac sodic, indometacin şi pentru
control (tratat cu tween 80). Se apreciază că cu cât volumul
edemului inflamator acut este mai mic cu atât compusul studiat are
un efect antiinflamator mai mare.
Fig. 8.17. Variaţia volumului edemului inflamator al labei de șobolan, la
loturile tratate cu derivaţii 5a-l, acid ferulic, diclofenac sodic, indometacin şi
lotul control, la 2 ore, 4 ore, 6 ore şi 24 ore.
Din analiza rezultatelor obținute se constată că pentru toți
compușii studiați efectul antiinflamator maxim, respectiv reducerea
volumului edemului labei de șobolan, s-a înregistrat la 24 de ore de
35
la administrare, similar diclofenacului și indometacinului, două
medicamente antiinflamator consacrate. Astfel se poate aprecia că
derivații sintetizați pot fi înacadrați, din punct de vedere
farmacocinetic, în categoria compușilor cu acțiune de lungă durată.
Cele mai bune rezultate au fost obținute în cazul derivaților 5h
(R = 2-OH) și 5g (2-OCH3), efectul acestor compuși fiind mai intens
decât al diclofenacului și indometacinului. Un efect antiinflamator
comparabil substanțelor de referință a fost înregistrat și pentru
compușii 5j (4-N(CH3)2) și 5l (4-OH-3-OCH3).
Aceste afirmații sunt susținute de valorile procentelor de inhibiție
a edemului inflamator acut, înregistrate pentru compușii studiați (5a-
l), calculate în raport cu valoarea lotului control, rezultate care sunt
prezentate în tabelul 8.6.
Tabel 8.6. Efectul antiinflamator (% inhibiţie edem inflamator) al
compuşilor testaţi (5a-l, L1-10) comparativ cu acidul ferulic (L11),
diclofenacul sodic (L12) şi indometacinul (L13) la diferite intervale de timp
Lot/compus % inhibiţie edem inflamator
2h 4h 6h 24h
L1/5a 18,98 ± 2,6 17,85 ± 5,14 20,03 ± 2,45 87,17 ± 6,33
L2/5b 34,17 ± 4,87 27,38 ± 3,06 22,35 ± 2,26 73,07 ± 5,86
L3/5c 31,64 ± 6,49 30,35 ± 4,28 32,94 ± 3,01 73,07 ± 4,87
L4/5d 48,10 ± 5,04 34,52 ± 7,95 57,64 ± 4,07 47,43 ± 6,21
L5/5f 56,96 ± 5,35 38,09 ± 9,82 22,35 ± 4,81 76,92 ± 2,56
L6/5g 34,68 ± 2,94 31,42 ± 3,21 32,23 ± 2,77 95,38 ± 8,70
L7/5h 55,69 ± 2,21 32,14 ± 1,61 47,05 ± 2,16 97,43 ± 7,09
L8/5i 56,32 ± 2,31 50,01 ± 8,44 50,58 ± 5,61 78,84 ± 4,33
L9/5j 53,16 ± 4,09 46,42 ± 3,10 57,64 ± 3,79 94,87 ± 6,61
L10/5l 27,84 ± 8,54 2,38 ± 1,98 23,52 ± 5,50 91,02 ± 9,12
L11/Acid ferulic 51,89 ± 2,20 47,61 ± 2,41 76,51 ± 9,27 92,30 ± 8,25
L12/Diclofenac
sodic
54,43 ± 3,48 53,57 ± 2,43 43,52 ± 2,25 94,87 ±11,61
L13/Indometacin 73,41 ± 2,70 64,28 ± 1,81 75,29 ± 2,15 96,15 ±11,10
8.4.2.2. Efect antiinflamator pe model de inflamație cronică
Referitor la efectul compușilor testați asupra formării țesutului de
granulație, corelat cu greutatea peletelor uscate, s-a observat că toți
compușii studiați au redus formarea țesutului de granulație
comparativ cu lotul martor (tratat cu tween 80); pentru unii dintre ei
efectul fiind comparabil cu cel al diclofenacului sodic și al
indometacinului (tabel 8.9, 8.10).
36
Cel mai important efect de inhibare a formării țesutului de
granulație și în consecință cel mai important efect antiinflamator, a
fost înregistrat pentru compusul 5f (R = 2-NO2). Acest compus a
inhibat formarea țesutului de granulație în proporție de 79,85%,
efectul fiind comparabil cu cel al diclofenacului (89,49%) și al
indometacinului (81,25%). Un efect apreciabil au prezentat și
compușii 5c (R = 4-F), 5l (R = 4-OH,3-OCH3) și 5d (R = 4-Br).
Acești compuși au inhibat procesul de proliferare celulară și
respectiv formarea țesutului de granulație, în procent de 71,05%
(5c), 73,35% (5l) și respectiv 74,49% (5d). În condiții experimentale
similare acidul ferulic a prezentat un apreciabil efect antiinflamator,
inhibând procesul de formare a țesutului de granulație în procent de
77,94%, efectul fiind comparabil cu cel al indometacinului.
