Studiul oxigenului atomic...2 Introducere | Studiul oxigenului atomic din plasma de temperatură...

UNIVERSITATEA “ALEXANDRU IOAN CUZA”, IAŞI, ROMÂNIA

Studiul oxigenului atomic din plasma de temperatură joasă produsă în amestecuri

de gaze. Aplicaţii Rezumatul tezei

Doctorand: Iuliana Motrescu

Conducător de doctorat: Prof.univ.dr. Gheorghe Popa

2011

ANUNȚ

În data de 29 septembrie 2011 la ora 17.00 în sala L1, domnișoara Iuliana

MOTRESCU va susține în ședință publică teza de doctorat cu titlul ”Studiul

oxigenului din plasma de temperatură joasă produsă în amestecuri de gaze.

Aplicații”, în vederea obținerii titlului științific de doctor în domeniul

fundamental Științe Exacte, subdomeniul FIZICĂ.

Comisia de doctorat are următoarea componență:

Președinte:

Prof.univ.dr. Dumitru Luca, Decanul Facultății de Fizică,

Universitatea “Alexandru Ioan Cuza” Iași

Conducător științific:

Prof.univ.dr. Gheorghe Popa, Universitatea “Alexandru Ioan Cuza” Iași

Referenți:

Prof.univ.dr. Masaaki Nagatsu, Universitatea Shizuoka, Japonia

Prof. univ.dr. Sorin Anghel, Universitatea “Babeș Bolyai”, Cluj Napoca

Prof.univ.dr. Nicoleta Dumitrașcu, Universitatea “Alexandru Ioan Cuza” Iași

Vă transmitem rezumatul tezei de doctorat și vă invităm să participați la ședința

de susținere publică a tezei.

OUTLINE

1 GENERAL INTRODUCTION

1.1 MOTIVATION AND OUTLINE 1.2 BIOLOGICAL MATERIAL 1.2.1 MICROORGANISMS 1.2.2 PROTEINACEOUS BIOMOLECULES 1.2.3 STUDIED BIOMOLECULES 1.2.4 ANALYSIS METHODS OF BIOMOLECULES STRUCTURE AND FUNCTION

1.3 PLASMA PROCESSING 1.3.1 GENERAL CONSIDERATIONS ON THE DISCHARGES INVESTIGATED IN THIS THESIS 1.3.2 DIAGNOSIS OF LOW TEMPERATURE PLASMA 1.3.3 LOW TEMPERATURE PLASMA PROCESSING - PLASMA REACTIVITY

REFERENCES

2 ATMOSPHERIC PRESSURE PLASMA APPLICATIONS

2.1 MICROORGANISMS INACTIVATION USING ATMOSPHERIC PRESSURE PLASMA 2.1.1 INTRODUCTION 2.1.2 SYSTEM FOR PLASMA GENERATION 2.1.3 RESULTS

2.2 MODIFICATION OF PEPTIDE AND AMINOACIDS USING ATMOSPHERIC PRESSURE PLASMA JET 2.2.1 INTRODUCTION 2.2.2 PLASMA PARAMETERS 2.2.3 RESULTS OF GLYCINE MODIFICATION BY APPJ 2.2.4 RESULTS OF APPJ TREATMENT OF ARGININE VASOTOCIN 2.2.5 INTERACTIONS BETWEEN ATMOSPHERIC PRESSURE PLASMA AND BIOMOLECULES

2.3 CONCLUSIONS REFERENCES

3 LOW PRESSURE PLASMA APPLICATIONS

3.1 LOW PRESSURE OXYGEN PLASMA VS. ARGON PLASMA. THE CONTRIBUTION OF ATOMIC OXYGEN – STATE OF ART 3.2 SYSTEM FOR PLASMA GENERATION 3.3 BIOMOLECULE MODIFICATION UNDER NON-REACTIVE PLASMA PROCESSING 3.3.1 ARGON SWP DIAGNOSIS 3.3.2 INACTIVATION OF ARGININE VASOTOCIN 3.3.3 CYSTINE RESULTS

3.4 BIOMOLECULE MODIFICATION UNDER EXPOSURE TO OXYGEN SWP – THE ROLE OF NEUTRAL PARTICLES 3.4.1 OXYGEN SWP DIAGNOSIS 3.4.2 ARGININE VASOTOCIN RESULTS 3.4.3 CYSTINE RESULTS

3.5 THE CONTRIBUTION OF PLASMA RADIATION ON BIOMOLECULE MODIFICATION 3.5.1 EXPERIMENTAL SETUP AND CONDITIONS 3.5.2 RESULTS AND DISCUSSIONS

3.6 CONCLUSIONS OF LOW PRESSURE PLASMA APPLICATIONS REFERENCES

4 GENERAL CONCLUSIONS

ACKNOWLEDGMENTS

RESEARCH ACTIVITY

PAPERS CONFERENCES

1 Introducere | Studiul oxigenului atomic din plasma de temperatură joasă produsă în amestecuri de gaze. Aplicaţii

IInnttrroodduucceerree

Plasmele la temperatură joasă (sau reci) sunt plasme de neechilibru cu un grad de ionizare mai mic de 10% și conţinând ioni și neutri la o temperatură joasă. Plasmele reci pot fi produse atât la presiune joasă cât şi la presiune atmosferică comunicând energie electromagnetică unui volum de gaz [1].

Plasmele la temperatură joasă prezintă în ultima vreme un interes deosebit fiind utilizate într-un domeniu variat de aplicaţii şi asta datorită caracteristicilor pe care le au [1], [2]. Apariţia şi dezvoltarea unor astfel de metode bazate pe plasme reci permite tratarea materialelor sensibile la temperatură, cum ar fi polimerii, făcând posibilă o procesare la temperatură joasă, netoxică şi cu costuri reduse [3], [4]. Una din aceste aplicaţii este sterilizarea echipamentelor medicale într-un timp relativ scurt şi, desigur, beneficiind în acelaşi timp de avantajele menţionate.

Efectul antimicrobial al plasmei este asociat cu acţiunea sinergetică a particulelor încărcate sau neutre din punct de vedere electric, fotoni şi radicali produşi în descărcare. Acţiunea simultană a acestor factori induce procese fizice şi chimice [5]. Ultimele sunt predominante în cazul plasmelor reactive, produse în gaze pure sau amestecuri conţinând oxigen, azot, hidrogen sau un alt gaz reactiv [6].

Pe lângă abilitatea de a distruge microorganisme [7], [8], [9], [10], [11], [12] plasmele reci prezintă un mare interes în aplicaţiile ce îşi propun inactivarea şi îndepărtarea de pe suprafeţe ale contaminanţilor la nivel molecular, mai exact biomolecule [13]. Astfel de agenţi infecţioşi sunt reprezentaţi de enzime toxice care pot rămâne pe o suprafaţă după distrugerea încărcăturii bacteriene, prioni, responsabili pentru encefalopatiile spongiforme transmisibile (din care foarte cunoscută este boala vacii nebune) sau alte molecule proteice.

Ţinând seama de faptul că în prezent inactivarea unor astfel de molecule cu risc biologic (cum ar fi prionii) nu este posibilă în totalite prin folosirea metodelor clasice (termice şi/sau chimice) [14], [15], [16], [17] se impune crearea şi perfecţionarea unor metode eficiente pentru a inactiva astfel de molecule acestea putând fi bazate pe utilizarea plasmei. Plasmele reci si-au dovedit deja utilitatea in diferite aplicaţii medicale cum ar fi îmbunătăţirea biocompatibilităţii sau a altor proprietăţi ale unor biomateriale, sterilizarea echipamentelor medicale sensibile la temperatură, etc. Aşadar, pentru a modifica funcţional molecule cu risc biologic plasmele reci s-ar putea dovedi a fi o alternativă viabilă.

Până în prezent există un număr limitat de lucrări publicate care se ocupă cu modificarea unor molecule peptidice sau proteice folosind plasma [18], [20], [21]. Dintre efectele prezentate de aceste studii cele mai importante sunt: modificările moleculelor de ADN iradiate într-un reactor de plasmă în oxigen [18], modificarea unor enzime folosind o descărcare luminescentă, tratament care a dus la pierderea funcţiei enzimatice [21], degradarea parţială a legăturilor peptidice din structura primară a unor proteine expuse în plasmă [22], oxidări şi deaminări în cazul lânii tratate într-o descărcare luminescentă [23], alterarea structurală a ovalbuminei


tratată într-un reactor de plasmă [24]. Cu toate acestea în lucrările menţionate se discută foarte puţin sau chiar deloc despre mecanismele implicate în interacţiunea plasmei cu biomoleculele tratate şi care au dus la modificările menţionate.

Două configuraţii diferite au fost utilizate de Mogul et al. [18] pentru a studia efectele plasmei de oxigen asupra Deinocuccus radiodurans, palsmidei ADN şi a unor proteine. Măsurătorile au dovedit existenţa mai multor modificări ale ADN-ului şi BSA ca rezultat a expunerii la plasma de oxigen. Lucrarea nu menţionează însă factorii care au indus aceste modificări şi nici nu precizează vreun mecanism al interacţiunii.

Banerjee et al. [19] au prezentat într-un studiu recent concluzii legate de îndepărtarea unor proteine model de pe suprafeţe contaminate folosind o plasmă produsă în aer. Monitorizarea efectului s-a făcut prin intermediul determinării azotului prin spectroscopie de raze X (XPS). Din nefericire nu este prezentată nicio corelare a rezultatelor cu parametrii plasmei, analiza făcută de autori fiind mai mult calitativă decât cantitativă.

Rauscher et al. [20] şi von Keudell et al. [13] au studiat modul în care plasma poate fi folosită pentru îndepărtarea unor biomolecule model de pe diferite suprafeţe. În acest sens este binecunoscut efectul plasmei produse în oxigen, o astfel de descărcare fiind studiată şi de autorii menţionaţi pentru a evalua rata de înlăturare a biomoleculelor prin monitorizare elipsometrică. Probe de BSA şi Lisozim au fost expuse unor fascicule de ioni extraşi din plasma, rezultatele indicând o eliminare mai rapidă în prezenţa ionilor de argon. În acelaşi articol [13] sunt prezentate şi alte rezultate referitoare la acidul lipoteicoic (LTA) şi peptidoglican (PGN), molecule din bacteriile gram pozitive care au fost inactivate după expunerea la o plasmă de microunde, în timp ce lisozim, reprezentând contaminare micotică, şi-a păstrat activitatea biologică chiar şi după o lungă expunere la plasmă (de aproximativ 30 de minute).

Dudak [21] a semnalat pierderea parţială a funcţiei enzimatice a glucon oxidazei în urma expunerii la o plasmă produsă în argon, aer şi etilenamidă, efect însoţit de fragmentarea biomoleculelor. Gao et al. [24] au discutat mai detaliat modul în care poate fi îmbunătăţită solubilitatea şi hidrofobia ovalbuminei prin procesare în plasmă, modificările structurale fiind atribuite unei adaptări ale conformaţiei acestei proteine. Şi în cazul acestor lucrări lipsesc discuţiile legate de structurile rezultate în urma tratamentelor în plasmă, precum şi corelarea cu parametrii plasmei a mecanismelor de modificare a biomoleculelelor.

O singură excepţie în acest sens poate fi menţionată, arătând că nu numai ramuri ca medicina şi industria alimentară pot profita de beneficiile oferite de tehnicile cu plasmă, ci şi industria textilă. Sadova [23] a discutat efectele tratamentelor în plasmă aplicate fibrelor de lână, referindu-se la modul în care este afectată compoziţia fibrelor în aminoacizi, demonstrând în acelaşi timp şi îmbunătăţirea capacităţii de a reţine vopseaua, toate efectele evidenţiate fiind puse pe seama radicalilor liberi produşi în plasmă.

Scopul experimentelor prezentate în această teză este de a determina rolul oxigenului atomic produs în plasme la temperatură joasă în inactivarea microorganismelor şi biomoleculelor proteice cu risc de infecţie. Teza îşi propune şi studiul capacităţilor unor plasme reci produse la


presiune atmosferică dar şi la presiune joasă în amestecuri de gaze conţinând oxigen de a induce efectele menţionate. Pe baza rezultatelor obţinute au fost discutate mecanismele implicate în interacţiunea plasmei cu microorganismele şi biomoleculele expuse, urmarindu-se modul în care pot fi controlate modificările prin ajustarea parametrilor plasmei.

Au fost studiate două sisteme de plasmă: un jet la presiune atmosferică în două configuraţii asemănătoare şi o plasmă de tip surface wave, excitată la presiune joasă cu ajutorul microundelor. Pentru a determina contribuţia oxigenului atomic, rezultele obţinute în plasma de oxigen la presiune joasă au fost comparate cu cele evidenţiate în aceeaşi configuraţie experimentală dar într-o plasmă nereactivă. În acelaşi timp, pentru plasma de oxigen la presiune joasă a fost comparată procesarea biomoleculelor prin expunere directă la plasmă cu cea prin expunerea la radicalii produşi într-o astfel de plasmă.

Primul capitol al tezei, Introducere, expune informaţii generale referitoare la procesarea în plasmă, reacţiile care au loc în timpul tratamentelor în plasmă, reactivitatea oxigenului precum şi informaţii despre probele biologice folosite în experimentele prezentate în teză.

Următoarele două capitole, Aplicaţii ale plasmei produse la presiune atmosferică, şi respectiv Aplicaţii ale plasmei produse la presiune joasă, descriu în detaliu experimentele efectuate, separând aplicaţiile după domeniul de presiune utilizat şi dispozitivele folosite pentru producerea plasmei. Fiecare din aceste capitole acoperă două tipuri de aplicaţii: inactivarea microorganismelor şi modificarea unor molecule proteice. O atenţie deosebită este acordată rolului oxigenului atomic în aceste tratamente efectuate în diferite condiţii pentru ambele tipuri de aplicaţii menţionate.

Fiecare din cele două părţi prezentând experimentele se încheie cu concluzii specifice, rezultatele tezei fiind rezumate în ultima parte a tezei, Concluzii Generale.

Materialul Biologic

Microorganisme

Pentru experimentele prezentate în această teză au fost utilizate patru specii de bacterii gram pozitive: Bacillus subtilis , Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Sarcina lutea, două gram negative: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, şi o specie de fungi, Candida albicans. Toate microorganismele folosite fac parte din colecţii standard (ATCC) şi au fost păstrate în formă liofilă până în momentul experimentelor.

Biomolecule

Arginin Vasotocină

Peptida utilizată în studiile prezentate în această teză este arginin vasotocina ([Arg8] vasotocina, AVT, sau Arg-VT: C43H67N15O12S2). Este o peptidă formată din nouă reziduuri de aminoacizi: Cys-


Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 cu o legătură disulfidică între reziduurile Cys-1 şi Cys-6. Arg-VT este un hormon antidiuretic secretat de neurohipofiza unor vertebrate (broaşte, păsări).

