59
UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE “GRIGORE T. POPA” IASI FACULTATEA DE FARMACIE IBRAHIM KHALAF REZUMAT TEZA DE DOCTORAT CONDUCATOR STIINTIFIC PROF. DR. MIHAI IOAN LAZAR IASI 2O10
UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE “GRIGORE T. POPA” IASI
FACULTATEA DE FARMACIE
IBRAHIM KHALAF
REZUMAT
TEZA DE DOCTORAT
CONDUCATOR STIINTIFIC PROF. DR. MIHAI IOAN LAZAR
IASI 2O10
CERCETAREA PRINCIPIILOR ACTIVE DIN GLYCYRHHIZA GLABRA DE ORIGINE SIRIANA
1
CUPRINS
INTRODUCERE
STADIUL CUNOAŞTERII
CAPITOLUL 1. PROFILUL BOTANIC SI CHIMIC AL SPECIEI GLYCYRRHIZA GLABRA
1
1. 1. ÎNCADRARE SISTEMATICĂ 1
1. 2. RÃSPÂNDIREA SPECIILOR DE GLYCYRRHIZA PE GLOB 3
1. 3. VARIETĂŢILE COMERCIALE DE LICVIRIŢIE 5
1. 4. CARACTERE ORGANOLEPTICE, RECOLTARE, CONDIŢIONARE 5
1. 5. CARACTERE MICROSCOPICE 6
1. 6. COMPOZITIA CHIMICÃ A SPECIILOR DE GLYCYRRHIZA 6
1. 6.1. COMPUSII FENOLICI DIN SPECIILE DE GLYCYRRHIZA 6
1. 6. 1. 1. Fenoli izoprenoid substituiţi din Glycyrrhiza glabra 6
1. 6. 1. 2. Fenoli izoprenoid substituiţi din Glycyrrhiza uralensis 7
1. 6. 1. 3. Fenoli izoprenoid substituiţi din Glycyrrhiza inflata 8
1. 6. 1. 4. Fenoli izoprenoid substituiţi din Glycyrrhiza eurycarpa 9
1. 6. 1. 5. Fenoli izoprenoid substituiţi din Glycyrrhiza aspera 10
1. 6. 2. COMPUŞI CU STRUCTURÃ TRITERPENICÃ 11
1. 6. 3. FLAVONOIDE, ISOFLAVONOIDE, CALCONE 11
1. 6. 4. CUMARINE 12
1. 6. 5. ALŢI COMPUŞI 12
2
CAPITOLUL 2. ASPECTE FARMACOLOGICE ŞI TOXICOLOGICE 14
2. 1. DATE FARMACOCINETICE ŞI FARMACOLOGICE 14
2. 1. 1. FARMACOCINETICĂ 14
2. 1. 2. FARMACOLOGIA EXPERIMENTALĂ 16
2. 1. 2. 1. Acţiune antiinflamatoare 16
2. 1. 2. 2. Acţiune antimicrobiană şi antivirală 17
2. 1. 2. 3. Acţiune antiprotozoarică 18
2. 1. 2. 4. Acţiune antioxidantă 18
2. 1. 2. 5. Acţiune asupra aparatului digestiv 19
2. 1. 2. 6. Acţiune antitumorală 20
2. 1. 2. 7. Studii asupra sistemului nervos central 20
2. 1. 2. 8. Studii cardiovasculare 21
2. 1. 2. 9. Studii imunologice 21
2. 1. 2. 10. Studii renale 23
2. 1. 2. 11. Activităţi citotoxice 23
2. 1. 2. 12. Studii respiratorii 23
2. 1. 2. 13. Efecte asupra diferenţelor de joncţiune ale canalelor 24
2. 1. 2. 14. Studii endocrinologice 24
2. 1. 3. FARMACOLOGIA CLINICĂ 24
2. 1. 3. 1. Efecte gastrointestinale 24
2. 1. 3. 2. Efecte anticanceroase 25
2. 1. 3. 3. Efecte antioxidative 25
2. 1. 3. 4. Efecte antivirale şi hepatoprotectoare 25
3
2. 1. 3. 5. Studii dermatologice 25
2. 1. 3. 6. Efecte endocrinologice 26
2. 1. 3. 7. Boli respiratorii 27
2. 1. 3. 8. Alte efecte 27
2. 1. 4. UTILIZĂRI INDUSTRIALE 27
2. 1. 5. CONTRAINDICAŢII. AVERTISMENTE. PRECAUŢII 28
2. 1. 6. INTERACŢIUNI CU MEDICAMENTELE 28
2. 2. EFECTE SECUNDARE ŞI TOXICITATE 29
2. 2. 1. UTILIZÃRI/CIRCUMSTANTE DE INTOXICARE 31 2. 2. 2. TOXICOCINETICA 31 2. 2. 3. ASPECTE TOXICOLOGICE 32 2. 2. 4. TOXICITATE 33 2. 2. 5. ANALIZA TOXICOLOGICÃ SI EXAMINARE BIOCHIMICÃ 33 2. 2. 6. SEMNE CLINICE DE INTOXICATIE 34 2. 2. 7. TRATAMENT 35 2. 2. 8. CARCINOGENEZĂ, MUTAGENEZĂ, SCĂDEREA FERTILITĂŢII 35
2. 2. 9. ÎNTREBUINŢAREA PEDIATRICĂ 36
2. 3. MODIFICAREA CHIMICĂ A ACIDULUI GLICIRIZIC PENTRU OBŢINEREA DE NOI SUBSTANŢE ACTIVE
36
2. 3. 1. IZOLAREA ACIDULUI GLICIRIZIC DIN MATERII PRIME ŞI STRUCTURA SA
38
2. 3. 2. IZOMERIZAREA ACIDULUI GLICIRIZIC 39
2. 3. 3. SĂRURILE ACIULUI GLICIRIZIC 39
2. 3. 4. TRANSFORMÃRILE ACIDULUI GLICIRIZIC 40
2. 3. 4. 1. Sinteza de esteri ai acidului glicirizic 40
2. 3. 4. 2. Sinteza amidelor acidului glicirizic 41
2. 3. 4. 3. Sinteza de acetiltiouree şi semicarbazide 43
2. 3. 4. 4. Sinteza homoderivaţilor acidului glicirizic 45
4
2. 3. 4. 5. Sinteza de glicopeptide ale acidului glicirizic 46
2. 3. 4. 6. Sinteza triterpenelor ureide şi a carbamaţilor 46
2. 3. 4. 7. Sinteza 4-dezoxi-4-nitroglicozidei acidului glicirizic 48
2. 3. 4. 8. Reducerea acidului glicirizic 50
2. 3. 4. 9. Sinteza triterpenei 2-dezoxi-β-glicozida acidului glicirizic 51
2. 3. 5. Proprietăţile farmacologice ale derivaţilor acidului glicirizic 52
CAPITOLUL 3. METODE DE ANALIZA A PRINCIPIILOR ACTIVE DIN SPECIILE DE GLYCYRRHIZA
54
3. 1. METODE CROMATOGRAFICE 54
3. 1. 1. CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBŢIRE 54
3. 1. 2. TESTE IMUNOCROMATOGRAFICE 54
3. 1. 3. CROMATOGRAFIE DE LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ 55
3. 2. METODE SPECTRALE 58
3. 2. 1. METODE SPECTRALE UV 58
3. 2. 2. METODE SPECTRALE IR SI RMN 60
3. 3. METODE ELECTROCHIMICE 60
3. 3. 1. ELECTROFOREZA 60
3. 3. 2. POLAROGRAFIE 60
CONTRIBUŢII PROPRII
CAPITOLUL 4. CARACTERIZAREA MACROSCOPICĂ ŞI MICROSCOPICĂ A RĂDĂCINILOR DE GLYCYRRHIZA GLABRA RECOLTATE DIN SIRIA
61
4. 1. ASPECTUL MACROSCOPIC AL SORTURILOR DE GLYCYRHIZA GLABRA
61
4. 2. STUDIUL HISTO-ANATOMIC AL RĂDĂCINII DE GLYCYRHIZA 65
5
GLABRA
CAPITOLUL 5. ANALIZA CROMATOGRAFICA A EXTRACTELOR ALCOOLICE OBTINUTE DIN RADACINILE SI RIZOMII DE GLYCYRRHIZA GLAABRA DE ORIGINE SIRIANA
88
5.1. ANALIZA CROMATOGRAFICĂ PE STRAT SUBTIRE 88
5.2. DETERMINAREA HPLC A ACIDULUI GLICIRIZINIC (GLICIRETIC) 101
CAPITOLUL 6. ANALIZA COMPUŞILOR POLIFENOLICI DIN GLYCYRRHIZA GLABRA
109
CAPITOLUL 7. ANALIZA FITOESTROGENILOR DIN GLYCYRRHIZA GLABRA
134
CAPITOLUL 8. ANALIZA COMPUŞILOR STEROLICI DIN GLYCYRRHIZA GLABRA
161
CAPITOLUL 9. ANALIZA COMPUŞILOR POLIFENOLICI, FITOESTROGENICI ŞI STEROLICI DIN TINCTURA DE GLYCYRRHIZA GLABRA
179
CONCLUZII GENERALE CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE
190
BIBLIOGRAFIA CONSULTATĂ 193
6
INTRODUCERE
Motto: Plantele medicinale fie că se exprimă prin rădăcini, rizomi, bulbi, tije, ramuri, frunze, flori sau fructe reprezintă în esenţă forţele benefice ale cosmosului.
Dr. Arcadie Percek
Numeroase plante sunt folosite din negura timpului pentru proprietăţile lor curative în îngrijirea şi menţinerea sănătăţii individului. Universalitatea lor este astfel recunoscuta şi fiecare civilizaţie, fiecare popor, posedă în acest domeniu tradiţia sa proprie.
Există argumente arheologice că mesopotamienii utilizau plantele, ca leac, în urmă cu mai bine de 6000 de ani. Cunoaştem că, în China, oamenii se foloseau de plante pentru a se menţine sănătoşi cu 27 de veacuri înainte de Hristos, deşi referiri cu privire la vindecarea cu ajutorul plantelor, pe acele meleaguri, sunt şi mai vechi. Egiptenii foloseau plantele ca aliment, ca medicament şi ca ingrediente în cosmetice, parfumuri şi chiar uleiuri pentru alinarea durerilor, ca aromatizant pentru băi şi pentru încăperile în care îşi petreceau cea mai mare parte din timp. Vechiul Testament face menţiuni privind sănătatea pe care o pot avea oamenii foosindu-se de plante. Vindecătorii de demult obţineau din plante extracte sub formă de tincturi, uleiuri, creme, cataplasme, tot felul de ceaiuri, prafuri, balsamuri. Ei sunt predecesorii medicilor de azi, fie că li se zicea vraci sau ,, oameni care vindecau cu buruieni”, iar plantele pe care le foloseau la uşurarea suferinţelor reprezintă o sursă importantă de materie primă pentru industria medicamentelor de azi.”
