PRELUCRAREA PROBELOR CONGELATETehnica secționării pieselor biologice congelate este apanajul laboratoarelor de anatomie patologică şi permite analiza microscopică rapidă a unui preparat. Recoltarea, fixarea, secționarea, etalarea, colorarea, montarea și etichetarea se desfășoară într-un timp foarte scurt (cca 10 minute) față de tehnica secțiunilor fine la parafină (cca 16 ore). Calitatea preparatului este însă diminuată față de probele incluse in parafină și secționate la microtom.

Aplicațiile tehnicii de secționare a pieselor congelate- efectuarea unui examen anatomopatologic rapid:

o în cadrul tehnicii chirurgicale Mohr (chemiochirurgie) - o metodă simplă de control microscopic 100% al marginilor unei probe chirurgicale;

o pentru examinarea în timpul operator a unei tumori cu presupuse metastaze; proba suspectă de a fi o metastază este prelucrată prin congelare și secționare la criotom iar rezultatul decide continuarea procedurii operatorii în sens radical sau conservator;

- evidențierea unor componente tisulare care se pierd la prelucrarea prin tehnici histologice uzuale (în care, de exemplu, folosirea formolului ca fixator dizolvă lipidele); se pot detecta lipidele, enzimele, mucopolizaharidele.

- efectuarea unor preparate care să permită detecția unor antigene, prin tehnici complementare de imunofluorescență sau imunohistochimie; aceste antigene pot fi mascate de fixarea cu formalină, motiv pentru care se poate opta pentru secționarea la criotom.

Materiale și echipamente necesare- țesut proaspăt recoltat;- criotom - un microtom pentru secţiuni congelate, cu grosimea de 5-60m, amplasat într-o incintă

frigorifică.- gel crioprotector OCT (Optimal Cutting Temperature), un amestec de glicerol și rășini care

împiedică formarea cristalelor de gheață în interiorul țesutului (fapt care ar afecta structura tisulară);- soluții de colorare (fie albastru de toluidină fie clasica tehnică de colorare HE), lame, lamele, mediu

de montare, alcool, xilol.

Tehnică de lucru- recoltarea se poate realiza prin metodele cunoscute (biopsie, puncție bioptică etc);- fixarea se realizează prin congelarea probei (implicit - metodă fizică)

Congelarea probei se realizează într-un container special (fig.1a)

Piesa este acoperită cu soluție crioprotectoare (fig.1b) și sigilată cu o membrană PET.Congelarea se poate realiza în sistemul de răcire al criotomului, pe o placă răcită la -58°C. Preparatele pot fi apoi stocate într-un congelator la -74°C, dacă nu sunt secţionate imediat. Incinta criotomului ajunge la -35°C

Containerul special de congelare este amplasat pe sistemul portobiect al criotomului. Blocul congelat cu țesutul trebuie să fie paralel cu lama cuțitului; acum se poate începe secţionarea.

În timpul secționării, care poate fi automată, semi-automată sau manuală, cu ajutorul unui penson se împiedică incurbarea secţiunilor.

În final secțiunile sunt preluate cu un penson și amplasate pe lamă.

Colorarea secțiunilor la gheațăColorarea secțiunilor din blocuri de țesut congelat se poate face fie pe secțiuni libere fie pe secțiuni lipite pe lame portobiect. Pentru secțiunile libere, bateria de colorare este formata din cutii Petri cu diametru mic prin care secțiunile se trec cu ajutorul unor baghete de sticla in forma de “L”. După colorare, aceste secțiuni se pescuiesc pe lame portobiect și se montează în medii apoase (glicerină, gelatină).Pentru secțiunile etalate pe lamă, colorarea se realizează cu diferiți coloranți și prim metode variate, în funcție de timpul disponibil.Colorațiile utilizate sunt cele folosite de obicei pentru secțiuni fine (albastru de toluidină sau hematoxilină eozină - colorații de rutină) sau sunt adaptate rezultatelor scontate (ex. imunofluorescență).Colorarea secțiunilor lipite pe lame cu soluție 1% de albastru toluidina - etape de lucruSecțiunile lipite pe lamă, după secționarea la criotom, sunt hidratate dar conțin încă impurități, grăsimi. În consecință este necesară o clarificare cu xilol (solvent organic). Xilolul nu este miscibil cu apa, așadar, înainte de clarificare, secțiunile trebuie deshidratate, iar după clarificare, secțiunile trebuie rehidratate deoarece soluția de colorare este apoasă. Etape:

DESHIDRATARE

Alcool 90%se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

Alcool 100%se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

CLARIFICAREXilol

se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

REHIDRATARE

Alcool 100%se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

Alcool 90%se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

COLORARE PROPRIU-ZISĂ

Albastru de toluidină,soluție 1%

se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă 30-60 secunde, apoi se scurge în vasul Petri

După colorare, secțiunile parcurg etapele de postcolorare, în funcție de mediul de montare:- pentru un mediu de montare apos - se adaugă direct 1-2 picături de mediu de montare și se acoperă

cu o lamelă; se elimină bulele de aer pin presarea ușoară a lamelei. Se poate examina la microscop;- pentru un mediu de montare anhidru (Balsam de Canada) etapele sunt:

DESHIDRATARE

Alcool 90%se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

Alcool 100%se toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

CLARIFICARE Xilolse toarnă în picături peste secțiuni, pe lama așezată pe marginile unei cutii Petri. Se lasă câteva secunde, apoi se scurge în vasul Petri

MONTAREBalsam de

Canada

se adaugă direct 1 picătură de mediu de montare și se acoperă cu o lamelă; se elimină bulele de aer pin presarea ușoară a lamelei. Se poate examina la microscop;

Rezultatele colorării cu albastru de toluidină: nuclei apar in albastru închis , iar citoplasma în albastru deschis.