RAPORT DE SINTEZA LA PROIECTUL/CONTRACTUL CEEX 32 /2006 “ACTIVAREA EFECTULUI CITOTOXIC AL UNOR CITOSTATICE PRIN

IRADIERE (EFAT)” Mihail Lucian Pascu

Proiectul CEEX “Activarea efectului citotoxic al unor citostatice prin iradiere (EFAT)” a fost propus plecand de la constatarile facute in practica medicala clinica pe plan mondial si national, ca utilizarea unor clase importante de medicamente pentru tratarea diferitor maladii intampina rezistenta si ca organismul uman si/sau bacteriile, de exemplu, au dezvoltat asa-numita rezistenta dobandita la tratamente multiple cu (unul sau mai multe) medicamente (multiple drug resistance - MDR).

La realizarea obiectivelor proiectului au participat inafara institutiei coordonatoare (CO) care a fost Institutul National de Fizica Laserilor, Plasmei si Radiatiei (INFLPR), in calitate de parteneri, Universitatea Bucuresti, Facultatea de Fizica (UBFFB) si Spitalul Clinic Univesitar de Urgenta “Carol Davila” Militar Central (SCUMC). Etapele, activitatile si obiectivele anuale care au fost tratate in cadrul proiectului sunt date in cele ce urmeaza: Etapa I-a: Identificarea compusilor de interes si a liniilor de celule. Selectionarea substantelor de studiat si a liniilor de celule; activitatile desfasurate au fost: - Documentare si analiza datelor privind proprietatile fotofizice ale citostaticelor (INFLPR); - Documentare si analiza prin spectroscopie de fluorescenta a citostaticelor (UBFFB). - Documentare si analiza liniilor de celule tumorale. Selectie a liniilor de celule (SCUMC). ETAPA II-a :Studiul fotofizic (absorbtie, fluorescenta) al compusilor selectionati; activitatile desfasurate au fost: - Masuratori de fluorescenta, absorbtie, FTIR ale compusilor selectati (INFLPR). - Masuratori asupra fluorescentei emise de compusii studiati (UBFFB) Etapa III-a: Studiul fotofizic (fluorescenta indusa cu laser- LIF, absorbtie tranzienta, masurarea starilor de triplet) al compusilor in studiu; activitatile desfasurate au fost: - Masuratori ale fluorescentei induse cu laseri, ale absorbtiei tranziente si studierea starilor de triplet ale substantelor cercetate (INFLPR). - Stabilirea metodelor de masurare a fluorescentei foto-produsilor obtinuti post-iradiere (UBFFB) - Elaborarea metodaelor de cultura aspecifice celulelro canceroase (SCUMC). Etapa IV: Studiul generarii de specii active (oxigen singlet). Fotobleaching. Elaborarea de protocoale de iradiere optica si dezvoltatrea de studii de citotoxicitate pe linii de celule tumorale; activitatile desfasurate au fost: - Masurarea concentratiei speciilor active generate prin iradiere optica. Masurarea foto-produsilor obtinuti post-iradiere.Stabilirea parametrilor optimi de iradiere. Stabilirea protocoalelor de iradiere. Efectuarea de iradieri (INFLPR). - Masuratori ale fluorescentei foto-produsilor obtinuti post-iradiere (UBFFB). - Masuratori biologice de citotoxicitate pe linii de celule tumorale (SCUMC).

Parcurgerea etapelor mentionate a condus la obtinerea urmatoarelor rezultate si concluzii: In scopul identificarii si selectionarii compusilor citostatici cu potential citotoxic

(imprimabil prin iradiere optica), exista doua optiuni de a alege din fondul total de substante care ar putea fi luate in calcul. Prima este considerarea exclusiva a substantelor care la acest moment

1

au toate testele clinice pe subiecti umani (etapele I-III si IV ) indeplinite, avand toate aprobarile necesare pentru comercializare si utilizare chimica. A doua optiune, este de a lua in studiu “pool”-ul de substante de interes, care in afara medicamentelor citostatice comercializate ca atare, contine si unele substante noi cu proprietati citostatice dezvoltate chiar pentru studiile din cadrul prezentului proiect. Aceasta optiune a fost explorata in cadrul proiectului.

O clasificare functionala a medicamentelor considerate este prezentata in FIGURA 1.

Referitor la sinteza si clasificarea din punct de vedere chimic a substantelor utilizate in chimioterapie, acestea fac parte din mai multe clase, dintre care cele mai importante au fost descrise in fazele proiectului, si anume: I. Substante care se leaga covalent la ADN - (agenti de alchilare).

Intre produsii din aceasta clasa pot fi citati: busulfanul, cisplatinul, clorambucilul, ciclofosfamida, mecloretamina. Substantele din aceasta clasa pot fi impartite in cinci sub-clase

1. substante de tip iperitic. 2. alchil sulfonati 3. nitrosouree 4. aziridine 5. compusi cu platina

II. Un alt grup principal de citostatice este cel al antimetabolitilor. Intre cei mai cunoscuti compusi utilizati sunt fluorouracilul si methrotrexatul.

Din clasa antimetabolitilor fac parte urmatoarele sub-clase: 1. antifolati 2. analogi ai pirimidinelor 3. analogi ai purinelor 4. analogi de zaharuri modificate.

III. O a treia clasa de medicamente antitumorale este cea a compusilor care se leaga prin legaturi ne-covalente la ADN. O grupa a acestei clase este formata din antracicline (exemple: doxorubicin, daunorubicin). Doxorubicin-ul si daunorubicin-ul au activitate anti-mitotica prin

2

formarea de complecsi cu ADN-ul, prin intercalare intre perechile de baze azotate (substantele sunt asa numite intercalatori). O alta substanta din clasa intercalatori este bleomicinul, o glicopeptida, un antibiotic cu activitate antitumorala care inhiba sinteza AND-ului.

IV. Clasa inhibitorilor functiei cromatinei – substante care fragmenteaza dinamica cromozomiala necesara realizarii replicarii ADN-ului si mitozei.