Avantajele fitoterapiei sunt: accesibilitatea ( plantele sunt uşor de procurat şi ieftine; culegerea lor din natură ajută la armonizarea organismului, eliberarea de stres etc.), acţiunea blândă şi lipsa efectelor adverse (când se respectă dozele adecvate), tratarea bolnavului ca întreg (plantele au efecte fizice şi psiho-emoţionale şi echilibrează organismul la toate nivelele), se poate folosi în paralel cu medicamentele alopate (cu câteva mici excepţii, la care trebuie să se ţină seama de antagonismul dintre unele medicamente şi unele plante).
În acest context, ne-am propus studierea speciei de Glycyrrhiza glabra, plantă originară din China, în India şi China fiind cultivată în scopuri medicinale. În majoritatea ţărilor în care această plantă se industrializează, se recoltează din flora spontană (Rusia, Spania, Iran, Irak). În ţara noastră cele mai multe calităţi se obţin din bazinele de floră spontană situate în zonele Vrancea, Galaţi, Suceava, Dobrogea, iar în ultimii ani s-a luat măsura introducerii şi extinderii speciei în cultura mare.
7
Lemnul dulce este o veche plantă medicinală, descrisă în lucrarea „Erbolario Bergomense” în anul 1441 de Guarnerius de Padua.
Denumirea engleza ”licorice” provine din grecescul ”glykeia rhiza” (rădăcină dulce); în greaca contemporană denumirea este ”glikoriza”. Primul element, ”glykys” înseamnă dulce, cel de-al doilea, “rhiza”, înseamnă rădăcină.
In latină, denumirea împrumutată din greacă era ”liquiritia”, influenţata de ”liquere” (curgere), care se referea la sucul de lemn dulce. Nu numai denumirea engleză are această sursă. Alte limbi au denumiri provenite similar: ”Lakritze” în germană, ”lekorice” în cehă, ”lokrytsya” în ucraineană. In majoritatea limbilor romanice cuvântul s-a schimbat prin metateza între sunetele L şi R: ”recalice” în provensală, ”reglisse” în franceză, ”ragaliz” în spaniolă.
Alte denumiri alătură epitetul ”dulce” substantivului ”lemn”, sau ”rădăcină”: ”Sussholz” în germană, ”zoethout” în olandeză, ”lemn dulce” în română. Gustul dulce, caracteristic, se reflectă în denumirile indiene. ”Madhu” (dulce, plăcut) în limba sanskrita este împrumutat în denumirile moderne: ”jestamadha” în marathi, ”yashtimodhu” în bengali, ”atimadhuramu” în telugu şi ”yashtimadhu” în kannada. Inrudite, dar în afara Indiei, sunt: ”saldymedis” în lituaniană, ”madudag” în armeană.
Alte exemple de denumiri, dominate şi motivate de gustul dulce al condimentului sunt: ”solodkyj” în ucraineană, ”magusjuur” în estoniană, ”edesgyoker” în maghiară, ”dladuk koren” în bulgară, toate însemnând rădăcină dulce.
Denumirea chinezească a unei specii înrudite, ”Glycyrrhiza uralensis” este ”gan cao”, care înseamnă ”paie dulci”, sau ”iarbă dulce”. Numele a fost împrumutat în vietnameză ”cam thao”, în coreeana ”kamcho” şi în japoneza ”kanzo”.
Lemnul dulce este una dintre cele mai valoroase plante medicinale, un puternic antiinflamator eficient în afecţiuni diverse, de la artrite, până la ulceraţii bucale. Se numără printre plantele cele mai utilizate în medicina europeană şi a fost folosită în scopuri medicale de mii de ani. Datorită compoziţiei foarte complexe, rădăcinile şi stolonii se utilizează pe scară largă în tratamentul bronşitelor şi faringitelor. În tradiţia populară: rizomul se făcea decoct şi se bea contra tusei şi durerilor de piept. Tradiţional, lemnul dulce a fost utilizat de către grecii antici pentru a trata astmul, problemele de piept şi ulceraţiile bucale.
În scopuri medicinale se folosesc rădăcinile, are acţiune uşor diuretică, expectorantă, ajutând la fluidificarea secreţiilor traheo-bronşice, calmând tusea. Este un uşor laxativ. Datorită proprietăţilor sale antiinflamatoare, antiulceroase şi cicatrizante se foloseşte cu succes în afecţiunile de mai jos.
Cu rădăcină de lemn dulce se pot îndulci ceaiurile şi în acelaşi timp ajută la ameliorarea gustului neplăcut al unor medicamente. Se evită fierberea rădăcinilor (decoct) pentru a nu trece în ceaiul respectiv rezinele şi substanţele amare. În dispepsiile de fermentaţie se preferă îndulcirea ceaiurilor cu lemn dulce pentru că acesta nu produce fermentaţie ca zahărul.
Antispasmodică, slab diuretică, uşor expectorantă prin fluidificarea secreţiilor bronhice, antispastică, antihistaminică, antiacetilcolinică, acţiune tampon a acidităţii gastrice, acţiune antitusivă, acţiune asupra metabolismului hidric-salin, acţiune anorexică, acţiune antiestrogenă, cardiovasculară, bacteriostatică, antitoxică faţă de toxina tetanică, acţiune difterică şi asupra stricninei, antihemoroidală, uşor laxativă, estrogenă, antiinflamatoare, antiulceroasă şi antidismenoreică. Este un hormon natural de excepţie. Reduce inflamaţiile gastrice, protector al mucoasei gastrice. Nu este indicat să se folosească de către cei care au hipertensiune pentru că reţine sodiul în organism şi prin aceasta face să crească tensiunea arterială. Ajută la inflamaţiile
8
articulare. Este febrifugă. Acţiune uşoară antiulceroasă, antitusivă, anorexică, antiflogistică. Se foloseşte în special în tratarea tusei, ulcerului gastric. Este un antioxidant foarte puternic şi are acţiune antivirală şi antimicrobiană, ajutând la refacerea sistemului imunitar. Previne şi combate osteoporoza.
Restabileşte funcţionarea normală a ţesuturilor şi membranelor, echilibrează balanţa hormonală şi este un stimulent al secreţiilor intestinale şi al respiraţiei şi are de asemenea efect laxativ.
Se foloseşte sub formă de pulbere, comprimate, supozitoare, ulei, tinctură în următoarele afecţiuni: afecţiuni respiratorii, afrodiziac feminin, alergii, amenoree, anemie, angină, artrite, ascaridoze, astmă, balonare, boli de stomac şi ficat, bronşită (fluidifică sputa), bufeuri, buze crăpate, calculoză renală şi biliară, cancer adjuvant indiferent de localizare, cancer hepatic, colici hepatobiliare, colecistită dischinezică, colici hepato-biliare, constipaţie, convalescenţă, degerături, dereglări hormonale, dischinezie biliară, dismenoree, dispepsie de fermentaţie, dureri de ochi, dureri de dinţi, dureri de picioare, dureri de piept, edeme, epuizare nervoasă, faringită, frigiditate, gangrenă, gastrite hiperacide, gripă, hemoroizi, hepatită cronică, hirsutism, inapetenţă, infertilitate la femei, infestări cu giardia, infecţii urinare, insomnie, înţepături de insecte, intoxicaţii cu ciuperci şi plante otrăvitoare (adjuvant), iritabilitate, junghiuri, malarie, menstruaţii dureroase, meteorism, migrenă, naştere (pentru uşurarea travaliului), oboseală, osteoporoză, oxiurază, parazitoze intestinale, plăgi vechi sau ulcerate, răceli, răni, răni ulcerate, reumatism chiar şi degenerativ, slăbiciune exagerată, stimularea creşterii părului, stomatită, stres, traheită, transpiraţia picioarelor cu miros neplăcut, tulburări de premenopauză, tuse (fluidifică secreţiile) uscată şi iritativă, ulcer stomacal, ulcer gastric şi duodenal, uşurarea durerilor la naştere.
Lemnul dulce a fost dintotdeauna folosit mai puţin ca mirodenie şi mai mult ca medicament. La o cercetare superficiala, dulceaţa puternică şi dominantă a lemnului dulce nu este potrivită nici mâncărurilor dulci şi nici celor picante. Totuşi, mici cantităţi de lemn dulce îmbogăţesc semnificativ gustul amestecului chinezesc ”5 arome”.
Lemnul dulce este un ingredient de bază la prepararea bomboanelor în nordul Europei, mai ales în Germania (numite ”Lakritz”) şi Scandinavia. (numite ”salmiaki”). Aceste bomboane sunt suc de lemn dulce concentrat, la care se adaugă diferite arome (cum ar fi lamâia), dar nu şi zahăr.
Lemnul dulce mai este folosit şi la prepararea bomboanelor, dar acestea conţin doar maxim 2 % extract de lemn dulce, restul aromei şi gustului fiind dat, de obicei, de anason. 90 % din lemnul dulce folosit ca agent de îndulcire merge către industria tutunului (ţigări, trabucuri, tutun de pipă).
Bucăţile de esenţă de lemn dulce pot fi dizolvate în apă fierbinte pentru a obţine ceaiuri, iar condimentul mai este folosit şi ca adaus la prepararea de sucuri de fructe, siropuri şi băuturi alcoolice aromate, ca sambuca şi berea Guiness.
Condimentul este disponibil uscat, fie întreg, fie pulbere şi ca batonaşe solide de esenţă concentrată, de culoare neagră, lucioase, dulci şi parţial solubile în apă. Aroma de lemn dulce este asemănătoare cu cea a feniculului, dar considerabil mai puternică. Gustul este dominant dulce, asemănător cu cel al anasonului, dar cu o mică tenta remanentă amăruie şi un pic sărată. Dacă este mestecat, pare să devina din ce în ce mai dulce. Motivaţia cercetării
9
În ultimii ani se constată o reorientare spre obţinerea de medicamente prornind de la produse vegetale deoarece înlocuind medicamentele cu remedii naturale nu facem altceva decât să punem în practică un principiu hipocratic, din păcate uitat, dar care nu şi-a pierdut niciodată valabilitatea: „a dobândi vindecarea este mai presus de toate ştiinţa medicală; mai multe căi, însă, dacă duc spre această ţintă trebuie să o alegem pe cea mai puţin vătămătoare”.
Deoarece speciile de Glycyrrhiza glabra sunt întânite în flora Siriei şi sunt larg utilizate atât datorită acţiunilor farmacologice cât şi ca ingredient la obţinerea sucurilor şi băuturilor racoritoare, am ales pentru analiză patru eşantioane recoltate din diferite zone ale Siriei: Bilekh, Rakka, Alepo-Azaz, Rass-Aenn.
Obiectivele tezei de doctorat
Datorită utilizării Glycyrrhizei glabra atât în medicina tradiţională cât şi datorită importanţei acestei plante atât în medicină cât şi ca mirodenie ne-am propus analiza plantei provenite din patru regiuni din Siria.
Lucrarea cuprinde studiul botanic al celor patru eşantioane, atât macroscopic cât şi microscopic, studiul fitochimic comparativ al principalelor grupe de compuşi cu acţiune
10
terapeutică: estrogeni, compuşi polifenolici şi fitosteroli. De asemenea, aceşti compuşi au fost analizaţi şi dintr-o formă farmaceutică larg utilizată – tinctura.
Teza de doctorat cuprinde 9 capitole, include 206 pagini (partea generală – 60 pagini, partea personală – 146 pagini), 134 figuri, 44 tabele şi 174 indicaţii bibliografice.