Tabelul 8.10. Efectul compuşilor 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-onă (5a-l) asupra procesului
proloferativ (formarea țesutului de granulație) din edemul inflamator cronic,
indus la şobolani
8.5. Evaluarea unor parametri biochimici şi hematologici pe
model de inflamaţie cronică
Compușii incluși în studiul efectului antiinflamator pe model de
inflamație cronică, respectiv compuşii 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-
metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-onă (5a-l) au fost studiaţi în
continuare privind efectul asupra următorilor parametri:
Comp
us
R Doza administrată
(mg/kg corp/zi)
Medie greutate
pelete uscate (mg)
%
Inhibiție
5a -H 98,75 0,617 21,31
5b -Cl(4) 159,00 0,768 2,05
5c -F(4) 481,25 0,227 71,05
5d -Br(4) 149,00 0,200 74,49
5f -NO2(2) 500,00 0,158 79,85
5g -OCH3(2) 135,00 0,528 32,66
5h -OH(2) 125,00 0,463 40,95
5i -Cl(2,6) 155,00 0,563 28,19
5j -N(CH3)2(4) 175,00 0,698 10,97
5l -OH(4)OCH3(3) 92,50 0,209 73,35
Acid ferulic 287,50 0,173 77,94
Diclofenac sodic 5,00 0,153 89,49
Indometacin 1,50 0,147 81,25
Tween 80 0,5 mL/100 g 0,784 -
37
hematologici – hemoleucograma;
biochimici – alanin-aminotransferaza (ALT), aspartatamino-
transferaza (AST), bilirubină totală, bilirubină directă,
lactatdehidrogenază (LDH), uree, creatinină, acid uric, colesterol
total, LDL colesterol, HDL colesterol, trigliceride.
Parametri biochimici de evaluare a funcţiei hepatice
Rezultatele obţinute în acest studiu, sunt prezentate în tabelul
8.19, 8.20, 8.21 și 8.22.
Din analiza rezultatelor obţinute se poate constata că enzimele
hepatice (AST, ALT, LDH) au înregistrat valori crescute pentru lotul
cu inflamație cronică indusă prin testul granulomului (lot 14),
comparativ cu lotul sănătos (lot 15), cea ce denotă influența negativă
a fenomenului inflamator asupra funcției hepatice. Valorile
înregistrate pentru lotul 14 au fost de 269,5 UI/L (AST), 51 UI/L
(ALT) și 1364 UI/L (LDH) comparativ cu valorile de 100 UI/L
(AST), 46,15 UI/L (ALT) și 400,6 UI/L (LDH) înregistrate pentru
lotul control sănătos.
Cea mai redusă afectare hepatică a fost înregistrată pentru lotul 2,
tratat cu compusul 5b (2-(4-clorofenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxi-
fenil)acrilamido]-tiazolidin-4-ona). În acest caz valorile
concentrației enzimelor hepatice au fost apropiate celor înregistrate
pentru antiinflamatoarele de referință utilizate în studiu (diclofenac
sodic și indometacin) și comparabile cu valorile înregistrate pentru
lotul martor sănătos.
Referitor la concentrația enzimei ALT, considerată cel mai
relevant indicator al funcționării normale a funcției hepatice
(indicator de citoliză hepatică) s-a constatat că cei mai puțin toxici la
nivel hepatic au fost compusii 5b (R = 4-Cl, lot 2) și 5l (R = 4-OH,3-
OCH3, lot 12), ceea ce susține influența favorabilă a substituției
nucleului aromatic din poziția 2 a ciclului de tiazolidin-4-onă cu
substituenții clor în poziția 4 și hidroxi și metoxi în pozițiile 4 și 3.
Pentru acești compuși valoarea enzimei ALT a fost de 50,5 UI/L
(5b) și respectiv 40 UI/l (5l), valori comparabile cu cele înregistrate
pentru diclofenac sodic (49 UI/L), indometacin (51 UI/L) și lot
control sănătos (46,15 UI/L).
Cu excepția compusului 5b (lot 2, LDH = 617 UI/L,), pentru toți
ceilalți derivați studiați valoarea enzimei LDL a fost mai mare
comparativ cu lotul control sănătos (lot 15, LDL = 400 UI/L) și
38
loturile tratate cu diclofenac sodic (LDL = 1116 UI/L) și
indometacin (LDL = 908,5 UI/L).
