FONDUL SOCIAL EUROPEAN Investeşte în oameni! Programul Operaţ ional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013 Proiect POSDRU/6/1.5/S/16 – Doctoranzi în sprijinul inovării şi competitivit ăţii UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI Facultatea Chimie Aplicata si Stiinta Materialelor Catedra Stiinta si Ingineria Materialelor Oxidice si Nanomateriale Nr. Decizie Senat __________ din _____________ TEZĂ DE DOCTORAT Materiale compozite hibride de tip polimer/ceramica Polymer/ceramic hybrid composite materials Coordonator stiintific: Prof. Dr.Ing. Ecaterina ANDRONESCU Autor: Ing. Maria FICAI (SÖNMEZ) Bucureşti 2011
Transcript
FONDUL SOCIAL EUROPEAN Investeşte în oameni!
Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013 Proiect POSDRU/6/1.5/S/16 – Doctoranzi în sprijinul inovării şi competitivităţii
UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI Facultatea Chimie Aplicata si Stiinta Materialelor
Catedra Stiinta si Ingineria Materialelor Oxidice si Nanomateriale
Nr. Decizie Senat __________ din _____________
TEZĂ DE DOCTORAT
Materiale compozite hibride de tip polimer/ceramica
Polymer/ceramic hybrid composite materials
Coordonator stiintific: Prof. Dr.Ing. Ecaterina ANDRONESCU
Autor: Ing. Maria FICAI (SÖNMEZ)
Bucureşti 2011
Cuprins
Justificarea alegerii temei de doctorat .....................................................................................5
I. MATERIALE COMPOZITE HIBRIDE BINARE .............................................................6
Compozite hibride de tip poli BisGMA-HA ............................................................................6
Compozite pe bază de APV–HA ............................................................................................ 10
Compozite pe bază de APV–Al2O3......................................................................................... 14
II. MATERIALE COMPOZITE HIBRIDE TERNARE...................................................... 18
Materiale compozite hibride de tip colagen/hidroxiapatita/magnetita................................. 18
Obţinerea şi caracterizarea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 .................................. 19
Sisteme multifuncţionale colagen/cisplatin şi colagen/hidroxiapatită/cisplatin.................... 24
Sinteza materialelor multifuncţionale de tip COL/cisplatin şi COL/HA/cisplatin............... 26
Spectrul filmului obţinut în condiţii hidrotermale prezintă atât benzile de absorbţie ale Al2O3 cât şi cele
ale APV (însă intensităţi relative diferite) precum şi benzi de absorbţie noi centrate la 1024 şi 1050cm-1
[119]. Intensitatea relativă mai scăzută a benzilor corespunzătoare Al2O3-ului din filmul hibrid obţinut în
condiţii hidrotermale, corelată cu apariţia benzilor Al-O-C sugerează formarea legăturii chimice dintre
alumină şi APV.
Figura 16. Spectrele IR ale filmelor APV-Al2O3
Teste biologice
Toate testele biologice efectuate pe probele pe baza de APV şi Al2O3 prezintă o citotoxicitate
scăzută. Citotoxicitatea creşte puţin odată cu creşterea concentraţiei de Al2O3; diferenţa fiind cel mai
probabil datorită desprinderii particulelor de alumină din material (Figura 17).
Figura 17.a. Analiza citotoxicitatii asupra celulelor HCT8 prin flowcitometrie; b. Nivelul de citotoxicitate testate pe celule HCT8; A, B. Distributia ciclului cellular in cazul celulelor diploide umane (cuantificarea dupa modelul Dean-Jett-Fox).
Distributia ciclului celular al celulelor eucariote arată că APV induce o uşoară scădere a ponderii
de celule in faza S (12.83 vs. 8.40 pentru PVA sau 8.33 pentru PVA-Al2O3), in timp ce in faza G1 şi G2 o
creştere uşoară.
II. MATERIALE COMPOZITE HIBRIDE TERNARE
Materiale compozite hibride de tip colagen/hidroxiapatita/magnetita
Magnetita este una dintre cele mai studiate materiale magnetice datorită aplicaţiilor
biomedicale: imagistică de rezonanţă magnetică (MRI), agent de contrast magnetic [121];
eliberare controlată şi purtător de medicamente [122, 123] şi hipertermie [124].
Figura 18. Aplicaţiile nanoparticulelor magnetice
Nanoparticule magnetice
Terapie Diagnoză (MRI)
Eliberare controlată şi transportor de medicamente Hipertermie
În cazul tratamentului cancerului osos, de obicei, prima etapă constă în îndepărtarea
chirurgicală a ţesutului osos tumoral [125]. După intervenţia chirurgicală, defectul osos rezultat
este “umplut” cu material de umplutură cu rol regenerativ sau, mai bine, cu materiale
regenerative care conţin magnetită şi/sau citostatice. În majoritatea cancerelor gradul de
recurenţă este destul de mare în special datorită îndepărtării parţiale a ţesutului tumoral. Acesta
este scopul pentru care intervenţia chirurgicală este asociată cu chimio/radioterapie.
Obţinerea şi caracterizarea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4
Obţinerea şi caracterizarea nanoparticulelor de magnetită
Prima etapă în obţinerea materialelor compozite de tipul COL/HA-Fe3O4 o reprezintă
punerea la punct a metodei de sinteză a particulelor de magnetită de formă şi dimensiuni
prestabilite eventual, în cazul obţinerii unei magnetite neuniforme (dimensional sau din punct de
vedere al formei) fracţionarea acestei mase de reacţie şi reţinerea fazei de interes.
Nanoparticulele de magnetită au fost obţinute prin precipitare pornind de la precursori de
Fe2+ şi Fe3+, mediul de reacţie slab bazic fiind realizat de NaOH. Au fost obţinute mai multe şarje
de magnetită, cu caracteristici diferite, acestea putând fi utilizate în diverse scopuri.
În cazul în care, se doreşte producerea hipertermiei în locul unde s-a implantat materialul
(adică nu se impune transportul nanoparticulelor de magnetita prin aplicarea diverselor câmpuri
electromagnetice care să inducă migrarea acestora spre locul unde se va produce hipertermia) se
pot utiliza, cu rezultate foarte bune, nanoparticule sferice obţinute prin coprecipitare, stabilizate
sau nu cu diverşi agenţi tensioactivi.
Caracterizarea nanoparticulelor
Imaginile TEM au fost obţinute pe probele fin mojarate utilizând un microscop electronic
prin transmisie de înaltă rezoluţie TECNAITM G2 F30 S-TWIN echipat cu detector STEM –
HAADF, EDX şi EELS.
Pentru o bună vizualizare a particulelor de magnetită obţinută se impune studierea acestor
particule cu ajutorul microscopului electronic prin transmisie (Figura 19). Pot fi astfel obţinute
informaţii referitoare la forma şi dimensiunea acestora. Pot fi astfel identificate două tipuri de
magnetită: sferică şi cilindrică (sub forma de bastonaşe). Obţinerea magnetitei cilindrice poate fi
pusă în evidenţă doar în condiţiile în care sinteza este realizată în prezenţa câmpului magnetic.
Dimensiunea particulelor sferice de magnetită variază de la ~ 5nm şi până la 20 nm, diametrul
mediu al acestor particule fiind 10 – 12 nm, în timp ce, în cazul particulelor cilindrice, acestea
pot atinge până la 50 nm în lungime, diametrul fiind apropiat de cel al particulelor sferice.
Figura 19. a, b, c) imagini TEM la diverse măriri şi d) imagine HRTEM a nanoparticulelor de magnetită Obţinerea şi caracterizarea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4
Gelul de colagen utilizat a fost obţinut în cadrul INCDTP – Suc. ICPI pornind de la piele
bovină prin extracţie chimică şi enzimatică, concentraţia gelului fiind 1,6 iar pH-ul gelului 7.
Obţinerea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4
Mineralizarea gelului de colagen are loc în două etape, în scopul mimării cât mai fidel a
osteosintezei naturale [126]. În prima etapă, suspensia de hidroxid de calciu (Fluka) este
adăugată peste gelul de colagen şi lăsat să interacţioneze timp de 24h. În etapa a doua, peste
masa de reacţie obţinută în etapa I, se adaugă soluţia de fosfat diacid de sodiu ceea ce duce la
precipitarea hidroxiapatitei. Cantităţile de gel de colagen şi precursori de HA au fost astfel
adăugate încât să se obţină un material compozit cu raportul masic COL:HA = 1:4; pH-ul de
precipitare final fiind ~ 9 şi se obţine prin adăugare de soluţie de NaOH sau HCl diluat.
