:

UNIVERSITATEA DIN BUCURETI

Facultatea de Biologie

TEZ DE DOCTORATCERCETRI ASUPRA UNOR PROCESE DE TRANSFORMARE A PROTEINELOR COLAGENICE SUB INFLUENA UNOR FACTORI XENOBIOTICI I REALIZAREA DE BIOMATERIALE MULTIFUNCIONALE.

REZUMAT

Conductor tiinificDr. Honoris Causa MARIA CALOIANU

Doctorand

Ing. SRBU EMILBUCURETI-2009-CUPRINS

Partea I

Stadiul actual privind scleroproteinele colagenice i realizarea de biomateriale

Introducere

Capitolul 1.

Caracteristicile i semnificatia proteinelor colagenice in sistemele viiI-VI

1.1. Caracteristici structurale i functionale1

1.2. Biosinteza colagenilor13

1.3. Asamblarea fibrilelor i fibrelor de colagen16

1.4. Biodegradarea colagenului i localizarea interactiilor20

1.5. Implicatiile colagenului in remodelarea i dezvoltarea tisulara27

1.5.1. Morfogeneza i regenerare tisulara27

1.5.2. Remodelare tisulara29

1.6. Discutii i concluzii31

Capitolul 2.

Materiale colagenice sursa biologica pentru realizarea de matrici naturale i biomateriale compozite cu valorificari multiple.

2.1. Aspecte generale34

2.2. Materiale colagenice38

2.2.1. Compozitia chimic a materialelor colagenice43

2.2.2. Structura componentilor colagenici din materialele colagenice45

2.2.3. Proprietatile materialelor colagenice47

2.3. Materiale compozite cu componenta colagenica47

2.4. Obtinerea de materiale compozite colagen parteneri necolagenici51

2.5. Discutii53

Partea II

Studii i experimentari de fundamentare a cresterii performantei de valorificare a materialelor colagenice in domeniile biomedical i protectia mediului

Capitolul 3

Strategia cercetarilor experimentale, materiale i metode

3.1. Concept experimental56

3.2. Materiale i metode58

3.3. Metode de analiza i caracterizare58

Capitolul 4.

Obtinerea, analiza i caracterizarea materialelor colagenice

4.1. Surse de materie prima de origine animala60

4.2. Procedee de obtinere a materialelor colagenice62

4.2.1. Principiile tehnologice de prelucrare a testurilor conjunctive62

4.2.2. Procedee de extractie a colagenului nativ i solubilizat.62

4.2.2.1 Extractia colagenului nativ (CN) (I-III) din derm bovin62

4.2.2.2. Extractia colagenului solubilizat (CS)65

4.2.2.3. Extractia colagenului nativ tip (I) din tendon bovin67

4.2.3 Purificarea67

4.2.4. Metode de conservare i sterilizare69

4.2.5. Rezultate i discutii69

4.3. Metode de analiza a materialelor colagenice70

4.3.1. Determinarea continutului de solide70

4.3.2. Determinarea continutului de substante minerale71

4.3.3. Determinarea continutului de azot71

4.3.4. Determinarea gradului de transformare a functiilor aminice71

4.3.5. Dozarea proteinelor prin metoda biuretului77

4.3.6. Determinarea vascozitatii72

4.3.7. Determinarea turbiditatii solutiei72

4.4. Caracterizarea chimica a materialelor colagenice75

4.5. Concluzii82

Capitolul 5

Proprietati ale materialelor colagenice potentiale indicatoare ale calitatii i posibilitatii de utilizare a matricelor membranare (CN), (CS)