Tabel 8.19. Valorile parametrilor funcţiei hepatice la şobolanii din loturile 1
(5a), 2 (5b), 3 (5c) şi 4 (5d) Parametru
biochimic
Lot/Compus
Lot 1/5a Lot 2/5b Lot 3/5c Lot 4/5d
AST (UI/L) 244 ± 0,28 124,5 ± 1,90 272,5 ± 0,63 212,5 ±1,48
ALT (UI/L) 58 ± 0,56 50,5 ± 0,63 96,5 ± 1,06 70,5 ±0,35
LDH (UI/L) 2734,5 ± 0,34 617 ± 3,52 3778 ± 0,25 1826,5 ± 2,92
Bilirubina totală (mg/dL) 0,11 ± 0,014 0,135 ± 0,01 0,115 ± 0,01 0,105 ± 0,01
Bilirubina directă (mg/dL) 0,045 ± 0,007 0,025 ± 0,02 0,035 ±0,01 0,045 ± 0,01
Tabel 8.20. Valorile parametrilor funcţiei hepatice la şobolanii din loturile 5
(5f), 6 (5g), 7 (5h) şi 8 (5i)
Parametru biochimic Lot/Compus
Lot 5/5f Lot 6/5g Lot 7/6h Lot 8/5i
AST (UI/L) 545 ± 7.70 185,5 ± 5,72 211 ± 0,28 207,5 ± 1,62
ALT (UI/L) 130,5 ± 5,86 52,5 ± 1,20 56 ± 0,84 67,5 ± 0,07
LDH (UI/L) 1181 ± 7,72 1866,5 ± 9,76 2450,5 ± 0,71 2046,5 ± 0,71
Bilirubina totală (mg/dL) 0,13 ± 0,09 0,105 ± 0,01 0,085 ± 0,01 0,095 ± 0,02
Bilirubina directă (mg/dL) 0,045 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,006 ± 0,03 0,003 ± 0,01
Tabel 8.21. Valorile parametrilor funcţiei hepatice la şobolanii din loturile 9
(5j), 10 (5l), 11 (AF – acid ferulic) şi 12 (Diclofenac sodic).
Parametru biochimic
Lot/Compus
Lot 9/5j Lot 10/5l Lot 11/AF Lot 12
/Diclofenac
AST (UI/L) 256,5 ± 0,21 177,5 ± 0,07 198,5 ± 2,47 133,5 ± 2,61
ALT (UI/L) 69,5 ± 0,07 40 ± 0,28 65,5 ± 1,48 49 ± 0,56
LDH (UI/L) 2555 ± 4,52 1824,5 ± 0,16 2020 ± 5,68 1116 ± 6,15
Bilirubina totală (mg/dL) 0,075 ± 0,03 0,095 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,115 ± 0,02
Bilirubina directă (mg/dL) 0,055 ± 0,02 0,035 ± 0,01 0,055 ± 0,02 0,035 ± 0,01
Tabel 8.22. Valorile parametrilor funcţiei hepatice la şobolanii din loturile13
(Indometacin), 14 (C1inflamație,Tween 80) şi 15 (C2sănătos,Tween 80)
Parametru biochimic
Lot/Compus
Lot 13/
Indometacin
Lot 14inflamație
/tween 80
Lot 15sănătos/
tween 80
AST (UI/L) 124,5 ± 0,35 269,5 ± 1,62 100 ± 1,08
ALT (UI/L) 59,5 ± 1,90 51 ± 1,41 46,15 ± 1,33
LDH (UI/L) 908,5 ± 4,16 1364 ± 4,78 400 ± 0,83
Bilirubina totală (mg/dL) 0,175 ± 0,05 0,115 ± 0,04 0,085 ± 0,04
Bilirubina directă (mg/dL)
0,045 ± 0,01 0,042 ± 0,01 0,03 ± 0,02
39
CAPITOLUL 9
CONCLUZII GENERALE
Cercetările realizate în cadrul lucrării de doctorat aduc contribuţii
originale în domeniul derivaţilor de acid aril-acrilic. Reprezentanții
acestei clase de compuși, printre care acidul ferulic ocupă un loc
deosebit, sunt cunoscuți în primul rând pentru importante efecte
antioxidante.
Odată cu descoperirea implicării stresului oxidativ în patologia
multor afecțiuni printre care se numără bolile autoimune, afecțiunile
neoplazice, inflamaţia, bolile neurodegenerative etc., interesul
pentru dezvoltarea de noi compuși cu potențial antioxidant a crescut
considerabil.
1. Modulări structurale ce au vizat gruparea carboxil liberă, din
structura acidului 3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)acrilic (acidul ferulic),
au condus la obţinerea a 2 compuşi intermediari şi a două noi serii
de compuși finali, derivaţi de acid ferulic cu structură de hidrazonă
(11 compuşi finali) şi derivaţi de acid ferulic cu structură de
tiazolidin-4-onă (12 compuşi finali).
2. Compuşii intermediari şi finali au fost caracterizaţi din punct
de vedere fizico-chimic determinându-se formula moleculară, masa
relativă, temperatura de topire, solubilitatea în apă şi în diferiţi
solvenţi organici şi randamentul de reacţie.
3. Structura derivaţilor de acid ferulic, intermediari şi finali, a
fost confirmată prin metode spectrale – spectrometrie în infraroşu
(IR) și spectrometrie de rezonanță magnetică nucleară de protoni
(1H-RMN), identificându-se toate elementele structurale
caracteristice compuşilor.
4. Potenţialul antioxidant al celor două serii de compuşi
(hirazone şi tiazolidin-4-one) a fost evaluat prin patru metode in
vitro, care au urmărit determinarea efectului antiradicalic faţă de
radicalii DPPH şi ABTS·+, a capacităţii totale antioxidante şi a
puterii reducătoare.
40
Derivaţii cu structură de hidrazonă şi cei cu structură de
tiazolidin-4-onă studiaţi au arătat un efect antioxidant mai intens
decât structura de bază (acidul ferulic); pentru unii dintre derivați
activitatea fiind comparabilă cu cea a martorului pozitiv, acidul
ascorbic.