1. Inhibitori ai enzimei topoizomeraza, care intervine in replicarea AND. Unul dintre compusii folositi este Etoposide

2. Inhibitori ai mitozei; sunt in general alcaloizi vegetali sau alti compusi derivati din produse naturale, care pot opri mitoza ori pot inhiba enzimele care produc proteine necesare reproducerii celulelor. Sunt unele dintre cele mai active substante antitumorale. V. Substante ce afecteaza functia endocrina (hormoni corticosteroizi). Sunt substante naturale (hormoni) sau artificiale care “copiaza” hormonii, si care au totodata si un effect antitumoral, distrugand celulele canceroase sau incetinindu-le cresterea. Exemplu: Tomaxifenul, cu utilizare antitumorala limitata la anumit tip de cancere. In afara de substantele care se incadreaza in clasele mentionate mai sus, mai sunt si altele care au effect antitumoral fara a face parte din aceste clase. Exemple pot fi anticorpii monoclonali (ritiximab si transtuzumab) ori inhibitorii de tirosin–kinaza. Un fenomen de mare importanta care apare in tratamentul antitumoral este rezistenta multipla la tratament (multple drug resistance - MDR). Mecanismele care genereaza aceasta situatie sunt diverse (scaderea afluxului de substanta activa, modificarea metabolismului ei, cresterea ratei de “reparare” a modificarilor produse de substanta activa, formarea de agenti – capcana pentru ea). Desi detalii ale proceselor de rezistenta nu sunt inca elucidate, au fost propuse noi substante active antitumoral care sa evite aparitia efectului MDR. Intre acestea in cadrul proiectului au fost propusi compusi poliaromatici de tip acridinic si antracenic, sintetizati ca substante antitumorale de parteneri francezi (Fac. de Farmacie, Univ. Mediteraneana-Marsilia) ai insitutiei coordonatoare. Substantele in cauza sunt: derivatii acridinici BG 186 (4-methoxy,9-thio[2-N-N-diethyl-amino-ethyl] acridine), BG 204 (3-amino, 9-thio [2-N-N-diethylaminoethyl] acridine), si derivatii diaza-anthracenici BG 558 (9-(2-N-N-diethylaminoethyl-1,9-diazantracen-10-one) si BG 1120 (4,5 bis [thio(2-N-N-diethylaminoethyl)], 9methyl 1,8-diazantracene). Substantele sunt codificate in seria BG si au urmatoarele structuri moleculare (FIGURA 2 - 5)

BG186 (4-methoxy,9-thio[2-N-N-diethyl-amino-ethyl] acridine)

N

SCH2 CH2

OCH3

N(C2H5)2

FIGURA 2

3

BG204 (4-methoxy,9-thio[2-N-N-diethyl-amino-ethyl] acridine)

N

SCH2 CH2 N(C2H5)2

NH2

FIGURA 3

BG558 (9-(2-N-N-diethylaminoethyl-1,9-diazantracen-10-one

NN

O

H2C CH2 N(C2H5)2

FIGURA 4

BG1120 (4,5 bis [thio(2-N-N-diethylaminoethyl)], 9methyl 1,8-diazantracene)

NN

CH3

SS CH2 CH2CH2CH2 N(CH3)2(H3C)2N

FIGURA 5

Studiile dezvoltate in cadrul proiectului au aratat posibilitatea activarii unor compusi poli-aromatici prin foto-iradiere, acestia devenind mai toxici pentru bio-molecule dacat ne-iradiati, actiunea avand loc prin intermediul radicalilor liberi formati fotochimic. Un astfel de fenomen este prezentat schematic in FIGURA 6.

4

FIGURA 6 Aceeasi linie, a dezvoltarii de noi compusi cu proprietati antitumorale superioare (care depasesc MDR de exemplu), o urmeaza o serie de derivati acridinici policiclici, care au aratat o afinitate deosebita fata de ADN, (functionand ca intercalatori), cu care formeaza complexe moleculare sicare sunt astfel astfel antitumorale eficace. O alta serie de compusi de tipul agentilor alchilanti, dintr-o noua clasa, fenil-cloroetil-ureica (FIGURA 7) au dovedit “in–vitro” un bun efect antitumoral.

FIGURA 7

Avand in vedere obiectivele proiectului, au fost stabilite si cateva elemente cheie ale PDT. In PDT, substanta activa (fotosensibilizatorul), dupa administrarea sistemica/locala si acumularea

5

preferentiala in tumora, este iradiat cu fascule optice adecvate. Reactiile fotochimice ulterioare absorbtiei unui foton produc in final distrugerea, mediata in general de oxigenul activ, a celulelor tesutului tumoral. Agentul citotoxic principal in PDT este considerat a fi oxigenul singlet 1O2, locatiile critice atacate incluzand mitocondriile, ADN-ul si membrana lipidica. Oxigenul singlet este produs pe urmatoarea cale (FIGURA 8):

So + hυ S1 S1 T1 T1 + 3O2 So+1O2

FIGURA 8

unde So, S1 si T1 sunt respectiv starea fundamentala, prima stare electronica de singlet excitata si prima stare excitata de triplet ale substantei active, iar 3O2 si 1O2 sunt starile fundamentala de triplet si excitata de singlet ale moleculei de oxigen. In afara oxidarii biomoleculelor, molecula 1O2 poate sa se dezexcite radiativ (emisie la 1270nm) sau ne-radiativ. Substantele activabile optic trebuie sa indeplineasca un set de conditii de tip clinic si fotofizic pentru a fi utilizate cu success ca citotoxice. Intre aceste conditii sunt si urmatoarele:

-valori ridicate pentru coeficientii de absorbtie in domeniul spectral de interes; -stari triplet cu timpi de viata lungi; -rate mari ale transferului de energie catre moleculele de substrat; -rate mari de generare a oxigenului singlet; -tendinta redusa de agregare in mediu apos; -selectivitate pentru tesutul tumoral ; -efect mutagen minim; -toxicitate sistemica redusa ; -eliberarea rapida din tesutul sanatos.

6

In ceeace priveste liniile tumorale, testele prevazute au avut in vedere studiul citotoxicitatii pe linii de celule. Functia predictiva a acestui tip de test are la baza idea ca substantele citotoxice afecteaza functiile de baza celulare, care sunt comune tuturor celulelor, iar efectul lor se poate stabili prin evaluarea distrugerilor aduse celulelor. A fost studiat efectul iradierii UV-VIS asupra proprietatilor de absorbtie (UV, VIS, FTIR), fluorescenta (excitatie, emisie) ale compusilor din seria BG. Dintre cei patru compusi mentionati cei care au prezentat cele mai interesante rezultate din punctul de vedere al obiectivelor proiectului au fost BG204 si BG1120. Probele analizate au constat in solutii apoase la concentratii in domeniul 10-3-10-6 M. Iradierea a fost efectuata cu o lampa cu Xe, Hamamatsu model L2273, putere 150W. Radiatia emisa de aceasta este focalizata pe celula continand proba si masurata cu ajutorul unui powermetru. Analiza spectrala a radiatiei absorbite/emise se face cu un spectrometru Ocean Optics conectat la computer si prevazut cu program dedicat masurarii spectrelor de fluorescenta. Spectrele de absorbtie au fost inregistrate cu un spectrofotometru Perkin Elmer. Iar spectrele de fluorescenta au fost analizate utilizind un spectrofluorimetru LS55, de asemenea Perkin Elmer.