Alegerea acestei peptide a fost motivată de faptul că [Arg8] vasotocina este o moleculă mică în

comparaţie cu o proteină, având o masă moleculară de 1050 Da, deci şi o structură mai simplă. În plus această peptidă îndeplineşte şi o funcţie care poate fi uşor cuantificată şi evaluată experimental, şi anume regularizează retenţia apei la majoritatea amfibienilor anulari [28]. Mecanismul prin care această funcţie este realizată constă în favorizarea creşterii fluxului de apă prin transolcarea unor canale numite acuaporine [29]. Acest fenomen, indicat schematic în Figura 1, este declanşat de interacţiunea moleculelor de [Arg8] vasotocină cu un receptor, interacţiune care se realizează prin intermediul unor siteuri speciale de la nivelul moleculelor de hormon (siteuri indicate în Figura 2) [30]. Ca urmare a interacţiunii cu receptorul se declanşează o serie de recţii care duc în final la deschiderea canalelor proteice, premiţând astfel moleculelor de apă să treacă dintr-o parte în alta a membranei.

Această funcţie biologică a arginin vasotocinei poate fi uşor evaluată folosind o cameră Ussing modificată (Figura 3) *31+, intensificarea fluxului de apă prin membrană putând fi determinată ca funcţie de timp în prezenţa hormonului. Dispozitivul prezintă două compartimente: unul conţine apă distilată iar celălalt soluţie izotonică de clorură de sodiu. Probele de arginin vasotocină a căror analiză este realizată sunt introduse în cel de-al doilea compartiment care simulează mediul din interiorul abdomeniului broaştei. Creşterea fluxului de apă este determinată cu ajutorul unei micropipete. În prezenţa hormonului viabil, în cazul nostru probe netratate, fluxul de apă dintr-un compartiment în altul va creşte liniar în timp.

Figura 1 Reprezentare schematică a modului în care AVT realizează creşterea fluxului de apă.

Figura 2 Reprezentare shematică a unei molecule de [Arg

8] vasotocină

şi a siteurilor responsabile pentru interacţiunea cu receptorul (roşu-liphophilic pocket, albastru-hydrophilic cleft, verde-hydrogen bonding, violet-stacking interactions) [30].

Figura 3 Cameră Ussing modificată.


Aminoacizi

Primul aminoacid studiat este glicina (Figura 4). Este cel mai mic aminoacid dintre cei 20 esenţiali, având o masă de aproximativ 75 g/mol şi formula C2H5NO2. Un alt aminoacid utilizat este serina, C3H7NO3. Serina este un aminoacid extrem de comun întâlnit în structura proteinelor (Figura 5) şi are o masă de 105.09 g/mol. Cistina este cea de-a patra moleculă studiată. Este un dimer format din două reziduuri de cisteină legate printr-o punte disulfidică (Figura 6), conexiune similară cu cea menţionată la arginin vasotocină. Masa moleculară a cistinei este de 240 g/mol, iar formula sa C6H12N2O4S2. Legătura disulfidică este imporantă deoarece are un rol esenţial de a stabiliza structura multor proteine şi peptide cum ar fi enzime, factori de creştere, toxine, prin scăderea valorii entropiei conformaţionale, prezentând în acest sens importanţă pentru realizarea funcţiei biologice a biomoleculelor ce conţin astfel de legături [32], [33], [34].

Metode de analiză a structurii şi funcţiei biomoleculelor studiate

Tehnicile experimentale utilizate pentru obţinerea rezultatelor prezentate în această teză sunt: spectroscopia electronică pentru analiză chimică (ESCA), rezonanţa magnetică nucleară (NMR), spectrometrie Raman, cromatografie lichidă (HPLC). Aceste metode au furnizat informaţii despre structura fizico-chimică a biomoleculelor în toate etapele tratamentelor efectuate. Informaţii legate de masa şi dimensiunele moleculelor au fost obţinute utilizând alte tehnici ca spectrometria de masă cu ionizare (ESI-MS). Procesarea în plasmă a fost uneori monitorizată cu ajutorul spectrometriei de masă.

Figura 4. Glicină.

Figura 5. Serină.

Figura 6. Cistină.


Procesarea în Plasmă

Consideraţii generale asupra descărcărilor studiate în această teză

O plasmă este numită de temperatură joasă sau plasmă rece atunci când temperatura ionilor şi neutrilor este considerabil mai mică decât cea a electronilor iar temperatura termodinamică a gazului este apropiată de temperatura camerei. Astfel de descărcări sunt deja folosite într-o multitudine de aplicaţii. În funcţie de presiunea gazului de descărcare, plasmele reci pot fi împărţite în plasme la presiune atmosferică, presiune medie sau presiune joasă. Plasmele de temperatură joasă ([38], [39], [40], [41]) pot fi de asemenea clasificate după frecvenţa câmpului electric folosit pentru producerea lor: DC (Hz), pulsuri DC (kHz), RF – radiofrecvenţă (MHz), MW – microunde (GHz). În cazul plasmelor produse la frecvenţă ridicată ionii nu pot urmării oscilaţiile câmpului extern şi astfel cea mai mare parte a energiei este comunicată electronilor. Densitatea acestora determină frecvenţa ciocnirilor dintre electroni şi neutri.

Pentru a studia procesarea biomoleculelor, în această teză au fost folosite două sisteme de producere a plasmei unul la presiune atmosferică şi unul funcţionând la presiune joasă. Detalii legate de condiţiile în care a fost obţinută plasma vor fi prezentate în capitolele experimentale.

Folosirea microundelor are avantajul produceri de plasme fără a fi nevoie de electrozi şi în plus acestea pot avea o mare extindere spaţială ceea ce permit tratarea unor suprafeţe mari. Pentru producerea unor astfel de plasme [41], [42], [43], [44] se pot folosi microunde cu o putere de la câţiva waţi la câteva sute de kilowaţi în funcţie de dispozitivul utilizat şi condiţiile de descărcare, şi pentru presiuni într-un domeniu larg, de la presiune joasă la presiune înaltă în diferite gaze sau amestecuri de gaze. Datorită versatilităţii, plasmele induse de microunde sunt folosite într-un număr mare de aplicaţii cum ar fi sterilizare [5], procesarea unor materiale (depuneri, implantări, curăţare) [4], tratamentul deşeurilor, ca surse de ioni sau de radiaţie, şi aşa mai departe.

Undele electromagnetice nu se pot propaga în plasme dense, fiind reflectate la suprafaţa plasmei datorită efectului pelicular, producând o undă evanescentă care se atenuează pe măsură ce se propagă în plasma. Distanţa de penetrare corespunde adâncimii stratului pelicular. Energia este transferată plasmei prin intermediul undei evanescente care intră în plasmă perpendicular pe suprafaţa acesteia şi descreşte

Figura 7 Adâncimea stratului pelicular în funcţie de densitatea plasmei.


exponenţial cu adâncimea.

Valoarea adâncimii stratului pelicular poate fi evaluată cu ajutorul formulei:

unde c este viteza luminii în vid, frecvenţa câmpului, iar frecvenţa plasmei care depinde

de concentraţia electronilor conform formulei

( este sarcina electronică,

masa efectivă a electronului, iar permitivitatea vidului). Rezultă că adâncimea stratului pelicular depinde de densitatea electronilor aşa cum arată Figura 7 cu calculele făcute pentru cazul plasmei analizate în această teză. Astfel se poate comunica energie plasmei nu printr-o undă care o traversează, ci conductivitatea plasmei permite undei să se propage de-a lungul suprafaţei plasmei. O astfel de plasmă se numeşte surface wave plasma (SWP) [39], [41], [42]. Domeniul de presiune a gazului în care pot fi produse asfel de plasme depinde de gazul folosit şi diametrul incintei: cu cât este mai mare camera, cu atât trebuie să fie mai mică presiunea minimă la care se poate aprinde descărcarea.

Diagnoza plasmelor de temperatură joasă

Diagnoza plasmei este un pas necesar pentru a discuta şi înţelege mai bine efectele produse de plasmă asupra biomoleculelor. Baza explicării şi controlului modului în care are loc procesarea în plasmă trebuie să fie bazată pe cunoaşterea speciilor din plasmă şi a parametrilor acesteia ce pot fi determinaţi prin metode electrice, optice şi de masă.

Procesarea în plasme reci – Reactivitatea plasmei

Întrucât scopul acestei teze nu este de a detalia cinetica reacţiilor chimice în descărcările studiate, aceast paragraf se vrea a prezenta unele aspecte generale legate de chimia plasmelor investigate doar pentru a facilita explicarea rezultatelor obţinute în urma tratării biomoleculelor şi microorganismelor şi discutarea mecanismelor implicate în procesare.

Într-o plasmă rece cea mai mare parte a energiei provenite de la sursa externă este canalizată către componenta electronică a descărcării. În acest fel electronii vor avea energie suficientă pentru a iniţia şi susţine descărcarea, în timp ce ionii şi neutri rămân la temperatură joasă. O caracteristică importantă a plasmelor reci este faptul că sunt capabile sa comunice o cantitate mică de energie substratelor expuse datorită neechilibrului termodinamic. Fiind un mediu ce posedă energie chimică, plasmele reci se pretează pentru un domeniu larg de tratamente chimice ale suprafeţelor fragile. Din acest motiv este necesară discutarea chimiei plasmei şi mai ales a chimiei care are loc la interfaţa dintre plasmă şi substratul expus.

Procesarea în plasmă poate fi considerată ca având două componente: interacţiuni în fază gazoasă şi respectiv interacţiuni ale plasmei la interfaţă gazoasă. Prima categorie este complexă cuprinzând un număr mare de reacţii elementare în volumul plasmei cum ar fi excitări, dezexcitări, ionizări, disocieri, recombinări, schimburi de sarcină şi altele în funcţie de natura


gazului sau al amestecului de gaze utilizat pentru a produce plasma. Aceste interacţiuni duc la formarea în plasmă a diferitor specii aflate în diferite stări energetice (de exemplu specii excitate sau ionizate). Producerea acestor specii are loc cu rate diferite datorită secţiunii eficace diferite a fiecărui proces. Speciile atomice şi moleculare includ atomi şi molecule aflate în diferite stări excitate electronice, vibraţionale şi rotaţionale, precum şi ioni. Prezenţa unei cantităţi de gaz reactiv în descărcare duce la producerea de radicali care sunt extrem de activi din punct de vedere chimic.

A doua categorie de interacţiuni are loc între speciile produse în volumul plasmei şi probele expuse. În fază gazoasă adâncimea stratului modificat este mai mică decât în cazul reacţiilor chimice în mediu lichid unde forţele capilare transportă substanţele către interiorul substratului. Procesarea în plasmă are loc prin intermediul gazului energetic parţial ionizat. La interfaţa dintre plasmă şi substrat au loc diferite procese ce pot fi iniţiate de ioni (modificări inerte sau reactive), radicali (polimerizare, funcţionalizare, etc) şi fotoni (activarea suprafeţelor, iniţierea polimerizării şi altele).

Prin modificarea parametrilor plasmei se poate controla natura și concentraţiile speciilor produse în plasmă putând fi astfel favorizate anumite reacţii la interfaţă care să ducă la obţinerea rezultatului dorit. Acest lucru poate fi realizat prin influenţarea distribuţiilor ionilor și electronilor și astfel a probabilităţii diferitelor căi de reacţie. Acestea din urmă pot fi identificate prin intermediul speciilor detectate în plasmă. Se poate concluziona că plasma este un reactor chimic datorită concentraţiilor ridicate de particule încărcate electric (electroni, ioni), neutre (atomi și molecule), specii active și fotoni. Chimia plasmei este puternic dictată de electroni deoarece aceștia reprezintă componenta care transferă plasmei energia sursei externe.

O altă componentă importantă a plasmei sunt ionii care pot produce atât efecte dorite cum ar fi creșterea reactivităţii unei suprafeţe, cât și efecte nedorite cum ar fi distrugerea suprafeţelor tratate în plasmă. Ionii sunt capabili să inducă reacţii chimice la interfaţa plasmă-probe sau doar interacţiuni fizice (ciocniri).

În cazul plasmei produse în amestecuri ce conţin oxigen sau alt gaz reactiv, un rol important îl au radicalii liberi. Din acest motiv chimia în plasmele produse la presiune joasă în gaze pure va fi tratată separat faţă de cea a plasmelor produse în aer și la presiune atmosferică.

Chimia determinată de plasmele la presiune joasă

În cazul plasmelor la presiune joasă, chimia acestora se complică datorită energiei mari ce poate fi acumulată de electroni între două ciocniri consecutive. Astfel, folosind ca și gaz de descărcare gaze pure și nu amestecuri ca în cazul plasmei produse în aer la presiune atmosferică, situaţia este foarte clară: pentru gaze neractive, cum ar fi argonul, în plasmă vom avea neutri, ioni și electroni, pe când în cazul gazelor moleculare (azot, oxigen, etc.) obţinem o plasmă foarte reactivă conţinând specii atomice și moleculare excitate, ionice și, binenţeles, electroni. În ambele cazuri trebuie să ţinem seama și de radiaţia emisă în plasmă și care în acest caz are o energie mult mai mare decât energiile legăturilor conţinute într-o biomoleculă.


Acţiunea simultană a diferitelor specii de particule și fotoni produce modificări ale probelor procesate în plasmă. În cazul simplu al plasmei produse într-un gaz inert, transferul energiei de la plasmă la probe se face direct prin intermediul ionilor energetici și a metastabililor, pe când fotonii sunt capabili să pătrundă în probă şi să producă efecte dincolo de suprafaţă.

În cazul tratamentelor efectuate la presiune joasă mecanismele diferă de cele care au loc în cazul în care se lucrează la presiune atmosferică. În primul caz omogeniatea expunerii este mai ridicată atingând nivelul molecular. Procesarea în plasmă cuprinde o serie de interacţiuni la interfaţa dintre faza gazoasă şi cea solidă reprezentată de proba supusă procesării. Ţinând seama de cele menţionate mai sus, reacţiile la interfaţă pot fi împărţite în trei categorii, acestea depinzând şi de natura gazului folosit pentru a produce plasma:

1. ciocniri ale particulelor din plasmă (ioni, atomi sau molecule în stare metastabilă, etc) cu probele;

2. procese foto-fizice şi foto-chimice induse de absorbţia fotonilor emişi în plasmă;

3.reacţii chimice intermediate de speciile reactive din plasmă în cazul în care pentru producerea acesteia se utilizează gaze reactive.

Aceste procese pot coexista, efectele induse fiind variate şi depinzând nu numai de natura speciilor din plasmă care le iniţiază dar şi de alţi parametrii cum ar fi concentraţia speciilor, energia lor, şi altele. Câteva din efectele posibile ar fi modificarea structurii chimice prin adăugarea sau îndepărtarea unor atomi sau grupări funcţionale, izomerizări datorită absorbţiei de energie, ablaţie în urma căreia sunt produşi compuşi volatili, sau plasma poate doar activa moleculele sau suprafeţele expuse, modificările asupra acestora continunând să aibă loc în aerul atmosferic după ce probele au fost scoase din incinta de descărcare.