În seria derivaţilor N-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acriloil]-N-(R-
benziliden)hidrazină (4a-k), cel mai intens efect antiradicalic s-a
observat pentru compusul rezultat în urma reacției de condensare cu
benzaldehida (4k). Un efect antiradicalic pronunțat a fost observat și
în cazul derivaților 4g (R = 2-OH), 4i (R = 4-OH) și 4f (R= 4-NO2),
evidențiindu-se astfel influența favorabilă a substituției nucleului
aromatic din structura hidrazonelor cu -OH (în pozițiile orto și para)
și -NO2 (în poziția para).
În cazul derivaților 2-(R-fenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)
acrilamido]-tiazolidin-4-onă (5a-l), cei mai activi s-au dovedit
compușii obținuți în urma reacției de condensare dintre hidrazida
acidului ferulic, acidul tioglicolic și 2,3-dihidroxibenzaldehida (5k)
și respectiv 2-hidroxi-3-metoxi-benzaldehida (5l). Aceste rezultate
susțin influență favorabilă exercitată de radicalii R = 2,3-diOH și 4-
OH,3-OCH3 asupra efectului antioxidant al acidului ferulic.
Totodată s-a constatat faptul că derivații de tiazolidin-4-onă sunt
mai activi decât derivații de hidrazonă, ceea ce susține influența
favorabilă a ciclului de tiazolidin-4-onă asupra intensificării
efectelor antioxidante ale acidului ferulic.
5. Rezultatele obţinute în cadrul determinării toxicităţii acute,
prin stabilirea dozei letale 50 (DL50) susţin încadrarea derivaţilor de
tiazolidin-4-onă în seria compuşilor cu toxicitate moderată. Gradul
de toxicitate este influențat de natura substituentului de pe nucleul
aromatic din structura de tiazolidin-4-onă, cea mai favorabilă
influență din acest punct de vedere exercitând-o
substituția cu fluor în poziția para (compus 5c) și cu nitro în poziția
orto (compus 5f).
6. Potenţialul antiinflamator al derivaţilor de acid ferulic a fost
evaluat prin metode in vitro și în vivo.
Studiul efectului antiinflamator in vitro a urmărit influența
derivaților de acid ferulic cu
structură de hidrazonă (4a-k) şi tiazolidin-4-onă (5a-l) asupra
inhibării denaturării albuminei serice bovină şi asupra stabilității
41
membranei eritrocitare. Similar rezultatelor obținute în studiul de
evaluare a efectului antioxidant, și în acest caz s-a observat că
derivaţii de tiazolidin-4-onă (5a-l) au avut un efect mai favorabil
decât derivaţii de hidrazonă (4a-k) atât asupra inhibării denaturării
proteice cât și asupra stabilității membranei eritrocitare.
Având în vedere rezultatele studiului in vitro, derivații de acid
ferulic cu structură de tiazolidin-4-onă (5a-l), au fost evaluați in
vivo pe două modele de inflamație indusă la șobolan: inflamație
acută indusă cu carrageenan și inflamație cronică indusă prin testul
granulomului.
Pe model de inflamație acută, toți compușii studiați au prezentat
un efectul antiinflamator maxim, la 24 de ore de la administrare,
ceea ce sugerează faptul că pot fi încadrați, din punct de vedere
farmacocinetic, în categoria compușilor cu acțiune de lungă durată.
Cel mai activ compus din serie s-a dovedit a fi compusul 2-(2-
hidroxifenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-
onă (5h), rezultat în urma reacției de condensare dintre hidrazida
acidului ferulic, acidul tioglicolic și 2-hidroxibenzaldehida. La 24 de
ore de la administrare efectul compusului a fost ușor mai intens
decât al diclofenacului sodic și al indometacinului, utilizate ca și
substanțe de referință.
În cazul modelului de inflamație cronică s-a observat că derivații
studiați (5a-l), similar substanțelor de referintă (diclofenac sodic,
indometacin), au avut un efect mai intens de inhibare a componentei
proliferative, respectiv de formare a țesutului de granulație, decât
asupra componentei transudative a inflamației cronice. Cel mai
important efect de inhibare a procesului
proliferativ a fost înregistrat pentru compusul 5f (2-(2-nitrofenil)-3-
[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-tiazolidin-4-onă), efectul
fiind comparabil cu cel al diclofenacului și al indometacinului.
7. Studiul efectului antiinflamator al derivaților de tiazolidin-
4-onă (5a-l) pe model de inflamație cronică a fost completat de un
studiu biochimic și hematologic ce a urmărit efectul compușilor
asupra funcției hepatice și renale și respectiv asupra
hemoleucogramei.
Funcția hepatică a fost evaluată prin determinarea
spectofotometrică a activităţii enzimelor hepatice: alaninamino-
trasferaza (ALT), aspartataminotransferaza (AST) şi lactatdehidro-
42
genaza (LDH) și prin determinarea concentrației bilirubinei totale şi
a bilirubinei directe. Cel mai puțin toxic s-a dovedit a fi compusul
5b (2-(4-clorofenil)-3-[3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamido]-tiazo-
lidin-4-ona), pentru care valoarea enzimelor ALT, AST și LDH a
fost comparabilă cu lotul control sănătos și cu valorile înregistrate
pentru diclofenac sodic și indometacin. Totodată compușii studiați
au prezentat valori ale bilibubinei totale și directe comparabile cu
valorile înregistrate pentru lotul control sănătos, diclofenac sodic și
indomretacin ceea ce sugerează un profil toxicologic similar acestor
antiinflamatoare clasice.