În cazul obţinerii compozitelor COL/HA-Fe3O4 materialul compozit obţinut după
mineralizarea gelului de colagen este amestecat cu cantitatea adecvată de magnetită, particulele
de magnetită fiind obţinute prin precipitare, aşa cum a fost prezentat, pornind de la FeCl3 şi
FeSO4, la pH 9.
Pe parcursul sintezei materialelor compozite de tip COL/HA-Fe3O4, temperatura a fost
termostatată la 35±2ºC; uscarea materialului fiind realizată prin liofilizare.
Dimensional, cristalele aciculare au lungimea în domeniul micronic iar diametrul este de 100 -
300 nm.
Formarea structurilor aciculare poate fi explicată pe baza metodei de sinteză prezentate
anterior. După adăugarea suspensiei de Ca(OH)2 pH-ul devine bazic şi procesul de fibrilogeneză
începe [127]. La adăugarea particulelor de magnetită, moleculele de colagen sunt asociate în
fibrile şi fibre şi acţionează drept surfactanţi pentru stabilizarea magnetitei.
Comparând acest caz cu cazul stabilizării magnetitei cu anionul citrat se poate observa o
modificare a morfologiei materialului compozit. Daca în cazul stabilizării cu acid citric
particulele de magnetită sunt sferice în cazul stabilizării în prezenţă de colagen conduce la o
morfologie aciculară datorită faptului că fibrilele şi fibrele de colagen sunt mai mari decât în
cazul citratului şi ca urmare în jurul particulelor de magnetită se ataşează doar câteva fibrile şi
fibre de colagen (prin interacţii electrostatice).
Figura 21. Imaginile SEM înregistrate pe materialele compozite COL/HA-Fe3O4
Teoria sus menţionată este de altfel confirmată şi de analizele EDS (Figura 22). În acest
scop au fost înregistrate, la aceleaşi măriri, spectrele EDS atât în zonele aciculare cât şi în zonele
lipsite de formaţiunile aciculare. Deşi analiza are un caracter semicantitativ datorită conţinutului
scăzut de magnetită spectrele înregistrate sunt sugestive. Prezenţa ferului poate fi vizualizată în
spectrul EDS al materialului compozit la 6,3keV înregistrat în zona aciculară în timp ce în cazul
zonelor lipsite de formaţiuni aciculare această bandă lipseşte.
Figura 22. Spectrele EDS ale materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 înregistrate într-o: a) zonă bogată în formaţiuni aciculare şi b) zonă lipsită de formaţiuni aciculare
Spectrul de absorbţie în infraroşu, înregistrat pentru compozitul COL/HA–Fe3O4
confirmă prezenţa benzilor caracteristice ale componenţilor (Figura 23), benzi care uneori se
suprapun. În scopul identificării acestor benzi suprapuse s-a recurs la deconvolutarea spectrului.
După deconvoluţie, în domeniul 400–1800 cm-1 pot fi identificate atât benzile de absorbţie
caracteristice ale compozitului COL/HA [126] cât şi benzile caracteristice magnetitei (713, 878,
962, 1082 şi 1450cm-1).
Figura 23. a) Spectrul IR al materialului compozit a) COL/HA-Fe3O4 şi b) spectrul deconvolutat al
Materialele compozite obţinute au fost analizate din punct de vedere al hipertermiei
produse (Figura 24). Deoarece nu a fost posibilă eliminarea temperaturii datorate efectului
capacitiv, temperatura datorată hipertermiei a fost obţinut prin diferenţă, între temperatura
rezultată, în condiţii identice, atât în cazul materialului compozit COL/HA cât şi a materialului
compozit COL/HA-Fe3O4. În condiţiile sus prezentate, temperaturile materialelor a ajuns la 49,5
şi respectiv 39,5 0C ceea ce înseamnă că efectul inductiv, datorat încălzirii magnetitei ca urmare
a interacţiei cu câmpul electromagnetic este de ~100C, pentru cazul materialului compozit care
conţine 7% magnetită.
Figura 24. Imaginile în infraroşu înregistrate în câmp electromagnetic a) în prezenţa materialului compozit COL/HA şi b) în prezenţa materialului compozit COL/HA-Fe3O4
În toate cazurile, determinarea temperaturii produse prin hipertermie este determinat în
condiţii identice pentru a limita la maxim erorile experimentale, în acest scop, materialele fiind
păstrate 1 h la aceeaşi temperatură (37 0C). După termostatare, materialele au fost introduse în
câmp electromagnetic (frecvenţa curentului alimentat fiind 150 kHz) iar temperatura a
determinată după 5, 10, 15, 20, 30 şi 60 minute. În toate cazurile studiate (materiale compozite
cu conţinut diferit de magnetită: 1, 2, 5%) se observă că creşterea conţinutului de magnetită duce
la creşterea hipertermiei produse, aşa cum reiese din Figura 25.
3637383940414243444546
0 10 20 30 40 50 60
time, min
Tem
pera
ture
, g
rd
COLL/HA-Fe3O4 1%
COLL/HA-Fe3O4 2%
COLL/HA-Fe3O4 5%
Figura 25. Dependenţa creşterii de temperatură datorate hipertermiei în cazul materialelor compozite
COL/HA-Fe3O4 cu conţinut variabil de magnetită cu timpul de iradiere
Este demn de menţionat că utilizarea aceluiaşi tip de nanoparticule magnetice (din punct
de vedere al dimensiunii şi formei nanoparticulelor) concentraţia poate influenţa efectul termic
rezultat ca urmare a aplicării câmpului electromagnetic produs de trecerea curentului alternativ
de frecvenţă 150 kHz printr-o spirală special construită în acest sens. Chiar şi în proporţii mici de
magnetită, hipertermia poate fi evidenţiată utilizând o cameră de măsură cu IR, în toate cazurile,
hipertermia produsă fiind adecvată pentru tratarea cancerului osos, timpii de aplicare a câmpului
electromagnetic fiind variaţi funcţie de concentraţia nanoparticulelor de magnetită. De asemenea,
utilizarea unei magnetite nestabilizate va permite dizolvarea în timp a acesteia şi metabolizarea
acesteia în timp ce materialul compozit rezultat va asista regenerarea normală a ţesutului
vătămat.
Sisteme multifuncţionale colagen/cisplatin şi colagen/hidroxiapatită/cisplatin Sistemele cu eliberare controlată sunt deosebit de utilizate în aplicaţii medicale datorită
reducerii toxicităţii sistemice [128, 129], în special. Avantajul sistemului COL/HA/cisplatin
provine din multifuncţionalitatea sistemului şi anume rol regenerativ datorită suportului
compozit COL/HA şi respectiv antitumoral datorită prezenţei cisplatinului.
Tratarea cancerului osos presupune intervenţia chirurgicala de îndepărtare a ţesutului
osos tumoral (Figura 26) [130]. În funcţie de gravitate, defectul osos produs poate varia în limite
foarte largi. Deşi organismul are mecanisme proprii de vindecare, în multe cazuri, datorita
atingerii unor dimensiuni critice ale defectului se impune utilizarea unor substituenţi de os [131].
Datorită faptului că, în foarte multe cazuri gradul de recurenţă este foarte mare, este de preferat
ca substituentul osos care se implantează sa aibă potenţiale activităţi antitumorale de lungă
durată (magnetită şi nanoparticulele de Au şi/sau Ag).
În prezent, au fost obţinute şi caracterizate sistemele simple COL/HA/cisplatin. În acest
caz acţiunea antitumorală a sistemului antitumoral este datorat doar eliberării cisplatinului, fără a
fi posibilă aplicarea hipertermiei (vezi Figura 26).