Probele analizate in IR, prin spectroscopie FTIR, au constat in peleti obtinuti din cristale de KBr impregnate cu solutiile compusilor studiati si uscate timp de o zi. Spectrele FTIR au fost inregistrate in domeniul 4000 – 400 cm-1cu un spectrometru Nicolet, model Magna – IR 550.

S-au efectuat de asemenea masuratori privind influenta pe care pH-ul mediului il are asupra asbsorbtiei/emisiei spectrale de fluorescenta a moleculelor de interes.

Substantele au fost preparate in solutie apoasa (ser fiziologic - 0,9% NaCl) adusa apoi la pH –ul dorit cu hidroxid de sodiu. Au fost alese doua valori ale pH –ului solutiilor masurate, anume pH = 4,0 si pH = 8,4. Pentru fiecare substanta au fost preparate probe conform cu cele de mai sus, probe carora le-au fost masurate spectroscopic absorbtia si emisia de fluorescenta.

Pentru masurarea fluorescentei, au fost utilizate, pentru excitare, lungimi de unda care sa permita stimularea emisiei de fluorescenta, in general lungimile de unda 410 nm si 460 nm. Radiatia de excitatie a fost obtinuta de la un laser acordabil cu colorant (coloranti – POPOP si 4-Metyl-umbeliferon) pompat cu un laser cu azot. Masurarea emisiei de fluorescenta s-a facut cu o fibra optica de culegere si un sistem spectral cuprinzand un monocromator, un fotomultiplicator alimentat de la o sursa de inalta tensiune si un osciloscop pentru masurarea marimii semnalului. Au fost mediate zece valori masurate pentru fiecare lungime de unda de masura. In FIGURA 9, sunt prezentate spectrele de absorbtie si de excitatie a fluorescentei intre 200-600 nm pentru probe de BG 204 la concentratie 2.5x10-5M. Se observa existenta principalelor maxime de absorbtie/excitatie la 263 nm, 370 nm si respectiv 450 nm caracteristice si pentru acridina. Spectrele de excitatie au fost inregistrate fixandu-se maximul de emisie al fluorescentei la 570 nm.

7

200 250 300 350 400 450 500 550 6000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8200 250 300 350 400 450 500 550 600

0

50

100

150

200

250

300

350

Fluo

resc

ence

(arb

. u.)

BG 204 conc 2.5x10-5M

Abs

orba

nce

wavelength (nm)

FIGURA 9 Spectrele de absorbtie si de excitatie a fluorescentei in domeniul spectral 200-600nm pentru probe de BG 204 la concentratie 2,5x10-5 M in solutie apoasa Variatia intensitatii fluorescentei emise pentru excitarea la 263 nm, 370 nm si 450 nm este ilustrata in FIGURA 10. Maximul fluorescentei emise (570nm) nu depinde de lungimea de unda de excitatie, datorita dezexcitarii ne-radiative de pe starile superioare de singlet ale moleculei pe starea S1, tranzitia avand loc intre starile S1 si S0.

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 7500

50

100

150

200

250

300

350

400

450BG 204 conc 2.5x10-5M

EmissionExcitation

450

370

263

fluor

esce

nce

(arb

. uni

t )

wavelength (nm)

FIGURA 10 Spectrele de fluorescenta de excitatie/emisie in domeniul spectral 200-750nm pentru probe de BG 204 la concentratie 2,5x10-5 M in solutie apoasa.

8

Compusul BG1120 prezinta proprietati spectrale caracteristice hidrocarburii aromatice din care este derivat, si anume antracen. Principalele maxime de absorbtie apar la 261 nm si respectiv 400 nm (FIGURA 11) Emisia de fluorescenta prezinta un maxim la 470 nm a carui intensitate urmareste variatia intensitatii benzilor de excitatie (FIGURA 12).

250 300 350 400 4500.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6250 300 350 400 450

0

200

400

600

800

1000

Fluo

resc

ence

(arb

. u.)

BG 1120 conc 1 x10-6M

Abs

orba

nce

wavelength (nm)

FIGURA 11 Spectrele de absorbtie si de excitatie a fluorescentei in domeniul spectral 200-600nm pentru probe de BG1120 la concentratie 10-6 M in solutie apoasa

250 300 350 400 450 500 550 600

0

200

400

600

800

1000

1200

EmissionExcitation

400

261

233

Fluo

resc

ence

(arb

. u.)

wavelength (nm)

FIGURA 12. Spectrele de fluorescenta de excitatie/emisie in domeniul spectral 200-750nm pentru probe de BG1120 la concentratie 10-6 M in solutie apoasa.

9

Una dintre etapele esentiale ale procesului de generare a speciilor active in PDT, amintita mai sus, este absorbtia fotonilor de la sursa de iradiere optica si generarea de specii active (exemplu – oxigenul singlet) care distrug celulele canceroase. In aceasta etapa este decisiva determinarea proprietatilor fotofizice ale fotosensibilizatorului determinante in interactia cu moleculele inconjuratoare din organism – si care formeaza un micro-environment pentru moleculele substantei fotosensibilizatoare. Proprietatile acestui micro-environment pot determina in mare masura dinamica fenomenului de generare a speciilor active dupa iradierea fotosensibilizatorului. Este de exemplu cunoscut faptul ca in interiorul tumorilor canceroase micro-environmentul este “mai acid” decat in tesuturile normale. Avand in vedere efectul important pe care pH-ul il poate avea asupra fluorescentei unei substante, a fost studiata si fluorescenta moleculelor fotosensibilizatoare in conditii diferite de pH al mediului. La nivelul fenomenelor elementare implicate in interactiile pe care moleculele substantelor fotosensibilizatoare le sufera in cursul procesului iradiere optica – distrugerea celulelor canceroase, existenta unui echilibru intre aceste procese face ca informatii obtinute despre unul dintre ele sa permita concluzii privind celelalte procese. Molecula de fotosensibilizator excitata, de exemplu, poate reveni pe starea fundamentala fie prin fluorescenta, fie prin cedarea energiei catre alte molecule (care devin astfel specii active), fie prin conversie interna. Scaderea emisiei fluorescente, in anumite conditii, ofera sanse mai bune transferului de energie catre moleculele ce devin specii active, si astfel eficientizarii aplicatiei PDT. Cunoastera efectului pH-ului asupra fluorescentei poate da informatii despre posibilele interactii ale fotosensibilizatorului cu moleculele specifice micro-environmentului, atat “in vitro” cat si “in vivo”.