Funcția renală, evaluată prin intermediul parametrilor biochimici
– creatiniă, uree, acid uric, nu a fost grav afectată de administrarea
compușilor studiați, valorile parametrilor respectivi, în marea
majoritate a cazurilor, fiind comparabile cu valorile înregistrate
pentru lotul control sănătos și pentru diclofenac sodic și
indometacin.
Evaluarea profilului lipidic realizat prin intermediul parametrilor:
colesterol total, LDL-colesterol, HDL-colesterol a evidențiat pentru
compușii studiați un profil de afectare a metabolismului lipidic
similar diclofenacului sodic și indometacinului.
Valorile parametrilor hematologici - leucocite, eritrocite,
hemoglobină, hematocrit, volum eritrocitar mediu, hemoglobină
eritrocitară medie, concentraţia medie de hemoglobină, s-au încadrat
în limite normale, neexistând diferențe semnificative față de lotul
control sănătos. În ceea ce priveste numărul de plachete (trombocite)
s-a observat o creștere față de valorile înregistrate pentru lotul
contrul, ceea ce era însă de așteptat ținând sema de faptul că
experimentul a fost realizat pe model de inflamție cronică, care,
după cum se cunoaște, se corelează cu o creștere a numărului de
plachete sanguine.
8. Prin originalitatea structurilor compușilor sintetizați,
caracterizarea fizico-chimică, spectrală și biologică a acestora se
poate afirma că au fost aduse contribuții importante în domeniul
compușilor heterociclici cu potențială aplicație în tratamentul
afecțiunilor inflamatorii dar și a altor afecțiuni unde inflamația și
stresul oxidativ joacă un rol important (boli neurodegenerative,
afecțiuni neoplazice, etc).
43
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Graf E, Antioxidant potential of ferulic acid. Free Radical
Biology and Medicine 1992; 13:435-448.
2. Clifford MN. Chlorogenic acids and other cinnamates – Nature,
occurrence and dietary burden. Journal of the Science of Food
and Agriculture 1999; 79:362-372.
3. Mattila P, Pihlava JM, Hellstrom J. Contents of phenolic acids,
alkyl-and alkenylresorcinols, and avenanthramides in
commercial grain products. Journal of Agricultural and Food
Chemistry 2005; 53:8290-8295.
4. Nishizawa C, Ohta T, Egashira Y, Sanada H. Ferulic acid
contents in typical cereals (in Japanese with abstract in English).
Nippon Shokuhin Kaga 1998; 45:499-503.
5. Sakakibara H, Honda Y, Nakagawa S, Ashida H, Kanazawa K.
Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables,
fruit and teas. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003;
51:571-581.
6. Sirinivasan M, Sudheer AR, Pillai KR, Kumar PR, Sudhakaran
PR, Menon VP. Influence of ferulic acid on gamma-radiation
induced DNA damage, lipid peroxidation and antioxidant status
in primary culture of isolated rat hepatocytes. Toxicology 2006;
228:249-258.
7. Itagaki S, Kobayashi Y, Otsuka Y, Kubo S, Kobayashi M,
Hirano T et al. Food-drug interaction between ferulic acid and
nateglinide involving the fluorescein/H+ cotransport system.
Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005; 53:2499-2502.
8. Rondini L, Peyrat-Maillard MN, Marsset-Baglieri A, Berset C.
Sulfated ferulic acid is the main in vivo metabolite found after
short-term ingestion of free ferulic acid in rats. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 2002; 50:3037-3041.
9. Barone E, Calabrese V, Mancuso C. Ferulic acid and its
therapeutic potential as a hormetin for age-related diseases.
Biogerontology 2009; 10:97-108.
10. Fetoni AR, Mancuso C, Eramo SL, Ralli M, Piacentini R,
Barone E, Paludetti G, Troiani D. In vivo protective effect of
ferulic acid against noise-induced hearing loss in the guinea-pig.
Neuroscience 2010; 169:1575-1588.
44
11. Trombino S, Cassano R, Ferrarelli T, Barone E, Picci N,
Mancuso C. Trans-ferulic acid-based solid lipid nanoparticles
and their antioxidant effect in rat brain microsomes. Colloids
Surf, B: Biointerf. 2013; 109:273-279.
12. Cassano R, Trombino S, Cilea A, Ferrarelli T, Muzzalupo R,
Picci N. I-lysine pro-prodrug containing trans-ferulic acid for 5-
amino salicylic acid colon delivery: synthesis, caracterization
and in vitro antioxidant activity evaluation. Chem. Pharm. Bull.
(Tokyo) 2010; 58:103-105.
13. Picone P, Bondi ML, Montana G, Bruno A, Pitarresi G,
Giammona G, Di Carlo M. Ferulic acid inhibits oxidative stress
and cell death induced by Ab oligomers: improved delivery by
solid lipid nanoparticles. Free Radic. Res. 2009; 43:1133-1145.