5.1. Aspecte generale84

5.2. Caracteristici morfostructurale ale matricelor colagenice membranare84

5.2.1. Caracteristici structurale92

5.2.2. Obtinerea i caracterizarea morfostructurala a matricelor colagenice membranare

5.2.2.1Materiale i metode98

92

5.2.2.2 Rezultate94

5.3. Proprietati biomecanice ale matricelor colagenice i comportarea lor la solicitari mecanice 96

5.3.1. Aspecte generale96

5.3.2. Comportarea membranelor colagenice (CN) i (CS) la solicitari mecanice

5.3.3. Comportarea reologic a matricei colagenice la solicitri mecanice98

99

5.4. Proprietati termice i comportamentul matricelor colagenice membranare la variatii de temperatura102

5.4.1. Termostabilitatea102

5.4.2. Transformari fizico-chimice ale fibrelor de colagen sub influenta temperaturii113

5.4.2.1. Modele experimentale113

5.4.2.2. Rezultate i discutii104

5.5. Studii i experimentari privind proprietatile electrice ale materialelor colagenice sub forma de matrici membranare109

5.5.1. Aspecte generale109

5.5.2. Polarizarea electrica a colagenului111

5.5.3. Piezoelectricitate114

5.6. Materiale colagenice i influenta apei din sistem116

5.6.1. Conformatia moleculei de colagen i apa116

5.6.2. Ansamblurile triplu helicale i hidratarea118

5.6.3. Comportamentul materialelor colagenice in apa pura120

5.7. Discutii i concluzii121

Capitolul 6.

Comportamentul matricelor de colagen nativ (CN) tip (I, I III) i modificat chimic la actiunea unor factori nocivi de mediu123

6.1. Obiective experimentale124

6.2. Materiale i metode de caracterizare 125

6.2.1. Materiale utilizate125

6.2.2. Realizare a tipurilor de membrane de colagen nativ i modificat chimic125

6.2.3. Metode experimentale de analiza i caracterizare126

6.2.3.1. Realizarea atmosferei denaturante126

6.2.3.2. Expunerea membranelor de colagen la actiunea mediilor denaturante127

6.2.4. Metode de caracterizare a filmelor colagenice degradate127

6.2.4.1. Capacitatea de absorbtie a apei127

6.2.4.2. Capacitatea de absorbtie a vaporilor de apa127

6.2.4.3. Temperatura de contractie a filmelor128

6.2.4.4. Rezistenta la solicitari mecanice128

6.3. Rezultate128

6.3.1. Evaluarea comportarii matricelor de colagen nativ expus la denaturanti acido-bazici (HCl i NH3)128

6.3.1.1. Variatia proprietatilor fizico-chimice128

6.3.1.2. Proprietatile de absorbtie a apei i ale filmelor degradate cu HCl i NH3131

6.3.1.3. Absorbtia vaporilor de apa a filmelor de colagen expuse la medii HCl i NH3132

6.3.1.4. Reactia matricelor la medii acide i bazice in functie de tipul de colagen tip (CN) i tip (CS I-III)134

6.4. Studiul actiunii unor agenti nocivi in stare de vapori asupra membranelor de colagen modificat prin reticulare cu aldehida glutarica i dehidrotermic 135

6.4.1. Variatia capacitatii de absorbtie a apei a filmelor (membranelor) de colagen reticulat expuse actiunii mediilor acide 136

6.4.2. Proprietatile de absorbtie a apei a matricelor colagenice reticulate expuse la medii cu vapori NH3137

6.4.3. Efectul actiunii vaporilor de acid azotic HNO3 asupra matricei colagenice140

6.4.4. Capacitatea de absorbtie a apei de catre matricele colagenice expuse la mediu cu substante chimice organice (acid acetic, acid formic, metilamina)141

6.5. Comportamentul membranelor de colagen nereticulat i reticulat la actiunea enzimelor142

6.5.1. Materiale i metode142

6.5.2. Actiunea tripsinei asupra membranelor cu colagen nedenaturat i reticulat cu HCl i NH3144

6.5.3. Actiunea tripsinei asupra filmelor de colagen expuse la actiunea HNO3, CHOOH, CH3-NH2146

6.6. Influenta temperaturii de contractie asupra membranelor de colagen tip I i I-III expuse la actiunea factorilor nocivi147

6.6.1. Materiale i metode147

6.6.2. Date experimentale148

6.7. Semnificatia modificarii chimice a colagenului cu cloruri acide asupra comportarii filmelor la medii denaturante151

6.7.1. Metodologia experimentala151

6.7.1.1. Modificarea materialelor colagenice i obtinerea membranelor151

6.7.1.2. Metode de analiza i caracterizare a variantelor experimentale152

6.7.2. Rezultatele privind reactivitatea colagenului modificat chimic cu cloruri acide la actiunea agentilor nocivi acido-bazici152

6.7.3. Discutii i concluzii155

6.8. Concluzii155

Capitolul 7.