Rezultatele obtinute sunt prezentate sub forma curbelor de variatie spectrala a absorbtiei, respectiv a fluorescentei, pentru fiecare dintre cele doua valori stabilite ale pH –ului solutiei pentru cele 2 substante tumorale (FIGURA 13 - 14).

(A) (B) FIGURA 13. Curbele spectrale de variatie ale absorbtiei (A) si fluorescentei (B) pentru BG 204 in functie de pH –ul mediului

10

(A) (B) FIGURA14. Variatia absorbtiei (A) si fluorescentei (B) la BG 1120 functie de pH.

Rezultatele obtinute arata ca in urma interactiei cu molecule ce pot modifica pH–ul micro-

mediului, fotosensibilizatorii sufera modificari ale absorbtiei si emisiei de fluorescenta, de care trebuie tinut cont pentru optimizarea generarii de specii active foto-toxice in procesul PDT.

Pentru compusul BG204, a fost observata influenta concentratiei asupra proprietatilor spectrale. Modificari importante ale spectrului de absorbtie in functie de concentratie se observa pentru solutiile in care, cu cresterea concentratiei, se produc asocieri moleculare (dimeri, polimeri). Au fost inregistrate spectrele de absorbtie pentru solutii de BG204 de concentratii cuprinse intre 10-3 M si 5x10-7 M (FIGURA 15). S-a determinat extinctia solutiilor preparate, pentru λ=500 nm in vizibil si pentru λ=273 nm in UV. S-a urmarit dependenta coeficientului molar de extinctie a maximelor de absorbtie din vizibil si UV, in functie de concentratie.

200 250 300 350 400 450 500 550 6000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

c = 10-3

c = 5x10-4

c = 10-4

c = 5x10-5

Abso

rban

ce

wavelength (nm)

200 250 300 350 400 450 500 550 600

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

c = 10-5

c = 5x10-5

c = 10-6

c = 5x10-7

abso

rban

ce

Wavelength (nm)

FIGURA.15 Dependenta de concentratie a spectrelor de absorbtie ale compusului BG204. Conform legii Lambert-Beer, extinctia (E/c*d) nu depinde de concentratie daca probele

nu suporta modificari datorita asocierii de molecule; coeficientul molar de extinctie depinde liniar

11

de concentratie. Se constata insa o modificare a acestuia pe domeniul de concentratii studiat care arata ca polimerizarea apare pentru concentratii >10-4M. In cadrul proiectului s-a investigat variatia proprietatilor fotosensibilizatoare in urma iradierii cu lumina UV-VIS, si a potentialul de formare a unor compusi care pot genera oxigen singlet. Evolutia benzilor de absorbtie respectiv emisie ale BG 204 in functie de durata iradierii este prezentata in FIGURA 16 pentru timpi de iradiere intre 10 si 40 min. In absorbtie, se observa scaderea intensitatii principalelor maximelor de absorbtie, aparitia unui maxim la 200 nm cu cresterea timpului de iradiere si o schimbare a raportului relativ a intensitatilor pentru maximele de la 240 nm si 270 nm. Efectul iradierii UV-Vis asupra fluorescentei se manifesta prin scaderea intensitatii emisiei la 570 nm si prin aparitia un maxim intermediar la 470 nm (FIGURA 17) pentru intervale de timp de iradiere intre 4-18 min atat pentru excitatie la 272 nm cat si 373 nm.

200 250 300 350 400 450 500 550 6000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

nonirad 10' 20' 30' 40'

Abso

rban

ce

wavelength (nm)350 400 450 500 550 600 650 700

0

100

200

300

400

500

600

700

800λexc = 272 nm

wavelength (nm)

Fluo

resc

ence

int.

(rel

. u.)

nonirad 10' 20'

FIGURA 16. Evolutia spectrelor de absorbtie si emisie ale BG 204 in urma iradierii in UV-VIS pentru timpi de iradiere intre 10-40min.

300 400 500 600 7000

200

400

600

800

nonirad. 4' 8' 12' 16' 18'

Fluo

rese

nces

int.(

rel.u

)

wavelength (nm)

λexc=272 nm

BG204

400 450 500 550 600 650 7000

50

100

150

200

250

300

nonirad. 4' 8' 12' 16' 18'

Fluo

rese

nce

int.(

rel.u

)

wavelength (nm)

λexc=373 nm

BG204

FIGURA 17. Evolutia spectrelor de emisie ale BG 204 in urma expunerii la radiatie UV-VIS pentru timpi de iradiere intre 4-18 min.

12

Aceasta comportare a proprietilor spectrale de absorbtie/emisie, evidentiaza o modificare a probelor studiate indusa de iradiere, procesele fotofizice indicate de aceasta manifestare fiind formarea unor compusi isomerici, fotodescompunerea, formarea unor noi fotoprodusi ori fotodimerizarea moleculelor studiate.

Pentru BG1120, evolutia spectrelor de absorbtie/emisie sub influenta radiatiei UV-VIS, este prezentata in FIGURA 18 pentru timpi de iradiere cuprinsi intre 4-15 min.

200 250 300 350 400 450 500 550

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14 noirad. 3' 6' 9' 12' 15'

Abso

rban

ce

wavelength (nm)

bg1120

450 500 550 6000

50

100

150

200

250

300 noirad. 3' 6' 9' 12' 15'

Flor

esen

ce in

t.(re

l.u)

wavelength (nm)

BG1120λex=400 nm

FIFURA 18. Evolutia spectrelor de emisie ale compusului BG 204 in urma expunerii la radiatie UV-VIS pentru timpi de iradiere cuprinsi intre 4-15 min.

Pentru elucidarea proceselor induse de iradiere si a posibilelor transformari fotochimice ale compusilor investigati, au fost realizate studii FTIR. In cazul BG-204 ne-iradiata si dupa 3 ore de iradiere, spectrele sunt date in FIGURA 19.

FIGURA 19. Spectrele FTIR ale BG 204 pentru solutie neiradiata si repectiv expusa 3 ore

13

Se observa modificari majore ale spectrului pentru proba iradiata 3 ore si in domeniul spectral 500 – 600 si 1000 – 1300 cm-1. Maximul centrat pe 500 – 550 cm-1 poate fi atribuit legaturii S – S; cel situat intre 640 – 670 cm-1 poate fi atribuit vibratiilor de extensie la nivelul atomului de sulf. Datele arata ruperea catenei laterale a moleculei, atomul de sulf ramanand legat la partea acridinica. Aceste modificari fac posibila formarea de tioli si bi-sulfuri. (FIGURA 20).