În funcţie de parametrii plasmei, natura şi compoziţia probelor procesate, efectele pot diferi mult. Scopul experimentelor discutate în această teză este reprezentat de studierea şi discutarea unor aspecte legate de rolul fiecărei componente a plasmei în aplicaţii ce implică inactivarea contaminării la nivel molecular cu ajutorul unor plasme reci.

Chimia la interfaţa cu plasma de oxigen

Oxigenul este un element nemetalic cu o reactivitate mare, capabil să formeze compuşi cu aproape toate celelate elemente. În condiţii normale de presiune şi temperatură, oxigenul formează o moleculă diatomică, O2. Oxigenul reprezintă aproximativ 20% din aerul atmosferic fiind un element conţinut în toate moleculele structurale ale organismelor vii (proteine, carbohidraţi, grăsimi). Ozonul, O3, este un alotrop al oxigenului, extrem de reactiv şi cu o capacitate mare de a absorbi radiaţii ultraviolete.

Atunci când plasma este produsă în oxigen pur sau amestecuri conţinând oxigen sunt produse o multitudine de specii în diferite stări excitate şi ionizate, natura şi concentraţiile acestora depinzând de parametrii descărcării. Dintre acestea pot fi amintite oxigenul atomic (O), diatomic (O2), triatomic (O3), în stări neutre sau încărcate electric sub formă de ioni pozitivi (O+,


O2+) sau negativi (O-, O-2). În cazul amestecurilor de gaze care conţin şi o cantitate de oxigen

există posibilitatea interacţiunii între speciile oxigenului şi celelate gaze şi specii din descărcare, caz în care creşte şi mai mult varietatea speciilor plasmei conţinând oxigen şi respectiv complexitatea acesteia (de exemplu NOx în plasme cu oxigen şi azot).

În cazul plasmei produsă în oxigen pur, cele mai importante specii sunt cele atomice și moleculare conectate printr-o serie de procese. Figura 8 arată curbele de energie pentru stările excitate şi ionizate ale oxigenului. La aproximativ 1 – 2 eV deasupra stării fundamentale O2(X3Σg ) oxigenul prezintă două stări metastabile: O2 1Δ ( cu un timp de viaţă de 4 s) şi respectiv O2 1Σ (cu un timp de viaţă de 14 s). Datorită diferenţei mici de energie, aceste stări sunt primele populate ca rezultat al excitării produse de electroni. Densităţile fiecărei specii ale plasmei vor depinde de condiţiile în care este aprinsă descărcarea.

Referinţe

[1] J. Harry: Wiley-VCH Verlag & Co. KgaA, Weinheim, Germany, 2010.

[2] A. Reutscher: Wiley-VCH Verlang GmbH, Weinheim, 2001.

[3] S-M. Kim, J-I. Kim: J. Microbiol. 44 (2006) 466.

[4] A. Ogino, S. Noguchi, M. Nagatsu: J. Photopolym. Sci. Technol. 22 (2009) 461.

[5] M. Moisan, J. Barbeau, M-C. Crevier, J. Pelletier, N. Philip, B. Saoudi: Pure Appl.Chem.,

74 (2002) 349-358.

[6] A. Ricard: SFV, Paris, 1996.

[7] M. K. Singh, A. Ogino, M. Nagatsu: New Journal of Physics 11 (2009) 115027.

[8] Y. F. Hong, J. G. Kang, H. Y. Lee, H. S. Uhm, E. Moon, Y. H. Park: Lett. Appl. Microbiol. 48 (2009) 33-37.

[9] B. Kim, H. Yun, S. Jung, Y. Jung, H. Jung, W. Choe, C. Jo: Food Microbiol. 28 (2011) 9-13.

[10] S. Ikawa, K. Kitano, S. Hamaguchi: Plasma Process. Polym. 7 (2010) 33-42.

[11] M. Laroussi, F. Leipold: Int. J. Mass Spectrom. 233 (2004) 81-86.

[12] H. Rauscher, O. Kylian, J. Benedikt, A. Von Keudell, F. Rossi: ChemPhysChem 11 (2010) 1382-1389.

[13] A. Von Keudell, P. Awakowicz, J. Benedikt, V. Raballand, A. Yanguas-Gil, J. Opretzka, C. Flotgen, R.

Reuter, L. Bylykh, H. Halfmann, K. Stapelmann, B. Denis, J. Wunderlich, P. Muranyi, F. Rossi, O. Kylian, N.

Hasiwa, A. Ruiz, H. Rauscher, L. Sirghi, E. Comoy, C. Dehen, L. Challier, J. P. Deslys: Plasma Process. Polym. 7

(2010) 327.

[14] D. M. Taylor: Vet. J. 159 (2000) 10.

[15] W .A. Rutala, D. J. Weber: Clin. Inf. Dis. 32 (2001) 1348.

[16] P. Brown, E. H. Rau, B. K. Johnson, A. E. Bacote, C. J. Gibbs, D. C. Gajdusk: Proc. Nat. Acad. Sci. USA

97 (2000) 3418.

[17] H. C. Baxter, G. A. Campbell, A. G. Whittaker, A. C.Jones, A. Aitken, A. H. Simpson, M. Casey, L.

Bountiff, L. Gibbard, R. L. Baxter: J. Gen. Virol. 86 (2005) 2393.

[18] R. Mogul, A. A. Bol’shakov, S. L. Chan, R. M. Stevens, B. N. Khare, M. Meyyappan: J. D. Trent,

Biotechnol. Prog. 19 (2003) 776.

[19] K. K. Banerjee, S. Kumar, K. E. Bremmell, H. J. Griesser: J. Hospit. Infect. (2010),

doi:10.1016/j.jhin.2010.07.001.

Figura 8 Diagrama de energie a oxigenului molecular [6].

11 Capitolul al II-lea. Aplicaţii ale plasmei produse la presiune atmosferică | Studiul oxigenului atomic din plasma de temperatură joasă produsă în amestecuri de gaze. Aplicaţii

[20] H. Rauscher, K. Stapelmann, O. Kylian, B. Denis, F. Rossi: Vacuum 84 (2009) 75.

[21] F. C. Dudak, J. Kousal, U. O. S. Seker, I. H. Boyaci, A. Choukourov, H. Biederman: Proc. 28th ICPIG,

Prague, July 15-20 2007.

[22] M. N. Vasilev, T. M. Vasileva: High Energy Chem. 40 (2006) 421.

[23] S. F. Sadova: High Energy Chemistry 40 (2006) 57.

[24] C. H. Gao, T. J. Herald, P. L. Miuno: J. Food Sci. 66 (2001) 89.

[25] UCLA Dept. Epidemiology: Definitions.

[26] R. Setlow, J.Appl.Microbiol. 101 (2006) 514-525.

[27] K. E. van Holde, W. C. Johnson, P. S. Ho: Pearson Education, Inc. 2006 p.2-30, 457-458.

[28] T. Hasegawa, H. Tanii, M. Suzuki, S. Tanaka: Endocrinology 144 (2003) 4087.

[29] M. Suzuki, T. Hasegawa, Y. Ogushi, S. Tanaka: Comp. Biochem. Physiol, Part A 148 (2007) 72.

[30] R. Walter, K. U. M. Prasad, R. Deslauriers, I. C. P. Smith: Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70 (1974) 2086.

[31] Y.Ogushi, D. Kitagawa, T. Hasegawa, M. Suzuki, S. Tanaka: J. Exp. Biol. 213 (2010) 288.

[32] S. F. Betz: Protein Sci. 2 (1993) 1551-1558.

[33] A. J. Doig, D. H. Williams: J. Mol. Biol. 217 (1991) 389-398.

[34] G. Bulaja: Biotech. Adv. 23 (2005) 87-92.

[35] J. H. Block, A. M. Bradshaw, P. C. Gravelle, J. Haber, R. S. Hansen, M. W. Roberts, N. Sheppard, K.

Tamaru: Pure Appl.Chem., 62 (1990) 2297-2322.

[36] L. D. Field, S. Sternhell, J. R. Kalman: John Wiley and Sons Ltd., 4th edition, London, 2007.

[37] M. C. McMaster: John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, 2007.

[38] G. Popa, L. Sirghi, “Al.I.Cuza” University, Iasi, 2000.

[39] R. Hippler, H. Kersten, M. Schmidt, K. H. Schoenbach: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KGaA, Weinheim,

2008.

[40] M. Moisan, Z. Zakrzewski: J.Phys.D:Appl.Phys. 24 (1991) 1025-1048.

[41] M. Moisan, J. Pelletier: EDP Sciences, France, 2006.

[42] M. Moisan, J. Pelletier: Elsevier Science B.V., Amsterdam, 1992.

[43] M. Nagatsu, G. Xu, M. Yamage, M. Kanoh, H. Sugai: Jpn. J. Appl. Phys. 35 (1996) 341-344.

[44] M. Nagatsu, I. Ghanashev, H. Sugai: Plasma Sources Sci.Technol., 7 (1998) 230.

[45] R. Merlino: Am. J. Phys. 75 (2007) 1078-1084.

[46] A. Fridman: Cambridge University Press, 2008.

[47] L. W. Sieck, J. T. Herron, D. S. Green: Plasma Chem. Plasma Process. 20 (2000) 235-258.

[48] J. T. Herron, D. S. Green: Plasma Chem. Plasma Process. 21 (2001) 459-481.

CCaappiittoolluull aall IIII--lleeaa.. AApplliiccaaţţiiii aallee ppllaassmmeeii pprroodduussee llaa pprreessiiuunnee aattmmoossffeerriiccăă

Dintre sistemele utilizate pentru a produse plasme reci, cele care funcţionează la presiune atmosferică sunt extrem de convenabile datorită faptului că nu necesită un sistem de vidare şi au de obicei o configuraţie simplă şi flexibilă a electrozilor. Diferite aranjamente experimentale şi-au dovedit deja aplicabilitatea într-un domeniu larg de bio-aplicaţii, de obicei folosind pentru aprinderea plasmei pulsuri de înaltă frecvenţă, plasma fiind generată în gaze nobile.

O soluţie pentru a produce plasme reci la presiune atmosferică este oferită de descărcările cu barieră dielectrică (DBD): un material dielectric este plasat între electrozii descărcării pentru a împiedica trecerea plasmei în regim de arc. În comparaţie cu alte tipuri de descărcări, DBD prezintă şi avantajul uniformităţii ridicate a realizări tratamentelor.

Domeniul larg de aplicabilitate ale unor astfel de descărcări se bazează pe chimia plasmei care este foarte complexă: pe lângă speciile specifice gazului utilizat pentrua produce descărcarea, plasma are un conţinut bogat de specii si radicali care provin din atmosfera ambiantă, conţinand oxigen (oxigen atomic, hidroxil, etc), azot dar și combinatii ale acestora (de exemplu


NOx). Contribuţia radiaţiilor ultraviolete este mai puţin importantă deoarece acestea sunt absorbite pe o distanţă scurtă iniţial de oxigenul atmosferic şi apoi şi de ozonul produs.

Toţi aceşti factori pot contribui la atingerea scopului propus în această teză, şi anume inducerea inactivării microorganismelor şi a contaminării de nivel molecular. Acest capitol se ocupă cu studiul abilităţii oxigenului produs în plasma la presiune atmosferică de a contribui la atingerea scopului propus.

Inactivarea microorganismelor folosind plasma produsă la presiune

atmosferică

Efectul bactericid al plasmelor se presupune a fi rezultatul acţiunii simultane a speciilor plasmei (radicali activi, ioni, ultraviolete, etc.). Experimentele prezentate în acest paragraf îşi propun să studieze efectele produse de impactul speciilor plasmei produse la presiune atmosferică cu diferite specii de microorganisme. Aceste efecte prezintă un interes ridicat datorită faptului că metodele care folosesc plasmă produsă la presiune atmosferică reprezintă o alternativă viabilă de sterilizare capabilă să păstreze integritatea echipamentului medical şi a materialelor biomedicale contaminate [1], [2], [3].

Halfmann et al. [4] au studiat efectul bactericid al radiaţiilor UV aratând că prin fotodesorbţie se pot produce specii volatile în urma afectării membranei sporilor de Bacillus atrophaeus. Eto et al. [5] au raportat inactivarea sporilor de Geobacillus stearothermophilus folosind o descărcare cu barieră dielectrică, factorii principali responsabili pentru sterilizare fiind acţiunea simultană a ozonului, radiaţiilor UV şi radicalilor hidroxil. Deng et al. [6] au arătat că difuzia radicalilor şi radiaţiei UV produse de un jet de plasmă pot steriliza o zonă mult mai mare decât cea expusă direct la plasmă. Roth et al. [7] au concluzionat că radiaţiile UV-C radiation ar fi cele mai eficiente în inactivarea sporilor. Yang et al. [9] au reuşit separarea contribuţiei speciilor reactive şi radiaţiei într-un reactor de plasma, afirmând că rolul principal l-ar avea ionii. Ţinând seama de aceste rezultate, voi discuta în continuare efectul bactericid al unei plasme produse în heliu.

Sistemul de generare a plasmei

Sistemul utilizat pentru producerea plasmei este reprezenat schematic în Figura 9. Descărcarea asimetrică cu barieră dielectrică [10] folosită pentru studiul inactivării microorganismelor a fost iniţiată în heliu cu un debit de curgere 0.15 l/min prin aplicarea unor pulsuri de Vpp= 9 kV cu o frecvenţă de 1.6 kHz între un electrod de

cupru plasat la aproximativ 10 mm de capătul unui tub de cuarţ şi electrodul împământat. Pentru tratamentele efectuate asupra microorganismelor s-au folosit două configuraţii care implică două distanţe diferite între cei doi electrozi: 2.5 şi 3.5 cm. Pentru analiza plasmei a fost

Figura 9 Schema dispozitivului folosit pentru studiul inactivării microorganismelor la presiune atmosferică.


întregistrat spectrul de emisie la nivelul electrodului împământat care reprezintă şi locul în care vor fi plasate probele în timpul expunerilor. Exceptând faptul că liniile emise sunt mai intense în cazul distanţei mai mari dintre electrozi, diferenţa esenţială este dată de apariţia emisiei corespunzătoare oxigenului atomic metastabil la 777.2 nm, linie evidenţiată doar pentru configuraţia cu o lungime a jetului de plasmă de 3.5 cm.

Electronii energetici care ciocnesc moleculele de oxigen duc la formarea de specii reactive [11], [12], [13], [14] în special ozon conform schemei de reacţie:

unde e* reprezintă un electron energetic iar M este fie O, O2 fie ozon deja generat, O3. Vasele Petri conţinând culturile de bacterii au fost plasate pe electrodul împământat. În aceste condiţii seria expunerilor a fost făcută pentru intervale de timp de 25, 35, 50, 75 şi respectiv 100 secunde pentru ambele distanţe ale jetului de plasmă. După incubarea culturilor pentru 24 h la o temperatură de 37.0±0.5 0C, au fost evidenţiate zone circulare de inhibiţie a creşterii microorganismelor, fiind evaluate atât diametrul acestora cât şi populaţia (CFU).