Studii i experimentari privind realizarea de biosenzori performanti prin valorificarea sensibilitatii matricei colagenice la factori nocivi de mediu158

7.1. Aspecte generale158

7.2. Obtinerea senzorului de detectare performanta a factorilor denaturanti159

7.2.1. Strategia experimental159

7.2.2. Metode i tehnologii de realizare a membranelor senzoriale160

7.2.2.1. Procedee de preparare a tipurilor de membrane/pelicule160

7.2.2.2. Optimizarea tehnologiei de obtinere a peliculelor/membranelor senzoriale 163

7.2.2.3. Obtinerea de senzor sub forma de gel165

7.2.2.3.1. Reteta i tehnologia de obtinere165

7.2.2.4. Obtinerea de biosenzor sub forma de granule 167

7.3. Testarea calitatii de senzor167

7.3.1. Matricea experimentala167

7.3.2. Influenta factorilor degradanti asupra tipurilor de senzor168

7.3.2.1. senzor colagenic membranar cu raporturi variabile de fuxina i CuSO4168

7.3.2.2. Senzor din colagen reticulat cu aldehida glutarica i combinat in raporturi variabile de PFDA169

7.3.2.3. Membrana biocompozita (COL CMC) asociata cu raporturi variabile de fuxina i CuSO4170

7.3.2.4. Membrana biocompozit (COL SAM) cu adaos de saruri173

7.3.3. Actiunea HIO3 asupra senzorului colagenic tip gel174

7.3.4. Actiunea detergentilor asupra membranelor de colagen175

7.3.5. Actiunea combinata a detergentului cu apa oxigenata 176

7.3.6. Influenta apei asupra senzorului colagenic177

7.4. Rezultate privind viteza de raspuns a matricelor senzoriale la actiunea factorilor denaturanti177

7.5. Selectarea calitatii de functionare a matricei senzoriale in functie de potentiali utilizatori181

7.5.1. Domenii de utilizare181

7.6. Mod de utilizare a biosenzorilor183

7.6.1. Principiul de functionare a prototipului aparatului de dozare a efectului reactiei la medii degradante a biosenzorilor sub forma de membrane183

7.6.2. Cresterea performantei biosenzorului pe baza denaturarii structurale a colagenului la actiunea factorului nociv185

7.7. Interpretarea datelor i analiza critica a solutiilor propuse pentru performanta biosenzorului fata de factori degradanti186

7.8. Concluzii190

Capitolul 8.

Potentiale aplicatii biomedicale ale materialelor colagenice membranare (tip I i I-III) naturale i composite192

8.1. Aspecte generale192

8.2. Matrice experimentala193

8.3. Obtinerea i caracterizarea membranelor biocompatibile pe baza de colagen nativ tip (I), (I III) i biocompozite (COL CMC), (COL SAM)193

8.3.1. Obtinerea i specificatia tehnica193

8.3.2. Metode de evaluare suplimentara a calitatii membranelor196

8.3.2.1. Caracterizarea structurala prin spectroscopie IR i FT I-R197

8.3.2.2. Caracterizarea membranelor/filmelor biocompozite (COL SAM) obtinute din diferite proportii de combinare a componentelor (colagen, SAM, glicerina)199

8.3.2.2.1. Permeabilitatea la aer199

8.3.2.2.2. Rezistenta la rupere i alungire la rupere a membranelor200

8.3.2.2.3. Permeabilitatea la vapori de apa202

8.3.2.2.4. Capacitatea de umflare a membranelor in apa203

8.3.2.2.5. Variatia morfostructurii membranelor functie de componenti204

8.4. Testarea viabilitatii i dezvoltarii celulare in vitro in prezenta de membrane colagenice folosite ca substrat/suport206