FIGURA 20. Modificarile moleculei de BG204 in dupa expunere la radiatie UV-VIS

In regiunea spectrala 100 – 1300 cm-1 benzile de absorbtie pot fi atribuite fie aminei tertiare substituite, fie grupului CH2 – S. Merita notata de asemeni prezenta benzilor datorate vibratiilor de extensie ale grupului C – S (1230 – 1300 cm-1), care pot sugera ca dupa iradiere echilibrul chimic s-a deplasat catre o forma lactamica (FIGURA 21).

FIGURA 21 Procesul de tautomerizare ale restului antracenic

Datele masurate conduc si la concluzia ca formele tautomerice ale substantei coexista cu

dimerii. Se mai poate mentiona si ca exista domenii spectrale in care nu se produc modificari majore in urma iradierii. Banda corespunzand vibratiilor de flexiune ale grupului N – H din

14

amina primara si banda de la 1630 cm-1 nu sufera modificari; acelasi lucru apare si la benzile grupului alchil 2850 cm-1 atribuit grupului CH2 , si 2925 cm-1 atribuit grupului (CH3 + CH2). Benzile foarte puternice de absorbtie puse in evidenta la 1400 cm-1 si in regiunea 3100 – 3500 cm-1 sunt amandoua atribuite vibratiilor de extensie N – H ale ionului amoniu format de amina. R3N + HOH → R3NH+ + OH-

Pentru BG-1120, spectrele FTIR ale substantei ne-iradiate, respectiv dupa iradiere 3 ore sunt date in FIGURA 22. Analiza lor sugereaza ca, si in acest caz, in urma iradierii se produc modificari majore in structura moleculelor.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Abso

rban

ce

(arb

.u.)

wave num ber (cm -1)

BG1120nir BG11203h

FIGURA 22. Spectrele FTIR ale BG 1120 pentru solutie neiradiata si expusa la radiatie 3 ore

In afara benzii intense localizate la 1400 cm-1 si atribuite modurilor de extensie ale

inelelor tiolice, spectrul prezinta si o banda mai slaba si mai larga aflata la 680 cm-1 care corespunde vibratiilor de flexiune in planul C – S – H. Benzile de absorbtie sugereaza si in cazul acestei substante o rupere a legaturii S – C cu formarea de amine tertiare si ditioli (FIGURA 23).

15

FIGURA 23. Ruperea catenei laterale si posibilele trasnformari in urma iradierii BG1120.

Analiza spectrului permite a se observa ca prezenta benzii largi, situata la 1098 cm-1 , corespunzand compusilor care contin un grup tiocarbonic (C-S), si a celor doua benzi de medie amplitudine situate la 1638 cm-1 respectiv 1579 cm-1 – corespunzand vibratiilor legaturii C = S sunt conforme cu forma lactamica a partii aromatice. Cei doi atomi S care se leaga la partea azantracenica produc o “destabilizare” a moleculei, astfel incat se poate produce un proces complex de tautomerizare. Restul moleculei se transforma in una dintre formele tautomerice bis-lactim, lactim-lactam ori bis-lactamice. (FIGURA 24).

FIGURA 24. Formele tautomerice ale restului diazantracenic Banda de la 1400 cm-1 poate fi atribuita extensiei inelului C – C din tioli si vibratiilor de flexiune din ionul NH4

+ . Banda lagga, localizata la 2710 cm-1 a fost atribuita modului de vibratie de extensie a sub-grupului –CH2 din grupul CH2-N al aminei tertiare: (CH3)2N-C2H5 + HOH ↔ (CH3)2N- H-C2H5 + HO-

Benzile din regiunea 3500 – 3100 cm-1 sunt atribuite vibratiilor de extensie NH din ionul NH4 si sunt intalnite in toate spectrele. Toate observatiile experimentale duc la concluzia ca prin iradiere se produc modificari importante in structura moleculelor substantelor analizate. In primul rand, se produce o rupere de

16

legatura localizata la nivelul atomului de S, intre restul aromatic si catena laterala, proces urmat de o tautomerizare a moleculelor. Prezenta ionului ionilor NH4 sugereaza existenta radicalilor HO-, care sunt potentiali agenti care pot determina actiunea citotoxica de distrugere a celulelor tumorale. Transformarile foto-induse in moleculele analizate indica faptul ca moleculele sunt foto-reactive si ca efectul lor terapeutic poate fi imbunatatit prin iradiere optica. In cadrul proiectului a fost realizat si studiul fotofizic al unor compusi de interes. Pentru aceasta, au fost realizate ansambluri experimentale in a caror componenta intra laserii “Surelite” si “Panther EX OPO”, procurati prin finantare din fondurile proiectului. Au fost realizate diferite masuratori experimentale ale unor parametri fotofizici ai substantelor studiate. In particular, s-a dovedit ca in cazul masurarii timpului de viata de fluorescenta, pentru anumite substante, durata pulsurilor generate de sistemele laser mentionate (5-7ns) este prea mare pentru aceste masuratori, conducand la erori sistematice de masurare a duratei de viata, astfel in cat este necesara utilizarea unor laseri cu durata mai mica a pulsului (exemplu: laserul cu azot TEA sau laseri cu colorant pompati cu laseri cu azot TEA, cu durata pulsului ≤1ns). Au fost realizate masuratori de fluorescenta indusa laser (LIF), si masuratori de absorbtie tranzienta referitoare la starile de triplet ale compusilor studiati. Au fost stabilite metode de masurare a fluorescentei foto-produsilor procesului de iradiere si a fost elaborata metoda culturii celulelor tumorale.