STADIUL CUNOASTERII
CAPITOLUL 1
PROFILUL BOTANIC SI CHIMIC AL SPECIEI GLYCYRRHIZA GLABRA
CAPITOLUL 2
ASPECTE FARMACOLOGICE ŞI TOXICOLOGICE
CAPITOLUL 3
METODE DE ANALIZA A PRINCIPIILOR ACTIVE DIN SPECIILE DE GLYCYRRHIZA
CONTRIBUTII PROPRII
CAPITOLUL 4
CARACTERIZAREA MACROSCOPICĂ ŞI MICROSCOPICĂ A RĂDĂCINILOR DE GLYCYRRHIZA GLABRA RECOLTATE DIN SIRIA
În acest capitol au fost caracterizate din punct de vedere macroscopic şi microscopic eşantioane de Glycyrrhiza glabra recoltate din flora Siriei, din patru zone diferite: Bilekh, Rakka, Alepo-Azaz, Rass-Aenn.
În cadrul analizei microscopice s-au urmărit drept caractere histo-anatomice de diferenţiere în caracterizarea celor 4 eşantioane.
11
Rizom de Glycyrrhiza glabra recoltată din Rakka – aspecte macroscopice
Eşantioanele recoltate se prezintă sub forma unor bucăţi cilindrice, drepte sau unor curbate, lungi de 4-15 cm, goase de 1,5 cm, cu suprafaţa externă brun-cenuşie, străbătută de numeroase striuri longitudinale. Fragmentele sunt dure, compacte, iar fractura este fibroasă şi colorată în galben. Culoarea la exterior este brun cenuşie. Miros slab caracteristic, gust dulceag, înţepător şi amărui.
4. 2. STUDIUL HISTO-ANATOMIC AL RĂDĂCINII DE GLYCYRHIZA GLABRA
În vederea realizării cercetărilor histo-anatomice materialul vegetal a fost reprezentat de fragmente de rizom de la 4 eşantioane de Glycyrhiza glabra: Bilekh, Rakka , Alepo-Azaz, Rass-Aenn. Bilekh
12
Concluzii:
La toate eşantioanele razele medulare (principale şi secundare) fragmentează inelul iniţial de liber secundar în trapeze foarte înguste.
In urma analizei microscopice putem spune ca există diferenţe în caracterele histo-anatomice de tip peridermă, fibre sclerenchimatice, raze medulare şi măduvă ale celor patru eşantioane de Glycyrrhiza glabra, dar şi asemănări după cum urmează: periderma eşantioanelor din Alepo-Azaz şi Rass-Aenn este asemănătoare cu cea a eşantionului din Bilekh, fibrele sclerenchimatice ale eşantionului Rakka sunt asemănătoare, dar mai numeroase decât cele ale eşantionului din Bilekh, fibrele sclerenchimatice liberiene ale eşantionului Alepo-Azaz sunt
13
asemănătoare cu cele ale eşantionului Rakka, iar cele ale lemnoase seamănă cu eşantionul Bilekh, razele medulare ale eşantioanelor Alepo-Azaz şi Rass-Aenn sunt asemănătoare cu cele ale eşantionului Rakka, măduva eşantionului Rakka este asemănătoare eşantionului Bilekh.
CAPITOLUL 5
ANALIZA CROMATOGRAFICA A EXTRACTELOR ALCOOLICE OBTINUTE DIN RADACINILE SI RIZOMII DE GLYCYRRHIZA GLAABRA DE ORIGINE SIRIANA
5. 1. ANALIZA CROMATOGRAFICĂ PE STRAT SUBTIRE
Extractele 10 % astfel obţinute se supun analizei cromatografice pentru punerea în evidenţă a flavonelor şi a compuşilor cu structură sterolică.
1. Analiza cromatografică a compuşilor flavonici din rădăcinile recoltate din Bilekh
Imaginea cromatogramelor obţinute după developările în UV sunt redate mai jos.
Cromatograma vizualizată în UV la 254 nm Cromatograma vizualizată în UV la 366 nm
Concluzii
Analizele cromatografice efectuate fără a folosi substanţe de referinţă arată că cele două vizualizări scot în evidenţă prezenţa compuşilor flavonici, numărul acestora observaţi depinzând de lungimea de undă UV.
Alte determinări cromatografice pe strat subţire
Am utilizat următoarele sisteme de developare:
14
1. metanol 90% 2. metanol-diclormetan (1:19) 3. cloroform-metanol (10:1) 4. ciclohexan:acetonă (3:1) Vizualizări: 1. Reactiv Dragendorff 2. Anisaldehidă 1% în acid sulfuric (încălzire timp de 5 minute la 105oC) 3. Expunere la vapori de iod
Cromatograma extractelor siriene (developare cu reactiv Dragendorff)
Concluzii:
1. Analizele cromatografice pe strat subţire scot în evidenţă compuşi ce pot aparţine următoarelor grupe de substanţe active: alcaloizi, cumarine, flavones, steroizi, taninuri,
2. Pentru elucidarea şi identificarea acestora este necesar să se utilizeze substanţe etalon din toate grupele menţionate.
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ A COMPUSILOR FLAVONICI Suport: Placi cromatografice Silicagel F254 (Aluminium TLC sheets (E. Merck)
S-au testat 11 standarde de compuşi flavonici (agliconi şi glicozide): kemferol , apigenina, cvercetol, luteolina, cvercitrozida, rutozida, izocvercitrozida, hiperozida, miricetol, fisetina, patuletina. Faze mobilă: toluen-acetat de etil-acid formic (36:12:5)
Rass-Aenn
15
Cromatograma pe strat subţire a extractului alcoolic
CONCLUZII
În toate sorturile de lemn dulce recoltate din cele patru localităţi am identificat cromatografic pe strat subţire toate flavonele folosite ca etaloane. De menţionat că alături de aceste flavone speciile de Glucyrrhiza conţin şi alţi componenţi flavonici, menţionaţi în capitolul 1. Aceştia nu au fost identificaţi din cauza lipsei de substanţe etalon.
5. 2. DETERMINAREA HPLC A ACIDULUI GLICIRIZINIC (GLICIRETIC)
Aşa după cum s-a arătat în altă parte a lucrării (capitolul I) glicirizina este compusul majoritar al fracţiunii care dă gustul dulce al produsului. In extractele alcoolice obţinute alături de glicirizină se găseşte şi acidul glicirizinic, denumit şi acid glicirinetic sau acid gliciretic.
Analizele au fost realizate pe un sistem HPLC Thermo-Surveyor echipat cu sistem de injecţie automată a probelor şi detector DAD (inetrval spectral de detecţie 190-360 nm).
Cromatogramele au fost înregistrate şi prelucrate într-un software de tipul ChromQuest, model 4.2.34, cu modul de indentificare spectrală a compuşilor separaţi pe coloană.
16
S-a folosit o coloană de tip Discovery RP-Amide (C16) (250 x 4,6, diametrul interior 5 mm) şi diametrul particulelor interioare de 5 μm. Faza mobilă folosită pentru eluţie a fost constituită dintr-un amestec acetonitril: acid acetic (10%). Eluţia compuşilor pe coloană s-a realizat după un gradient liniar al proporţiilor în faza mobilă a celor două componente ale fazei mobile:
Timp CH3COOH (10%) ACN
0 92 8
30 9 91
35 92 8
37 92 8
Debitul folosit a fost de 1 ml/min, iar detecţia s-a realizat la lungimile de undă 254 şi respectiv 280 nm.
ECUAŢIA CURBEI DE REGRESIE COEFICIENT DE REGRESIE (R2)
Acidul gliciretinic
y = 195863578.8530x - 158400.3749 0.9994
Curba de etalonare a acidului gliciretinic
LIMITA DE CUANTIFICARE LIMITA DE DETECŢIE
17
(MG/ML) (MG/ML)
Acidul gliciretinic 0,000039 0,0000259
HPLC cromatograma acidului gliciretinic (etalon)
Conţinutul în acid gliciretic al sorturilor de Glycyrrhiza glabra provenite din Siria
SORTUL DE GLYCYRRHIZA
CONŢINUT % (G)
1. Bilekh 18,50
2. Rakka 19,46
3. Alepo-Azaz 19,64
4. Rass-aenn 19,48
18
Conţinutul în acid gliciretic al sorturilor siriene de Glycyrrhiza glabra
Concluzii:
1.Analiza HPLC a extractelor alcoolice obţinute din rădăinile şi rizomii de Glycyrrhiza glabra recoltate din cele patru locaţii ne arată un conţinut în acid gliciretinic cuprins între 18,50 % şi 19,64 %. 2. Cel mai mare conţinut în acid gliciretinic îl are Glycyrrhiza recoltată din Alepo-Azaz-19,64 % 3. Cel mai mic conţinut îl au rădăcinile şi rizomii recoltaţi din Bilekh- 18,50 %.
CAPITOLUL 6
ANALIZA COMPUŞILOR POLIFENOLICI DIN GLYCYRRHIZA GLABRA Pentru analiza compuşilor polifenolici din extractele de Glycyrrhiza glabra s-a folosit
cromatografia de lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masă (LC/MS). Analiza s-a efectuat utilizând un sistem Agilent 1100 HPLC Series, echipat cu degazor
G1322A, pompă cu gradient cuaternar G1311A, autosampler G1313A. Pentru separare s-a utilizat o coloană analitică cu fază inversă Zorbax SB-C18 (100 mm x 3.0 mm i.d., 3.5 µm), prevăzută cu o precoloană Zorbax SB-C18, menţinute la temperatura de 48 0C.
S-au testat 18 standarde de compuşi polifenolici: doi agliconi de tip flavonă, 5 agliconi de tip flavonoli, patru glicozide ale cvercetolului, şase derivaţi de acid cinamic şi un acid hidroxibenzoic.