8.4.1. Tipuri celulare, modele experimentale i metode de analiza i caracterizare206

8.4.2. Modele experimentale de culturi celulare in vitro 207

8.4.3. Metode de analiza i caracterizare a evolutiei celulare in vitro208

8.4.4. Obtinerea i selectarea tipurilor de membrane utilizate ca substrat/suport pentru culturi celulare in vitro210

8.4.4.1. Materiale folosite210

8.4.4.2. Prepararea membranelor211

8.4.5. Testarea i evaluarea evolutiei in vitro a celulelor fibroblast like i epiteliale culturate in medii cu membrane de colagen nativ I i I-III i biocompozite COL CMC, COL SAM) folosite ca substrat stimulator214

8.4.5.1. Comportamentul celulelor fibroblast like in vitro in prezenta de membrane suport de colagen (CN) i (CS) tip(I) i (I-III)2214

8.4.5.2. Comportamentul fibroblastelor, in raport cu membrana de colagen reticulat cu aldehida glutarica220

8.4.5.3. Comportamentul fibroblastelor in interrelatie cu suporturi biocompozite (COL CMC), (COL SAM)220

8.4.5.4. Evolutia celulelor epiteliale in raport cu tipurile de suporturi colagenice, prezente in mediul de cultur in vitro224

8.4.5.5. Discutii226

8.4.5.6. Concluzii231

CONCLUZII GENERALE

233

BIBLIOGRAFIE204236

IntroducereProgresele nscrise n domeniul cunoaterii obinerii i valorificrii de substane extrase din variate surse de natur biologic, includ cu prioritate familia colagenilor, scleroproteine cu 21 de tipuri de exprimare structural i funcional n ansamblul interrelaiilor celul-matricea extracelular a tesuturilor conjunctive din organismul animal.

Gama larg de bioproduse, biomateriale i aplicaii stimuleaz aprofundarea cercetrilor pentru creterea inovrii i a performanei n tehnologiile de extracie cu conservarea proprietilor native, proiectarea i procesarea de extracte cunoscute ca materiale colagenice, n formule simple sau asociate cu ali componeni naturali sau sintetici, n funcie de destinaia acestora. Fa de aceste provocri , noi ne-am propus ca pe baza cunotinelor actuale i a investigaiilor proprii s contribuim la aprofundarea proprietilor i creterea performanei colagenilor extrai, a comportamentului i a efectelor unor interacii cu sisteme vii i a unor factori nocivi de mediu, respectiv evaluarea unor noi posibilitai de valorificare .

Problemele legate de obinerea i calitile materialelor colagenice de a interaciona cu sisteme vii i inerte n special nocive au fost analizate din urmtoarele perspective:

Sursele biologice de materie prim colagenic i procedeele de extracie a tipurilor de colagen, rentabile prin calitate si cantitate. Proprietile materialelor colagenice conservate prin prelucrare i modelare n formule de bioproduse/biomateriale noi sau performante. Fenomenologia biotransformrii colagenilor i procesarea de: matrici naturale membranare biocompatibile desemnate ca suport substrat pentru dezvoltarea celular in vitro i realizarea de modele funcionale in vitro cu aplicaii n ingineria celular i tisular; testarea biocompatibilitii pentru produi noi destinai uzului uman. matrici naturale reactive la factori denaturani din mediul ambiant (aer, ap, sol) i utilizabile ca markeri senzoriali rapizi de identificare i monitorizare a acestora i n incinte speciale sau condiii cotidiene, n mediul nconjurtor.

Teza de doctorat cu titlul: Cercetri privind realizarea de matrici naturale multifuncionale n raport cu sisteme vii i factori de de mediu degradani este structurat n dou pri cu 8 capitole.PARTEA I Stadiul actual privind scleroproteinele colagenice; realizarea de biomateriale

Capitolul 1. Caracteristicile i semnificaiile proteinelor colagenice n sistemele vii

Reprezint o selecie a cunotinelor asupra familiei colagenilor, component major a matricei extracelulare a esutului conjunctiv caracteristic regnului animal. Se face o trecere n revist a celor mai reprezentative opinii tiinifice asupra structurii i aplicaiilor colagenului n: dezvoltarea i meninerea morfostazei organismului, n procesele de regenerare; remodelare i refacere tisular; n cinetica proceselor de baz; n interrelaiile matrice extracelular-celule cu efecte generale asupra organismului att pozitive ct i negative (traumatisme, patologii).