Echipamentul laser utilizat, produs de firma Continuum, este compus din doua unitati: 1. Unitatea Laser “Surelite” este conceput ca un laser pulsat cu o bagheta YAG: Nd, pompat cu lampi flash, cu celula Pockels pentru Q-switch si optica Gaussiana. Laserul genereaza patru lungimi de unda (fixe) (fiind dotat cu cristale neliniare): 1064nm, 532nm, 355nm si 266nm. Caracteristicile principale de emisie ale fascicolului generat sunt urmatoarele:

Lungimea de unda emisa Caracteristica 1064 532nm 355nm 266nm

Energia (mJ) 450 200 100 60 Durata puls (ns) 5-7 4-6 4-6 4-6 Largimea de banda (cm-1) 1 1 1 1 Divergenta (mrad) 0,6 0,6 0,6 0,6 Jitter (ns) +/-0,5 +/-0,5 +/-0,5 +/-0,5

Este interesant a compara aceste caracteristici cu cele ale sistemului de doi laseri cu azot

sincronizati, utilizat pana acum drept sursa de pompaj a laserilor acordabili cu colorant:

Caracteristica Lungimea de unda emisa 337 nm

Energia (mJ) pentru fiecare dintre cei doi laseri

1

Durata puls (ns) 1 Largimea de banda (cm-1) 1 Divergenta (mrad) (orizontala x verticala)

3x5

Jitter Nu a fost masurat

17

2. Unitatea Laser “Panther EX OPO” pompat de radiatia 355 nm a laserului “Surelite”, care este un oscilator parametric cu cristale neliniare care genereaza radiatie laser continuu acordabila pe domeniul spectral 400nm - 2500nm, iar prin dublare in cristale neliniare, pe domeniul 230 nm … 420 nm, cu energia pulsului de minim 1,5mJ (si un maxim de aproximativ 90mJ), cu durata pulsului de 3-7 nanosecunde si divergenta fascicolului <2 mrad. Comparativ, laserii cu colorant pompati cu laserii cu azot, utilizati pana acum, puteau genera radiatie acordabila pe domeniul spectral 400-700nm (utilizand 6-8 coloranti diferiti), cu energia maxima de aproximativ 300 μJ. In FIGURA 24 - 26 sunt prezentate schemele optice ale celor doua echipamente si dependenta de lungimea de unda a energiei pulsului emis de echipamentul ”Panther EX OPO”.

FIGURA 24

FIGURA 25

18

FIGURA 26

Utilizand acest sistem laser au fost masurate spectre de fluorescenta ale antraciclinelor

care sunt o clasa de agenti de chimioterapie avand la baza saminele si tetra-hidro-naftacen-dionele. Aceasta clasa cuprinde diversi compusi (daunorubicin, idarubicin, doxorubicin, epirubicin, mitoxantrona), care sunt prezentati in FIGURA 27.

FIGURA 27

19

Spectrul de fluorescenta indusa laser a doxorubicinului (λex = 355nm, excitatie cu sistemul Surelite + Panther OPO) este prezentat in FIGURA 28.

FIGURA 28 Spectrele de emisie de fluorescenta ale BG 204 si BG 1120 au fost excitate cu sistemul

de laseri Surelite+Panther OPO, iar fluorescenta a fost culeasa cu ajutorul sistemului Ocean Optics. Spectrele celor doua citostatice sunt prezentate in FIGURA 29, respectiv FIGURA 30 in care sunt prezentate si rezultatele modificarilor spectrale obtinute in urma iradierii optice a probelor pe durata mai multor intervale de timp.

FIGURA 29

20

FIGURA 30

Pe baza spectrelor de fluorescenta indusa cu laser masurate a fost abordat si studiul

fotofizic cu masuratori spectroscopice rezolvate in timp si al starilor de triplet utilizand tehnica de pompa – sonda tinand cont ca starile de triplet sunt implicate direct in generarea compusilor activi (oxigen singlet) in tehnica terapiei fotodinamice. Sistemul experimental utilizat este dat in FIGURA 31 si permite atat masurarori de tip pompa-sonda cat si masuratori de tip fotoliza flash.

FIGURA 31

21

Sistemul poate fi utilizat in doua moduri diferite si anume: a) pastrand neschimbata lungimea de unda a pulsului sonda si masurand absorbtia probei la diferite momente de timp, prin modificarea intarzierii introduse de linia de intarziere optica (absorbtie diferita, in functie de timp, la o lungime de unda fixa).

b) pastrand neschimbata intarzierea liniei optice de intarziere si modificand lungimea de unda a pulsului sonda. Sistemul a fost utilizat pentru studiul tranzient al unor stari excitate ale mai multor compusi dintre care sunt date in continuare rezultatele obtinute pentru acridina. In cazul acridinei exista problema duratei de viata a starii excitate de singlet, care, in cazul in care solventul compusului este apa, are o valoare de aproximativ 11ns (10ns conform unor raportari), valoare care este de acelasi ordin de marime cu intarzierea maxima (oferita de linia optica de intarziere) intre pulsul pompa si pulsul sonda; masurarea unui spectru tranzient in acest caz, ar introduce erori prin aceea ca absorbtia masurata la numai 20ns de la pulsul pompa, si care ar trebui sa corespunda exclusiv contributiei starilor de triplet, ar putea fi afectata si de existenta unor molecule aflate inca in stare de singlet. De aceea, bazandu-ne pe raportari din literatura conform carora timpul de viata al fluorescentei acridinei scade pana la 0,4ns in cazul unei solutii in etanol a substantei, am utilizat astfel de solutii pentru masuratori. In acest fel, intre durata de viata a starilor de singlet (~ 0,4ns) si durata intre “pompajul” probei si sondarea acesteia (20ns) exista o diferenta suficienta pentru ca, in momentul trecerii pulsului sonda, sa se poata considera ca singurele stari care contribuie la absorbanta probei sunt starile (tranziente) de triplet. In plus, pentru a evita decay-ul starilor de triplet prin efectul de stingere de catre oxigen, proba de masura a fost balbotata cu azot timp de 20 minute inainte de masurare, pe durata masuratorilor ea gasindu-se intr-o cuva etansa. Prin efectuarea masuratorilor ca mai sus, a fost gasit spectrul tranzient al acridinei, la 20ns de pulsul pompa (generat de unitatea Surelite, λ = 355nm), prezentat in FIGURA 32.

FIGURA 32

A fost, de asemenea, efectuata si masurarea directa a fosforescentei oxigenului singlet. Sistemul

experimental este prezentat in FIGURA 33. Solutia este excitata optic cu radiatia acordabila provenita de la un OPO pompat cu un laser cu YAG:Nd pulsat.Prin absorbtia radiatiei de excitare, compusul sensibilizator ajunge,

22

intr-o stare excitata de triplet, de pe care poate transfera energie moleculei de oxigen (in stare de triplet in starea naturala) care trece astfel pe o stare de singlet – unde este foarte reactiva. O mica parte dintre moleculele de oxigen excitate se dezexcita prin emisia radiatiei de fosforescenta care este culeasa cu un sistem optic adecvat (colimare si filtrare pentru trecerea unei benzi cat mai inguste in jurul lungimii de unda de 1270 nm) si detectata de un fotomultiplicator. Semnalul detectat este masurat si prelucrat cu un osciloscop digital acordat pe frecventa de repetitie a laserului YAG:Nd cu ajutorul unei fotodiode rapide.