Figura 26.Reprezentarea schematică a etapelor de tratament a cancerului osos în cazul osteosarcomului [130]
Caracterizarea prealabilă a cisplatinului utilizat Cisplatinul (Figura 27) face parte din clasa citostaticelor derivate de platină fiind
descoperită încă din 1845 de către M. Peyrone şi aprobată de FDA pentru aplicaţii medicale în
1978 [132].
Figura 27. Cisplatinul (Sarea lui PEYRONE)
Cisplatinul este un antineoplazic citostatic, imunosupresiv si radio–sensibilizant din clasa
citostaticelor pe baza de platina. Produsul actioneaza ca alchilant bifazic, inhiba selectiv si
preferential sinteza ADN–ului si mai putin a ARN–ului; nu are specificitate de faza a ciclului
celular.
Cisplatinul poate fi cuantificat prin diverse metode instrumentale de la clasicele
determinări spectrofotometrice în domeniul UV-Vis [133] şi până la metodele moderne [134]
(spectroscopie de absorbţie atomică, spectrometrie de masă sau spectrometrie de masă cu plasmă
cuplată inductiv).
Spectrul de absorbţie în UV-VIS prezintă un maxim de absorbţie la 300nm (Figura 28),
acest pic putând fi utilizat în determinările cantitative ale cisplatinului. Domeniul de linearitate al
cisplatinului (determinarea cisplatinului fiind efectuată la 300nm) este de aproximativ 3 ordine
de mărime (~10 µM – 2mM).
Figura 28. Spectrul de absorbţie în UV-VIS al soluţiei de cisplatin 1mM
Spectrul IR al cisplatinului este redată în Figura 29. Este deosebit de important de
menţionat faptul că benzile caracteristice cisplatinului nu se suprapun cu cele ale suportului
propriu-zis [135, 136], spectrele putând fi utilizate în determinarea semi-cantitativă a
conţinutului de cisplatin.
Figura 29. Spectrul IR al cisplatinului
Sinteza materialelor multifuncţionale de tip COL/cisplatin şi COL/HA/cisplatin
Materialele multifuncţionale au fost obţinute prin adsorbţia cisplatinului pe matricile
compozite COL/HA obţinute. Matricile compozite COL/HA au fost obţinute conform unei
metodologii publicate în cadrul colectivului nostru cu menţiunea că, materialul rezultat după
mineralizare a fost reticulat cu glutaraldehidă, spălat cu apă distilată pentru îndepărtarea sărurilor
rezultate în procesul de precipitare (Schema 1).
Au fost astfel obţinute o serie de materiale multifuncţionale compozite în care s-a variat
atât morfologia suportului cât şi conţinutul de cisplatin. Metoda uscării mixte a permis obţinerea
unor materiale cu porozităţi diferite şi evident, procese de eliberare controlată diferite,
materialele poroase permiţând eliberarea mai rapidă a medicamentului. De asemenea, au fost
obţinute şi caracterizate materiale multifuncţionale cu conţinut variabil de cisplatin (0,1%, 2% şi
10%).
Caracterizarea fizico-chimică a materialelor şi eliberarea a fost studiată pentru toate
materialele multifuncţionale COL/HA/cisplatin, iar activitatea antitumorală a fost testată doar
pentru materialul multifuncţional mai complex, COL/HA/cisplatin, finalitatea acestor studii fiind
aceea de a obţine sisteme multifuncţionale mult mai complexe, ce includ şi nanoparticule de
magnetită şi Au şi/sau Ag precum şi substanţe cu activitate analgezică şi antiinflamatorie.
Schema 1. Fluxul tehnologic de obţinere a sistemelor multifuncţionale COL/HA/cisplatin
Caracterizarea materialelor multifuncţionale
Spectroscopia de absorbţie în IR permite analiza materialelor multifuncţionale
COL/HA/cisplatin atât din punct de vedere al materialului suport cât şi din punct de vedere al
substanţei cu rol antitumoral, având ca referinţă cisplatinul pur (Figura 30). Astfel, se pot
distinge benzile de absorbţie caracteristice ale colagenului (1650 cm-1 corespunde amidei I, C=O;
triplu degenerată (1035, 1087, 1110 cm-1)) pentru toate materialele multifuncţionale obţinute,
chiar dacă unele dintre benzile menţionate pot fi identificate doar prin deconvoluţie.
Colagen 1. Ca(OH)2
2. NaH2PO4
Mineralizare COL/HA
Reticulare
Spălare
Adsorbţie de
citostatic
Caracterizare Uscare
Glutaraldehidă
SBF
citostatic
Figura 30. Spectrele IR ale două materiale multifuncţionale de tipul COL/HA/cisplatin raportate la spectrul
IR al cisplatinului pur
La fel ca în cazul materialelor compozite COL/HA simple, sistemele multifuncţionale
conţin şi hidroxiapatită carbonatată, prezenţa carbonatului fiind explicabilă pe baza absorbţiei
dioxidului de carbon din aer şi poate fi dovedită pe baza benzilor de absorbţie de la 1340 (ν3
2-3CO ) şi 895 (ν2 2-
3CO ). În funcţie de concentraţia de agent antitumoral, intensitatea benzilor
caracteristice cisplatinului diferă în raport cu intensitatea benzilor materialului compozit suport,
în raport linear cu concentraţia, deşi la concentraţiile de 2% cisplatin, cuantificarea este posibilă
doar după deconvoluţie.
Datorită interferenţelor Rontgen produse atât de HA cât şi de cisplatin difracţia de raze X
poate fi utilizată în analiza materialelor multifuncţionale COL/HA-cisplatin.
Figura 31. Difractograma de raze X înregistrată pentru materialul multifuncţional COL/HA-cisplatin
Difractograma de raze X (Figura 31) poate fi uşor interpretată pe baza fişelor ASTM
corespunzătoare hidroxiapatitei (74-5066) şi respectiv cisplatinului (74-0950). Picurile
caracteristice hidroxiapatitei şi respectiv cisplatinului nu suferă deplasări semnificative faţă de
poziţiile picurilor componentelor pure însă, picurile cisplatinului, excepţie picurile de la ~ 14,3 şi
20.3, se suprapun peste picurile HA şi nu pot fi identificate. Dacă în cazul materialului
multifuncţional COL/HA-cisplatin având un conţinut de 10% cisplatin se pot identifica parţial
picurile de interferenţă rontgen în cazul materialelor multifuncţionale cu conţinut mai scăzut de
cisplatin aceste picuri nu pot fi decelate.
Microscopia electronică de baleiaj este utilizată în analiza morfologică atât a materialelor
multifuncţionale COL/cisplatin cât şi a materialelor multifuncţionale COL/HA-cisplatin.
Figura 32. Imagini SEM caracteristice materialelor multifuncţionale COL/cisplatin (1% cisplatin)
Morfologia materialelor COL/cisplatin (Figura 32) este practic identică cu cea a
matricilor colagenice de la care s-a pornit, adsorbţia cisplatinului neavând nici influenţă asupra
suportului colagenic. Aglomeratele de cisplatin pot fi uşor vizualizate ca fiind puncte albe
intense prin SEM utilizând detectorul de electroni retroîmprăştiaţi „backscattering”.
În cazul matricilor multifuncţionale compozite COL/HA-cisplatin morfologia se modifică
semnificativ faţă de matricile multifuncţionale COL/cisplatin datorită depunerii unei cantităţi
însemnate de fază minerală, raportul colagen:hidroxiapatită fiind de 1:4 (Figura 33). Per
ansamblu, morfologia materialului este foarte asemănătoare cu morfologia materialelor
compozite COL/HA însă, la concentraţii mari de cisplatin, se pot distinge zone bogate în
cisplatin, cu morfologie diferită (Figura 33f).
a) b)
Figura 33. Imagini SEM caracteristice materialelor multifuncţionale COL/HA-cisplatin
Studii de eliberare a cisplatinului din materialele multifuncţionale
Studiile de eliberare au fost efectuate în SBF astfel încât a reproduce cât mai bine
condiţiile în vivo. Aceste studii au fost realizate în special din perspectiva aplicării acestor
sisteme în tratarea cancerului (cercetării aplicative) şi într-o mai mică măsură din punct de
vedere al cercetării fundamentale.