Este subliniat aportul mijloacelor performante de investigare i modelare computerizat asupra organizrii moleculare i importana transformrilor modulare care deschid noi ci de ntelegere a biotransformrii in situ i in vitro i a posibilitilor de valorificare cu int precis a bioproduselor extrase.

Capitolul 2. Materiale colagenice-surs biologic complex pentru realizarea de matrici naturale i biomateriale compozite cu valorificri multiple se refer la colagenele ex vivo valorificate sub forme variate de biomateriale.

Considerarea colagenilor extrai ca materiale colagenice aduce, n literatura de specialitate problemele legate n primul rnd de sursa biologic, reprezentat de organisme animale, care s asigure accesibilitatea, calitatea, cantitatea, rentabilitatea i uurina prelucrrii prin tehnologii nepoluante, necostisitoare. Se continua cu problema variabilitatii biologice a surselor care induce variaia procedeelor de prelucrare de la o schem general principial adoptat de specialiti la provocarea de a realiza procedee inovante sau noi de obinere a colagenului exogen cu caliti structurale i funcionale similare celui nativ. Proprietile materialelor colagenice fiind decisive pentru domeniul de aplicaie sunt luate ca baz a sintezei datelor vizand compozitia, structura, capacitile colagenului de cuplare cu ali parteneri naturali i sintetici n formule de biocompozite, a direciilor i specificului de aplicare a biomaterialelor cu component colagenic.

Se subliniaz de asemenea necesitile i perspectivele viitoare de folosire a colagenului pe noi trepte i generaii de biomateriale multifuncionale.

Rezultatele personale i sinteza cercetrilor experimentale sunt cuprinse n capitolele urmtoare.PARTEA a II-a Studii si experimentri de fundamentare a creterii performanei de valorificare a materialelor colagenice n domeniile biomedical i protecia mediuluiCapitolul 3Strategia cercetrilor experimentale, materiale i metode cuprinde scopul i obiectivele cercetrilor. Prin corelarea informaiilor furnizate de literatura de specialitate i disponibilitile experimentale s-a fcut opiunea de aprofundare a studiilor i investigaiilor asupra colagenului extras tip nativ CN (I) i a celui solubilizat CS(I-III) cu perspective de: obinere de tehnologii reconsiderate prin prisma noiunii de perfoman. evaluarea caracteristicilor i comportamentului complex al acestora n funcie de condiiile specifice de funcionare ex vivoi respectiv de rspuns interactiv cu sisteme vii sau reactiv la factorii nocivi din mediul nconjurtor.

realizarea pe aceast baz a unor biomateriale funcionale structurate ca matrici naturale biocompatibile cu aplicaii n medicina reconstructiv n ingineria celular, tisular, respectiv ca membrane/matrici senzoriale cu capacitate de reacie rapida la factori cu efect denaturant.

n continuare se descriu materiale, tehnici i metode utilizate n cercetare i modele experimentale adoptate. Procedee specifice unor aprofundri sunt prezentate la capitolele respective.

Capitolul 4. Surse biologice obinerea i caracterizarea materialelor colagenice este consacrat procedeelor utilizate pentru obinerea colagenului exogen pornind de la analiza i selectarea sursei biologice de materie prim i tipul de colagen urmrit.

Se prezint sintetic pe fluxuri tehnologice fazele de extracie i adaptrile considerate utile creterii performanelor n funcie de factorii utilizai (pH, trie ionic, acizi, baze, enzime). De asemenea metodele i tehnicile analitice selectate i utilizate pentru caracterizarea compoziiei chimice i a parametrilor de calitate a materialelor colagenice obinute (substan uscat, azot, substane grase, solubilitate, vscozitate, etc.) comparativ la dou tipuri de colagen (CN) tip (I) i (CS) tip (I-III) alese ca obiective de studiu. Rezultatele evideniaz calitatea extractelor i necesitatea furnizrii datelor specifice fiecrui tip de material colagenic extras.