Rezultate

Efectul bactericid a fost discutat pe baza dimensiunii ariilor de inhibiţie a creşterii microorganismelor care se prezintă sub forma unor discuri transparente, deosebindu-se de fundalul opac corespunzând coloniilor dezvoltate care nu au fost expuse plasmei (Figura 11).

În Figura 12 sunt reprezentate grafic datele experimentale pentru configuraţia cu 2.5 cm distanţă între electrozi – fiind calculate deviaţii stadard de 5-7%. Pentru 3.5 cm suprafeţele în care bacteriile au fost inactivate sunt mai mici în mod semnificativ în comparaţie cu cele evidenţiate pentru 2.5 cm – pentru B. cereus şi S. lutea în cele mai multe cazuri diametrele fiind zero.

(1)

Figura 11 Zone de inhibiţie a creşterii culturilor bacteriene: P. aeruginosa, 50 s, 3.5 cm; E. coli, 35 s, 2.5 cm; B. cereus, 100 s, 2.5 cm; S. lutea, 100 s, 2.5 cm.


Cele mai mari zone de inhibiţie de până la 19 mm au corespuns culturilor de P. aeruginosa care pare a fi cel mai sensibil microorganism dintre cele studiate la acţiunea plasmei, în timp ce culturile de E. coli, S. lutea şi B. cereus au manifestat mai multă rezistenţă, diametrul maxim al zonelor de inhibiţie fiind de aproximativ 12 mm.

Sensibilitatea mare la acţiunea ozonului manifestată de E. coli faţă de celelate bacterii a fost raportată de mai mulţi autori. Sensibilitatea la ozon a bacteriilor gram negative a fost semnalată de Restaino et al. [16] care a concluzionat că aceste bacterii au fost mult mai sensibile decât cele gram pozitive. Li şi Wang [17] au evidenţiat o sensibilitate la ozon a E. coli de 40 de ori mai mare decât cea a B. subtilis. Thanomsub et al. [18] au presupus că aceste diferenţe se datorează faptului că peretele celular al bacteriilor gram negative are un conţinut mai mare de proteine ceea ce influenţează sensibilitatea la ozon fapt susţinut şi de Komanapalli et al. [19] conform cărora ozonul reacţionează mai degrabă cu proteinele decât cu lipidele. Sensibilitatea la plasma produsă la presiune atmosferică evidenţiată în experimentele efectuate arată că tratamentele bazate pe utilizarea jeturilor de plasmă pot fi eficiente chiar şi în cazurile microogranismelor pentru care tratamentele chimice sunt mai puţin eficiente.

În Figura 12 (a) şi (b) sunt prezentate datele determinate pentru culturile de S. aureus şi B. subtilis corespunzând ambelor distanţe între electrozi (2.5 cm şi respectiv 3.5 cm). Diametrul zonelor de inactivare variază între 0 şi 3.3 cm pentru B. subtilis şi respectiv între 5.5 mm şi 16.5 mm pentru S. aureus, diametrul zonei trasparente crescând proporţional cu timpul de expunere, cu excepţia probelor tratate pentru 100 s în configuraţia 2.5 cm.

Figura 12 Răspunsul (a) S. aureus şi (b) B. subtilis la expunerea în DBD pentru diferite intervale de timp evaluat prin diametrul ariilor de inhibiţie.

Figura 13 prezintă rezultatele obţinute pentru tatamentele efectuate asupra E. coli şi respectiv C. albicans (fungi). Zonele de inhibiţie au diametre în acelaşi interval 1.5 mm–6.5 mm fiind şi în acest caz evidenţiată o tendinţă de saturare pentru 100 s/2.5 cm. Creşterea diametrului zonei de inactivare cu timpul de tratament este aproape liniară sau se fitează după o funcţie putere.


Pentru S. aureus a fost evidenţiată o sensibilitate ridicată la tratamentele în plasmă cu zone de creştere inhibată care au diametrul de aproximativ 4–5 ori mai mare în comparaţie cu B. subtilis.

Figura 13 Răspunsul microorganismelor expuse la DBD pentru diferite intervale de timp pentru

(a) E. coli şi (b) C. albicans.

Nu au fost evidenţiate zone de inhibiţie pentru B. subtilis expus la plasmă în configuraţia 2.5 cm pentru un timp de tratament de 25 s. Această sensibilitate scăzută la tratamentele în plasmă pare să fie o caracteristică a celor două tulpini de bacterii gram negative studiate.

Rezumând aceste ultime rezultate pentru cele trei specii de bacterii în comparaţie cu primele patru studiate se poate spune că inhibarea creşterii este favorizată de plasmă mai ales pentru configuraţia jetului în care distanţa dintre electrozi este de 3.5 cm faţă de 2.5 cm şi se manifestă mai ales pentru timpii cei mai lungi de expunere.

În cazul C. albicans trebuie considerată complexitatea celulelor eucariote. Deşi pentru germenii gram negativi ne-am aştepta la o inactivare mai eficientă datorită concentraţiei mai mari de ozon în cazul configuraţiei cu distanţa de 3.5 cm, rezultatele experimentale nu au confirmat aşteptările. Este posibil ca proteinele din peretele celular să fie afectate parţial şi reversibil de ozon, reversibilitatea efectelor putând fi pusă pe seama stabilităţii şi complexităţii acestor molecule. În afară de ozon, efectul distructiv s-ar putea datora şi radicalilor hidroxil precum şi oxigenului aflat în stare de singlet aşa cum recent au arătat Sun et al. [20]. Aşadar în cazul nostru eficienţa redusă măsurată pentru C. albicans ar putea fi asociată cu faptul că celulele eucariote ale acestei ciuperci sunt mai dezvoltate, aceastea putând compensa destabilizările membranei induse de ozon dar şi alte specii reactive din plasmă conţinând oxigen care ar putea modifica permeabilitatea peretelui celular al unor astfel de microorganisme aşa cum a arătat şi Sun [20] care a raportat o scădere a rezistenţei la agenţi chimici antifungici a microorganismelor în urma expunerii la plasmă.

Inhibarea dezvoltării microorganismelor ar putea fi pusă şi pe seama modificărilor suferite de agar în urma expunerii acestuia în plasmă. Referitor la efectul pH-ului, Ikawa et al [21] au


prezentat un studiu care arată că există o valoare critică a pH-ului de aproximativ 4.7. În cazul în care pH-ul mediului de cultură este mai mare decât această valoare critică autorii au arătat că iradierea agarului într-un jet de plasmă atmosferică nu afectează dezvoltarea microorganismelor, ceea ce înseamnă că acesta este şi cazul experimentelor prezentate aici deoarece valoarea pH-ului mediului de cultură în cazul nostru a fost de 6.8. Aşadar, efectele prezentate mai sus nu pot fi puse pe seama modificării mediului de cultură ca urmare a expunerii sale la plasmă.

O posibilitate care ar explica rezultatele obţinute este distrugerea microorganismelor datorită efectelor fizice induse de ionii din plasmă, dar şi efectele chimice cauzate de speciile reactive (ozon, oxigen atomic, etc.). Impactul simultan al atomilor şi ionilor poate cauza perforarea peretelui celular [23]. Contribuţia forţelor electrostatice exercitate datorită sarcinilor acumulate poate determina destabilizarea membranei celulare, care ar putea fi urmată de pătrunderea speciilor plasmei în interiorul celulelor. Difuzia ozonului şi oxigenului atomic ar putea duce la oxidarea proteinelor şi ADN-ului [24] explicând perturbarea metabolismului şi moartea celulelor. Conform [25] ionii electronegativi pot fi de asemenea consideraţi ca radicali cu efect bactericid (de exemplu O− şi O2

−).

Modificarea peptidelor şi aminoacizilor folosind un jet de plasmă la

presiune atmosferică

Parametri plasmei

Sistemul folosit pentru producerea jetului de plasmă la presiune atmosferică (APPJ) constă dintr-un tub de sticlă pe care este plasat un electrod de cupru. Pentru a aprinde descărcarea s-a folosit heliu şi au fost aplicate pulsuri de tensiune (5 kV) cu o frecvenţă de 5 kHz. Cel de-al

Figura 15 Aspect vizual al descărcării. Figura 14 Reprezentare schematică a dispozitivului experimental.


Figura 16 Spectre XPS ale stării O 1s pentru probele de glicină (netratată şi respectiv expusă 10 min la APPJ).

doilea electrod, cu o suprafaţă mai mare şi în acelaşi timp conectat la masă reprezintă şi suportul pe care sunt plasate probele ce urmează a fi procesate în plasmă.

Modificarea Glincinei cu ajutorul APPJ

Probe de glicină au fost expuse la APPJ pentru 2, 5, 7, 10, 20 şi respectiv 30 de minute. Toate probele de aminoacizi au fost pregătite prin dizolvarea în apă distilată a aminoacizilor sub formă de pudră şi apoi uscarea soluţiei pe plăcuţe de siliciu de 5 x 5 mm. Distanţa dintre probă şi capătul tubului de descărcare în timpul expunerii a fost de 5 mm.

Primul efect evidenţiat a fost creşterea concetraţiei de oxigen din probe ca rezultat al procesării în APPJ. Creşterea este puternică în primele 10 minute după care fenomenul pare să se satureze. Acest efect poate fi explicat prin faptul că, fiind vorba de molecule mici, există puţine posibilităţi prin care oxigenul se poate conecta la probele expuse în plasmă. Ca rezultat al tratamentelor numărul de legături duble C=O aproape s-a dublat după 10 minute aşa cum se poate observa în Figura 16.

Figura 17 Procentul de carbon şi respectiv azot atomic în probe vs. Timpul de procesare în APPJ.


Nu doar conţinutul în oxigen al probelor se modifică în urma iradierii în plasmă. Cantitea de azot detectată în probe creşte aşa cum se poate vedea în Figura 17, fiind pusă pe seama adiţiei de grupuri amino deoarece în spectrele XPS N 1s nu a fost detectată nici o modificare a energiei

de legătură (0.1 eV) şi nici a lărgimii peak-ului, valoarea FWHM fiind aceeaşi. Corelând rezultatele obţinute cu concluziile trase din spectrele de emisie înregistrate, se poate presupune că creşterea cantităţii de oxigen din probe se datorează ionilor moleculari, O2

+, şi/sau oxigenului atomic, O. Ţinând seama şi de discuţia făcută pe baza azotului se poate afirma că în probele expuse la APPJ oxigenul se implică în legături cu carbonul şi nu cu azotul.

În Figura 17 se poate observa și o uşoară scădere a procentajului de atomi de carbon conţinut de probe, cauza pentru aceast efect putând fi atribuită oxigenului atomic care în urma reacţiilor cu probele de aminoacid duce la ruperea unor legături C-C cu formarea de specii volatile.

Rezultate ale tratamentelor aplicate arginin vasotocinei în APPJ

Spre deosebire de glicină, în cazul vasotocinei cele mai vizibile rezultate ale tratamentului apar pentru intervale de expunere lungi (30 min) [35] . În cazul Arg – VT expusă la jetul de plasmă cea mai proeminentă modificare a fost evidenţiată în spectrele XPS corespunzătoare stării S 2p (Figura 18). Maximul detectat la o energie de legătură de 164 eV corespunde legăturii disulfidice din moleculele de vasotocină care impun o anumită conformaţie acestei molecule. Spectrele probelor expuse în APPJ evidenţiază o lărgire a acestui peak indicând prezenţa unui nou maxim în jurul valorii de 169 eV a energiei de legătură. Acest nou maxim se datorează unor grupări de sulf care conţin şi oxigen, grupări rezultate în urma expunerii în APPJ. Datorită lărgimii acestui peak şi a faptului că sulful prezintă stări de oxidare de la 6 la -2, este complicat de indicat cu exactitate care sunt noile grupări formate ca rezultat a interacţiunii celor doi atomi de sulf din fiecare moleculă de vasotocină cu oxigenul reactiv din plasmă.

Posibilităţile de formare de legături cu oxigenul sunt legate nu doar de legătura disulfidică ce ar putea rezulta în grupări ca oxidul disulfidic -S(O)S- sau S-dioxidul -S(OO)S-, dar şi cu atomii de sulf separaţi prin ruperea legăturii disulfidice care ar putea duce la sulfoxid -SO, dialchilsulofonă -S(OO)-, sulfonă =SO2, acid sulfinic -S(OO)H, acid sulfonic -SO3H, dar şi nitrotiol -SNO2 sau nitrosilat –SNO, ţinând seama că plasma produsă la presiune atmosferică poate conţine şi specii ale azotului.

Reacţiile moleculelor de Arg-VT cu speciile din plasmă afectează şi azotul din probe, spectrul XPS 1s corespunzător azotului lărgindu-se după 30 de minute de tratament sugerând creşterea conţinutului de azot al probelor. Aceasta nu se face pe baza modificării componentei corespunzătoare grupărilor (–NH–) care râmane nemodificată aşa cum ne aştepam datorită caracterului puternic de legătură dublă a legăturii peptidice, mai puternică decât o legătură covalentă. Componenta care apare în spectru s-ar putea datora unor noi grupări amino (–NH2) şi/sau (–NOx), a doua posibilitate având o probabilitate mai mare datorită faptului că oxizii de azot pot exista în palasma produsă în aer. Toate concluziile obţinute sunt în concordanţă cu spectrele XPS măsurate pentru carbon şi oxigen.


În ciuda multitudinii efectelor detectate asupra probelor de vasotocină expuse la APPJ, moleculele nu şi-au pierdut funcţia biologică în urma tratamentelor în plasmă ceea ce duce la concluzia că tratamentele în plasma produsă la presiune atmosferică în prezenţa aerului sunt tratamente mai puţin intense, posibil reversibile.

Concluzii

În acest capitol a fost studiată abilitatea unui jet de plasmă DBD produs la presiune atmosferică de a inactiva microorganisme şi a modifica molecule.

Plasma produsă la presiune atmosferică a fost eficientă în a inhiba dezvoltarea unor microorganisme. Cele mai favorabile efecte au fost obţinute în cazul unor specii de bacterii gram pozitive a căror dezvoltare a fost cel mai bine stopată pentru o configuraţie în care distanţa dintre electrozi a fost de 2.5 cm, evidenţiindu-se zone largi de inhibiţie a creşterii cu diametre până la 11 mm pentru B. cereus şi respectiv 13 mm pentru S. lutea. Principalul factor care se presupune că ar fi contribuit la aceste efecte sunt speciile de oxigen, extrem de reactive. Configuraţia în care distanţa dintre electrozi a fost de 3.5 cm s-a dovedit mai puţin favorabilă

Figura 18 Spectre XPS S 2p ale Arg-VT (netratată şi respectiv expusă pentru 30 min la APPJ).

Figura 19 Spectre XPS N 1s ale Arg-VT (netratată şi respectiv expusă pentru 30 min la APPJ).


pentru inhibarea dezvoltării germenilor gram pozitivi, în timp ce speciile gram negative au fost mult mai sensibile la interacţiunea cu plasma. Diametrele zonelor de inhibare a dezvoltării microbiene au fost de până la 6 mm în cazul E. coli şi 8 mm pentru P. aeruginosa. Doar bacteriile E. coli au fost complet distruse.