14. Trombino S, Cassano R, Muzzalupo R, Pingitore A, Cione E,
Picci N. Stearyl ferulate-based solid lipid nanoparticles for the
encapsulation and stabilization of beta-carotene and alpha-
tocopherol. Colloids Surf. B: Biointerf. 2009; 72:181-187.
15. Ballard C, Gauthier S, Corbett A, Brayne C, Aarsland D, Jones
E. Alzheimers disease. Lancet 2011; 377:1019-1031.
16. Keeney JT, Swomley AM, Harris JL, Fiorini A, Mitov MI,
Perluigi M, Sultana R, Butterfield DA. Cell cycle proteins in
brain in mild cognitive impairment: insights into progression to
Alzheimer disease. Neurotox. Res. 2012; 22:220-230.
17. Ferrer I. Altered mitochondria, energy metabolism, voltage-
dependent anion channel, and lipid rats converge to exhaust
neurons in Alzheimer’s disease. J. Bioenerg.Biomembr. 2009;
41:425-431.
18. Grothe M, Zaborszky L, Atienza M, Gil-Neciga E, Rodriguez-
Romero R, Teipel SJ, Amunts K, Suarez-Gonzalez A, Cantero
JL. Reduction of basal forebrain cholinergic system parallels
cognitive impairment in patients at high risk of developing
Alzheimer’s disease. Cereb. Cortex. 2010; 20:1685-1695.
19. Jin Y, Yan EZ, Li XM, Fan Y, Zhao YJ, Liu Z, Liu WZ.
Neuroprotective effect of sodium ferulate and signal transduction
mechanism in the aged rat hippocampus. Acta Pharmacol. Sin.
2008; 29:1399-1408.
20. Janicke B, Hegardt C, Krogh M, Onning G, Akesson B,
Cirenajwis HM, Oredsson SM. The antiproliferative effect of
dietary fiber phenolic compounds ferulic acid and p-coumaric
45
acid on the cell cycle of Caco-2 cells. Nutr. Cancer 2011;
63:611-622.
21. Adluri RS, Nagarajan D, Periyaswamy V, Venugopal PM. Dose-
response effect of ferulic acid against nicotine-induced tissue
damange and altered lipid levels in experimental rats: a
pathohistological evaluation. Clin. Pharmacol. 2008; 22:557-567.
22. Hemaiswarya S, Doble M. Combination of phenylpropanoids
with 5-fluorouracil as anti-cancer agents against human cervical
cancer (HeLa) cell line. Phytomedicine 2013; 20:151-158.
23. Karthikeyan S, Kanimozhi G, Prasad NR, Mahalakshmi R.
Radiosensitizing effect of ferulic acid on human cervical
carcinoma cells in vitro. Toxicol. In Vitro 2011; 25:1366-1375.
24. Bandugula VR, Prasad NR. 2-Deoxy-d-glucose and ferulic acid
modulates radiation response signaling in non-small cell lung
cancer cells. Tumour Biol. 2013; 34:251-259.
25. Ramar M, Manikandan B, Raman T, Priyadarsini A, Palanisamy
S, Velayudam M, Munusamy A, Marimuthu Prabhu N,
Vaseeharan B. Protective effects of ferulic acid and resveratrol
against alloxan-induced diabetes in mice. Eur. J. Pharmacol.
2012; 690:226-235.
26. Roy S, Metya SK, Sannigrahi S, Raharnan N, Ahmed F.
Treatment with ferulic acid to rats with streptozotocin-induced
diabets: effects on oxidative stress, pro-inflammatory cytokines
and apoptosis in the pancreatic β cell. Endocrine 2013; 44:369-
379.
27. Reed TT. Lipid peroxidation and neurodegenerative disease. Free
Radic. Biol. Med. 2011; 51:1302-1319.
28. Shomoto-Nagi M, Maruyama W, Hashizume Y, Yoshida M. In
parkinsonian substantia nigra, alpha-synuclein is modified by
acrolein, a lipid-peroxidation product and accumulates in the
dopamine neurons with inhibition of proteasome activity. J.
Neural. Trans. 2007; 114:1559-1567.
29. Gustaw-Rothenberg K, Lowalczuk K, Stryjecka-Zimmer M.
Lipids peroxidation markers in Alzheimers disease and vascular
dementia. Geriatr. Gerontol Int. 2010; 10:161-166.
30. Solfrizzi V, Panza F, Frisardi V, Seripa D. Diet and Alzheimers
disease risk factors for prevention: the current evidence. Expert
Rev. Neurother. 2011; 11: 677-708.
46
31. Hu N, Yu JT, Tan L, Wang YL. Nutrition and the risk of
Alzheimers disease. Biomed. Res. Int. 2013; 2013:524820.
32. Čačić M, Molnar M, Šarkanj B, Has-Schön E, Rajković V.
Synthesis and Antioxidant Activity of Some New Coumarinyl-
1,3-Thiazolidine-4-Ones. Molecules 2010; 15(10):6795-6809.
33. Tripathi AC, Gupta SJ, Fatima GN, Sonar PK, Verma A, Saraf
SK. 4-Thiazolidinones: The Advances Continue... Eur J Med
Chem 2014; 72:52-77.