COMPUS R3 R6 R3’ R4’ R5’
Flavone apigenină H H H OH H
luteolină H H OH OH H
19
Flavonoli
cvercetol OH H OH OH H
kemferol OH H OH H H
patuletină OH OCH3 OH OH H
miricetol OH H OH OH OH
fisetină OH H OH OH H
Flavonozide
hiperozida O-Β-D-galactozida
H OH OH H
izocvercitrozidă O-Β-D-glucozida
H OH OH H
cvercitrozida O-Β-D-ramnozida
H OH OH H
rutozida O-Β-D-rutinozida
H OH OH H
COMPUS R3 R4 R5
Derivaţi de acid cinamic
Acid p-cumaric H OH H
Acid cafeic OH OH H
Acid ferulic H OH OCH3
Acid sinapic OCH3 OH OCH3
Acid clorogenic Acid 3-cafeoilchinic
Acid caftaric Acid 2-cafeoiltartric
20
Cromatograma unui amestec de 18 polifenoli, detecţie UV la 330 şi 370 nm
Timpii de retenţie şi parametrii dreptelor de calibrare pentru compuşii polifenolici analizaţi, detecţia în UV
Nr. Nume compus Timp retenţie (min) Ecuaţie dreaptă calibrare
1 Acid caftaric 2.10 Calitativ
2 Acid gentisic 2.15 Calitativ
3 Acid cafeic 5.6 Calitativ
4 Acid clorogenic 5.6 Calitativ
5 Acid p-cumaric 8.7 A = - 0.325 + 33.23 x
6 Acid ferulic 12.2 A = - 1.016 + 39.55 x
7 Acid sinapic 14.3 A = - 0.236 + 37.10 x
8 Hiperozida 18.6 A = 0.107 + 19.29 x
9 Izocvercitrozida 19.6 A = - 0.273 + 12.97 x
10 Rutozida 20.2 A = 0.226 + 13.47 x
21
11 Miricetol 20.7 A = -0.544 + 26.45 x
12 Fisetina 22.6 A = 0.241 + 19.19 x
13 Cvercitrozida 23.0 A = 0.047 + 10.69 x
14 Cvercetol 26.8 A = -1.152 + 36.32 x
15 Patuletina 28.7 A= - 0.429 + 31.44 x
16 Luteolina 29.1 A = - 0.760 + 28.97 x
17 Kemferol 31.6 A = - 1.270 + 30.15 x
18 Apigenina 33.1 A = - 0.908 + 20.40 x
* A = aria picului în mAU×s, x = concentraţia in μg mL-1
Analiza polifenolilor prin detectie MS Modul de analiză MS şi ionii caracteristici din spectrul de masă al polifenolilor
analizaţi
Nr. Nume compus Mod analiză MS Ioni specifici pentru identificare
Ion [M-H] > Ioni din spectru
1 Acid caftaric MRM* 311>148.6, 178.6
2 Acid gentisic MRM 153>108.7
3 Acid cafeic MRM 179.4>134.7
4 Acid clorogenic MRM 353.5>178.7, 190.7
5 Acid p-cumaric MRM 163> 118.7
6 Acid ferulic MRM 193.2> 133.7, 148.7, 177.6
22
7 Acid sinapic MRM 223.4>148.6, 163.6, 178.7, 207.7
8 Hiperozida SIM** 463.1
9 Izocvercitrozida SIM 463.1
10 Rutozida SIM 609.1
11 Miricetol SIM 317.1
12 Fisetina SIM 285.1
13 Cvercitrozida SIM 447.1
14 Cvercetol SIM 301.1
15 Patuletina SIM 331.1
16 Luteolina SIM 285.1
17 Kemferol SIM 285.1
18 Apigenina SIM 269.2
*MRM = „multiple reaction monitoring” - monitorizare ion specific substanţei, în urma unui dublu proces MS (izolare şi fragmentare), se aplică atunci când substanţa ionizează mai greu, ionii corespunzători au intensităţi mai mici, iar spectrometrul i-ar putea considera “zgomot de fond” ** SIM = „single ion monitoring” - presupune un singur stagiu MS, acela de izolare a compusului de interes şi apoi scanare, fără etapa de fragmentare (se aplică atunci când analitul nu se fragmentează eficient).
Rezultatele analizei celor 4 extracte sunt reunite în tabelul 6.3, exprimate în μg/ml extract. Compuşii fenolici sunt redaţi în ordinea timpilor de retenţie.
Conţinutul (μg/ml) în compuşi polifenolici al extractelor metanolice, nehidrolizate şi hidrolizate, din cele 4 extracte (G1 - Bilekh, G2 - Rakka, G3 - Alpo-Azaz, G4 - Rass-Aenn)
Polifenoli G1 G2 G3 G4
NH H NH H NH H NH H
Acid gentisic * * - * - * - *
23
Acid cafeic * * - * - - * *
Acid p-coumaric * 3.627 - 4.932 * 2.173 * 2.173
Acid ferulic - 5.014 - 11.84 * 6.236 - 5.141
Luteolina 0.620 1.139 * 0.85 0.332 0.908 0.217 0.332
Apigenina * 1.218 - 1.054 1.054 1.381 0.728 1.463
Acid sinapic - 3.694 - 2.93 * 13.981 - 2.032
NH – probă nehidrolizată; H – probă hidrolizată * S-a realizat doar determinare calitativă prin MS; semnalul UV < LQ (limita de cuantificare) sau interferenţele/suprapunerea picurilor altor compuşi nu permite determinarea cantitativă a acestor substanţe.
Variaţia conţinutului luteolinei şi apigeninei în cele patru extracte nehidrolizate de
Glycyrrhiza glabra
Variaţia conţinutului acidului p-cumaric, ferulic, sinapic, a luteolinei şi apigeninei în cele
24
patru extracte hidrolizate de Glycyrrhiza glabra
Rezultatele obţinute indică prezenţa acidului gentisic, p-cumaric, ferulic şi sinapic în toate probele, în special sub formă de ester. Acidul gentisic şi cafeic nu au putut fi determinaţi cantitativ în nici una din probe, cantitatea fiind sub limita de cuantificare.
În cazul flavonoidelor, luteolina şi apigenina sunt prezente în toate cele patru probe sub formă glicozidată şi sub formă de agliconi liberi, cu excepţia probei Rakka ce conţine doar apigenină sub formă glicozidată.
In probele analizate nu s-au găsit cei cinci flavonoli analizaţi (cvercetol, patuletină, kemferol, fisetină, miricetină) şi nici cele patru flavonozide (hiperozidă, cvercitrozidă, izocvercitrozidă, rutozidă) testate.
Determinarea cantitativă a fost posibilă pentru acidul cumaric, acidul ferulic, luteolin㸠apigenină şi acid sinapic în special după hidroliză, iar din probele Alpo-Azaz şi Rass-Aenn luteolina şi apigenina au putut fi cuantificate şi sub formă de aglicon.
Concluzii
Acidul gentisic, p-cumaric, ferulic şi sinapic sunt acizii polifenolcarboxilici cel mai des întâlniţi în probele analizate, din care acidul p-cumaric, ferulic şi sinapic pot fi cuantificaţi. Luteolina este observată în toate probele atât nehidrolizate cât şi hidrolizate.
În nici una din probe nu s-au găsit patuletină, kemferol, fisetină, miricetină, hiperozidă, cvercitrozidă, izocvercitrozidă, rutozidă.
Proba din Bilekh a avut cea mai mare cantitate de luteolină, cea din Rakka de acid p-cumaric şi acid ferulic, cea din Alpo-Azaz de acid sinapic, iar cea din Rass-Aenn de apigenină.
CAPITOLUL 7
ANALIZA FITOESTROGENILOR DIN GLYCYRRHIZA GLABRA Fitoestrogenii reprezintă un grup heterogen de compuşi non-steroizi care se găsesc în
plante în mod natural şi care datorită structurii moleculare asemănătoare cu a estradiolului, pot mima efectele acestuia în organism.
Pentru analiza compuşilor fitoestrogenici din extracte de Glycyrrhiza glabra am folosit cromatografia de lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masă (LC/MS). (166-
170)
Metoda se poate aplica pentru analiza cantitativă a opt compuşi cu activitate fito-estrogenică (şapte izoflavone şi un lignan). S-au utilizat următoarele standarde, in ordinea eluţiei
25
cromatografice: daidzină, genistină, ononină, daidzeină, gliciteină, genisteină, cumestrol, formononetină.
Analiza s-a efectuat utilizând un sistem Agilent 1100 HPLC Series, echipat cu degazor G1322A, pompă cu gradient cuaternar G1311A, autosampler G1313A. Pentru separare s-a utilizat o coloană analitică cu fază inversă Zorbax SB-C18 (100 mm x 3.0 mm i.d., 5 µm), prevăzută cu o precoloană Zorbax SB-C18, menţinute la temperatura de 50 oC.
Detecţia s-a realizat prin spectrometrie de masă utilizând un spectrometru de masă Agilent Ion Trap 1100 VL dotat cu o interfaţă ESI (electrospray) cu mod de ionizare negativ, SIM pentru agliconi şi SRM pentru glicozide. Pentru a obţine valori maxime de sensibilitate, condiţiile de lucru au fost optimizate astfel: gaz de uscare - azot, debit 12 L/min, temperatură 360 oC, nebulizator - azot, presiune 65 psi, potenţial capilară - +4500 V.
PROBE__000005.D: TIC -All MSn
PROBE__000005.D: EIC 252.4-253.4 -MS2(415.0)
PROBE__000005.D: EIC 268; 269 -MS2(431.0)
PROBE__000005.D: EIC 266.4-267.4 -MS2(429.0)
PROBE__000005.D: EIC 252.4-253.4 -MS2(253.0)
PROBE__000005.D: EIC 282.4-283.4 -MS2(283.0)
PROBE__000005.D: EIC 268.4-269.4 -MS2(269.0)
PROBE__000005.D: EIC 266.3-267.3 -MS2(267.0)
0
16x10
Intens.
0
2
5x10
0
1
5x10
0
24
4x10
024
5x10
0.0
0.5
1.06x10
0
1
6x10
0
1
6x10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 Time [min] Cromatograma amestecului de izoflavone şi cumestrol, detecţie MS (cromatograma1: TIC- toţi
compuşii, cromatograma 2: daidzina (3.9 min), cromatograma 3: genistină (5.8 min), cromatograma 4: ononina (9.1 min), cromatograma 5: daidzeina 9.6 min), cromatograma 6:
gliciteina (10.4 min), cromatograma 7: genisteina (11.3 min), cromatograma 8: cumestrol (13.0 min) şi formononetina (14.8 min)
Timpii de retenţie şi parametrii de detecţie (mod detecţie, valori m/z) pentru compuşii analizaţi
26
Nr. Nume compus
Timp retenţie (min)
Mod detecţie
m/z ion părinte [M-H]-
m/z monitorizat
1 Daidzina 3.9 SRM 415 253 2 Genistina 5.8 SRM 431 268, 269 3 Ononina 9.1 SRM 429 267 4 Daidzeina 9.6 SIM 253 253 5 Gliciteina 10.4 SIM 283 283 6 Genisteina 11.3 SIM 269 269 7 Cumestrol 13.0 SIM 267 267 8 Formononetina 14.8 SIM 267 267
*SRM= single reaction monitoring; SIM = single ion monitoring
Timpii de retenţie şi parametrii de detecţie (mod detecţie, valori m/z) pentru compuşii analizaţi
Nr. Nume compus
Timp retenţie (min)
Mod detecţie
m/z ion părinte [M-H]-
m/z monitorizat
1 Daidzina 3.9 SRM 415 253 2 Genistina 5.8 SRM 431 268, 269 3 Ononina 9.1 SRM 429 267 4 Daidzeina 9.6 SIM 253 253 5 Gliciteina 10.4 SIM 283 283 6 Genisteina 11.3 SIM 269 269 7 Cumestrol 13.0 SIM 267 267 8 Formononetina 14.8 SIM 267 267
*SRM= single reaction monitoring; SIM = single ion monitoring
Curbele de calibrare au fost realizate in intervalul 40-2000 ng/ml.