Plasma studiată a fost capabilă de efecte bactericide asupra microorganismelor gram pozitive şi gram negative inoculate în mediu de cultură. În majoritatea cazurilor investigate dependenţa matematică între diametrul zonei de inhibiţie şi timpul de expunere a fost fitată cu o funcţie putere cu un coeficient de corelaţie ridicat. Cea mai mare sensibilitate la tratamentele în plasmă a fost manifestată de S. aureus pentru care au fost evidenţiate zonele de inhibiţie cu cea mai mare suprafaţă (6–16 mm diametru). Prezenţa ozonului a fost evidenţiată în special pentru configuraţia cu 3.5 cm între electrozi prin intermediul oxigenului atomic detectat în spectru de emisie, ceea ce ar fi putut duce la zonele de inhibiţie mult mai largi care au fost puse în evidenţă în acest caz (faţă de cazul tratamentelor operate în configuraţia cu 2.5 cm distanţă între electrozi).

La nivel molecular efectul principal evidenţiat ca rezultat al expunerii la APPJ a fost oxidarea probelor, mai ales pentru moleculele mici (glicină). Pentru astfel de biomolecule cele mai pregnante modificări apar la scurt timp de la începerea expunerilor, după aproximativ 10 minute efectele saturându-se. Creşterea conţinutului atomic de oxigen poate fi pusă pe seama oxigenului atomic prezent în descărcare. Procesarea ar putea fi favorizată şi de alte componente ale plasmei (electroni, radiaţie, etc.). Nu doar speciile oxigenului interacţionează cu probele expuse în plasmă ci şi cele ale azotului.

Pentru molecule mari, în cazul experimentelor prezentate în teză arginin vasotocina, oxidarea e mai predominantă după intervale mai lungi de iradiere, aproximativ 30 de minute. Procesări mai scurte par să nu afecteze ireversibil structura peptidei, aceasta păstrându-şi funcţia biologică în toate circumstanţele investigate.

Se poate spune că efectele induse de plasmă depind nu doar de parametrii acesteia ci şi de moleculele care fac subiectul tratamentelor în plasmă (mărime, structură chimică, etc.). În cazul biomoleculelor care conţin legături disulfidice, acestea sunt puternic afectate fiind rupte sau rezultând grupări cu oxigen. Cu toate că procesarea în plasmă nu a dus la inactivarea peptidei, acest lucru ar putea fi schimbat prin îmbunătăţirea condiţiilor de descărcare (adăugarea de oxigen, apă împreună cu gazul de descărcare, etc).

Rezultatele prezentate în acest capitol evidenţiază abilitatea plasmelor produse la presiune atmosferică de a modifica structural molecule proteinacee în principal datorită speciilor reactive ale oxigenului care prin intermediul reacţiilor chimice induc la nivelul biomoleculelor tratate în plasmă ruperea unor legături sau oxidarea acestora.


References

[1] M. Laroussi, and F. Leipold, Int. J. Mass Spectrom. 233 81(2004).

[2] M. Moisan, J. Barbeau, S. Moreau, J. Pelletier, M. Tabrizian, and L.H. Yahia, Int. J. Pharm. 226 1 (2001).

[3] M. Laroussi, IEEE Trans. Plasma Sci. 30 1409-1415 (2002).

[4] H. Halfmann, B. Denis, N. Bibinov, J. Wunderich, and P. Awakowicz, J. Phys. D Appl. Phys. 40 5907-5911,

(2007).

[5] H. Eto, Y. Ono, A. Ogino, and M. Nagatsu, Appl. Phys. Lett. 93, 221502 (2008).

[6] S. Deng, C. Cheng, G. Ni, Y. Meng, and H. Chen, Jap. J. Appl. Phys., 47, 7009–7012 (2008).

[7] S. Roth, J. Feichtinger, and C. Hertel, J.Appl.Microbiol. 108 521–531 (2010).

[8] N. Philip, B. Saoudi, M. C. Crevier, M. Moisan, J. Barbeau, and J. Pelletier, IEEE Trans. Plasma. Sci., 30 (4):

1429 – 1436 (2002).

[9] L. Yang, J. Chen, and J. J. Gao, J. Electrost. 67 (4): 646-651 (2009).

[10] N. Dumitrascu, I. Topalam, and G. Popa, IEEE Trans. Plasma Sci. 33 (2005), p. 1710

[11] J. H. Choi, I. Hana, H. K. Baik, M. H. Lee, D. W. Han, J. C. Park, I. S. Lee, K. M. Song , and Y. S. Lim, J.

Electrost., 64: 17-22 (2006).

[12] K. Lee, K. Paek, W.T. Ju, and Y. Lee, J. Microbiol. 44 (3) (2006), p. 269.

[13] B. Eliasson, M. Hirth, and U. Kogelschatz, J. Phys. D: Appl. Phys. 20 (1987), p. 1421.

[14] A. Chirokov, A. Gutsol, and A. Fridman, Pure Appl. Chem. 77 (2005) p.487.

[15] K. Herbold, B. Flehming, and K. Botzenhart, 55 2949-2953 (1989).

[16] L. Restaino, E. W. Frampton, J. B. Hemphill, and P. Palnikar, Appl. Env. Microbiol. 61 3471–3475 (1995).

[17] C. S. Li, and Y. C. Wang, Aiha J. 64 533-7 (2003).

[18] B. Thanomsub, V. Anupunpisit, S. Chanphetch, T. Watcharachaipong, R. Poonkhum, and C. Srisukonth,

J. Gen. Appl. Microbiol., 48 193–199 (2002).

[19] I. R. Komanapalli, and B. H. S. Lau, Appl. Microbiol. Biotechnol., 49 766–769 (1998).

[20] P. Sun, Y. Sun, W. Zhu, J. L. Lopez, J. Zhang, R. Li, and J. Fang, Appl. Phys. Lett 98 (2011).

[21] S. Ikawa, K. Kitano, and S. Hamaguchi, Plasma Process. Polym. 7 33-42 (2010).

[22] A. V. Nastuta, I. Topala, C. Grigoras, V. Pohoata, G. Popa, J. Phys. D: Appl. Phys. 44 105204 (2011).

[23] J. Opretzka, J. Benedikt, P. Awakowicz, J. Wunderlich, and A. von. Keudell, J. Phys. D: Appl. Phys. 40

(2007), p. 2826

[24] M. Cooper, N. Vaze, S. Anderson, G. Fridman, V.N. Vasilets, S. Anandan, A. Gutsol, A. Tsapin, and A.

Fridman, First International Conference on Plasma Medicine (ICPM-1), October 15th–18th, 2007, Corpus

Christi, Texas.

[25] N. Ekem, T. Akan, Y. Akgun, A. Kiremitci, S. Pat, and G. Musa, Surf. Coatings Technol. 201 (2006), p. 993.

[26] M. Laroussi, X. Lu: Appl. Phys. Lett. 87 (2005) 113902.

[27] R. Molina, P. Jovancic, D. Jocic, E. Bertran, P. Erra: Surf. Inter. Anal. 35 (2003) 128-135.

[28] A. Vesel, M. Mozetic, S. Strnad, Z. Persin, K.S tana-Kleinschek, N. Hauptman: Vacuum 84 (2010) 79-82.

[29] S. F. Sadova: High Energ. Chem. 40 (2006) 83-95.

[30] R. Morent, N. de Geyter, J. Verschuren, K. de Clerck, P. Kiekens, C. Leys: Surf. Coat. Technol. 202 (2008)

3427- 3449.

[31] J. Wan, J. Coventry, P. Swiergon, P. Sanguansri, C. Versteeg: Trends Food Sci. Technol. 20 (2009) 414-424.

[32] C. H. Gao, T. J. Herald, P. L. Muino: J. Food Sci. 1 (2001) 89-94.

[33] X. T. Deng, J. J. Shi, H. L. Chen, M. G. Kong: Proceedings of 28th ICPIG, 2007, Prague, p.1385.

[34] S. M. Kim, J. I. Kim: J. Microbiol. 44 (2006) 466-471.

[35] J. L. Walsh, M. G. Kong: Appl. Phys. Lett. 93 (2008) 111501.

[36] I. Motrescu, T. Hara, A. Ogino, S. Tanaka, T. Fujiwara, H. Kawagishi, S. Kodani, G. Popa, M. Nagatsu: J.

Automat. Mobile Robot. Intell. Sys. 3 (2009) 150-152.

M. R. Wertheimer, A. C. Fozza, A. Hollander: Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B151 (1999) 65-75.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jam.2009.108.issue-2/issuetoc

http://www.sciencedirect.com/science/journal/03043886

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235634%232009%23999329995%231152052%23FLA%23&_cdi=5634&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=73b3062ce127feb84b436d8ccf42f4aa

22 Capitolul al III-lea. Aplicaţii ale plasmei la presiune joasă | Studiul oxigenului atomic din plasma de temperatură joasă produsă în amestecuri de gaze. Aplicaţii

CCaappiittoolluull aall IIIIII--lleeaa.. AApplliiccaaţţiiii aallee ppllaassmmeeii llaa pprreessiiuunnee jjooaassăă

Studiul prezentat în acest capitol se doreşte a determina fezabilitatea controlului funcţiei biologice a unor molecule proteinacee prin iradiere în plasmă şi, în acelaşi timp, obţinerea unor informaţii detaliate legate de rolul speciilor de oxigen produse în plasmă. Pentru realizarea acestui obiectiv, în acest capitol se compară procesarea în plasma produsă într-un gaz inert, nereactiv (argon), cu cea în plasma de oxigen, puternic reactivă. În plus se încearcă separarea efectelor produse de speciile neutre printre care si oxigenul atomic şi compararea lor cu rezultatele expunerii directe în plasmă. Deoarece în cazul plasmei la presiune joasă radiaţia optică emisă are o energie considerabilă, în final se discută şi contribuţia acesteia la modificarea biomoleculelor.

În cazul procesării într-o plasmă produsă la presiune joasă într-un gaz intert, energia este transferată de la plasmă la probe prin interacţiuni fizice (ciocniri ale ionilor energetici şi metastabililor cu probele procesate) şi absorbţia fotonilor produşi în plasmă, capabili şi de efecte în volumul probei nu doar la suprafaţă, datorită puterii lor de penetrare. Atunci când plasma este produsă într-un gaz reactiv, mai apare o cale de comunicare e energiei între plasmă şi probe, reprezentată de energia chimică înmagazinată de speciile reactive din plasmă. În acest fel, prin compararea efectelor produse de o plasmă nereactivă cu cele într-o plasmă reactivă se poate discuta contribuţia speciilor reactive.

Sistemul pentru generarea plasmei

În cazul tratamentelor la presuine joasă plasma a fost produsă într-o incintă de oţel (Figura 20), la o presiune de 0.1 torr şi un debit de gaz de 100 sccm folosind microunde cu o putere de 500 W. Probele au fost plasate pe un suport aflat la 11 cm sub fereastra de cuarţ situată în partea superioară a incintei. Camera de descărcare are mai multe porturi care pot fi conectate la diferite instrumente de măsură (sondă, spectrometru de masă, spectrometru de emisie, etc). Temperatura la nivelul probelor în timpul tratamentelor în plasmă se estimează cu ajutorul thermolabel-urilor. Ca şi gaze de descărcare au fost folosite argonul (pentru plasma produsă în gaz nereactiv) şi respectiv oxigenul. Detalii suplimentare în legătură cu condiţiile de realizare a tratamentelor vor fi

prezentate cand va fi necesar pe parcursul discutării experimentelor.

Figura 20 Reprezentare schematică a incintei folosite pentru producerea plasmei la presiune joasă.


Modificarea biomoleculelor prin procesare în plasmă nereactivă

Caracteristicile plasmei utilizate pentru procesarea biomoleculelor au fost determinate prin măsurători de sondă şi emisie optică. Profilul plasmei se dovedeşte a fi omogen pe direcţie radială corespunzând poziţiei la care vor fi plasate probele în timpul expunerii. Uniformitatea a fost confirmată pe o distanţă de aproximativ 10 cm în jurul centrului camerei de descărcare.

Densitatea electronică măsurată a fost de 1.3×1011 cm-3, în timp ce temperatura electronilor are o valoare de aproximativ 1 eV (Figura 22).

Procesele radiative din plasmă au fost identificate prin intermediul spectroscopiei de emisie. Liniile VUV şi UV (100-400 nm) reprezintă fotoni de energie ridicată (până la 10 eV) emişi ca urmare a tranziţiilor efectuate de ionii de argon. Pentru lungimi de undă mai mari de 400 nm liniile emise indică prezenţa speciilor de argon uşor sau puternic excitate.

Inactivarea arginin vasotocinei

O probă expusă plasmei ar fi subiectul acţiunii simultane a radiaţiei optice şi particulelor produse în descărcare. În SWP produsă în argon energia este comunicată prin intermediul ionilor, metastabililor şi fotonilor. Potenţialul plasmei şi cel flotant au valoarea 11.5±0.5 V şi respectiv 5.5±0.5 V [12]. Astfel ionii de argon sunt acceleraţi în stratul de sarcină spaţială format în apropierea probelor astfel încât vor ajunge la moleculele de [Arg8] vasotocină având o energie de aproximativ 6 eV.

Cea mai importantă modificare rezultată în urma expunerii la plasma de argon asupra vasotocinei a fost evidenţiată în spectrul XPS al stării S 2p (Figura 23): maximul corespunzător legăturii disulfidice a vasotocinei (164.5 eV) nu mai este prezent în spectrul probelor expuse pentru 10 minute la plasma de argon în condiţiile mai sus menţionate, indicând faptul că acestea au fost rupte. Ţinând seama că temperatura în timpul procesării nu a depăşit 60ºC,

Figura 21 Profilul radial al curentului ionic de saturaţie determinat la z= 11 cm.

Figura 22 Profilul radial al temperaturii electronilor şi densităţii plasmei la z= 11 cm.


efectul nu a fost de natură termică ci s-a datorat exclusiv plasmei, putându-se afirma că plasma este capabilă de a produce ruperea legăturii disulfidice la temperatură joasă şi în mediu gazos.

Pentru a explica mecanismul modificărilor în plasma de argon, nu trebuie să uităm că toate reacţiile au loc în mediu gazos şi nu lichid ca în cazul reacţiilor biochimice clasice. În mediu gazos cel mai probabil eveniment este disocierea neutră sau homoliză, proces faţă de care energia de disociere a legăturilor chimice covalente are valori mai mari decât cele din fază lichidă. Dacă în ultimul caz acestea au aproximativ valorile 2.22 eV (S-S), 2.70 eV (C-S), 3.04 eV (C-N) [13], [14], [15], în fază gazoasă valorile sunt aproximatv 2.90 eV (S-S), 3.25 eV (C-S), 5.29 eV (C-N) [16]. Oricum acestea sunt determinate pentru molecule mici. Pentru moleculele de dimensiuni mai mari se poate manifesta efectul de ecranare mai ales în cazul moleculelor care conţin grupări polare, deci şi în cazul moleculelor proteinacee (-NH2, -C=O).