Studiile de eliberare au indicat faptul că, în toate cazurile de materiale multifuncţionale
COL/cisplatin şi respectiv COL/HA-cisplatin în decursul primei zile se eliberează ~ 78-85% din
conţinutul total de cisplatin, fiind mai avansată în cazul matricilor multifuncţionale
COL/cisplatin decât în cazul materialelor multifuncţionale compozite COL/HA/cisplatin,
probabil datorită unor interacţii mai puternice ce se dezvoltă între HA şi cisplatin.
În contextul integrării acestor materialelor multifuncţionale de tip colagen/cisplatin şi
colagen/hidroxiapatită/cisplatin în sistemele mult mai complexe propuse în planul de realizare al
proiectului, atenţia a îndreptată în special în direcţia controlului vitezei de eliberare. Viteza de
eliberare este puternic dependentă de temperatură, aşa cum reiese din Figura 34 şi Figura 35.
Figura 34. Influenţa încălzirii asupra vitezei de eliberare a cisplatinului din materialele multifuncţionale de tip COL/HA-cisplatin
e) f)
d) c)
Figura 35. Influenţa răcirii asupra vitezei de eliberare a cisplatinului din materialele multifuncţionale de tip COL/HA-cisplatin
Evaluarea potentialului citotoxic pe linii celulare de osteoblaste normale şi din osteosarcom
în prezenta sistemului cu eliberare controlată
Citotoxicitatea cisplatinului incorporat în sistemul cu eliberare controlat a fost evaluata
prin realizarea testului LDH pe mediile de cultura mentinute în contact cu osteoblastele fetale
(Figura 36) şi de osteosarcom (Figura 37), test care permite stabilirea gradului de compromitere
a integritatii membrane celulare şi,implicit, a potentialului de inducere a mortii celulare.
LDH hFOB
control 6 100.0
0 .1
0 .2
0 .3control
6µM cisplatin10µM c isplatin
DO
495n
m
Figura 36. Evaluarea efectului compozitului colagen-hidroxiapatita fara cisplatin (control) şi cu cisplatin incorporat (in concentratii de 6µM şi 10µM) asupra eliberarii LDH în mediul de cultura de catre celulele
hFOB 1.19
LDH- G292
control 6 100 .0
0 .1
0 .2
0 .3control
6µM cisplatin10µM c isplatin
DO
495n
m
Figura 37. Evaluarea efectului compozitului colagen-hidroxiapatita fara cisplatin (control) şi cu cisplatin incorporat (in concentratii de 6µM şi 10µM) asupra eliberarii LDH în mediul de cultura de catre celulele
G292
Rezultatele obtinute demonstreaza ca în cazul ambelor linii celulare se inregistreaza o
reducere a viabilitatii celulare ce este direct proportional cu concentratia citostaticului inglobat în
matricile cu eliberare controlată.
Citotoxicitatea sistemelor cu eliberare controlată a fost pusa în evidenta şi prin evaluarea
densitatii şi morfologiei celulare ca rezultat al marcarii citoscheletului actinic al osteoblastelor cu
faloidina-TRITC (Figura 38 şi Figura 39). Osteoblastele fetale umane crescute în mediul de
extractie al compozitului colagen-hidroxiapatita manifesta o citomorfologie tipica cu un
citoschelet actinic bine evidentiat şi o densitate celulara corespunzatoare unei culturi normale în
faza exponentiala de crestere (Figura 38. A). In prezenta sistemului cu eliberare controlata
(Figura 38. B şi C), densitatea celulara scade proportional cu cresterea concentratiei de citostatic
ceea ce reflecta inducerea mortii celulare de catre acesta. Mai mult, morfologia celulara se
modifica în sensul ca celulele se micsoreaza gradat, fibrele de stres sunt mai putin evidente iar
nucleii dobandesc în multe celule aspectul unei inflorescente asemanatoare corpilor apoptotici ce
sunt caracteristici mortii celulare prin apoptoza.
(A) (B)
(C)
Figura 38. Efectul compozitului colagen-hidroxiapatita fara cisplatin (A) şi cu cisplatin incorporat în concentratii de 6µM (B) şi 10µM (C) asupra morfologiei şi densitatii osteoblastelor fetale hFOB 1.19.
Marcarea actinei citoscheletale cu faloidina-TRITC.(x16)
Dupa cum se remarca în Figura 39A, compozitul colagen-hidroxiapatita nu influenteaza
morfologia celulara, osteoblastele din osteosarcom prezentand o morfologie tipica: poligonala şi
usor alungita. La concentratii de cisplatin de 6 µM (Figura 39B) densitatea celulara este redusa,
fenomen ce se accentueaza la concentratia de 10 µM (Figura 39C) ca rezultat al mortii celulare
suferite de celule în prezenta sistemului cu eliberare controlat. In plus, morfolagia celulara care
este expresia gradului de “sanatate” a celulelor se modifica în special la doza mare de cisplatin
cand se constata aparitia nucleului fragmentat, micsorarea celulelor şi absenta fibrelor de stres,
fapt ce denota slabirea interactiilor dintre celule şi suportul de crestere.
(A) (B)
(C)
Figura 39. Efectul compozitului colagen-hidroxiapatita fara cisplatin (A) şi cu cisplatin incorporat în concentratii de 6µM (B) şi 10µM (C) asupra morfologiei şi densitatii celulelor de osteosarcom G292.
Marcarea actinei citoscheletale cu faloidina-TRITC.(x16) Per ansamblu, osteoblastele normale par a suferi modificari morfologice mai putin
pronuntate comparativ cu celulele din osteosarcom ce par a fi mai sensibile la sistemele cu
eliberare controlată.
Evaluarea potentialului proliferativ al osteoblastelor normale şi din osteosarcom în
prezenta sistemului cu eliberare controlată
Cele mai comune citostatice actioneaza prin uciderea celulelor care se divid rapid, una
dintre proprietatile principale ale majoritatii celulelor canceroase. Studiul prezentat si-a propus
evaluarea potentialului proliferativ al osteoblastelor normale şi din osteosarcom în prezenta
sistemului cu eliberare controlată prin cuantificarea numarului de celule viabile metabolic active
folosind testul MTT şi prin determinarea nivelului de expresie a PCNA printr-un studiu Western
blot.
M T T - h F O B
control 6 100.0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4c ontro l
6µM c isp la tin10µM c isp la tin
DO
550n
m
Figura 40. Rata de supravietuire a celulelor hFOB 1.19 sub influenta compozitului colagen-hidroxiapatita
fara cisplatin (control) şi cu cisplatin incorporat (in concentratii de 6µM şi 10µM)
Dupa cum reiese din Figura 40, viabilitatea celulelor hFOB 1.19 s-a diminuat de la 100%
sub influenta compozitului colagen-hidroxiapatita la 53% şi 44% în prezenta sistemului cu
eliberare controlată cu 6 µM şi respectiv 10 µM cisplatin.
M T T -G292
control 6 100.0
0.1
0.2
0.3
0.4contro l
6µM c isplatin10µM c isplatin
DO
550n
m
Figura 41. Rata de supravietuire a celulelor G292 sub influenta compozitului colagen-hidroxiapatita fara
cisplatin (control) şi cu cisplatin incorporat (in concentratii de 6M şi 10M)
Osteoblastele din osteosarcom s-au dovedit usor mai putin influentate din punct de vedere
al numarului de celule metabolic active în raport cu osteoblastele fetale (Figura 41). Astfel,
viabilitatea celulara a inregistrat o reducere de la 100% sub influenta compozitului colagen-
hidroxiapatita la 58% şi 48% în prezenta sistemului cu eliberare controlată cu 6 µM şi respectiv
10µM
Pentru a avea o imagine cat mai completa în ce priveste efectul sistemelor cu eliberare
controlată asupra potentialului proliferativ al osteoblastelor normale şi din osteosarcom s-a
realizat un studiu de determinare a expresiei proteice a ANPC. Acesta este o proteina de 36 kDa
identificata ca o proteina auxiliara a DNA polimerazei. Distributia sa prin ciclul celular creste în
faza G1, atingand un peak în faza G1/S şi inregistrand o scadere în faza G2. Proteina nu poate fi
detectata prin metode imunocitochimice în celulele în faza M şi latente, fapt ce explica
importanta sa ca marker de proliferare. La inceputul fazei S, ANPC are o distributie granulara
fiind absent în nucleoli, iar la sfarsitul fazei S predomina în nucleoli.