Capitolul 5. Proprieti ale materialelor colagenice-poteniale indicatoare ale calitii i utilizrii matricelor membranare (CN tip I) i (CS tip I-III) prezint studiile i rezultatele cercetrilor proprii viznd evidenierea unor proprieti ale materialelor colagenice obinute prin metode specifice (compoziie chimic, caracteristici morfostructurale, interaciuni intermoleculare cu apa structural i din soluie, fa de care manifest hidrofilie, caracter ionic variabil, funcionalitate divers , compatibilitate de cuplare n sisteme cu componente micro sau macromoleculare).

Se aprofundeaz proprietile celor dou tipuri de proteine colagenice extrase n stare uscat sub form de membrane (matrici, folii, filme) prin prisma aciunii unor factori i se demonstreaz proprieti: biomecanice, elasticitate i rezinten superioar la solicitarea static i dinamic, termostabilitate, proprieti electrice i electrocinetice, conducie electric i piezoelectricitate activ pn la -20C.

Se apreciaz c prin luarea n considerare a acestor indicatori de proprietate membranele colagenice tip I i tip I-III se constituie ca bioproduse difereniate pentru noi valorificri n diverse arii de activitate practic.

Capitolul 6. Date experimentale privind comportamentul matricelor colagenice (CN I) i (CS I-III) nedenaturate i modificate chimic la aciunea agenilor denaturani acido-bazici este consacrat investigrii modului diferentiat n care cele dou tipuri de materiale colagenice (n forme solide, membranare naturale i modificate chimic) reacioneaz la soluii i medii gazoase ce conin vapori de acizi sau baze anorganice i organice. Efectele s-au urmrit prin: evaluarea structurii proprietilor fizico-mecanice, absorbtive, a vitezei de degradare, a termostabilitii i contraciei membranelor; natura, durata i concentraia de agent denaturant contactat pe serii paralele de experimentare.

Se evidentiaz comparativ influenta factorilor nocivi asupra membranelor cu colagen nativ tip I i I-III i a membranelor de colagen modificat chimic prin reticulare cu compui micromoleculari, cu cloruri acide i prin aciune dehidrotermic.

Rezultatele obinute ilustreaz mecanisme de reacie ce intervin n procesul denaturrii acido-bazice cu modificri ale resturilor de aminoacizi i scindarea catenelor polipeptidice care variaz ca efect n funcie de natura colagenului , de concentraia factorului denaturant, pH, temperatura i durata de interaciune.

Ilustreaz de asemenea ci noi de nelegere a fenomenelor interactive a sistemelor vii cu factori nocivi de mediu i a valorificriii efectelor pentru realizarea de biomateriale senzoriale noi sau performante.

Capitolul 7.Studii i experimentri de valorificare a sensibilitii materialelor colagenice sub forme de membrane senzoriale fa de ageni de mediu denaturani prezint rezultatele i analiza comparativ a variantelor experimentale care definesc variaiile mecanismelor de reacie la factori nocivi i permit elaborarea de procedee/tehnologii de obinere a matricelor colagenice capabile s interacioneze cu mediile poluante (acido bazice i oxidante). Studiul denaturrii prin spectroscopie IR i microscopie electronic evidentiaz semnificaia factorilor implicai in generarea morfologiei solide colagenice i a interaciunilor cu factorul nociv. Se testeaz i se confirm performane ale materialelor senzoriale obinute i mijloacele de preluare a informaiei cu ajutorul unor dispozitive (opto-electronice) i de prelucrare computerizat. Se obine i se analizeaz de asemenea matrici naturale, pe baz de materiale compozite cu component colagenic asociat cu polimeri naturali i sintetici in sistem energetic metastabil. Se evalueaz potenialii utilizatori.