27
Curba de calibrare pentru ononină Concentraţiile de fitoestrogeni regăsite în probele nehidrolizate
Proba G1 G2 G3 G4 Compus Concentraţie (ng/ml) Daidzină 233.4 0.0 306.9 114.5 Genistină 0.0 0.0 0.0 0.0 Ononină 23120.1 507.3 13928.8 21335.3 Daidzeină 2681.4 0.0 2026.6 382.6 Gliciteină 0.0 0.0 0.0 0.0 Genisteină 285.1 0.0 180.3 69.0 Cumestrol 1016.1 0.0 432.9 575.5 Formononetină 7838.7 64.2 3919.3 4789.8
Concentraţiile de fitoestrogeni regăsite în probele hidrolizate (echivalent în extractul iniţial)
Proba G1 G2 G3 G4 Compus Concentratie (ng/ml) Daidzină 0.0 0.0 0.0 0.0 Genistină 0.0 0.0 0.0 0.0 Ononină 5036.7 5055.1 6605.0 4350.7 Daidzeină 2487.6 3165.5 2590.4 634.9 Gliciteină 0.0 0.0 0.0 0.0 Genisteină 433.6 193.9 330.8 288.3 Cumestrol 705.4 252.6 320.0 214.9 Formononetină 14505.3 12032.2 14896.6 14157.0
28
Conţinutul comparativ în fitoestrogeni din cele patru probe nehidrolizate
Conţinutul comparativ în fitoestrogeni din cele patru probe hidrolizate
Concluzii
1. Comparând rezultatele din probele analizate, se observă că, extractele din Bilekh, Alepo-Azaz şi Rass-Aenn sunt mai bogate în compuşi fitoestrogenici.
2. Ononina este cea mai abundentă izoflavonă glicozidată şi se găseşte în toate probele. Agliconul său, formononetina, este prezent în cantităţile cele mai mari în toate extractele, cu excepţia probei din Rakka ce conţine cantităţi mai mici din acest compus.
29
3. Daidzina şi agliconii genisteinei şi cumestrolului lipsesc din extractul din Rakka.
4. Diferenţele calitative şi cantitative dintre extractele testate pot fi explicate prin condiţiile pedoclimatice diverse din ariile de recoltare ale produsului vegetal.
CAPITOLUL 8
ANALIZA COMPUŞILOR STEROLICI DIN GLYCYRRHIZA GLABRA Sterolii sunt monoalcooli secundari ciclici, care derivă de la o hidrocarbură policiclică,
numită steran, nucleul de bază fiind de natură ciclopentanperhidrofentrenică. Pentru analiza sterolilor din extractele de Glycyrrhiza glabra s-a folosit cromatografia de
lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masa (LC/MS). Metoda de analiza utilizată se bazează pe o metodă HPLC publicată în literatura de specialitate, la care s-au adus unele modificări.
Principala modificare adusă metodei iniţiale este schimbarea coloanei cromatografice şi a debitului fazei mobile. Ca rezultat, faţă de metoda publicată în literatură, timpul de analiză a scăzut de la 30 minute la 5 minute fără a afecta separarea şi rezoluţia sterolilor.
Probele luate în lucru sunt constituite din părţi din rădăcini de Glycyrrhiza glabra colectate din Siria, din 4 locaţii: Bilekh (notată G1), Rakka (notată G2), Alepo-Azaz (notată G3), Rass-Aenn (notată G4).
Pentru determinarea cantitativa, au fost utilizate patru standarde, beta-sitosterol, stigmasterol, campesterol si ergosterol (fig. 1), achiziţionate de la firma Sigma (Germania). Din standardele au fost preparate soluţii cloroformice stoc (1 mg/ml), păstrate la 4 0C, ferite de lumină, care au fost diluate corespunzător cu acetonitril înainte de injectarea în HPLC.
Analiza s-a efectuat utilizând un sistem Agilent 1100 HPLC Series, echipat cu degazor G1322A, pompă cu gradient cuaternar G1311A, autosampler G1313A. Pentru separare s-a utilizat o coloană analitică cu fază inversă Zorbax SB-C18 (100 mm x 3.0 mm i.d., 5 µm), prevăzută cu o precoloană Zorbax SB-C18, menţinute la temperatura de 40 0C.
Pentru prepararea fazei mobile s-a folosit un amestec alcătuit din metanol şi acetonitril 30:70 (v/v), iar eluţia a fost izocratică. Debitul fazei mobile este de 1 ml/min, iar volumul de injectare este de 4 μl.
S-a folosit detecţie MS/MS, mod de analiză MRM, monitorizarea ionilor specifici sterolilor.
Pentru detecţia prin spectrometrie de masă s-a utilizat un spectru de masă Agilent Ion Trap 1100 VL dotat cu o interfaţă APCI (atmosferic pressure chemical ionisation) cu mod de
30
ionizare pozitiv. Pentru a obţine valori maxime de sensibilitate, condiţiile de lucru au fost optimizate astfel: gaz de uscare - azot, debit 7 L/min, temperatură 250 0C, nebulizator - azot, presiune 50 psi, potenţial capilară - -4000 V.
Datele cromatografice au fost procesate utilizând programul Chem Station (vA09.03) şi Data Analysis (v 5.3) de la Agilent, SUA.
În conditiile cromatografice anterioare, timpii de retenţie ai celor patru steroli analizaţi sunt: 2.4 min pentru ergosterol, 3.7 min atât pentru stigmasterol cât şi pentru campesterol (coeluţie) şi 4.2 min pentru sitosterol.
Ionii monitorizaţi prin metoda MS sunt prezentaţi în tabelul VIII.1. Deoarece în condiţiile de ionizare toţi sterolii pierd o moleculă de apă, ionii detectaţi de spectrometru sunt întotdeauna de forma [M-H2O+H]+.
Ionii specifici sterolilor monitorizaţi în metoda de screening, în ordinea crescătoare a timpului de retenţie
Sterol Timp retenţie min M M-H2O M-H2O+H+
Ergosterol 2.4 396 378 379
Stigmasterol 3.7 412 394 395
Campesterol 3.7 400 382 383
Sitosterol 4.2 414 396 397
Detecţia MS a pus în evidenţă ionii-părinte ai sterolilor analizaţi (ioni parinte = ioni care se formează dupa ionizarea substanţei, înainte de o eventuala fragmentare). În cazul fiecărui sterol, s-a pus în evidenţă ionul aşteptat (tabelul 8. 1).
Cromatograma totalului ionic a unui amestec al celor patru steroli este prezentată mai jos. Este reprezentată grafic suma tuturor ionilor scanaţi de spectrometru, indiferent de masa acestora.
31
ST_CC___000011.D: TIC +All MSn
0
1
2
3
4
56x10
Intens.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Time [min]
Cromatograma totalului ionic al unui amestec de standarde de steroli. Ordinea de elutie este ergosterol (2.4 min), stigmasterol şi campesterol (ambele la 3.7 min), sitosterol (4.2 min); [picul
de la 3.2 min corespunde colesterolului]
Spectrul de tip full-scan al stigmasterolului în faza mobilă
Ionii specifici ai celor patru standarde de steroli (379 pentru ergosterol, 395 pentru stigmasterol, 383 pentru campesterol şi 397 pentru beta-sitosterol) au fost fragmentaţi, iar pe baza fragmentelor din spectrul MS s-au construit cromatogramele extrase ale fiecărui compus.
384.5
385.5
395.4
396.4
397.4407.3
409.4
+MS, 3.6-3.6min (#999-#1017)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
6x10
385 390 395 400 405 m/z
32
Această metodă de analiză (numită şi MS/MS) este extrem de specifică, deoarece în metoda de screening, unde se înregistrează doar intensitatea ionului principal, un compus izomer – deci cu aceeaşi masă moleculară – poate da un semnal fals pozitiv. Dar în analiza pe baza fragmentelor din spectrul MS, care sunt specifice fiecărei structuri în parte şi nu sunt aceleaşi la izomeri diferiţi, se va detecta doar compusul de interes, fără interferenţe din partea
Mai mult, intensitatea ionilor din spectrul de masă este proporţională cu concentraţia substanţei în proba analizată, deci metoda poate fi aplicată şi pentru cuantificare în loc de identificare calitativă.
Spectrul MS/MS al ergosterolului.
146.9
160.9
174.9
189.0203.0
215.0
229.0
243.0
257.0
271.0
287.1
301.2
315.2
327.2
341.1
355.2369.2
379.2
395.1
100 150 200 250 300 350 400 m/z0
2000
4000
6000
Intens.
146.9
160.9 186.9200.9
215.0
227.0
241.0
255.0
269.1
283.1
297.1
311.1
325.2
339.2
100 150 200 250 300 350 400 m/z0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4x10Intens.
33
Spectrul MS/MS al campesterolului
În vederea cuantificării celor patru steroli din extractele vegetale, s-au construit cromatogramele extrase pentru fiecare dintre ei, ţinând cont de intensitatea principalilor ioni din spectrul de masă. Ionii folosiţi pentru cuantificare sunt enumeraţi în tabelul următor.
Ionii din spectrele MS ale sterolilor analizaţi pe baza cărora s-a realizat cuantificarea
Nr. Nume compus Ioni specifici pentru identificare
Ion [M-H2O+H+] > Ioni din spectru
1 Ergosterol 379> 158.9; 184.9; 199; 213; 225; 239; 253; 295; 309; 323
2 Stigmasterol 395> 255; 297; 283; 311; 241; 201
3 Campesterol 383> 147; 149; 161; 175; 189; 203; 215; 229; 243; 257
4 Beta-Sitosterol 397> 160.9; 174.9; 188.9; 202.9; 214.9; 243; 257; 287.1; 315.2
Pentru construirea curbelor de calibrare, cele patru standarde de steroli au fost dizolvate
în cloroform (concentraţie 1 mg/ml), după care s-au făcut diluţii succesive în acetonitril pentru obţinerea soluţiilor de calibrare.
Concentraţiile soluţiilor de calibrare ale stigmasterolului şi acurateţea determinării
Nivel concentraţie
Stigmasterol
Concentraţie teoretică (ng/ml)
Concentraţie regăsita (ng/ml)
Acuratete (%)
1 150.0 163.5 109.0
2 300.0 277.0 92.3
3 600.0 534.3 89.1
4 1200.0 1213.0 101.1
5 2400.0 2651.4 110.5
34
6 4800.0 4727.7 98.5
7 7200.0 7781.6 108.1
Cromatogramele celor patru steroli analizaţi (A: semnale suprapuse, B: ergosterol, C: stigmasterol, D: campesterol, E: beta-sitosterol).
ST_CC___000011.D: TIC +All MSn
ST_CC___000011.D: EIC 158.9; 184.9; 199; 213; 225; 239; 253; 295; 309; 323 +MS2(379.3)
ST_CC___000011.D: EIC 255; 297; 283; 311; 241; 201 +MS2(395.3)
ST_CC___000011.D: EIC 147; 149; 161; 175; 189; 203; 215; 229; 243; 257 +MS2(383.3)
ST_CC___000011.D: EIC 160.9; 174.9; 188.9; 202.9; 214.9; 243; 257; 287.1; 315.2 +MS2(397.3)
0
1
2
3
46x10
Intens.
0.0
0.5
1.0
1.5
6x10
0
2
4
6
5x10
0.0
0.5
1.0
1.56x10
0.0
0.5
1.0
1.5
6x10
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Time [min]
A
B
C
D
E
35
Curba de calibrare a stigmasterolului
În tabelul următor sunt prezentaţi parametrii curbei de calibrare pentru fiecare
standard utilizat.