34. Abhinit M, Ghodke M, Pratima NA. Exploring potential of 4-
thiazolidinone: A Brief Review. Int J Pharm Sci 2009; 1(1):47-
64.
35. Nikalje APG, Khan FK, Ghodke M. Design and Synthesis of 2-
(1, 3-Dioxoisoindolin-2-Yl)-N-(4-Oxo-2-Substitutedthiazolidin-
3-Yl) Acetamide Derivatives as Potential Anticonvulsant Agents.
European Journal of Medicinal Chemistry 2011; 46(11):5448-
5455.
36. Senthilraja M, Alagarsamy V. Synthesis and Pharmacological
Investigation of 2-(4-Dimethylaminophenyl)-3,5-Disubstituted
Thiazolidin-4-Ones as Anticonvulsants. Archiv der Pharmazie
2012; 345(10):827-833.
37. De P, Baltas M, Lamoral-Theys, Bruère C, Kiss R, Bedos-Belval
F, Saffon N. Synthesis and anticancer activity evaluation of 2(4-
alkoxyphenyl)cyclopropyl hydrazides and triazolo phthalazines.
Bioorganic and Medicinal Chemistry 2010; 18:2537-2548.
38. Al-Mousawi S, Moustafa MS, Elnagdi MH. On the reaction of
phenacylmalononitrile with hydrazines: a new route to
pyrazolo[3,4-c]pyridazine, isoxazolo[5,4-c]pyridazine and
pyrimid[4,5-c]pyridazine. Journal of Saudi Chemical Society
2011; 15:309-312.
39. Suthar SK, Jaiswal V, Lohan S, Bansal S, Chaudhary A, Tiwari
A, Alex AT, Joesph A. Novel quinolone substituted thiazolidin-
4-ones as anti-inflammatory, anticancer agents: Design, synthesis
and biological screening. Eur J of Med Chem. 2013; 63:589-602.
40. Murugesan V, Makwana N, Suryawanshi R, Saxena R, Tripathi
R, Paranjape R, Kulkarni S, Katti SB. Rational design and
synthesis of novel thiazolidin-4-ones as non-nucleoside HIV-1
reverse transcriptase inhibitors. Bioorg and Med Chem 2014;
22:3159-3170.
47
41. Costea T, Vlase L, Istudor V, Popescu M-L, Gârg C-E, Research
upon indigenous herbal products for therapeutic valorification in
metabolic disease. Note II. Polyphenols content, antioxidant
activity and cytoprotective effect of betulae folium dry extract.
Farmacia 2014; 62(5):961-970.
42. Shih M-H., Ke F.-Y., Syntheses and evaluation of antioxidant
activity of sydnonyl substituted thiazolidinone and thyazoline
derivatives, Bioorganic and Medicinal Chemistry 2004; 12:4633-
4643.
43. Lupaşcu FG, Dragostin OM, Foia L, Lupaşcu D, Profire L. The
synthesis and the biological evaluation of new thiazolidin-4-one
derivatives containing a xanthine moiety. Molecules 2013;
18:9684-9703.
44. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Zang M, Rice-
Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS
radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and
Medicine 1999; 26:1231-1237.
45. Dragostin OM, Lupaşcu F, Vasile C, Mareş M, Nastasa V,
Moraru RF, Pieptu D, Profire L. Synthesis and biological
evaluation of new 2-azetidinones with sulfonamide structures.
Molecules 2013; 18:4140-4157.
46. Lungu Apetrei C, Tuchiluş C, Aprotosoaie AC et al. Chemical,
antioxidant andantimicrobial investigations of Pinus cembra L.
Bark and Needles. Molecules 2011; 16:7773-7788.
48
LISTĂ LUCRĂRI ŞTIINŢIFICE
Lucrări publicate ca prim autor (din teza de doctorat):
1. Wolszleger (Drăgan) M, Stan CD, Pânzariu A, Jităreanu A,
Profire L. New thiazolidin-4-ones of ferulic acid with
antioxidant potential. Farmacia 2015, 63 (1): 150-154 (ISI,
FI=1,251).
2. Wolszleger (Drăgan) M, Stan CD, Apotrosoaiei M, Vasincu I,
Pânzariu A, Profire L. New hidrazones of ferulic acid:
synthesis, characterization and biological activity. Rev. Med.
Chir. Soc. Med. Nat., Iaşi 2014, 118; 4:1150-1156. (BDI, B+).
Alte lucrări:
Lucrări publicate în reviste cotate ISI:
1. Apotrosoaei M, Vasincu I, Drăgan M, Buron F, Routier S,
Profire L, Design, synthesis and the biological evaluation of
1,3-thiazolidine-4-ones based on 4-amino-2,3-dimethyl-1-
phenyl-3-pyrazolin-5-one scaffold. Molecules 2014; Doi:
10.3390/molecules190913824: 13824-13847. (ISI, FI=2,095)
2. Stan CD, Tătărîngă G, Gafiţanu C, Drăgan M, Braha S, Popescu
MC, Lisă G, Ştefanache A. Preparation and characterization
of niosomes containing metronidazole. Farmacia 2013, 61;
6:1178-1185. (ISI, FI=1,251).