Capitolul 8.Biomateriale peliculogene pe baz de colagen cu poteniale valorificri biomedicale cuprinde date analitice asupra variantelor de membrane cu colagen nativ tip (I) i (I-III) i membrane compozite (COL-CMC) i (COL-SAM) obinute i caracterizate conform specificaiei din Farmacopeea Romniei IX i X. Sunt evideniate elemente noi de evaluare a calitaii membranelor prin performana structural, rezisten la rupere i alungire, umflarea membranelor n ap, biocompatibilitate, respectiv sistemul de combinare i procesare a componentelor.

Prin experiene mono i multifactoriale pe serii de culturi celulare cu utilizarea suporturilor membranare se demonstreaz evoluia i interrelaiile benefice dezvoltrii celulare. Datele se constituie ca o contribuie util pentru ingineria celular i tisular, pentru realizarea de modele funcionale in vitropentru testarea rapid a biocompatibilitii unor substane i produse noi, precum i pentru aprofundarea unor mecanisme celulare i moleculare normale sau patologice.Lucrarea se ncheie cu un capitol de Concluzii generale, list selectiv a citatelor bibliografice folosite la elaborarea tezei i lista datelor valorificate prin publicaii.O parte din rezultatele obinute n cadrul tezei s-au valorificat sub form de publicaii: o carte de specialitate, trei cereri de brevete de invenie n curs de analiz la OSIM, 11 lucrri n reviste de specialitate si volume ale unor simpozioane i conferine naionale i internaionale.

Teza de doctorat se ntinde pe 257 pagini, incluznd: 169 figuri, 56 tabele, 10 plane, 365 citate bibliografice.PARTEA a II-a

Capitolul 3.Strategia lucrrilor experimentale, materiale i metode

Strategia cercetrii

Cercetrile privind evoluia proteinelor modulare, structura tridimensional a domeniilor, definirea de multidomenii de structur, compuse din unitile modulare i cile de interacie reflect ncercrile de noi aprecieri a structurii i funcionalitii acestora. Pentru majoritatea domeniilor ns, funciile lor sunt nc puin cunoscute i predicii funcionale sunt dificil de fcut.

Matricea extracelular a esuturilor conjunctive apare n acest context una dintre cele mai complexe sisteme biologice prin proteinele sale modulare i n special prin scleroproteinele colagenice. Paralel cu aceast situaie principiile noi care au cucerit ingineria materialelor include faptul c obinerea bioproduselor cu pstrarea calitilor funcionale sau cu denaturarea colagenului se constituie ca o problem teoretic ce pune n discuie starea energetic a asociatului moleculartriplu helix i ansamblul de factori care pot imprima caracterul reversibil sau ireversibil al acestuia cu consecine imprevizibile pentru utilizarea practic.innd seama de acest context general precum i de posibilitile noastre concrete de dezvoltare a cercetrilor n cadrul tezei de doctorat s-a optat pentru dou obiective principale:1. Aprofundarea cunotinelor asupra colagenilor, a surselor biologice in extracie avantajoas ca domeniu de referint: evaluarea caracteristicilor i comportamentului complex al materialelor colagenice n funcie de condiiile specifice de funcionare ex vivo i respectiv de rspuns reactiv la factori degradani.

2. Modelarea i creterea performanelor procedeelor utilizate pentru:

- obinerea de materiale colagenice cu caliti specifice corespunztor tipului de colagen i a condiiilor de procesare tehnologic.- evaluarea i corelarea proprietilor materialelor colagenice fa de colagenul in situpentru realizarea de biomateriale multifuncionale i lrgirea posibilitilor de aplicaie practic n domeniile medicinii reconstructive n special ingineria celular i proteciei mediului nconjurtor.