STANDARD ECUAŢIA CURBEI DE CALIBRARE R2 Ergosterol y = 2006.6073 x + 14988.2649 0.9994
Stigmasterol y = 656.1371 x + 6552.3729 0.9957
Campesterol y = 2514.6804 x + 56452.9510 0.9987
Sitosterol y = 2085.1047 x + 16268.9043 0.9937
Concentratiile de steroli regăsite în cele 4 extracte de Glycyrrhiza glabra sunt prezentate
în tabelul de mai jos.
Concentratiile sterolilor în probele analizate (concentraţiile sunt determinate în proba injectată în HPLC)
Proba G1 G2 G3 G4
Compus Concentratie (ng/ml)
Ergosterol 3117.8 2053.1 2977.2 1894.3
Stigmasterol 7185.5 6346.0 5784.1 3241.9
Campesterol 1484.0 1411.5 2285.8 1074.2
Sitosterol 6624.8 7408.6 12448.7 5562.0
Cromatogramele extrase pentru cei patru steroli determinaţi din probele analizate sunt
prezentate în figurile 8.(16 – 19) dintre care o prezentăm doar pe cea a probei G1
36
ST_CC___000013.D: EIC 158.9; 184.9; 199; 213; 225; 239; 253; 295; 309; 323 +MS2(379.3)
ST_CC___000013.D: EIC 255; 297; 283; 311; 241; 201 +MS2(395.3)
ST_CC___000013.D: EIC 147; 149; 161; 175; 189; 203; 215; 229; 243; 257 +MS2(383.3)
ST_CC___000013.D: EIC 160.9; 174.9; 188.9; 202.9; 214.9; 243; 257; 287.1; 315.2 +MS2(397.3)
0.0
0.5
1.0
6x10Intens.
0.00
0.25
0.50
0.75
6x10
0
2
4
5x10
0
1
2
6x10
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Time [min] Cromatogramele extrase ale ergosterolului, stigmasterolului, campesterolului şi sitosterolului din
proba G1 În figurile 8.(20 – 23) este reprezentat grafic conţinutul în fitosteroli în fiecare din probele analizate, iar în figura 8.24 comparativ pentru cele patru probe.
Ergosterol
StigmasterolCampesterol
Sitosterol
37
Fig.8.20. Concentraţia în fitosteroli în proba G1
Ergosterol
Stigmasterol
Campesterol
Sitosterol
Fig.8. 21. Concentraţia în fitosteroli în proba G2
Ergosterol
Stigmasterol
Campesterol
Sitosterol
Fig.8. 22. Concentraţia în fitosteroli în proba G3
38
Ergosterol
Stigmasterol
Campesterol
Sitosterol
Fig.8. 23. Concentraţia în fitosteroli în proba G4
Din cei patru steroli analizaţi, în proba G1 din Bilekh se găseşte o cantitate mai mare de stigmasterol, fapt mai rar întâlnit în lumea vegetală, în plante, de obicei, predomină beta-sitosterolul, aşa cum este cazul probelor G2-G4.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
1 2 3 4
ErgosterolStigmasterolCampesterolSitosterol
Fig.8.24. Conţinutul comparativ în fitosteroli din cele patru probe
39
Concluzii 1.In toate cele patru probe predomină beta-sitosterolul şi stigmasterolul, în proba G3 din
Alepo-Azaz găsindu-se cea mai mare cantitate de beta-sitosterol, 2. In proba G1 din Bilekh găasindu-se cea mai mare cantitate de stigmasterol, în care se
se găseşte şi cea mai mare cantitate de ergosterol. 3. În proba G3 din Alepo-Azaz se găseşte şi cea mai mare cantitate de campestrol. 4. Proba G4 din Rass-Aenn are conţinutul cel mai mic în steroli.
CAPITOLUL 9
ANALIZA COMPUŞILOR POLIFENOLICI, FITOESTROGENICI ŞI STEROLICI DIN TINCTURA DE GLYCYRRHIZA GLABRA
Pentru a avea o valoarea a conţinutului în compuşi polifenolici, fitoestrogenici şi sterolici cât mai exactă dintr-o formă farmaceutică, aceşti compuşi s-au determinat utilizând aceleaşi metode ca şi în capitolele 6-8 dintr-o soluţie alcoolică de tip tinctură.
Pentru analiza compuşilor polifenolici din tinctură s-a folosit cromatografia de lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masă (LC/MS), utilizând aceleaşi 18 standarde: acid cafeic, acid clorogenic, acid p-cumaric, kenferol, apigenină, rutozidă, cvercetol, cvercitrozidă, izocvercitrozidă, fisetină, hiperozidă, miricetol, acid ferulic, acid gentisic, acid sinapic, patuletină, luteolină, acid caftaric.
Pentru analiza compuşilor fitoestrogenici din tinctură am folosit cromatografia de lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masă (LC/MS), utilizând ca standarde daidzină, genistină, ononină, daidzeină, gliciteină, genisteină, cumestrol, formononetină.
Pentru analiza sterolilor din tinctură s-a folosit cromatografia de lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masa (LC/MS), iar ca standarde: beta-sitosterol, stigmasterol, campesterol si ergosterol.
Analizele s-au efectuat utilizând un sistem Agilent 1100 HPLC Series, echipat cu degazor
G1322A, pompă cu gradient cuaternar G1311A, autosampler G1313A. Pentru separare s-a utilizat o coloană analitică cu fază inversă Zorbax SB-C18 (100 mm x 3.0 mm i.d., 3.5 µm – pentru polifenoli şi 100 mm x 3.0 mm i.d., 5 µm – pentru steroli şi fitoestrogeni), prevăzută cu o precoloană Zorbax SB-C18, menţinute la temperatura de 48 0C (polifenoli), 50 0C (fitoestrogeni), 40 0C (steroli), .
Pentru polifenoli detecţia s-a realizat:
- în ultraviolet la 330 nm primele 17 minute, apoi la 370 nm până la 38 minute, utilizând un detector DAD G1315 A.
40
- prin spectrometrie de masă, utilizând un spectrometru de masă Agilent Ion Trap 1100 VL dotat cu o interfaţă ESI (electrospray) cu mod de ionizare negativ, gaz de uscare - azot, debit 12 L/min, temperatură 360 0C, nebulizator - azot, presiune 70 psi, potenţial capilară - +3000 V.
Pentru fitoestrogeni detecţia s-a realizat:
- prin spectrometrie de masă, utilizând un spectrometru de masă Agilent Ion Trap 1100 VL dotat cu o interfaţă ESI în mod de ionizare negativ, SIM pentru agliconi şi SRM pentru glicozide, gaz de uscare - azot, debit 12 L/min, temperatură 360 0C, nebulizator - azot, presiune 65 psi, potenţial capilară - +4500 V.
Pentru steroli detecţia s-a realizat:
- prin spectrometrie de masă, utilizând un spectru de masă Agilent Ion Trap 1100 VL dotat cu o interfaţă APCI în mod de ionizare pozitiv, gaz de uscare - azot, debit 7 L/min, temperatură 250 0C, nebulizator - azot, presiune 50 psi, potenţial capilară - -4000 V.
Datele cromatografice au fost procesate utilizând programul Chem Station (vA09.03) şi Data Analysis (v 5.3) de la Agilent, SUA.
1. Analiza compuşilor polifenolici Conţinutul (μg/ml) în compuşi polifenolici al tincturii, proba nehidrolizată
Compus Identificat UV Confirmat MS Concentraţie în tinctură (ug/ml)
Ac gentisic NU DA -
Ac cafeic NU DA -
Ac p-cumaric DA DA 1.270
Ac ferulic DA DA 1.560
Luteolina DA DA 0.620
41
Apigenina DA DA 1.708
Conţinutul (μg/ml) în compuşi polifenolici al tincturii, proba hidrolizată
Compus Identificat UV Confirmat MS Concentraţie în tinctură (ug/ml)
Ac gentisic NU DA -
Ac cafeic NU DA -
Ac p-cumaric DA DA 13.859
Ac ferulic DA DA 25.912
Ac sinapic DA DA 9.534
Luteolina DA DA 0.966
Apigenina DA DA 2.361
Fig.9.1. Conţinutul comparativ în compuşi polifenolici din tinctură,
proba nehidrolizată/probă hidrolizată
42
Fig. 9.2. Cromatograma tincturii de Glycyrrhiza glabra nehidrolizate, UV
Fig. 9.3. Cromatograma tincturii de Glycyrrhiza glabra hidrolizate, UV
Acidul gentisic şi cafeic nu au putut fi determinaţi cantitativ în nici una din probe, cantitatea fiind sub limita de cuantificare.
Luteolina, apigenina, acidul p-cumaric şi ferulic sunt prezente atât în proba nehidrolizată cât şi în cea hidrolizată, sub formă glicozidată şi sub formă de agliconi liberi, cantităţile fiind mai mari după hidroliză.
În proba hidrolizată s-a găsit şi cuantificat acid sinapic.
2. Analiza compuşilor fitoestrogenici
43
Concentraţiile de fitoestrogeni regăsite în tinctură, proba nehidrolizată şi hidrolizată sunt în tabelelul 9.3.
Figurile 9.5-9.6 prezintă cromatogramele tincturii de Glycyrrhiza glabra, proba nehidrolizată şi hidrolizată.
Tabel 9.3
Concentraţiile (ng/ml) de fitoestrogeni regăsite în tinctură, proba nehidrolizată şi hidrolizată
Proba Tinctură – proba nehidrolizată Tinctură – proba hidrolizată
Compus
Daidzină 884.3 286.8
Genistină 0.0 251.2
Ononină 13744.6 11620.5
Daidzeină 2672.3 2682.1
Gliciteină 1237.7 1907.6
Genisteină 513.2 531.3
Cumestrol 948.8 211.1
Formononetină 12749.0 10030.7
44
Fig.9.4. Concentraţia în fitoestrogeni în tinctură (nehidrolizată şi hidrolizată)
Daizina, ononina, cumestrolul, formononetina se găsesc în cantităţi mai mari în tinctură, proba nehidrolizată, iar daidzeina, gliciteina, genisteina se găsesc în cantităţi mai mari în tinctură, proba hidrolizată.
3. Analiza sterolilor
Concentratiile de steroli regăsite în tinctura de Glycirrhiza glabra sunt prezentate în tabelul 9.5 şi figura 9.7, iar cromatogramele extrase pentru cei patru steroli determinaţi sunt redată în figura 9.8. Tabel 9.5
Concentratiile sterolilor în tinctură (concentraţiile sunt determinate în proba injectată în HPLC)
Proba Tinctură
Compus Concentraţie (ng/ml)
Ergosterol 1856.3
45
Stigmasterol 14847.5
Campesterol 4704.0
Sitosterol 27549.2
Campesterol
Stigmasterol
Ergosterol
Sitosterol
Fig. 9.7 Concentraţia în fitosteroli în tinctură
Tinctura analizată prezintă toţi cei patru steroli analizaţi: sitosterol, ergosterol,
stigmasterol, campesterol.
Figurile 9.(9 – 12) prezintă comparativ conţinutul în compuşii analizaţi în tinctură.