Aşa cum am discutat mai sus interacţiunile se realizează prin intermediul radiaţiei şi ionilor de argon. Energia este comunicată moleculelor producând specii excitate. Aceste excitări se pot propaga din aproape în aproape ajungând în alte locuri decât cel în care a fost iniţial absorbită energia. Există mai multe efecte ce pot urma, cum ar fi disociera unor legături, izomerizare, ionizare, relaxare radiativă. Secţiunea eficace a fiecărui din aceste procese depinde de energia absorbită iniţial

de la plasmă, masa particulelor care au ciocnit probele, dar şi de moleculele supuse tratamentului în plasmă. Autoionizarea stărilor supraexcitate este un proces neglijabil pentru biomolecule mari. S-a dovedit că în cazul acestora [16], datorită dimensiunilor mari, energia absorbită este transferată numeroaselor stări vibraţionale ale moleculei. Aşadar chiar dacă energia absorbită ar fi mai mult decât suficientă pentru a produce disocierea unor legături, acest lucru nu se întâmplă. Aşa se explică şi rezultatele obţinute în cazul experimentului descris în care energia ionilor este mai mare decât cea de disociere a legăturilor covalente.

Probele au fost analizate cu ajutorul spectrometriei de masă, constatându-se că masa lor rămâne aceeaşi după expunerea la plasmă ca şi înainte de tratament. Vasotocina tratată în palsma de argon pentru 10 minute nu suferă fragmentare ci doar o modificare conformaţională, fapt susţinut şi de rezultatele analizei de rezonanţă magnetică nucleară, prezentate în Figura 24. Diferenţele dintre spectrele moleculelor netratate şi cele expuse în plasmă corespund modificării reziduurilor Tyr [14], dar şi α-CH sau β-CH2 în reziduul de ileucină (Ile), glutamină (Gln) şi aspargină (Asn).

Inte

nsity (a

rb. u

nits)

Inte

nsity (a

rb. u

nits)

170 168 166 164 162 160

Binding Energy (eV)

170 168 166 164 162 160

Binding Energy (eV)

(a)

(b)

S-S

Figura 23 Spectre XPS S 2p ale arginin vasotocinei (a) netratată şi (b) expusă pentru 10 minutes la SWP în argon.


Figura 24 Spectre NMR ale vasotocinei (a) netratată (b) expusă pt 10 min la plasma de argon (în D2O).

(a)

(b)

AA’X

X’

Ty

r

a-C

H-G

lna

-CH

-Ile

a-C

H-G

ly

a-C

H-A

rga

-CH

-Pro

gC

H-P

ro

bC

H2-G

ln A

ceta

te

Met

hy

l gro

up

s o

f Il

e

b-C

H2-C

ys

d-C

H2-A

rg

b-C

H2-T

yr

b-C

H2-A

sn

gC

H2-G

ln

gC

H2-A

rg

gC

H2-I

le

Figura 25 Creşterea debitul de apă vs. timp pentru [Arg8] vasotocină netratată şi respectiv procesată în plasmă.


Figura 25 indică faptul că vasotocina expusă la SWP în argon pentru 10 minute îşi pierde funcţia de a favoriza creşterea debitului de apă prin pielea abdominală a broaştei, aceasta putând fi asociată cu modificarea conformaţiei ne mai permiţând conectarea moleculelor expuse cu receptorul ceea ce ar determina deschiderea acuaporinelor.

O posibilă structură rezultată ca urmare a procesării vasotocinei în plasmă este prezentată în Figura 26, conform cu rezultatele discutate mai sus.

Modificarea cistinei în plasma de argon

Cistina a fost expusă la SWP în argon în aceleaşi condiţii ca şi vasotocina. În acelaşi timp procesarea a fost monitorizată cu ajutorul unui spectrometru de masă.

Măsurătorile XPS au evidenţiat reducerea maximului corespunzător legăturii disulfidice după 10 minute de tratament, fapt ce poate fi explicat prin ruperea acestora în unele molecule expuse. Cum moleculele de cisteină sunt mult mai mici decât cele de vasotocină, numărul stărilor vibraţionale e mai mic, disocierea legăturilor fiind mai puternică. Astfel nu doar legătura disulfidică este afectată ci şi alte legături de energie joasă, ca C-N, C-O, rezultând scăderea numărului de grupări amino şi hidroxil. Aceste modificări sunt evidenţiate şi în spectrele NMR.

Aceste rezultate indică faptul că procesarea biomoleculelor în plasmă nu depinde doar de parametrii acesteia ci şi de mărimea şi structura biomoleculei expuse acţiunii plasmei. Moleculele mai mici sunt mai uşor modificate cu ajutorul plasmei, principalul proces fiind cel al ruperii de legături, pe când în cazul moleculelor de dimensiuni mai mari disocierea e mai redusă predominând modificările conformaţionale. În cazul cisteinei disocierea a fost evidenţiată şi

Figura 26 (a) Reprezentare schematică a moleculei native de vasotocină şi (b) a moleculei după procesarea în plasmă (reziduurile reprezentate cu albastru şi contur punctat sunt cel mai probabil cele afectate de tratamentul în plasmă).


prin intermediul măsurătorilor spectrometrice de masă efectuate în timpul procesării, fiind detectate diferite specii volatile.

Modificarea biomoleculelor în plasma de oxigen – Rolul neutrilor produşi în plasmă

În cazul procesării în plasma de argon am arătat că există posibilitatea modificării funcţionale a moleculelor peptidice, efectele datorându-se acţiunii componentelor plasmei, mai exact ioni, metastabili şi fotoni. Prin folosirea oxigenului ca gaz de descărcare se adaugă o componentă chimică reactivă plasmei şi deci procesării.

Acest paragraf prezintă rezultate ale procesării în plasma de oxigen la presiune joasă, insistându-se asupra rolului radicalilor produşi în plasmă. Pentru separarea acestora a fost folosită o grilă conectată la masă, având o transparenţă optică de aproximativ 17.7 %, astfel că împreună cu neutrii la probe vor ajunge şi o parte din fotonii emişi în plasmă. În toate experimentele poziţia probelor în camera de descărcare a fost aceeaşi.

Figura 27 prezintă un spectru de emisie tipic al SWP produse în oxigen. Acesta conţine mai multe linii ale O I , dar şi una corespunzând unei tranziţii a O II precum şi tranziţii ale O2

+. Deşi emisia în domeniul UV este sărăcăcioasă în comparaţie cu plasma de argon de exmplu, energia fotonilor emisi este intensă, cea mai puternică linie fiind la o valoare a lungimii de undă de 130.6 nm provenind de la O I (3p5P – 3s5S0). Cele mai intense linii din spectru corespund stării metastabile ale oxigenului atomic, 3p5P – 3s5S0 la

777.4 nm. Mai sunt evidenţiate şi câteva linii din sistemul vibraţional O2

+ b4Σg

- a4Πu [19] între 500 şi 700 nm.

În zona de plasare a probelor valoarea temperaturii electronilor este de aproximativ 1.1 eV iar a densităţii 2 x 1011 cm-3. Potenţialul plasmei a avut o valoare de 8 V. Diagrama potenţialului pe direcţie radială arată că între spaţiul de deasupra grilei şi cel de dedesubt (zona tratamentelor) există o diferenţă de potenţial de aproximativ 7 V astfel încât ionii sunt împiedicaţi să ajungă în zona probelor, eventualele efecte putând fi atribuite exclusiv neutrilor produşi în plasmă şi radiaţiei optice.

Figura 27 Spectrul de emisie al plasmei de oxigen.


Arginin vasotocina expusă la plasma de oxigen

Schimbarea cea mai proeminentă şi în cazul tratamentelor în plasma de oxigen este evidenţiată în spectrul XPS S 2p care indică ruperea legăturilor disulfidice. Acest eveniment are loc nu doar la expunerea directă în plasmă ci şi atunci când sunt extraşi doar neutri. Datorită reactivităţii chimice puternice a speciilor din plasma de oxigen, conţinutul în oxigen atomic al probelor creşte în urma expunerii, în timp ce procentul de azot şi carbon scad indicând o puternică fragmentare. Radicalii din plasmă, mai ales oxigenul atomic, reacţionează cu toate elementele oxidând probele. Spectrele XPS au evidenţiat prezenţa grupărilor (-NOx). Prin comparaţie cu rezulatele obţinute în plasma nereactivă şi prezentate anterior putem concluziona că aceste efecte se datorează speciilor reactive. În plus comparând efectul neutrilor cu cel al expunerii directe la plasmă, se poate observa că oxigenul atomic produce în principal disocierea legăturilor din biomoleculele expuse, în timp ce ionii de oxigen molecular duc la creşterea cantităţii de oxigen din probe.

Disocierea intensă în urma expunerii directe la plasma de oxigen este dovedită şi de evaluarea masei moleculelor după expunere. Exceptând peak-ul corespunzător moleculelor native, sunt evidenţiate fragmente de diferite mase, procesarea dovedindu-se într-o oarecare măsură specifică (predomină fragmente de masă 331 şi 291 amu). Rezultatele sugerează

faptul că plasma a distrus legături peptidice. Pentru timpi mai lungi de procesare

numărul fragmentelor creşte.

Cistina procesată în plasma de oxigen

În cazul cistinei expunerea la plasma de oxigen determină creşterea numărului de legături simple ale oxigenului în special cu sulf şi azot, probabil ca rezultat al oxidării probelor. În schimb pentru probele expuse doar la neutri din plasmă oxidarea nu apare atât de pregnant. Aceste rezultate duc la concluzia că efectul neutrilor şi speciilor încărcate electric nu sunt cumulative.

O analiză mai detaliată indică faptul că neutri şi ionii produc diferite grupări funcţionale: la probele expuse neutrilor peakul XPS al oxigenului creşte cu 80% probabil datorită unor grupări ca S=O, în timp ce pentru expunerea directă la plasmă predomină grupări cu legături simple, ca

Figura 28 Spectru de masă al vasotocinei expusă la plasma de oxigen pentru 10 minute.


SOx, evidenţiate la energii de legătură diferite. Se formează legături și între oxigenului şi atomi de azot. Astfel un nou peak este detectat la 534.6 eV indicând prezenţa grupărilor NOx.

Figurile 29 şi 30 prezintă o comparaţie între procesarea în plasma de oxigen, respectiv neutri extraşi din plasmă şi operarea plasmei fără probă în incintă. Spectrul indicat cu culoare roşie în Figura 29 arată că în timpul procesării în plasmă sunt produse o multitudine de compuşi volatili, intensitatea peakurilor determinate de aceştia fiind mai mare decât în cazul expunerii cistinei la neutri din plasmă (spectrul de culoare verde din Figura 30).

Creşterea conţinutului în oxigen al probelor poate fi explicată de următorul mecanism de reacţie R*+O* → RO, unde R* este un radical de cistină format ca rezultat al disocierii homolitice a unei molecule de cistină: R1 –R2 → R1

* + R2*. Ţinând seama de prezenţa oxigenului atomic în

descărcare, disocierea moleculelor de cistină poate avea loc şi ca urmare a reacţiei de oxidare: R1 – R2 + O* → R1O + R2*.

Studiul modificării unor aminoacizi folosind cromatografia lichidă şi

spectrometria de masă

Pentru experimentele prezentate în acest paragraf a fost folosită o altă incintă de descărcare cu un volum mai mare, prezentată în Figura 31. Plasma a fost produsă în oxigen (150 sccm) folosind microunde (2 kW) pentru diferite presiuni ale gazului între 1 şi 7 Pa. Pentru a studia efectele induse de neutri produşi în plasmă a fost folosită o grilă împământată, la fel ca în experimentul anterior.

Figura 29 Spectre de masă în timpul procesării în plasma de oxigen.

Figura 30 Spectre de masă în timpul procesării cu neutri extraşi din plasmă.

Figura 31 Schema dispozitivului experimental.


Figura 32 prezintă rezultatele măsurătorilor de sondă realizate în funcţie de presiunea gazului. Se poate observa că temperatura electronilor scade monoton de la aproximativ 1.7 eV pentru 1 Pa la puţin peste 1 eV pentru o presiune de 7 Pa.

În domeniul de presiune investigat densitatea plasmei variază cu aproape un ordin de mărime având o valoare maximă în jurul unei presiuni de 2-3 Pa. Un profil similar a fost evidenţiat şi pentru concentraţia ionilor moleculari, O2

+, determinată cu spectrometrul de masă în mod ionic aşa cum se poate observa din Figura 33. Aceeaşi figură arată variaţia concentraţiei de ioni atomici care descreşte cu creşterea presiunii descărcării fiind neglijabilă pentru presiuni mai mari de 4 Pa.

Procesarea aminoacizilor

Probe de aminoacizi au fost expuse în două condiţii: direct la plasmă şi respectiv la neutri produşi în plasmă, pentru descărcări produse la presiuni de 3 Pa şi 5 Pa. Comparând plasma produsă la cele două presiuni, la 5 Pa concentraţia de ioni moleculari este mai mică iar cea de ioni atomici neglijabilă; temperatura electronilor este similară în ambele cazuri însă componenta electronică nu prezintă importanţă pentru tratamentele în plasme reci, aceştia având o energie mult prea mică.

Spectrometria de masă a fost utilizată şi pentru monitorizarea procesării în toate circumstanţele. Rezultatele indică o disociere mai accentuată în cazul plasmei produse la 3 Pa decât pentru cea produsă la 5 Pa, dar şi mai intensă decât procesarea sub acţiunea neutrilor plasmei. Figura 34 prezintă spectrele măsurate pentru cazul în care presiunea a fost 3 Pa. Se poate observa că disocierea e neglijabilă când doar neutri interacţionează cu probele de serină. Situaţia diferă mult pentru expunerea directă la plasmă, fiind detectate fragmente în patru zone: 1 – hidrogen, 2 – pot aparţine radicalilor hidroxil, 3 – pot fi COOH sau alt produs rezultat din disocierea serinei, 4 – 67 şi respectiv 69 amu aceste peak-uri confirmă ruperea de grupări hidroxil. Se pare că şi în acest caz disocierea legăturilor este selectivă, la fel ca în cazul prezentat în paragraful anterior.

Figura 32 Densitatea plasmei şi temperatura electronilor vs. presiune.

Figura 33 Concentraţia speciilor ionice în plasma de oxigen vs. presiune.


Probele expuse în aceste condiţii au manifestat un comportament intersant. Spectrele HPLC au indicat modificarea masei moleculelor. Rezultatele sunt susţinute de măsurătorile XPS care arată modificarea spectrului azotului, cel mai probabil prin formarea de grupări cu oxigenul. În probele expuse la neutri din plasmă, conţinutul de oxigen scade, probabil datorită ruperii unor grupări hidroxil.