FIGURA 33 In FIGURA 34 sunt prezentate rezultatele masuratorilor efectuate pentru diferiti parametri de iradiere. Agentul fotosensibilizator utilizat a fost fotosensibilizatorul Methylene Blue (MB), iar iradierea de activare a fost facuta la λ=640 nm. Se poate observa din figura ca durata de viata pe starea excitata de singlet a oxigenului, generat prin sensibilizare de catre compusul MB este de aproximativ 20 microsecunde (solvent alcool etilic).

FIGURA 34

23

A fost subliniata, in decursul proiectului importanta duratei de viata a starii de triplet a fotosensibilizatorului; o durata mare a starii de triplet permite un transfer eficient al energiei catre moleculele de oxigen pentru a genera singlet. Pentru masurarea duratei de viata a starilor de triplet a fost utilizata tehnica fotolizei flash, care implica iradierea probei cu un plus de durata mica si intensitate mare; la intervale adecvate de timp se masoara schimbarile care au loc in absorbtia probei, prin masurarea acesteia cu ajutorul unui alt fascicol optic (fascicolul proba), care trece prin acelas volum al probei ca si pulsul pompa. Sistemul conceput pentru aplicarea acestei metode este prezentat in FIGURA 35.

FIGURA 35.

In cazul utilizarii metilen blue (balbotat cu curent de azot pentru eliminarea oxigenului din solutie) se obtine semnalul de absorbtie tranzienta a starilor de triplet ale fotosensibilizatorului (FIGURA 36).

FIGURA 36

24

În vederea analizării efectului citostatic al substantelor BG204 si BG1120 s-a ales o linie de celule de adenocarcinom colorectal (Caco-2). După tratarea acestor celule cu diferite concentratii ale celor două substante, efectul a fost analizat printr-un test de citotoxicitate: MTT. Cultivarea liniei celulare Caco-2

Această linie celulară stabilizată de celule epitliale intestinale a fost furnizată de firma ATCC (American Type Culture Collection). Celulele au fost obţinute din adenocarcinom de colon uman de la un bărbat caucazian în vârstă de 72 de ani.

Pentru cultivarea celulelor din linia celulara Caco-2 se foloseste mediu MEM (Eagle`s Minimum Essential medium cu Earl`s BSS si 2mM L-glutamina) care este îmbogăţit cu:

-antibiotic (10ml/L) -piruvat de sodiu (1mM) -bicarbonat de sodiu (1,5 g/L) -ser fetal bovin (20%)

Mod de lucru: -celulele epiteliale de adenocarcinom colorectal sunt cultivate in mediu la o densitate de 1x104 celule/cm2

FIGURA 37. -la o confluentă a celulelor de 80% sau o densitate celulară între 8x104 si 1x105celule/cm2 are loc tripsinizarea:

-aspirarea si îndepartarea mediului din flaskuri -spălare flask cu 2 ml tampon fosfat salin – PBS (flask 75cmp) -tripsinizare 1 ml tripsina 4x (flask 75 cmp) - incubare la 37°C, 5 minute -inactivare tripsina cu 2 ml mediu MEM, 20% ser fetal -centrifugarea celulelor la 1500 rpm, 10 minute, 4°C -resuspendarea celulelor in 8 ml mediu MEM, 20% ser fetal -repartizarea celulelor pe flask -incubarea la 37°C, 5% CO2

-la 48-36 ore are loc o modificare a culorii mediului ceea ce indică consumarea nutrientilor si eliberarea în mediu de cultură a metabolitilor; si se realizează o schimbare a mediului de cultură.

FIGURA 37 Linia celulară Caco-2. A: densitate celulară scăzută (1x104 celule/cm2) B: densitate celulară ridicată (între 8x104 si 1x105celule/cm2).

25

1.Măsurarea de efecte ale citostaticului BG204 asupra culturilor de celule În vederera măsurării efectului citostaticului BG204 asupra liniei celulare Caco-2, s-a realizat un

tratament al acestor celule cu diferite concentratii de substantă iar efectul citotoxic a fost analizat prin testul de citotoxicitate MTT (bromurã de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu).

Tratamentul celulelor cu BG204   Au fost însământate pe o placă cu 24 godeuri (2 cmp) la o densitate de 104celule/godeu: -celulele au fost tripsinizate si numărate -după numărare s-au repartizat 104celule/godeu -s-au incubat la 37°C, 5% CO2 până când au aderat (48 ore). După aderare celulele au fost sincronizate timp de 12 ore prin cresterea lor în MEM cu 2% ser fetal.

BG204, 10-4M

BG204,

10-6M

BG204,

10-8M

BG204,

10-8M

BG204,

10-8M

BG204,

10-6M

BG204,

10-6M

BG204, 10-4M

BG204, 10-4M

BG204, 2x10-3M

BG204,

10-5M

BG204, 2x10-3M

BG204, 2x10-3M

BG204,

10-7M

BG204,

10-9M

BG204,

10-7M

BG204,

10-9M

BG204,

10-9M

BG204,

10-7M

BG204,

10-5M

BG204,

10-5M

Martor Martor Martor

FIGURA 38 Schema plăcii de tratamentul pentru citostaticul BG204.

Tratamentul s-a realizat timp de 4 ore cu diferite concentratii de BG204: 2x10-3M, 10-4M, 10-5M,

10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M; fiecare concentratie lucrându-se în triplicat (FIGURA 38). După 4 ore de tratament celulele au fost observate la microscop, în vederea evidentierii

modificărilor morfologice ce pot apărea ca urmare la tratament, iar apoi s-a realizat testul de citotoxicitate.

Testul de citotoxicitate MTT (bromurã de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu) Principiul metodei. Testul MTT a fost descris de Mosmann în 1983; el se bazează pe capacitatea dehidrogenazei mitocondriale de a cliva inelul tetrazoliu al MTT, de culoare galbenă, din celulele viabile si de a forma cristale de culoare albastru închis de formazan care nu pot traversa membrana celulară si astfel se acumulează în celulele viabile. Numărul de celule viabile este direct proportional cu cantitatea de formazan formată. Solubilizarea cristalelor se realizeaza prin adăugare de izopropanol iar cantitatea de formazan format este determinată spectrofotometric prin cuantificare la 595 nm. Mod de lucru -celulele tratate sunt spălate de 2 ori cu PBS, (200μl PBS/godeu) -se adaugă 50μL solutie MTT/godeu; -incubare 2ore/37°C, după 2 ore se obervă formarea unor cristale albastre -se îndepărtează solutie de MTT -are loc solubilizarea cristalelor formate prin adăugarea de 50μl izopropanol/godeu -citirea absorbantei la 595nm

26

Rezultate si discutii Observarea modificărilor morfologice Înainte de realizarea testului MTT s-au observat la microscop modificările morfologice ale celulelor (FIGURA 39 - 43).