46
1.271.560.621.708
884.30
13744.62672.3
1237.7513.2
948.812749
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
Ac p-cumaricAc ferulicLuteolina
ApigeninaDaidzină
GenistinăOnonină
DaidzeinăGliciteină
GenisteinăCumestrol
Formononetină
Fig. 9.9. Conţinutul comparativ în componenţi polifenolici şi fitoestrogenici din tinctură, proba nehidrolizată
13.85925.9120.9662.361
286.8251.2
11620.52682.1
1907.6531.3
211.110030.7
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
Ac p-cumaricAc ferulicLuteolina
ApigeninaDaidzină
GenistinăOnonină
DaidzeinăGliciteină
GenisteinăCumestrol
Formononetină
Fig. 9.10. Conţinutul comparativ în componenţi polifenolici şi fitoestrogenici din tinctură,
proba hidrolizată
47
1.271.560.621.708
884.30
2672.31237.7
513.2948.8
127491856.3
14847.54704
27549.2
13744.6
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
Ac p-cumaricAc ferulicLuteolinaApigenina
DaidzinăGenistinăOnonină
DaidzeinăGliciteină
GenisteinăCumestrol
FormononetinăErgosterol
StigmasterolCampesterol
Sitosterol
Fig. 9.11. Conţinutul comparativ în componenţi polifenolici şi fitoestrogenici din tinctură, proba nehidrolizată şi compuşii sterolici
13.85925.9120.9662.361286.8251.2
2682.11907.6
531.3211.1
10030.71856.3
14847.54704
27549.2
13744.6
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
Ac p-cumaricAc ferulicLuteolinaApigenina
DaidzinăGenistinăOnonină
DaidzeinăGliciteină
GenisteinăCumestrol
FormononetinăErgosterol
StigmasterolCampesterol
Sitosterol
Fig. 9.12. Conţinutul comparativ în componenţi polifenolici şi fitoestrogenici din tinctură, proba hidrolizată şi compuşii sterolici
Concluzii
În nici una din probe nu s-au găsit patuletină, kemferol, fisetină, miricetină, hiperozidă, cvercitrozidă, izocvercitrozidă, rutozidă.
Acidul p-cumaric, ferulic, luteolina şi apigenina s-au găsit şi cuantificat în ambele probe (nehidrolizată şî idrolizată). Acidul sinapic s-a determinat doar în proba hidrolizată.
48
Daizina, ononina, cumestrolul, formononetina, daidzeina, gliciteina, genisteina sunt prezente în tinctură, atât în proba nehidrolizată, cât şi în cea hidrolizată. Genistina este absentă în proba nehidrolizată.
Dintre steroli, cea mai mare cantitate regăsită în tinctură este de sitosterol, iar cea mai mică ergosterol. Comparând componentele determinate în tinctură, se poate observa că, predomină sitosterolul, stigmasterolul, formononetina şi ononina.
49
CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE.
PERSPECTIVE DE CERCETARE.
CONCLUZII GENERALE
În lucrare sunt prezentate rezultatele studiului întreprins asupra a patru eşantioane din specia de Glycyrrhiza glabra recoltate din diferite zone ale Siriei: Bilekh, Rakka, Alepo-Azaz, Rass-Aenn.
Lucrarea este structurată în două părţi: Stadiul cunoaşterii formată din 3 capitole şi Contribuţii proprii formată din 6 capitole.
Partea generală sistematizează informaţiile din materialul bibliografic referitoare la Glycyrrhiza glabra:
1. Primul capitol intitulat „Profilul botanic şi chimic al speciei Glycyrrhiza glabra” cuprinde încadrarea sistematică a speciei, răspândirea speciilor pe glob, varietăţile comerciale de licviriţie, caracterele organoleptice, condiţiile de recoltare şi condiţionare, caracterele microscopice, date referitoare la compoziţia chimică din Glycyrrhiza glabra, Glycyrrhiza uralensis, Glycyrrhiza inflata, Glycyrrhiza eurycarpa, Glycyrrhiza aspera, compuşi cu structură triterpenică, flavonoide, isoflavonoide, calcone, cumarine.
2. Capitolul doi cuprinde aspecte farmacocinetice, date referitoare la acţiunile farmacologice ale Glycyrrhizei glabra: acţiune antiinflamatoare, acţiune antimicrobiană şi antivirală, acţiune antiprotozoarică, acţiune antioxidantă, acţiune asupra aparatului digestiv, acţiune antitumorală, studii asupra sistemului nervos central, studii cardiovasculare, imunologice, studii renale, activităţi citotoxice, studii respiratorii, efecte asupra diferenţelor de joncţiune ale canaleor, studii endocrinologice, farmacologia clinică, efecte gastrointestinale, efecte anticanceroase, efecte antioxidative, efecte antivirale şi hepatoprotectoare, studii dermatologice, efecte endocrinologice, boli respiratorii. De asemenea, au fost prezentate informaţii referitoare la analiza toxicologică: semnele clinice de intoxicaţie, tratament, carcinogeneză, mutageneză, scăderea fertilităţii. Tot în acest capitol am mai prezentat modificările chimice ale acidului glicirizic în vederea obţinerii de noi substanţe active
3. Dintre metodele de analiză a principiilor active din Glycyrrhiza glabra ne-am oprit la metodele cromatografice – cromatografia pe strat subţire, cromatografie de lichide de înaltă performanţă, metodele spectrale – UV, IR, RMN, metodele elctrochimice – electroforeză, polarografie.
Partea de Contribuţii originale este structurată în 6 capitole ce includ: caracterizarea macroscopică şi microscopică a rădăcinilor de Glycyrrhiza glabra recoltate din Siria, analiza
50
compuşilor polifenolici, fitoestrogenilor, compuşilor sterolici din Glycyrrhiza glabra şi analiza compuşilor polifenolici, fitoestrogenici şi sterolici din tinctura de Glycyrrhiza glabra.
4. Capitolul 4 cuprinde caracterizarea din punct de vedere macroscopic şi microscopic eşantioane de Glycyrrhiza glabra recoltate din flora Siriei, din patru zone diferite: Bilekh, Rakka, Alepo-Azaz, Rass-Aenn. În cadrul analizei microscopice s-au urmărit drept caractere histo-anatomice de diferenţiere în caracterizarea celor 4 eşantioane: periderma (localizare; grosime; grad de exfoliere); fibrele sclerenchimatice (corticale; liberiene; lemnoase); razele medulare (principale; secundare); măduva. La toate eşantioanele razele medulare (principale şi secundare) fragmentează inelul iniţial de liber secundar în trapeze foarte înguste.
In urma analizei microscopice putem spune ca există diferenţe în caracterele histo-anatomice de tip peridermă, fibre sclerenchimatice, raze medulare şi măduvă ale celor patru eşantioane de Glycyrrhiza glabra, dar şi asemănări după cum urmează: periderma eşantioanelor din Alepo-Azaz şi Rass-Aenn este asemănătoare cu cea a eşantionului din Bilekh, fibrele sclerenchimatice ale eşantionului Rakka sunt asemănătoare, dar mai numeroase decât cele ale eşantionului din Bilekh, fibrele sclerenchimatice liberiene ale eşantionului Alepo-Azaz sunt asemănătoare cu cele ale eşantionului Rakka, iar cele ale lemnoase seamănă cu eşantionul Bilekh, razele medulare ale eşantioanelor Alepo-Azaz şi Rass-Aenn sunt asemănătoare cu cele ale eşantionului Rakka, măduva eşantionului Rakka este asemănătoare eşantionului Bilekh.
5. În capitolul 5 am prezentat analiza cromatografică a extractelor alcoolice obţinute din rădacinile şi rizomii de Glycyrrhiza glabra de origine siriană prin cromatografie pe strat subţire şi cromatografie de lichide de înaltă performanţă. Analizele cromatografice pe strat subţire au fost efectuate fără a folosi substanţe de referinţă şi au arătat că cele două vizualizări scot în evidenţă prezenţa compuşilor flavonici, numărul acestora observaţi depinzând de lungimea de undă UV.
6. Capitolul 6 include analiza compuşilor polifenolici din Glycyrrhiza glabra utilizând cromatografia de lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masă (LC/MS). Acidul gentisic, p-cumaric, ferulic şi sinapic sunt acizii polifenolcarboxilici cel mai des întâlniţi în probele analizate, din care acidul p-cumaric, ferulic şi sinapic pot fi cuantificaţi. Luteolina este observată în toate probele atât nehidrolizate cât şi hidrolizate. În nici una din probe nu s-au găsit patuletină, kemferol, fisetină, miricetină, hiperozidă, cvercitrozidă, izocvercitrozidă, rutozidă. Proba din Bilekh a avut cea mai mare cantitate de luteolină, cea din Rakka de acid p-cumaric şi acid ferulic, cea din Alpo-Azaz de acid sinapic, iar cea din Rass-Aenn de apigenină.
7. Analiza fitoestrogenilor din Glycyrrhiza glabra s-a realizat prin cromatografia de lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masă (LC/MS). Metoda se poate aplica pentru analiza cantitativă a opt compuşi cu activitate fito-estrogenică (şapte izoflavone şi un
51
lignan). Comparând rezultatele din probele analizate, se observă că, extractele din Bilekh, Alpo-Azaz şi Rass-Aenn sunt mai bogate în compuşi fitoestrogenici. Ononina este cea mai abundentă izoflavonă glicozidată şi se găseşte în toate probele. Agliconul său, formononetina, este prezent în cantităţile cele mai mari în toate extractele, cu excepţia probei din Rakka ce conţine cantităţi mai mici din acest compus. Daidzina şi agliconii genisteinei şi cumestrolului lipsesc din extractul din Rakka. Diferenţele calitative şi cantitative dintre extractele testate pot fi explicate prin condiţiile pedoclimatice diverse din ariile de recoltare ale produsului vegetal.
8. Pentru analiza sterolilor din extractele de Glycyrrhiza glabra s-a folosit cromatografia de lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masa (LC/MS). In toate cele patru probe predomină beta-sitosterolul şi stigmasterolul, în proba G3 din Alpo-Azaz găsindu-se cea mai mare cantitate de beta-sitosterol, iar în proba G1 din Bilekh găasindu-se cea mai mare cantitate de stigmasterol, în care se se găseşte şi cea mai mare cantitate de ergosterol. În proba G3 din Alpo-Azaz se găseşte şi cea mai mare cantitate de campestrol. Proba G4 din Ras-Aenn are conţinutul cel mai mic în steroli.
9. Pentru a avea o valoarea a conţinutului în compuşi polifenolici, fitoestrogenici şi
sterolici cât mai exactă dintr-o formă farmaceutică, aceşti compuşi s-au determinat dintr-o soluţie alcoolică de tip tinctură. Luteolina, apigenina, acidul p-cumaric şi ferulic sunt prezente atât în proba nehidrolizată cât şi în cea hidrolizată, sub formă glicozidată şi sub formă de agliconi liberi, cantităţile fiind mai mari după hidroliză. În proba hidrolizată s-a găsit şi cuantificat acid sinapic. Daizina, ononina, cumestrolul, formononetina se găsesc în cantităţi mai mari în tinctură, proba nehidrolizată, iar daidzeina, gliciteina, genisteina se găsesc în cantităţi mai mari în tinctură, proba hidrolizată. Tinctura analizată prezintă toţi cei patru steroli analizaţi: sitosterol, ergosterol, stigmasterol, campesterol.