În acelaşi timp sunt produse şi deaminări ceea ce indică faptul că ionii moleculari, cea mai densă specie în plasma produsă la 3 Pa produc mai degrabă ruperea legăturilor simple C-N decât grupări cu oxigen ale azotului aşa cum se întâmplă în cazul neutrilor.

Pentru o presiune de 5 Pa rezultatele diferă enorm faţă de cele prezentate până acum. Spectrele din Figura 35 arată prezenţa după procesare a unor molecule care au masa mult mai mare decât cea a serinei native.

Pentru a explica aceste rezultatele trebuie să ţinem seama de rezultatele diagnozei plasmei în cele două cazuri. Având în vedere prezenţa unei concentraţii mult mai mari de ioni moleculari în cazul plasmei produse la 3 Pa, se poate spune că această specie este responsabilă pentru rezultatul obţinut. Şi ionii de oxigen atomic ar putea contribui într-o oarecare măsură deoarece concentraţia lor e destul de mare pentru 3 Pa faţă de cazul în care presiunea e 5 Pa.

Aceste rezultate ar putea fi în continuare completate de alte experimente pentru a lămuri pe deplin contribuţia fiecărei specii produse în plasmă.

Figura 34 Monitorizare în timpul procesării moleculelor de serină.

Figura 35 Spectre HPLC ale serinei netratată, expusă la plasma de oxigen pentru 3 Pa şi

respectiv 5 Pa.


Contribuția radiației optice emise de plasmă la modificarea biomoleculelor

În afară de efectele induse în plasmă de particule (electroni, ioni, neutri), nu trebuie neglijat efectul fotonilor din plasmă. Acest paragraf își propune să prezinte rezultate obţinute ca urmare a expunerii biomoleculelor la radiaţia emisă de plasmă.

Datorită proceselor radiative de dezexcitare care au loc în plasmă sunt emiși fotoni într-un domeniu larg de lungimi de undă de la cele mai mici (VUV) în domeniul ultraviolet până la radiaţii infraroșii (IR), emisii care depind de gazul folosit pentru producerea descărcării dar și de condiţiile de operare. Energiile și lungimile de undă corespunzătoare acestor domenii sunt sumarizate în Tabelul 1 [22].

Tabelul 1 Domenii de energie ale fotonilor produși în plasmă [22].

Cea mai mare energie corespunde fotonilor din domeniul ultraviolet, aceștia fiind capabili să producă efecte notabile asupra biomoleculelor expuse plasmei. Efectele acoperă un domeniu larg de la simple excitări până la disocierea

unor legături. Un efect posibil e și crearea de noi legături între molecule adiacente.

Grupările cromofore tipice absorbante de radiaţii VUV/UV sunt –C=O, -ROOH și grupările aromatice, motiv pentru care în cazul moleculele proteinacee ne putem aștepta la efecte puternice dacă ţinem seama ca acești cromofori sunt grupări extrem de comune în astfel de molecule.

Aranjament experimental și condiții de lucru

Figura 36 Reprezentare schematică a dispozitivului utilizat pentru studiul contribuţiei radiaţiei emise în plasmă asupra modificării biomoleculelor.


Contribuţia fotonilor emiși în plasmă asupra biomoleculelor a fost studiată cu dispozitivul prezentat în Figura 36: probele au fost plasate într-o mică incintă vidată, fotonii fiind extrași din plasmă prin intermediul unei ferestre de florură de litiu (LiF) transparentă doar pentru radiaţii care au lungimea de undă mai mare de 120 nm. Au fost comparate efectele obţinute pentru o plasmă de azot și una de oxigen, toţi parametrii descărcării fiind aceiași în ambele situaţii. Presiunea în interiorul incintei mici a fost menţinută la valoarea de 0.1 torr. Probele au fost procesate pentru intervale de timp destul de lungi 10, 20 și respectiv 30 de minute în ideea de a avea efecte proeminente.

Rezultate și discuții

Prima concluzie rezultată din datele XPS este că 10 minute de procesare doar sub acţiunea radiaţiei nu sunt suficiente pentru obţinerea unor efecte remarcabile. Pentru timpi mai lungi de

procesare, spectrul sulfului S 2p arată în mod clar dispariţia maximului caracteristic legăturii disulfidice.

Fragmentarea vasotocinei este evidenţiată și de măsurătorile ESI-MS ale masei moleculelor (Figura 38). Pe măsură ce crește timpul de iradiere crește și gradul de fragmentare a moleculelor expuse la radiaţiile emise în plasmă.

Moleculele proteinacee sunt bune absorbante de radiaţii ultraviolete datorită grupărilor ketonice pe care le conţin ceea ce le face sensibile la radiaţia emisă de plasmă. Concluzia sugerată de aceste rezultate este că atunci când sunt evaluate efectele plasmei, nu trebuie neglijată contribuţia radiaţiilor emise mai ales când este vorba de plasma produsă la presiune joasă și pentru timpi mari de expunere.

Figura 37 Spectre XPS S 2p ale vasotocinei în diferite condiţii.

Figura 38 Spectrul de masă al vasotocinei expuse pentru 20 min la radiaţia emisă în plasma de oxigen.


Concluzii ale aplicațiilor plasmelor produse la presiune joasă

Plasma, prin constituenţii ei, s-a dovedit a fi un bun instrument pentru inactivarea sporilor și modificarea moleculelor proteinacee. Efectul procesării în plasmă depinde de parametrii acesteia. Un factor important îl reprezintă gazul de descărcare; speciile plasmei și reactivitatea lor depind radical de natura gazului deci și mecanismele implicate în procesarea în plasmă vor fi diferite.

Plasma produsă în oxigen la presiune joasă s-a dovedit a fi o unealtă puternică nu doar în aplicaţii de sterilizare dar și în tratarea contaminării la nivel molecular. Modificarea funcţională a [Arg8]-Vasotocinei a fost obţinută prin expunerea la o plasmă nereactivă și se datorează schimbării conformaţionale determinate nu doar de ruperea legăturii disulfidice dar și de celelalte efecte care au indus rearanjarea legăturilor în molecula expusă în plasmă. Toate modificările produse de acţiunea simultană a ionilor, metastabililor și fotonilor din plasmă au contribuit la pierderea funcţiei biologice a peptidei de a favoriza creșterea fluxului de apă prin pielea abdominală a broaștei.

Rezultatele expunerii biomoleculelor la plasma de oxigen în diferite condiţii au dovedit că efectul particulelor cu sarcină electrică și a neutrilor nu sunt cumulative. Se pare că speciile ionice produc o puternică oxidare a probelor, cele mai reactive fiind ionii moleculari, în timp ce oxigenul atomic ar fi responsabil pentru disocierea legăturilor cu producerea de specii volatile.

În cazul serinei procesate într-un alt dispozitiv rezultatele au indicat faptul că efectele depind radical de speciile din plasmă și concentraţiile acestora. Ionii moleculari produc creșterea conţinutului de oxigen al probelor în timp ce radicalii atomici oxidează grupările amino. Ionii moleculari care, pentru o presiune de descărcare de 3 Pa au o concentraţie mai mare decît pentru 5 Pa, pot produce oligomerizarea serinei așa cum indică rezultatele cromatografiei lichide. Fragmentarea a fost studiată prin intermediul măsurătorilor spectrometrice de masă dovedindu-se a fi neglijabilă atunci când moleculele sunt expuse doar neutrilor extrași din plasmă. Disocierea se pare că este totuși un proces selectiv doar anumite reziduuri fiind evidenţiate.

Pentru a evidenţia rolul componentelor plasmei în cadrul procesării biomoleculelor, a fost studiată contribuţia radiașiilor emise de plasmă, demonstrându-se că ultravioletele au un rol important în procesare producând nu doar disocierea legăturilor disulfidice dar și a altor legături cu energie joasă. Exceptând interacţiunile fizice ale particulelor cu probele, reacţiile induse de fotoni se datorează în principal radiaţiei ultraviolete.


Referințe

[1] O. Kylian, J. Benedikt, L. Sirghi, R. Reuter, H. Rauscher, A. von Keudell, and F. Rossi, Plasma Process.

Polym. 6 (2009) 255-261.

[2] H. Rauscher, K. Stapelmann, O. Kylian, B. Denis, and F. Rossi, Vacuum 84 (2009) 75.

[3] F. Rossi, O. Kylian, N. Hasiwa, A. Ruiz, H. Rauscher, L. Sirghi, E. Comoy, C. Dehen, L. Challier, and J. P.

Deslys: Plasma Process. Polym. 7 (2010) 327.

[4] M. Moisan, J. Barbeau, M-Ch. Crevier, J. Pelletier, N. Philip, and B. Saoudi, Pure Appl.Chem. 74 (2002)

349-358.

[5] M. Nagatsu, F. Terashita, H. Nonaka, L. Xu, T. Nagata, and Y. Koide, Appl.Phys.Lett. 86 (2005) 211502.

[6] M. Nagatsu, F. Terashita, and Y. Koide, Jpn.J.Appl.Phys 42 (2003) L856-859.

[7] Y. Zhao, M. Shingh, A. Ogino, and M. Nagatsu, Thin Solid Films, 518 (2010) 3590-3594.

[8] S. Lerouge, A. C. Fozza, M. R. Werthimer, R. March, and L. H. Yahia, Plasma Proces. Polym. 5 (2000) 33.

[9] Y. Zhao, A. Ogino, and M. Nagatsu, Appl. Phys. Lett. 98 (2011) 191501.

[10] K. K. Banerjee, S. Kumar, K. E. Bremmell, and H. J. Griesser, J. Hospit. Infect. (2010),

doi:10.1016/j.jhin.2010.07.001.

[11] I. Motrescu, A. Ogino, S. Tanaka, T. Fujiwara, S. Kodani, H. Kawagishi, G. Popa, and M. Nagatsu, Thin

Solid Films, 518 (2010) 3585.

[12] A. Ogino, S. Noguchi, and M. Nagatsu, J. Photopolym. Sci. Technol. 22 (2009) 461.

[13] D. Nelson, M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, (Palgrave Macmillan , 2000), 4th ed.

[14] R. Walter, K. U. M. Prasad, R. Deslauriers, and I. C. P. Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70 (1974) 2086.

[15] R. T. Morrison, and R. N. Boyd: Organic Chemistry, Prentice Hall, 1992,6th ed.

[16] R.P.Wayne: Principles and applications of photochemistry, Oxford University Press, Oxford, 1998

[17] T. Hasegawa, H. Tanii, and M. Suzuki, S. Tanaka, Endocrinology 144 (2003) 4087.

[18] H. Hausmann, A. Richters, H-J. Kreienkamp, W. Meyerhof, H. Mattes, K. Laderis, H. Zwiers, and D. Richter,

Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Biochemistry, 93 (1996) 6907.

[19] P. H. Krupenie, J. Phys. Chem. Ref. Data 1 (1972) 423-534.

[20] A. Qayyum, S. Zeb, S. Ali, A. Waheed, and M. Zakaullah: Plasma Chem. Plasma Process. 25 (2005) 551.

[21] R. A. N. Pertile, F. K. Andrade, C. Alves Jr., M. Gama: Carbohydr. Polym. 2010,

doi:10.1016/j.carbpol.2010.05.037.

[22] J. Reece Roth: IOP Publishing Ltd., London, 2001.

[23] R. P. Wayne: Oxford University Press, Oxford, 1998.

[24] A. Mozumder, Y. Hatano: Marcel Dekker, Inc., New York, 2004.

[25] P. Boule: Springer- Verlag Berlin Heidelberg, 1999.

[26] Y. Zhao, M. K. Shingh, A. Ogino, M. Nagatsu: Thin Solid Films 518 (2010) 3590-3594.

36 Concluzii generale | Studiul oxigenului atomic din plasma de temperatură joasă produsă în amestecuri de gaze. Aplicaţii

CCoonncclluuzziiii ggeenneerraallee

În această teză sunt prezentate rezulate de primă importanţă legate de interacţiunile plasmelor reci cu molecule proteinacee, inactivarea unor astfel de biomolecule dar și a unor microorganisme fiind obţinută. Au fost investigate capacităţile unor plasme produse atât la presiune atmosferică cât și la presiune joasă de a produce astfel de efecte, precum și mecanismele responsabile pentru aceste rezultate, fiind studiată interacţiunea dintre plasma rece și peptide, aminoacizi și microorganisme.

Pentru plasma DBD la presiune atmosferică a fost demonstrată abilitatea de inactivare a microorganismelor în cazul bacteriilor (atat gram pozitive cât și gram negative) dar și a fungilor. Plasma s-a dovedit a avea cea mai mare eficienţă în cazul bacteriilor S. aureus pentru care au fost puse în evidenţă cele mai mari zone de inhibilţie a dezvoltării bacteriene ca urmare a expunerii la plasmă. Principalii factori responsabili pentru obţinerea acestor efecte par a fi radicalii liberi, formarea ozonului fiind evidenţiată mai ales în cazul configuraţiei cu o distanţă între electrozi de 3.5 cm prin intermediul oxigenului atomic. Bacteriile gram pozitive au răspuns mai bine decât cele gram negative pentru configuraţia în care distanţa a avut valoarea de 2.5 cm.

Plasma produsă la presiune atmosferică a permis modificarea structurii unor biomolecule. Efectul principal al expunerii biomoleculelor la o astfel de plasmă este oxidarea promovată de speciile reactive din plasmă. Mecanismul de modificare a unor astfel de molecule pare să depindă de dimensiunile acestora; în cazul unui aminoacid, glicina, câteva minute de expunere au fost suficiente pentru a produce schimbări majore, procesul saturându-se pentru intervale de timp mai lungi, în timp ce în cazul peptidei procesate conţinând nouă reziduuri de aminoacizi, a fost necesar un timp mai îndelungat pentru a produce efecte notabile.

Plasmele reci produse la presiune joasă s-au dovedit și mai eficiente pentru obţinerea sterilizării microorganismelor dar și modificarea biomoleculor. Creșterea concentraţiei de oxigen atomic duce la micșorarea dimensiunilor sporilor trataţi în plasmă.

Vasotocina expusă unei astfel de plasme este inactivată doar dupa 10 minute în plasma nereactivă datorită unor modificări conformaţionale induse de constituenţii plasmei prin rearanjarea moleculei ca urmare a absorbţiei de energie. Comparând rezultatele procesării în plasme nereactive cu cele obţinute în plasma de oxigen a fost clar evidenţiată contribuţia oxigenului atomic în determinarea unor modificări radicale care s-au finalizat cu fragmentarea moleculelor procesate în plasmă. Reactivitatea crescută a oxigenului face ca plasma de oxigen să fie o unealtă puternică pentru inactivarea rapidă a contaminării atât la nivel molecular cât și microscopic.

Fără îndoială, plasmele reci sunt extrem de eficiente pentru inactivarea contaminării biologice datorită puterii de penetrare și a energiei înmagazinate de componentele sale și care poate fi ușor transferată probelor expuse în plasmă, putând acţiona nu doar prin ruperea unor legături dar și prin inducerea unor modificări conformaţionale.