Analiza Western blot a expresiei proteice a ANPC a demonstrat un nivel de expresie
aproape constat al ANPC în celulele aflate sub influenta compozitului colagen-hidroxiapatita şi
în prezenta sistemului cu eliberare controlată cu 6 µM cisplatin, valoare ce este comparabila şi cu
celulele crescute în mediul de crestere uzual. Atat în osteoblastele fetale, cat şi din osteosarcom
se remarca o reducere a nivelului sau de expresie în prezenta sistemelor cu eliberare controlată
cu 10 µM cisplatin (Figura 42). Aceasta reducere este mult mai evident în cazul celulelor hFOB
1.19, sugerand ca ele sunt mai puternic afectate din punct de vedere al perturbarii ciclului celular.
Figura 42. Analiza Western blot privind efectul compozitului colagen-hidroxiapatita: fara cisplatin (linia 2) şi cu cisplatin incorporat în concentratii de 6M (linia 3) şi 10M (linia 4) asupra nivelului de expresie proteica
a PCNA. Linia 1: cultura în mediul de crestere uzual
Evaluarea potentialului apoptotic al osteoblastelor normale şi din osteosarcom în prezenta
sistemului cu eliberare controlată
Actiunea citostatica a substantelor chimioterapeutice se manifesta nu numai prin limitarea
potentialului proliferativ ci şi prin inducerea mortii celulare. Celulele sufera 2 forme principale
de moarte celulare: apoptoza şi necroza. Spre deosebire de necroza, care este o forma de moarte
celulara ce se sustrage descompunerii de catre fagocite conducand la debriuri celulare, apoptoza
este o forma de moarte celulara programata, mediata printr-un program intracelular şi care
trimite semnale chimice sistemului imun.
Prezentul studiu a urmarit evaluarea influentei sistemelor cu eliberare controlată asupra
potentialului apoptotic al osteoblastelor fetale şi din osteosarcom prin determinarea nivelelor de
expresie ale doi dintre mediatorii importanti ai apoptozei celulare: supresorul tumoral p53 şi
caspaza 3.
Proteina p53 este un factor de transcriptie care regleaza expresia unei largi varietati de
gene implicate în oprirea ciclului celular şi apoptoza celulara ca raspuns la stres genotoxic sau
celular. In cadrul procesului de malignizare, instabilitatea genomica este factorul principal, iar
proteina p53, prin reglarea raspunsului celular normal la leziunile DNA şi la alte “insulte”
celulare, indeplineste un rol central în controlul cresterii şi diviziunii celulare, functionand ca un
‘guardian of the genome’. Este bine cunoscut ca proteina p53 este stabilizata prin fosforilarea de
catre o kinaza inductibila de leziunile DNA - ATM kinaza (ataxia telangiectasia-mutated), iar
p53 fosforilat este rezistent la proteoliza ubiquitin-dependenta.
Deoarece proteina 53 este un puternic inhibitor al cresterii celulare, functiile ei sunt inalt
controlate pentru a permite o crestere şi dezvoltare normala. Controlul p53 este extrem de
complex şi se realizeaza prin reglarea sa la nivel transcriptional şi post-translational. Inductia
rapida a p53 ca raspuns la multiple forme de stres are loc prin mecanisme post-translationale,
conducand la stabilizarea şi activarea proteinei p53.
In stare «wild-type » care nu a suferit mutatii, proteina p53 este produsul unei gene
supresor de tumori, funcţionând ca un reglator negativ al diviziunii celulare, ce se găseşte
intracelular în celule normale şi ţesuturi la nivele foarte scazute. Cand apar mutaţii punctiforme
la nivelul unor secvente inalt conservate din gena p53, este exprimata o proteina mutant care
manifesta caracteristicile unui produs oncogenic activat. Proteinele p53 mutant şi «wild-type » se
deosebesc pe baza reactivitatii diferite fata de anticorpi monoclonali. Proteinele p53 mutant sunt
prezente în concentratii mari în aproape toate clasele de tumori umane şi în unele linii celulare
tumorale în cultura. In general, proteinele p53 mutant au un t1/2 mai lung decat «wild-type » -
ceea ce permite formelor mutant sa se acumuleze în concentratii detectabile în acele tumori şi
linii celulare tumorale asociate cu o oncogena p53 activata. In contrast, p53 «wild-type» nu se
acumuleaza în mod normal şi nu este usor detectabila.
Proteazele detin un rol central în faza de executie a apoptozei, iar caspazele, o familie de
cistein proteaze, sunt de importanta majora [137]. Proteazele sunt în general sintetizate ca
precursori inactivi care necesita activare, cel mai adesea prin proteoliza limitata, constituind deci,
ele insele substrat pentru proteaze. O asemenea semnalizare prin proteaze, ca o cale de
transducere a unui semnal, este de aceea ireversibila, astfel diferentiindu-se de alte mecanisme de
semnalizare [138]. Datorita acestei ireversibilitati, semnalizarea proteazica este o modalitate
eficienta de omorare a unei celule, avand în vedere faptul ca odata initiat programul, moartea
celulara nu mai poate fi reversata sau prevenita.
Caspazele pro-apoptotice pot fi impartite în caspaze initiatoare (2, 8, 9 şi 10) şi caspaze
efectoare (3, 6 şi 7), în functie de rolul lor în procesul apoptotic [139]. Activarea caspazelor
initiatoare constituie probabil punctul critic din intreaga cale apoptotica. Exista doua cai majore
de activare a caspazelor, calea extrinseca şi calea intrinseca. In calea extrinseca, legarea
liganzilor mortii din familia TNF (tumor necrosis factor) conduce la oligomerizarea receptorilor.
Acestia leaga apoi proteine adaptor formand astfel complexul DISC (death-inducing signalling
complex), care serveste ca platforma de activare pentru caspazele 8 şi 10. Calea intrinseca sau
mitocondriala este declanşată de stresul celular, care determina activarea membrilor pro-
apoptotici ai familiei Bcl-2. Caspazele iniţiatoare sunt recrutate prin intermediul domeniilor lor
de recrutare, ca DED (caspazele 8 şi 10) sau CARD (caspaza 9), la nivelul platformelor de
activare, unde sunt activate intr-o manieră alosterică, cum este de exemplu modificarea
conformaţională indusă de dimerizarea a doi monomeri inactivi [140]. Caspazele iniţiatoare
activate activează apoi direct caspazele efectoare prin scindare proteolitica.
După activare, caspazele efectoare proceseaza printr-un numar limitat de scindări un
subset de proteine celulare, dintre care circa 300 au fost identificate în diferite modele de
apoptoza. Caspazele scindează proteine implicate în sinteza, clivarea şi repararea DNA, proteine
implicate în translaţie, reglatori ai ciclului celular, proteine ale citoscheletului, proteine de
adeziune, protein kinaze şi fosfataze şi multe altele. In consecinţă, un număr de funcţii vitale ale
celulei sunt anulate iar celula moare.
Analiza Western blot a nivelului de expresie proteica a proteinei p53 şi procaspazei 3
(Figura 43) sub influenta compozitului colagen-hidroxiapatita şi în prezenta sistemului cu
eliberare controlată a evidenţiat următoarele: i) în celulele din osteosarcom, proteina p53 este ne-
exprimata iar pro-caspaza 3 înregistrează valori extreme de mici; ii) în osteoblastele fetale,
nivelul de expresie al proteinei p53 şi procaspazei 3 înregistrează valori similar în cazul celulelor
crescute în mediul de creştere uzual (linia 1) şi mediul de extracţie al compozitului
hidroxiapatita-colagen (linia 2); iii) osteoblastele crescute în mediile de extracţie ale sistemelor
cu eliberare controlată cu 6 µM cisplatin (linia 3) şi 10 µM (linia 4) înregistrează o reducere a
nivelului de expresie a ambelor proteine pe măsura creşterii concentraţiei de cisplatin.
Figura 43. Analiza Western blot privind efectul compozitului colagen-hidroxiapatita:fără cisplatin (linia 2) şi cu cisplatin incorporat în concentraţii de 6µM (linia 3) si 10µM (linia 4) asupra nivelului de
expresie proteica a proteinei p53 şi pro-caspazei 3.Linia 1: cultura în mediul de creştere uzual.