CONTRIBUŢII ORIGINALE
Rezultatele cercetărilor experimentale efectuate în cadrul tezei de doctorat includ o serie de contribuţii cu caracter de originalitate:
- analiza speciei de Glycyrrhiza glabra din patru zone zone ale Siriei: Bilekh, Rakka, Alepo-Azaz, Rass-Aenn
- am pus la punct o metodă cromatografică pe strat subtire şi una cromatografică de lichide de înaltă performanţă pentru extracte alcoolice
- am pus la punct o metodă HPLC-MS pentru determinarea compuşilor polifenolici din extractele de Glycyrrhiza glabra
- am pus la punct o metodă HPLC-MS pentru determinarea compuşilor fitoestrogenilor din extractele de Glycyrrhiza glabra
- am realizat o analiză calitativă şi cantitativă a compuşilor sterolici din cele patru sorturi luate în lucru de Glycyrrhiza glabra prin utilizarea unei metode HPLC-MS
- am realizat analiza compuşilor polifenolici, fitoestrogenici şi sterolici din tinctura de Glycyrrhiza glabra
52
PERSPECTIVE DE CERCETARE
Datorită compoziţiei complexe a speciei analizate, este posibil să se iniţieze noi cercetări pentru identificarea şi caracterizarea celorlalte grupe de compuşi cu acţiune farmacologică.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA
1. Snow J. Glycyrrhiza glabra Monograph. Protocol Journal of Botanical Medicine, 1,3: 9-14, 1996
2. BHMA British Herbal Compendium, Volume 1. British Herbal Medical Association,
Bournemouth, Devon, 1992
3. Ciulei I., Grigorescu Em., Stănescu Ursula, Plante medicinale, Fitochimie, Fitoterapie, Ed. Medicală Bucureşti, 1998
4. Stănescu Ursula, Anca Miron, Monica Hânceanu, Clara Aprotosoaie, Bazele
farmaceutice, farmacologice şi chimice ale fitoterapiei, vol. I, II, Ed. Gr.T.Popa Iaşi, 2002
5. Bruneton J. Pharmacognosy, phytochemistry, medicinal plants. Paris, Lavoisier, 549–
554, 1995
6. Williamson EM. 2003. Liquorice. In Potter’s Cyclopedia of Herbal Medicines. C W Daniels: Saffron Walden, UK, 269–271.
7. Li JR, Wang YQ, Deng ZZ. 2005. Two new compounds from Glycyrrhiza glabra. J
Asian Nat Prod Res 7: 677–680.
8. Haraguchi H. 2001. Antioxidative plant constituents. In Bioactive Compounds from Natural Sources: Isolation, Characterization and Biological Properties, Tringali C (ed.). Taylor and Francis: New York, 348–352.
9. Hiroaki Hayashi, Miyako Yasuma, Noboru Hiraoka, Yasumasa Ikeshiro, Hirobumi
Yamamoto, Erdem Yesilada, Ekrem Sezik, Gisho Honda and Mamoru Tabata, Flavonoid variation in the leaves of Glycyrrhiza glabra, Phytochemistry, Volume 42, Issue 3, 1996, 701-704
10. Ivan A. Ross, Medicinal plants of the world: chemical constituents, traditional and
modern medicinal uses, Humana Press, 2003
53
11. Zeng L., Fukai T., Nomura T., et al. Four new prenylated flavonoids, glyasperins A, B, C and D from the roots the Gycyrrhiza aspera // Heterocycles.- 1992.-Vol.34, N 3.-P.575-588
12. Xiu-Ping Shen，Pei-Gen Xiao6tg, Chang-Xiao Liu, Research and application of Radix
Glycyrrhizae Asian Journal of Pharmacodynamics and Pharmacokinetics,1608-2281-2007
13. Behrens, J. Can the utilisation and conservation of medicinal plants co-exist? European
Journal of Herbal Medicine, 5, 2001
14. Farese RV Jr, Biglieri EG, Shackleton CH, Irony I, Gomez-Fontes R. Licorice-induced hypermineralocorticoidism. N Engl J Med., 325 (17), 223-1227, 1991
15. Marjan N. A., Hossein H., Review of pharmacological effects of Glycyrrhiza glabra sp.
and its bioactive compounds, Phytother. Res. 22, 709-724, 2008
16. Kamei J, Saitoh A, Asano T et al. 2005. Pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles of the antitussive principles of Glycyrrhizae radix (licorice), a main component of the Kampo preparation Bakumondo-to (Mai-men-dong-tang). Eur J Pharmacol 507: 163–168.
17. Hatano T, Fukuda T, Miyase TT, Noro T, Okuda T. 1991b. Phenolic constituents of
licorice. III. Structures of glicoricone and licofuranone, and inhibitory effects of licorice constituents on monoamine oxidase. Chem Pharm Bull 39:1238–1243.
18. Hatano T, Fukuda T, Liu YZ, Noro T, Okuda T. 1991a. Phenolic constituents of licorice.
IV. Correlation of phenolic constituents and licorice specimens from various sources, and inhibitory effects of licorice extracts on xanthine oxidase and monoamine oxidase. Yakugaku Zasshi 111: 311–321.
19. Akamatsu H, Komura J, Asada Y, Niwa Y. 1991. Mechanism of anti-inflammatory
action of glycyrrhizin: effects on neutrophil functions including reactive oxygen species generation. Planta Med 57: 119–121.
20. Wang ZY, Nixon DW. 2001. Licorice and cancer. Nutr Cancer 39: 1–11.
21. Human skin fibroblasts. J Pharm Pharmacol 57: 1661–1666.
22. Perera P, Ringbom T, Huss U, Vasange M, Bohlin L. 2001. Search for natural products
which affect cyclooxygenase-2. In Bioactive Compounds from Natural Sources: Isolation, Characterization and Biological Properties, Tringali C (ed.). Taylor and Francis: New York, 458, 462.
54
23. Tsukahara M, Nishino T, Furuhashi I, Inoue H, Sato T, Matsumoto H. 2005. Synthesis and inhibitory effect of novel glycyrrhetinic acid derivatives on IL-1b-induced prostaglandin E2 production in normal human dermal fibroblasts. Chem Pharm Bull 53: 1103–1110.
24. Hatano T, Shintani Y, Aga Y, Shiota S, Tsuchiya T, Yoshida T. 2000b. Phenolic
constituents of licorice. VIII. Structures of glicophenone and glicoisoflavanone, and effects of licorice phenolics on methicillin-resistant Staphylococcus aureus.Chem Pharm Bull 48: 1286–1292.
25. Hatano T, Kusuda M, Inada K et al. 2005. Effects of tannins and related polyphenols on
methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Phytochemistry 66: 2047–2055.
26. Fukai T, Marumo A, Kaitou K, Kanda T, Terada S, Nomura T. 2002b. Antimicrobial activity of licorice flavonoids against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Fitoterapia 73:536–539.
27. Fukai T, Satoh K, Nomura T, Sakagami T. 2003. Preliminary evaluation of antinephritis
and radical scavenging activities of glabridin from Glycyrrhiza glabra. Fitoterapia 74: 624–629.
28. Onkarappa R, Shobha KS, Chaya K. 2005. Efficacy of four medicinally important plant
extracts (crude) against pathogenic bacteria. Asian J Microbiol Biotech Env Sci 7: 281–284.
29. He J, Chen L, Heber D, Shi W, Lu Q-Y. 2006. Antibacterial compounds from
Glycyrrhiza uralensis. J Nat Prod 69: 121–124.
30. Meghashri, Shubha Gopal, In Vitro Antifungal and Antibacterial Activities of Root Extract of Glycyrrhiza Glabra, Journal of Applied Sciences Research, 5(10): 1436-1439, 2009
31. Cohen JI. 2005. Licking latency with licorice. J Clin Invest 115:591–593.
32. Jenett-Siems K, Mockenhaupt FP, Bienzle U, Gupta MP, Eich E. 1999. In vitro
antiplasmodial activity of Central American medicinal plants. Trop Med Int Health 4: 611–615.
33. Haraguchi H, Yoshida N, Ishikawa H, Tamura Y, Mizutani K, Kinoshita T. 2000.
Protection of mitochondrial functions against oxidative stresses by isoflavans from Glycyrrhiza glabra. J Pharm Pharmacol 52: 219–223.
34. Sheela ML, Ramakrishna MK, Salimath BP. 2006. Angiogenic and proliferative effects
of the cytokine VEGF in Ehrlich ascites tumor cells is inhibited by Glycyrrhiza glabra. Int Immunopharmacol 6: 494–498.
55
35. Jo E-H, Kim S-H, Ra JC et al. 2005. Chemopreventive properties of the ethanol extract of
Chinese licorice (Glycyrrhiza uralensis) root: induction of apoptosis and G1 cell cycle arrest in MCF-7 human breast cancer cells. Cancer Lett 230:239–247.
36. Salvi M, Fiore C, Armanini D, Toninello A. 2003. Glycyrrhetinic acid-induced
permeability transition in rat liver mitochondria. Biochem Pharmacol 66: 2375–2379.
37. Hosseinzadeh H, Nassiri Asl M. 2003. Anticonvulsant, sedative and muscle relaxant effects of carbenoxolone in mice. BMCPharmacol 3: 3.
38. Mendes-Silva W, Assafim M, Ruta B, Monteiro RQ, Guimaraes JA, Zingali RB. 2003.
Antithrombotic effect of glycyrrhizin, a plant-derived thrombin inhibitor. Thrombosis Res 112:93–98.
39. Adamyan TsI, Gevorkyan ES, Minasyan SM, Oganesyan KR, Kirakosyan KA. 2005.
Effect of licorice root on peripheral blood indexes upon vibration exposure. Bull Exp Biol Med 140: 197–200
40. Somjen D, Katzburg S, Vaya J et al. 2004a. Estrogenic activity of glabridin and glabrene
from licorice roots on human osteoblasts and prepubertal rat skeletal tissues. J Steroid Biochem Mol Biol 91: 241–246.
41. Puodziuniene G, Janulis V, Milasius A, Budnikas V. 2005. Development of cough-
relieving herbal teas. Medicina 41: 500–505.
42. Goldie MP. 2005. Antioxidants in oral health care: making the connection. Int J Dent Hygiene 3: 93–95.
43. Kasyanov, G.I.; Kvasenkov O.I. Pat. 2000117, Rusşian Federation. Pub. 7.09.1993. Bull.
No. 33-36
44. Bondarev, A.I.; Zarudyi, F.S.; Rusakov, I.A. Chim. Pharm Zh., 1995, 29, 33.
45. Bondarev, A.I.; Zarudyi, F.S.; Rusakov, I.A. Chim. Pharm Zh., 1995, 29, 33.
46. Fodorea C. S., Vlase L., Leucuta S. E., Tamas M., Phytochemical Study on Some Polyphenols of Geranium pyrenaicum, Chemistry of Natural Compounds, 2005, 41(4), 400-403
47. Suciu S., Vlase L., Fodorea C. S., Tamas M., Leucuta S. E., Analiza HPLC a compusilor
polifenolici din specia indigena Eryngium campestre L., Revista de Medicina si Farmacie (Orcosi es Gyogyszereszeti Syemel), 2004, 50(2), 52-54
56