37 Mulţumiri | Studiul oxigenului atomic din plasma de temperatură joasă produsă în amestecuri de gaze. Aplicaţii

MMuullțțuummiirrii

Îi mulţumesc lui Dumnezeu pentru toate lucrurile minunate de care am avut parte în ultimii ani și pentru tot ce am învâţat în această perioadă. Mulţumirile mele sunt adresate în mod egal tuturor celor care au fost alături de mine.

Îi sunt deosebit de recunoscătoare coordonatorului știinţific al acestei teze, domnul profesor Gheorghe Popa, nu doar pentru îndrumarea știinţifică dar și pentru faptul că este un model pentru mine și pentru că a influenţat destul de mult drumul meu în ultimii ani, mai ales către cel mai bun lucru care mi s-a întâmplat în viaţa: venirea în Japonia în cadrul programului de dublu doctorat. Nu este vorba doar de plăcerea de a face cercetare, unul din lucrurile care îmi place la nebunie, dar și de faptul că am avut ocazia să trăiesc într-o ţară de care m-am întrăgostit și în care am parte de o mulţime de experienţe interesante și plăcute. Trebuie să îi mulţumesc în acest sens și domnului profesor Dumitru Luca, prima persoană care mi-a stârnit interesul în acestă direcţie și una din nu foarte multele persoane care m-a susţinut în acest sens.

Mă consider extrem de norocoasă pentru ajutorul primit mai ales din partea unei dragi doamne, doamna profesoară Dorina Creangă, care mi-a ghidat pașii în realizare primelor experimente de microbiologie, scrierea primului articol important, și apoi pe tot parcursul redactării tezei cu sfaturi utile. Voi admira mereu capacitatea dumneaei de a găsi la fiecare problemă o gamă largă de perspective. Apreciez din tot sufletul răbdarea dumneai și mai ales faptul că pune enorm de mult suflet în tot ceea ce face.

Mă consider extrem de norocoasă printre altele pentru că am ajuns în Japonia într-un grup de cercetare pe care îl simt ca o familie, și asta se datorează în foarte mare măsură îndrumătorului știinţific al tezei de doctorat japoneze, profesorul Masaaki Nagatsu, care pentru mine va fi mereu ”sensei”și pe care îl admir. De la dumnealui am învăţat, printre altele, să am mai multă răbdare; în schimb am oferit o perspectivă mai relaxantă și optimistă perfecţiunii pe care o așteaptă de la noi, studenţii săi.

O altă persoană pe care o admir și căreia îi adresez mulţumiri este profesorul Akihisa Ogino și asta pentru răbdarea și suportul tehnic acordat de nenumărate ori, pentru susţinere și încurajări.

În ciuda distanţei geografice dintre România și Hamamatsu, familia mi-a fost mereu aproape și m-a susţinut ca de obicei în toate. Ţin să le mulţumesc și unor persoane care au fost de asemenea alături și m-au încurajat, mai ales în ultimii trei ani dar nu numai. Aceștia sunt domnul profesor Octavian Rusu, domnul profesor Constantin Leonte și doamna Doina Stupariu. Sunt fericită și onorată că îi cunosc. Apreciez toate gândurile bune pe care prietenele mele dragi Ana Andreea Arteni, Luiza Druta și Laura Banu mi le-au adresat.

Pe cei nemenţionaţi în mod expicit aici îi rog să ma ierte. Lista pesoanelor care mi-au fost aproape într-un fel sau altul în ultimii ani este lungă; fiecare din ei ar trebui să știe că au are un loc în sufletul meu și că mă bucur să îi am aproape.

38 Activitatea de cercetare | Studiul oxigenului atomic din plasma de temperatură joasă produsă în amestecuri de gaze. Aplicaţii

AAccttiivviittaatteeaa ddee cceerrcceettaarree

Articole

Iuliana Motrescu, Takuya Hara, Akihisa Ogino, Shigeyasu Tanaka, Taketomo Fujiwara, Hirokazu Kawagishi, Shinya Kodani, Gheorghe Popa, Masaaki Nagatsu, "Investigation of Low Temperature Plasma Capabilities to Modify The Structure and Function of Bio-polymers", J. of Automation, Mobile Robotics & Intelligent Systems, Vol. 3 (2009) pp.150-152.

A.Poiata, Iuliana Motrescu, C.Tuchilus, A.Nastuta, D.E.Creanga, G.Popa “Microorganism Response to Atmospheric Pressure Helium Plasma DBD Treatment”, J. Electrostatics 68 (2), 2010, pp.128-131.

Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Shigeyasu Tanaka, Taketomo Fujiwara, Shinya Kodani, Hirokazu Kawagishi, Gheorghe Popa, and Masaaki Nagatsu, "Mechanism of peptide modification by low-temperature microwave plasma", Soft Matter (2011) 7, pp. 4845-4850, DOI:10.1039/C0SM01412E.

Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Shigeyasu Tanaka, Taketomo Fujiwara, Shinya Kodani, Hirokazu Kawagishi, Gheorghe Popa, Masaaki Nagatsu, "Effects of Nitrogen and Oxygen Radicals on Low-temperature Bio-molecule Processing", Jpn. J. Appl. Phys.(2011) 50 (2011) 08JF07, DOI: 10.1143/JJAP.50.08JF07.

Masaaki Nagatsu, Ying Zhao, Iuliana Motrescu, Ryota Mizutani, Yuya Fujioka, Akihisa Ogino, , "Sterilization Method for Medical Container Using Microwave-Excited Volume-Wave Plasma", Plasma Process. Polym. accepted for publication.


Conferințe

1. Iuliana Motrescu, C. Astefanoaei, C. Nadejde, D.E. Creanga, G. Stoian, „The influence of direct current discharges on vegetal organisms exposed during early ontogenetic stages”, November 2007, TIM’07, Universitatea de Vest, Timisoara, Romania.

2. Iuliana Motrescu, A.Poiata, A.Nastuta, D.E.Creanga, G.Popa – “Bacteria and Fungi Response to Cold Plasma Treatment”, 19th Europhysics Conference on the Atomic and Molecular Physics of Ionized Gases, 2008, Granada, Spain.

3. Iuliana Motrescu, A. Poiata, A. Nastuta, D. Creanga, G. Popa, « Pathogen Bacteria Sterlization in Low Temperature Helium Plasma» , 7th International Conference on Global Research and Education InterAcademia, September 15th-18th, Pecs, Hunagry.

4. Iuliana Motrescu, Shuhei Kojima, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu，"Analysis of Molecular

Structures of Amino Acids and Peptides Irradiated by Atmospheric Pressure Plasma"，Plasma Science

Society 2009/ Symposium of Plasma Processing - 26 (PSS-2009/SPP-26)，Nagoya University (2009.2.2-4) P3-39, pp.492-493, Japan.

5. Shuhei Kojima, Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu, “Effect of ion bombardment in amino acid and low temperature of peptide surface wave plasma processing”, Plasma Science

Society 2009/ Symposium of Plasma Processing - 26 (PSS-2009/SPP-26)，Nagoya University (2009.2.2-4) P3-20, pp.454-455, Japan.

6. Iuliana Motrescu, Kojima Shuhei, Ryota Kakei, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu, “Effects of plasma irradiation on the structure and function of amino acids and peptide” 56th meeting of Japan Society of Applied Physics, Tsukuba University,(2009.3.30-4.2) 31a-Q-2, p.259.

7. Iuliana Motrescu, Takuya Hara, Akihisa Ogino, and Masaaki Nagatsu，"Modification of Peptide

by Surface Wave Plasma Processing "， The 22nd Symposium on Plasma Science for Materials (SPSM-

22)，Univ. of Tokyo, Sanjo Conference Hall (2009.6.15-16) p.16, Japan.

8. Iuliana Motrescu，Akihisa Ogino，Shigeyasu Tanaka, Taketomo Fujiwara, Hirokazu Kawagishi,

Shinya Kodani，Masaaki Nagatsu，"Investigation of the Mechanisms of Peptide Modification by

Plasma Irradiation"，The 70th Autumn Meeting, 2009; The Japan Society of Applied Physics，Univ. of Toyama (2009.9.8-11) 8p-TG-10, p.208, Japan.

9. Takuya Hara, Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu，"Effect of Biasing on Peptide

Modification Using Microwave Plasma"，The 2009 Tokai-Section Joint Conference on Electrical and

Related Engineering，Aichi Institute of Technology (2009.9.10-11) O-461, Japan.

10. Iuliana Motrescu, Akihisa OGINO, Masaaki NAGATSU, "Investigation of VUV/UV Emission and Mass Spectrometry in Plasma-Biopolymers Interaction in Different Gas Circumstances", The Japan

Society of Plasma Science and Nuclear Fusion Research 26th Annual Meeting，Kyoto International community House (2009.12.1-4) 1pD32P, Japan.


11. Takuya Hara, Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu, "Control of Biopolymer’s Conformation by Means of Ion Bombardment of Microwave Plasma", The Japan Society of Plasma

Science and Nuclear Fusion Research 26th Annual Meeting，Kyoto International community House (2009.12.1-4) 1pD35P, Japan.

12. Iuliana Motrescu, Takuya Hara, Akihisa Ogino, Shigeyasu Tanaka, Taketomo Fujiwara, Hirokazu Kawagishi, Shinya Kodani, Gheorghe Popa, Masaaki Nagatsu, "Investigation of Low Temperature Plasma Capabilities to Modify The Structure and Function of Bio-polymers ", Inter-Academia 2009, Kazimierz Dolny and Warsaw, Poland (2009.9.14-17).

13. I.Motrescu, T. Hara, A. Ogino, S. Tanaka, T. Fujiwara, S. Kodani, H. Kawagishi, Gheorghe Popa1, M. Nagatsu, "MODIFICATION OF BIO-POLYMERS USING MICROWAVE EXCITED SURFACE-WAVE PLASMA ", 7th International Workshop on MICROWAVE DISCHARGES: FUNDAMENTALS AND APPLICATIONS (MD-7), CURREAC, Hamamatsu, Japan (2009.9.22-27) p.34 .

14. Takuya Hara, Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu, "Study of Interaction between

Microwave Plasma and Biopolymer Using Mass Spectroscopy"，The 27th Symposium on Plasma

Processing(SPP-27)，Yokohama Memorial Hall of Port Opening (2010.2.1-3) P2-45，pp. 313-314, Japan.

15. Masaaki Nagatsu, Iuliana Motrescu, Ying Zhao, Mrityunjai K. Singh and Akihisa Ogino, "Low-temperature Plasma Processing for Bio- and Medical Application ", APSPT-6, Taipei, Taiwan (2009.12.12).

16. Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu, "Effects of VUV/UV in Plasma-Biopolymer

Interaction in Different Gas Circumstances"，The 27th Symposium on Plasma Processing (SPP-27)

Yokohama Memorial Hall of Port Opening (2010.2.1-3) P2-47，pp. 317-318, Japan.

17. Iuliana Motrescu，Tsukasaki Akira，Ogino Akihisa，Nagatsu Masaaki，"Mass spectroscopic and Optical Emission Spectroscopic Study of Plasma-Bio-molecules Interaction under Different Gas

Circumstances"，The 57th Spring Meeting, 2010; The Japan Society of Applied Physics，Tokai Univ. (2010.3.17-20) 19a-ZG-15, Japan.

18. Tianling Ni, Akihisa Ogino, Iuliana Motrescu, Masaaki Nagatsu，"Surface Treatment of Arginine

Vasotocin Powder by Air Plasma Sources at Atmospheric Pressure"，The 57th Spring Meeting, 2010;

The Japan Society of Applied Physics，Tokai Univ. (2010.3.17-20) 19a-R-1, Japan – poster.

19. Iuliana Motrescu, Takuya Hara, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu，"Role of Radicals in Plasma-

Biomolecules Interaction in Nitrogen and Oxygen Plasmas"，The 71st Autumn Meeting, 2010; The

Japan Society of Applied Physics，Nagasaki Univ. (2010.9.14-17) 16a-ZH-9 – oral presentation.

20. Y. Zhao, I. Motrescu, A. Ogino, M. Nagatsu, G. Popa, "Experimental Study of Spore Etching of Microorganisms in Oxygen Plasma Using Optical and Mass Spectroscopy", 37th IEEE International Conference on Plasma Science (ICOPS), Norfolk, VA, USA (2010.6.20-24) 1P-71.

21. I.Motrescu, T. Hara, A. Ogino, M. Nagatsu, G. Popa, "Structural Modification of Amino Acids and Peptides Using Low-pressure Microwave Plasma", 37th IEEE International Conference on Plasma Science (ICOPS), Norfolk, VA, USA (2010.6.20-24) 1P-70.


22. I.Motrescu, A. Ogino, M. Nagatsu, "Study of Low-Temperature Plasma Modification of Bio-molecules", 15th Int. Conf. on Plasma Physics and Application (CPPA2010), Iasi, Romania (2010.7.1-4).

23. M. Nagatsu, I. Motrescu, Y. Zhao, T. E. Saraswati and A. Ogino, "Low-temperature Plasma Processing for Medical Application", 15th Int. Conf. on Plasma Physics and Application (CPPA2010), Iasi, Romania (2010.7.1-4).

24. Iuliana Motrescu, Takuya Hara, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu, “Role of Radicals in Plasma – Biomolecules Interaction in Nitrogen and Oxygen Plasmas”, 71st Fall Meeting of Japan Society of Applied Physics 2010, Nagasaki, Japan (2010.9.14-17).

25. Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Shigeyasu Tanaka, Taketomo Fujiwara, Shinya Kodani, Hirokazu Kawagishi, Gheorghe Popa, Masaaki Nagatsu, "Effects of Nitrogen and Oxygen Radicals on Low-temperature Bio-molecule Processing", 63rd Annual Gaseous Electronics Conference and 7th International Conference on Reactive Plasmas, Paris, France (2010.10.4-8) KWP.00023.

26. Takuya Hara, Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu, "Study of Structure Change of Bio-molecules by Low Temperature Plasma Processing", The 2010 Korean - Japanese Student Workshop, Pusan National University, Korea (2010.11.2-3).

27. Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Masaaki Nagatsu, “Influence of Bio-Molecules Properties under Exposure to Low-Temperature Reactive Plasma”, 3rd International Symposium on Advanced Plasma Science and its Applications for Nitrides and Nanomaterials (ISPlasma 2011), Nagoya Institute of Technology (2011.3.6-9).

28. Iuliana Motrescu, Akihisa Ogino, Shigeyasu Tanaka, Taketomo Fujiwara, Shinya Kodani, Hirokazu Kawagishi, Gheorge Popa, Masaaki Nagatsu, ”Biochemical Assessment of Amino Acid Molecules Processed by Nitrogen Low-Temperature Plasma” 10th International Conference on Global Research and Education, Inter-Academia 2011, Sucevita, Romania.s

Date post:	24-Jan-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	31 times
Download:	0 times

Studiul oxigenului atomic...2 Introducere | Studiul oxigenului atomic din plasma de temperatură...

Documents