Absenta expresiei proteinei p53 în linia G292 ar putea fi explicata prin mutatiile suferite
de aceasta în osteosarcom. Inexplicabila este insa reducerea nivelului proteinei p53 în celulele
hFOB 1.19 cu creşterea dozei de cisplatin, cunoscut a genera leziuni ADN ce pot activa supra-
expresia sa. Este foarte posibil ca inducerea apoptozei celulare, remarcata prin reducerea
densităţii celulare şi alterări morfologice sub influenta sistemelor cu eliberare controlată în
ambele linii celulare, sa fie mediata prin activarea caspazelor. Acest lucru explica reducerea
nivelului procaspazei 3 ca rezultat al conversiei sale în forma activa pe măsura creşterii
concentraţiei de cisplatin în sistemele cu eliberare controlată.
Rezultatele obţinute sunt concordante cu studiul lui Seki şi colab. care au investigat în
vitro efectele mai multor citostatice (adriamicina, cisplatin, vincristina, ciclofosmamida) asupra
celulelor de osteosarcom şi caile de semnalizare pentru fiecare substanţă în parte. Ei au
demonstrat ca cisplatinul induce apoptoza în mod specific prin activarea caspazelor iar ceilalţi
agenţi antitumorali induc moartea celulara prin cai de semnalizare diferite.
Implicarea sistemelor cu eliberare controlată în modularea activitatii metaloproteinazelor
matriceale
Celulele din osteosarcom manifesta potenţialul de metastazare, proces ce implica o
cascada proteolitică ai căror actori principali sunt metaloproteinazele matriceale (MMP). MMP
sunt Zn-endopeptidaze, înrudite din punct de vedere structural şi funcţional, capabile de
degradarea majorităţii componentelor proteice din matricea extracelulara (MEC) (colageni,
proteoglicani, lamininǎ, fibronectinǎ, etc.) atât în vitro cat şi în vivo. Principalele MMP implicate
în procesele invazive şi de metastazare sunt colagenazele de tip IV (gelatinaza A sau MMP-2 şi
gelatinaza B sau MMP-9) al căror substrat primordial este colagenul tip IV, componentul
majoritar din membrane bazala.
Un alt obiectiv al studiilor realizate a fost evaluarea efectului sistemelor cu eliberare
controlată în modularea activităţii MMP responsabile de invazia tumorală şi metastazare. După
cum reiese din Figura 44, se remarca o inhibitie a activitatii specific MMP-2 pe măsura creşterii
concentraţiei de cisplatin în special în cazul celulelor din osteosarcom. Prin urmare sistemele cu
eliberare controlată pot determina reducerea potenţialului invaziv al osteoblastelor tumorale.
Figura 44 Analiza zimografica a efectului compozitului colagen-hidroxiapatita:fără cisplatin (linia 1) şi cu cisplatin incorporat în concentraţii de 6µM (linia 2)si 10µM (linia 3) asupra activităţii gelatinolitice specifice
MMP-2 şi MMP-9
Expresia activităţilor specifice MMP-2 şi MMP-9 în mediile condiţionate ale
osteoblastelor hFOB 1.19, foarte puţin inhibate de sistemele cu eliberare controlată, poate a fi
asociata cu fenomenul de remodelare a MEC necesar regenerării osoase.
CONCLUZII
Teza de doctorat intitulata „Materiale compozite hibride de tip polimer – ceramica” a
urmarit obtinerea de compozite polimerice ranforsate cu particule ceramice cu potentiale aplicatii
in implantologie si /sau in practica stomatologica.
In cadrul tezei au fost obtinute o gama larga de materiale compozite: compozite
hibride binare pe baza de poli bis-GMA/HA, APV/HA, APV/Al2O3 respectiv compozite hibride
I. Concluzii asupra obtinerii si caracterizari materialelor compozite hibride binare pe baza de
bis-GMA/HA
- s-a pus la punct două metode de polimerizare (termic si chimic) a monomerului BisGMA,
compatibile cu metodele de obţinere a compozitelor hibride prezentate precum şi metodele de
caracterizare ale acestora.
- raportul masic luat in lucru intre componentii fiind de 9/1;
- materialele nanocompozite hibride obţinute au fost caracterizate prin XRD, FTIR, SEM şi TEM
cât şi din punct de vedere al comportamentului termic prin analiza ATD-TG.
- prin vizualizarea imaginiilor SEM se observă ca materialul rezultat este omogen iar
aglomeratele au dimensiuni submicronice;
- prin TEM se observă dimensiunea şi forma particulelor. Din punct de vedere al dimensiuni se
poate afirma că materialele compozite obţinute se încadrează în domeniul nanometrilor;
- XRD şi FTIR confirmă obţinerea compozitului prin picurile şi benzile caracteristice
componentelor individuale;
- analiza termogravimetrică suportă mici diferenţe în funcţie de modul de polimerizare,
diferenţele care apar datorându-se iniţiatorului folosit;
- materialele obţinute au potenţiale aplicaţii în stomatologie ca material de umplutură sau
material de cementare (legare).
II. Concluzii asupra obtinerii si caracterizari materialelor compozite hibride binare pe baza de
APV/HA
Au fost obţinute şi caracterizate trei compozite pe bază de APV şi HA, cu conţinut variat
de fază minerală, alcoolul polivinilic şi HA fiind cunoscute ca biomateriale utilizabile in
implantologie datorita faptului ca sunt netoxice, compozitul rezultat fiind şi el studiat şi utilizat
în medicină.
Sinteza compozitelelor pe bază de APV/HA se realizează pornind de la pulbere de alcool
polivinilic şi pulbere de HA; Procesul de omogenizare s-a realizat prin agitare magnetică şi sub
uşoară încălzire;
Materialele compozite obţinute au fost caracterizate atât din punct de vedere morfologic
cât şi compoziţional:
- Difracţia de raze X a fost utilizată în scopul identificării fazelor existente în compozitele
obţinute. Se observă creşterea în intensitate a picurilor caracteristice HA precum şi diferenţierea
netă a acestora odată cu creşterea conţinutului de HA din compozit.
- Spectroscopia de absorbţie în infraroşu oferă informaţii suplimentare inclusiv metodei XRD
care este puternic limitată de cristalinitatea fazelor. Spectrele IR obţinute au fost suprapuse astfel
încât să se evidenţieze atât benzile caracteristice alcoolului polivinilic cât şi al compozitelor
APV-HA cu conţinut variabil de fază minerală.
- Compoziţia chimică a compozitului induce modificări morfologice însemnate în special la
concentraţii mari de APV.
- Imaginile SEM în cazul compozitelor APV-HA cu rapoarte masice între componenţi de 1:4 şi
respectiv de 1:1 arată că morfologia materialelor este foarte asemănătoare, materialele fiind
omogene atât din punct de vedere al distribuţiei de particule cât şi din punct de vedere al
distribuţiei celor două faze, putându-se afirma că cele două materii prime sunt compatibile.
- În cazul în care raportului masic între componenţi este de 4:1 imaginile SEM diferă net de
celelalte compozite, materialul obţinut având un aspect fibrilar pronunţat;
- Fibrele de APV-HA au diametrul de ordinul 100 – 250 nm şi lungime de ordinul zecilor de
µm.
III. Concluzii asupra obtinerii si caracterizari materialelor compozite hibride binare pe baza de
APV/alumina.
În cadrul acestei lucrări s-au obţinut şi caracterizat şi o serie de compozite pe bază de
APV şi Al2O3 cu rapoarte masice variabile. Compozitele astfel obţinute au fost caracterizate prin
XRD, FTIR şi SEM. Deoarece în condiţii normale de temperatură se formează două faze
distincte, unul preponderent polimeric şi unul compozit, s-a propus şi s-a realizat o metodă
hidrotermală de sinteză care să permită realizarea unor legături chimice suplimentare de tip
polimer – ceramică (Al-O-C) mărind astfel gradul de compatibilitate şi astfel obţinându-se un
material compozit omogen în cazul unui raport polimer ceramică de 1:1.