3. Stan CD, Coromelci-Pastravanu C, Creţescu I, Drăgan M.
Treatment of pesticides in wastewater by heterogeneous and
homogeneous photocatalysis. International Journal of
Photoenergy 2012, Doi:10.1155/2012/194823. (ISI, FI=2,663).
4. Stan CD, Ştefanache A, Tuchiluş C, Diaconu DE, Drăgan M,
Profire L. Influence of extraction solvent on the erythromycin
ethylsuccinate separation from oral suspendable powder.
Farmacia 2011, 59; 3:396-401. (ISI, FI=0,669).
5. Zavastin D, Creţescu I, Bezdadea M, Bourceanu M, Drăgan M,
Lisă G, Mangalagiu I, Vasic V, Savic J. Preparation,
characterization and applicability of cellulose acetate –
polyurethane blend membrane in separation techniques.
Colloids and Surface A: Physicochemical and Engineering
Aspects 2010, 370; 1-30:120-128. (ISI, FI=2,236).
49
6. Bezdadea M, Bourceanu M, Wolszleger M. The permeation of
protein solution at ultrafiltration through indigenous
polyurethane membranes. Roumanian Biotechnological Letters
2006, 11; 5:2905-2931. (ISI, FI=0,291).
Lucrări publicate în reviste cotate BDI/B+
1. Stan CD, Drăgan M, Diaconu DE, Ştefanache A. Posibilităţi de
acilare a acidului 7-aminocefalosporanic în scopul obţinerii unor
cefalosporine. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iaşi 2014, 118;
1:244-249.
2. Stan CD, Ştefanache A, Drăgan M, Corciovă AM. Development
and validation of a spectrophotometric method for quantitative
determination of new preservatives from pharmaceutical forms.
Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iaşi 2013, 117; 4:1014-1020.
3. Stan CD, Ştefanache A, Drăgan M, Poiată A, Diaconu DE,
Profire L. Cercetări privind îmbunătăţirea condiţiilor de acilare
în cazul obţinerii penicilinelor antistafilococice. Rev. Med. Chir.
Soc. Med. Nat., Iaşi 2011, 115; 3:972-977.
Lucrări publicate în volume de conferinţe
1. Drăgan M, Stan CD, Pânzariu A-T, Dragostin OM, Vasincu I-
M, Apotrosoaiei M, Profire L. Noi hidrazone ale acidului
ferulic. Congresul Naţional de Farmacie din România cu
participare internaţională, ed. a XV-a, 24 – 27 septembrie 2014.
2. Stan CD, Tătărîngă G, Drăgan M, Ştefanache A. Descoperirea
vaccinurilor – piatra de temelie a medicinii modern. Al IV-lea
Colocviu International de Istoria Farmaciei şi a XXIII-a
Reuniune Naţională Anuală – 10 Ani de la înfiinţarea secţiei
Brăila a SRIF (2004-2014), Brăila, 5-7 iunie 2014.
3. Stan CD, Drăgan M, Ştefanache A. Descoperirea rapamicinei-
un imunosupresiv de succes. Pagini din istoria farmaciei, Ed.
“Gr. T. Popa” U.M.F. Iaşi, p. 218-220, 2013.
4. Stan CD, Drăgan M, Ştefanache A. Metode clasice şi moderne
de obţinere a vitaminei C. Timp şi semnificaţie în istoria
medicine, Ed. “Gr.T.Popa”, UMF, p. 231-234, 2012.
5. Stan CD, Drăgan M, Poiată A, Ştefanache A. Testarea activităţii
antimicrobiene a unor derivaţi ai acidului mandelic. Actualităţi
şi perspective în cercetarea farmaceutică, Craiova, p. 83-84,
2012.
50
6. Drăgan M, Poulios I, Stan CD. Degradarea pesticidelor organo-
persistente prin fotocataliză eterogenă (condiţii optime).
Conferinţa Naţională de Fitoterapie, ed. aV-a, Iaşi, p.108-111,
2011.
7. Dragostin OM, Vasile C, Lupaşcu F, Drăgan M, Profire L.
Sinteza şi caracterizarea unor noi hidrazone cu structură
sulfonamidică. Conferinţa Naţională de Fitoterapie, ed. aV-a,
Iaşi, p.105-107, 2011.
8. Stan CD, Ştefanache A, Drăgan M, Dumitrache M, Profire L.
Patentarea primului microorganism transgenic. A XV-a
Reuniune Naţională de Istoria Farmaciei, Galaţi, 2009.
9. Stan CD, Ştefanache A, Poiată A, Dumitrache M, Wolszleger
M, Nastase V, Profire L. The testing of preservative action for
some mandelic acid esters in cosmetics. 14th Panhellenic
Pharmaceutical Congress, Atena, Grecia, 2009.
10. Wolszleger M, Bezdadea M, Creţescu I, Doniga E. Controlul
medicamentelor prin cromatografie în strat subţire, folosind noi
faze staţionare cu structură polimeră. The first conference of
phd students in Medicine and Pharmacy, Târgu-Mureş, Rev. De
Medicină şi Farmacie 2008, 54; 3: 538-540.