FIGURA 39 Celule Caco-2 martor, după 4 ore

FIGURA 40 Celule Caco-2 tratate cu BG204, 10-9M timp de 4 ore

FIGURA 41 Celule Caco-2 tratate cu BG204, 10-6M timp de 4 ore

27

FIGURA 42 Celule Caco-2 tratate cu BG204, 10-4M timp de 4 ore

FIGURA 43 Celule Caco-2 tratate cu BG204, 2x10-3M timp de 4 ore Observarea celulelor la microscop a evidentiat modificari morfologice ale acestora ncepand de la o concentratie de 10-4M citostatic BG204. La concentratii mici de citostatic nu s-au evidentiat modificări semnificative din punct de vedere al numărului celulelor si morfologiei acestora. Modificari semnificate s-au observat după 4 ore de tratament, la concentratia de 2x10-3M: celulele devin rotunjite si pierd capacitatea de a adera de substrat, se vacuolizeaza si se constata inceperea fragmnentarii ADN, comparativ cu celulele martor care au o formă hexagonală normala si proliferează. (FIGURILE 31 - 35). Testul MTT

Datele obtinute prin testul MTT vin să confirme observatiile microscopice: la concentratii mici de citostatic nu se observă o scădere semnificativă a celulelor viabile, în schimb începând cu o concentratie de 10-4M se observă o scădere cu aproximativ 20% a celulelor viabile. Cea mai drastică scădere se observa la concentratia de 2x10-3M unde mai rămân doar 10% celule viabile (FIGURA 44).

28

FIGURA 44 Testul MTT pentru celulele Caco-2 tratate cu diferite concentratii de BG204

2.Măsurarea de efecte ale citostaticului BG1120 asupra culturilor de celule În vederera măsurării efectului citostaticului BG1120 asupra liniei celulare Caco-2, s-a realizat un

tratament al acestor celule cu diferite concentratii de substantă iar efectul citotoxic a fost analizat prin testul de citotoxicitate MTT (bromurã de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu).

Tratamentul celulelor cu BG1120   În vederea efectuării tratamentrului celulele au fost însământate pe o placă cu 24 godeuri (2 cmp) la o densitate de 104celule/godeu: -celulele au fost tripsinizate si numărate -după numărare s-au repartizat 104celule/godeu -s-au incubat la 37°C, 5% CO2 până când au aderat (48 ore). După aderare celulele au fost sincronizate timp de 12 ore prin cresterea lor în MEM cu 2% ser fetal. Tratamentul s-a realizat timp de 4 ore cu diferite concentratii de BG1120: 2x10-3M, 10-4M, 10-5M, 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M; fiecare concentratie lucrându-se în triplicat (FIGURA 45).

BG1120, 10-4M

BG1120,

10-6M

BG1120,

10-8M

BG1120,

10-8M

BG1120,

10-8M

BG1120,

10-6M

BG1120,

10-6M

BG1120, 10-4M

FIGURA 45 Schema plăcii de tratamentul pentru citostaticul BG1120.

BG1120, 2x10-3M

BG1120, 2x10-3M

BG1120, 2x10-3M

Martor Martor Martor

BG1120, 10-4M

BG1120,

10-5M

BG1120,

10-5M

BG1120,

10-5M

BG1120,

10-7M

BG1120,

10-7M

BG1120,

10-7M

BG1120,

10-9M

BG1120,

10-9M

BG1120,

10-9M

29

După 4 ore de tratament celulele au fost observate la microscop, în vederea evidentierii

modificărilor morfologice ce pot apărea ca urmare la tratament, iar apoi s-a realizat testul de citotoxicitate.

Testul de citotoxicitate MTT (bromurã de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu) Mod de lucru -celulele tratate sunt spălate de 2 ori cu PBS, (200μl PBS/godeu) -se adaugă 50μL solutie MTT/godeu; -incubare 2ore/37°C, după 2 ore se obervă formarea unor cristale albastre -se îndepărtează solutie de MTT -are loc solubilizarea cristalelor formate prin adăugarea de 50μl izopropanol/godeu -citirea absorbantei la 595nm Rezultate si discutii Observarea modificărilor morfologice Înainte de realizarea testului MTT s-au observat la microscop modificările morfologice ale celulelor (FIGURILE 46 - 50).

FIGURA 46 Celule Caco-2 martor, după 4 ore

 

FIGURA 47 Celule Caco-2 tratate cu BG1120, 10-9M timp de 4 ore

30

 

FIGURA 48 Celule Caco-2 tratate cu BG1120, 10-6M timp de 4 ore

FIGURA 49 Celule Caco-2 tratate cu BG1120, 10-4M timp de 4 ore

  FIGURA 50 Celule Caco-2 tratate cu BG1120, 2x10-3M timp de 4 ore  

31

După observarea celulelor la microscop s-a evidentiat o modificare morfologică a acestora încă de la concentratii foarte mici de citostatic (10-9M). La concentratii mici de citostatic (10-9M) s-au evidentiat modificări din punct de vedere al numărului si morfologiei celulelor dar încă există un număr mare de celule normale. Începând cu concentratia de 10-6M se observă o rotunjire a celulelor si desprinderea acestora de substrat. După cele 4 ore de tratament, la concentratiile de 10-4M si 2x10-3M se pot observa cele mai semnificative modificări: celulele devin rotunjite si pierd total capacitatea de a adera de substrat, comparativ cu celulele martor care au o formă hexagonală si proliferează.

Testul MTT Datele obtinute prin testul MTT vin să confirme observatiile microscopice: la concentratii mici de

citostatic se observă o scădere relativ semnificativă a celulelor viabile, în schimb începând cu o concentratie de 10-4M se observă o scădere cu aproximativ 85% a celulelor viabile (FIGURA 51).

  FIGURA 51: Testul MTT pentru celulele Caco-2 tratate cu diferite concentratii de BG1120. CONCLUZII GENERALE

Datele obtinute in cadrul prezentului proiect scot in evidenta ca medicamentele de tip citosatice pot fi modificate prin expunere la radiatie optica si pot deveni mai eficiente in invingerea rezistentei la tratamente. Pentru dezvoltarea acestui domeniu este necesara abordarea sistematica a studiului modificarilor moleculare in citostatice si a interactiunii acestora cu sistemele tumorale la nivelul intercalarii in moleculele de ADN. In acelasi timp rolul generarii de radicali liberi reactivi trebuie considerat in cazurile in care aplicatiile se fac “in vivo”.

32