Etapa de dizolvare şi omogenizare se realizează la 1500C şi se păstrează această
temperatură până la evaporarea a 75 – 80% din apa de reacţie.
Etapa de uscare se realizează în două etape succesive: la 100 0C pentru îndepărtarea apei
a până la 90-95% urmată apoi de uscarea finală în condiţii normale de temperatură;
Imaginile de microscopie electronică de baleiaj confirmă obţinerea unei faze unice, morfologic
foarte asemănător cu cea a fazei preponderent polimerice;
Difractogramele de raze X înregistrate pentru APV şi respectiv pentru compozitul APV-
Al2O3 sunt asemănătoare atât din punct de vedere al fazelor cât şi din punct de vedere al
cristalinităţii acestora; mai mult, picurile caracteristice Al2O3 lipsesc din difractograma
compozitului datorită hibridului format prin legături chimice de tip - Al-O-C -.
Compozitele pe baza de APV/alumina pot fi utilizate pentru aplicaţii dentare şi pentru
proteze de şold.
IV. Concluzii asupra obtinerii si caracterizari materialelor compozite hibride ternare pe baza
de COL/HA/magnetita
Materialele compozite ternare pe bază de colagen şi hidroxiapatită indeplinescu 2 roluri:
suport regenerativ datorita compozitului COL/HA si rol antitumoral datorita nanoparticulelor de
magnetita. Rolul nanoparticulelor de magnetită este de a produce hipertermie şi poate fi activată
la comandă, în condiţii uşor controlabile: frecvenţă, timp de aplicare a câmpului electromagnetic
sau a conţinutul de magnetită. Deşi materialele compozite COL/HA-Fe3O4 ce conţin 1 sau 2 %
de magnetită pot produce hipertermia necesară, se recomandă utilizarea unui conţinut mai ridicat
de magnetită pentru a reduce timpul de iradiere pe de o parte şi, pentru că în cazul aplicării in
vivo, datorită ţesutului vecin, pierderile de căldură vor fi mai mari. Obţinerea structurilor
cilindrice caracteristice doar în cazul materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 poate fi explicată
pe baza interacţiilor ce se dezvoltă între fibrilele şi fibrele de colagen şi nanoparticulele de
magnetită.
Pentru obţinerea materialelor multifuncţionale Col/HA/Fe3O4 prima etapă constând în
obţinerea particulelor de magnetită prin precipitare pornind de la precursori de Fe2+ şi Fe3+,
mediul de reacţie slab bazic fiind realizat de NaOH.
Caracterizarea nanoparticulelor a fost realizat cu ajutorul microscopului electronic
prin transmisie la înaltă rezoluţie pe probele fin mojarate identificându-se două tipuri de
magnetitită: sferică şi cilindrică (sub forma de bastonaşe). Obţinerea magnetitei cilindrice poate
fi pusă în evidenţă doar în condiţiile în care sinteza este realizată în prezenţa câmpului magnetic.
Dimensiunea particulelor sferice de magnetită variază de la ~ 5nm şi până la 20 nm, diametrul
mediu al acestor particule fiind 10 – 12 nm, în timp ce, în cazul particulelor cilindrice, acestea
pot atinge până la 50 nm în lungime, diametrul fiind apropiat de cel al particulelor sferice.
Obţinerea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 a fost realizată în două etape. În prima
etapă, suspensia de hidroxid de calciu (Fluka) este adăugată peste gelul de colagen şi lăsat să
interacţioneze timp de 24h. În etapa a doua, peste masa de reacţie obţinută în etapa I, se adaugă
soluţia de fosfat diacid de sodiu ceea ce duce la precipitarea hidroxiapatitei.
Materialul compozit obţinut după mineralizarea gelului de colagen este amestecat cu
cantitatea adecvată de magnetită.
Materialele obţinute au fost caracterizate prin difractie de raze X, spectroscopie IR şi
microscopie electronică de baleiaj.
Difracţia de raze X confirmă prezenţa hidroxiapatitei şi a magnetitei prin picurile
caracteristice acestora: HA (2Theta = 25.90, 28.96, 31.79, 32.21, 32.92, 34.09, 39.82, 46.73 şi
49.53) şi magnetita (2Theta = 30.04, 35.43, 43.05, 56.94 şi 62.52).
Imaginile SEM au fost obţinute la măriri diferite rezultând ca la măriri moderate,
materialele prezintă o foarte bună omogenitate fiind foarte asemănătoare cu morfologia
materialelor compozite COL/HA iar la măriri relativ mari, datorită interacţiilor ce se dezvoltă
între colagen şi magnetită, în masa materialului compozit putându-se identifica cristale aciculare
(cilindrice).
Spectrul de absorbţie în infraroşu, înregistrat pentru compozitul COL/HA–Fe3O4
confirmă prezenţa benzilor caracteristice ale componenţilor.
Materialele compozite obţinute au fost analizate din punct de vedere al hipertermiei
produse observandu-se că odată cu creşterea cantităţii de magnetită creşte şi hipertermia produsă.
V. Concluzii asupra obtinerii si caracterizari materialelor compozite hibride ternare pe
baza de COL/HA/cisplatin.
Materialele compozite pe baza de COL/HA/ cisplatin sunt materiale multifunctionale
datorita compozitului COL/HA care faciliteaza regenerarea osoasa respectiv suport pentru
eliberarea controlata de medicamente datorita prezentei cisplatinului acesta având acţiune locală
de distrugere a celulelor canceroase viabile neextirpate în urma intervenţiei chirurgicale, gradul
de recurenţă fiind semnificativ redus şi toxicitatea sistemică asociată cu eliberarea cisplatinului
după implantare ar fi minimă..
Citostaticile sunt medicamente cu efect general asupra celulelor organismului,
eficacitatea lor bazându-se pe susceptibilitatea dintre celule maligne şi benigne. Cisplatinul
utilizat a fost caracterizat în prealabil prin UV-Vis si FTIR. Este deosebit de important de
menţionat faptul că benzile caracteristice cisplatinului nu se suprapun cu cele ale suportului,
spectrele putând fi utilizate în determinarea semi-cantitativă a conţinutului de cisplatin.
Materialele multifuncţionale au fost obţinute prin absorbţia cisplatinului pe matricile
compozite Col/HA; Materialele obţinute au fost uscate prin metoda uscării mixte, metodă care a
permis obţinerea unor materiale cu porozităţii diferite şi implicit procese de eliberare controlate
diferite, materialele poroase permiţând o eliberare mai rapidă a medicamentului;
Materialele au fost caracterizate prin spectrometrie de absorbţie în IR atât din punct de
vedere al materialului suport cât şi din punct de vedere al substanţei cu rol antitumoral cât şi prin
difracţie de raze X;
Morfologia materialelor COL/cisplatin realizate prin SEM este practic identică cu cea a
matricilor colagenice de la care s-a pornit, adsorbţia cisplatinului neavând nici o influenţă asupra
suportului colagenic. În cazul matricilor multifuncţionale compozite COL/HA-cisplatin
morfologia se modifică semnificativ faţă de matricile multifuncţionale COL/cisplatin datorită
depunerii unei cantităţi însemnate de fază minerală, raportul colagen:hidroxiapatită fiind de 1:4;
Au fost studiate de asemenea mecanismele de eliberare controlată a medicamentelor, care
să permită ca o anumită cantitate de medicament să fie eliberată într-o perioadă determinată de
timp, precum şi de cerinţele impuse polimerului pentru îndeplinirea funcţiei de transportor de
medicamente.
Studiile de eliberare au indicat faptul că, în toate cazurile de materiale multifuncţionale
COL/cisplatin şi respectiv COL/HA-cisplatin în decursul primei zile se eliberează ~ 78-85% din
conţinutul total de cisplatin, fiind mai avansată în cazul matricilor multifuncţionale
COL/cisplatin decât în cazul materialelor multifuncţionale compozite COL/HA/cisplatin,
probabil datorită unor interacţii mai puternice ce se dezvoltă între HA şi cisplatin.
În urma efectuări testelor de biocompatibilitate pe medii de cultură menţinute în contact
cu osteoblastele fetale si din osteosarcom se înregistrează o reducere a viabilităţi celulare,
densităţi şi morfologiei celulare în cazul ambelor linii celulare odată cu creşterea cantităţi de
cisplatin. Materialele multifuncţionale realizate inhibă activitatea MMP (metoloproteinazele
matriciale) împiedicând invazia tumorală şi metastazarea.
Din punct de vedere al potenţialelor aplicaţii, aceste materiale sunt promiţătoare atât ca
grefe cât şi ca suporturi pentru sistemele multifuncţionale cu eliberare controlată deoarece
metoda utilizată nu implică nici tehnologie foarte avansată şi nici investiţii foarte mari.
Diseminare rezultate
Articole ISI
1. Maria Ficai, Ecaterina Andronescu, Denisa Ficai , Georgeta Voicu, Anton Ficai., ”Synthesis
and characterization of COLL–PVA/HA hybrid materials with stratified morphology”,
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 81 (2010) 614–619. 2. Ecaterina Andronescu, Maria Ficai, Georgeta Voicu, Denisa Ficai,Maria Maganu, Anton
Ficai, “Synthesis and characterization of collagen/hydroxyapatite: magnetite composite
material for bone cancer treatment, Mater Sci: Mater Med (2010) 21:2237–2242
3. Maria FICAI, Ioan-Avram NEDELCU, Denisa FICAI, Bogdan Stefan VASILE, Anton FICAI, Ecaterina ANDRONESCU, The Influence of Ultrasonication on the Formation of
Albu, Anton Ficai, Compozite colagen/cochilie de molusca potentiale biomateriale pentru
substitutia osoasa, Revista Romana de Materiale 2010,40(4), 359-364. Articole BDI 1. Maria FICAI, Ecaterina ANDRONESCU, Anton FICAI, Georgeta VOICU, Bogdan Ştefan
VASILE, Poly BIS-GMA/HA based hybrid composite materials, U.P.B. Sci. Bull., Series B, Vol. 73, Iss. 1, 2011.
Bibliografie selectivă
1. Violeta S. Contributii la studiul materialelor hibride polimeric-anorganice. Romania: Universitatea din Bucuresti; 2008.
2. Laine RM. In Inorganic and Organometallic Polymers with Special Properties. NATO ASI Ser 1992:206.
3. Sugimoto T. In Fine Particles. Synthesis, Characterization and Mechanism of Growth. New York: Marcel Dekker; 2000.
4. Livage J. Sol-gel synthesis of solids In: King RB, editor. Encyclopedia of Inorganic Chemistry. John Wiley edition ed. New-York, 1994. p. 3836-3851
5. Watanabe T. In Photocatalytic Purification and Treatment of Water and Air. In: El-Akabi ebDOaH, editor. New York, 1993. p. 747.
6. Link M, Gebhardt M, Meyers P, editors. Osteosarcoma. 5th ed: Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, 2006.
7. Yuan X, Zhu X, Huang X, Sheng P, He A, Yang Z, et al. Interferon-α enhances sensitivity of human osteosarcoma U2OS cells to doxorubicin by p53-dependent apoptosis. Acta Pharmacologica Sinica 2007;28:1835-1842.
8. Decker S, Winkelmann W, Nies B, van Valen F. Cytotoxic effect of methotrexate and its solvent on osteosarcoma cells in vitro. J Bone Joint Surg 1999;81-B:545-551.
9. Jin-Chao Zhang X-YJ, Li-WeiWang, Lu-Wei Li, Jing Sun, and Ying Zhang. "Synthesis, Characterization, and Cytotoxicity of New Types of Binuclear Platinum(II) Complexes". Synthesis and Reactivity in Inorganic, Metal-Organic, and Nano-Metal Chemistry 2010;40(ISSN: 1553-3174 print / 1553-3182 online):879–882.
10. Chou A, Gorlick R. Chemotherapy resistance in osteosarcoma: current challenges and future directions. . Expert Rev Anticancer Ther 2006;6:1075-1085.
11. HONG SUN JM, YINGWU TANG, FUSHI ZHANG, GUOSHI WU. Hydroxyapatite coating on a polyamide implant. Journal Of Materials Science Letters 2002;21:901-902.
20. M T. Curring performances of experimental bis-GMA based binary monomer mixtures for dental visible-light-cured composite resin inlays. Materials Science Letters 1994;13:1229-1231.
21. Codruţa N. Aplicarea in stomatologie a unor biomateriale compozite autohtone cu caracteristici optice superioare Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca, 2003. p. 1.
22. KLEVERLAAN C. J. FAJ. Polymerization shrinkage and contraction stress of dental resin composites. Dent Mater 2005;21:1150-1157.
121. Brahler M, Georgieva R, Buske N, Muller A, Muller S, Pinkernelle J, et al. Magnetite-Loaded Carrier Erythrocytes as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. NANO LETTERS 2006;6(11):2505-2509.
122. Lin CY, Ho KC. Synthesis of superparamagnetic magnetite nanoparticles for thermoresponsive drug delivery. Nano Science and Technology Institute 2007;2:405 - 408.
123. Yang J, Lee H, Hyung W, Park S-B, Haam S. Magnetic PECA nanoparticles as drug carriers for targeted delivery : Synthesis and release characteristics. Journal of microencapsulation 2006;23(2):203-212.
124. Matsuoka F, Shinkai M, Honda H, Kubo T, Sugita T, Kobayashi T. Hyperthermia using magnetite cationic liposomes for hamster osteosarcoma. Biomagn Res Technol 2004;2(3).
125. Orentas R, Hodge JW, Johnson BD, editors. Cancer vaccines and tumor immunity: John Wiley & Sons, Inc., 2008.
126. Ficai A, Andronescu E, Ghitulica C, Voicu G, Trandafir V, Manzu D, et al. Collagen/hydroxyapatite interactions in composite biomaterials. Materiale Plastice 2009;46(1):11-15.
127. Li Y, Asadi A, Monroe MR, Douglas EP. pH effects on collagen fibrillogenesis in vitro: Electrostatic interactions and phosphate binding. Materials Science and Engineering: C 2009;29(5):1643-1649
128. Yan XL, Gemeinhart RA. Cisplatin delivery from poly(acrylic acid-co-methyl methacrylate) microparticles. Journal of Controlled Release 2005;106(1-2):198-208.
129. Ta HT, Dass CR, Dunstan DE. Injectable chitosan hydrogels for localised cancer therapy. Journal of Controlled Release 2008 Mar 20;126(3):205-216.
130. Andronescu E, Ficai M, Voicu G, Ficai D, Maganu M, Ficai A. Synthesis and characterization of collagen/hydroxyapatite:magnetite composite material for bone cancer treatment. Journal of Materials Science - Materials in Medicine 2010;21(7):2237-2242.
131. Zhao Z, Yang D, Ma X, Zhao H, Nie C, Si Z. Successful repair of a critical-sized bone defect in the rat femur with a newly developed external fixator. Tohoku J Exp Med 2009 Oct;219(2):115-120.
132. Approval Summary for cisplatin for Metastatic ovarian tumors. FDA Oncology Tools Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research 1978.
133. Fumarel R, Murgoi G, Albert P, Hurduc A, Pascu ML. Increase of cisplatin therapeutical index through optical irradiation: a case study of choroidal metastasis. Romanian Reports in Physics 2008;60(3):877-884.
134. Ito A, Shinkai M, Honda H, Kobayashi T. Medical application of functionalized magnetic nanoparticles. Journal of Bioscience and Bioengineering 2005 Jul;100(1):1-11.
135. Ficai A, Andronescu E, Trandafir V, Ghitulica C, Voicu G. Collagen/hydroxyapatite composite obtained by electric field orientation. Materials Letters 2010;64(4):541-544.
136. Ficai A, Andronescu E, Voicu G, Ghitulica C, Vasile BS, Ficai D, et al. Self assembled collagen/ hydroxyapatite composite materials. Chemical Engineering Journal 2010;160(2):794-800.
137. Earnshaw WC, Martins LM, Kaufmann SH. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annu Rev Biochem 1999;68:383-424.
138. Turk B. Targeting proteases: successes, failures and future prospects. Nat Rev Drug Discov 2006;5:785-799.
139. Fuentes-Prior P, Salvesen GS. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem J 2004;384:201-232.
140. Boatright KM, Salvesen GS. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol 2003;15:725-731.