Prin dezvoltarea de cercetri fundamentale i de dezvoltare-inovare n cadrul acestor dou obiective s-a avut n vedere obinerea de contribuii la: lrgirea gradului de utilizare a resurselor biologice de origine animal; inovarea sau creterea performanelor procedeelor i tehnologiilor de extracie, procesarea i obinerea de materiale colagenice simple sau compozite cu aplicaii multiple n funcie de tipul de colagen i procedeele de extracie folosite.Materiale i metode

Pentru obinerea datelor de fundamentare stiinific a demersurilor etapizate s-au definit urmtoarele obiective concrete:

- Obtinerea i folosirea de colageni nativi tip (I) i (I-III) (CN) i colageni solubili (CS) mai puin studiai ca materiale de referin pentru cercetrile experimentale i prin modelarea procedeelor de prelucrare, realizarea unui domeniu larg al indicatorilor structurali i compoziionali cu efecte proiective variabile i favorabile diversificrii produilor finali.

- Definirea valorilor indicatorilor fizico-chimici i funcionali care individualizeaz materialele colagenice fa de alte materiale biocompatibile.

- Folosirea de parteneri necolagenici (polisaharide, polimeri sintetici i reactivi chimici), pe parcursul experimentelor ca modificatori chimici, ageni de alcalinizare i acidulare, factori de asociere etc., provenii de la diverse firme cu acceptarea caracteristicilor precizate de furnizori i subordonate tipului de cercetare analitic de caracterizare.

Metode de analiz i caracterizare:

Metodele de analiz i caracterizare selectate au vizat caracterizarea preliminar general a probelor ce conin colagene (substan uscat, azot, substane grase, solubilitate, densitate, etc.) analizele fiind difereniate n funcie de tipul de material colagenic i de destinaia de utilizare. Analiza extractelor de colagen nativ obinute i modificate cu denaturare termic sau chimic prin cromatografie de cernere molecular, de schimb ionic HPLC, vscozimetrie, determinarea greutii moleculare, analiza termic (DSC). Din gama metodelor UV, IR i IR-FTIR i a altor tehnici analitice s-au selectat i grupat cele optime pentru furnizarea unor date specifice interpretabile pentru fiecare tip de material colagenic i biocompozit obinut. Evidenierea i interpretarea funcionalitii biomaterialelor colagenice sau compozite cu component colagenic s-au realizat cu folosirea de metode specifice (microscopie optic, contrast de faz, microscopie electronic (TEM i SEM), sisteme de culturi celulare in vitro etc.). Folosirea de modele funcionale mono, bi i multifuncionale, sisteme de culturi celulare in vitro etc. s-au folosit n funcie de necesitatea evalurii standardelor i posibilitatilor de valorificare a materialelor colagenice i biocompozite ca suporturi stimulatoare pentru dezvoltarea celular n ingineria celular, respectiv de materiale senzoriale fa de factori degradani. Evaluarea interaciei sistemelor vii cu factori nocivi s-a realizat prin efectuarea de experimentri pe modele funcionale bazate pe folosirea de matrici bioartificiale pe baz de colagen cu caliti funcionale i capacitate de reacie rapid la factori de mediu poluani (acid clorhidric raspndit i folosit n tehnologii de extracie a colagenilor, acid formic, acid acetic, amoniac, metilamin, ap oxigenat, detergeni, etc.).

S-a avut n vedere ca senzorii realizai i destinai dozrii i monitorizrii poluanilor din aer i ap s reprezinte valorificarea sensibilitaii i denaturrii suferite de materialul colagenic la contactul direct cu mediul nociv. Tipurile de colagen nativ i solubilizat manifest o reactivitate puternic fa de numeroase combinaii chimice poluante iar transformrile structurale produse pot fi convertite avantajos n semnale preluate de dispozitive senzoriale.

Rezultatele scontate au fost de aprofundare a unor mecanisme specifice i de definire a posibilitilor de valorificare prin realizarea de: Membrane / folii biocompatibile cu utilizri biomedicale; Pelicule/suport pentru ingineria celular i tisular in vitro; testarea bicompatibilitii in vitro a unor substane i produse destinate uzului uman; Matrici senzoriale reactive la factori degradani de mediu necesare pentru identificare i monitorizare de noxe din zone cu activiti specifice n vederea proteciei organismelor.

Prezentarea rezultatelor obinute prin strategiile experimentale stabilite i evidenierea aspectelor noi brevetabile sau inovante, respectiv calitile i aplicaiile practice evaluate pentru domeniile biomedical i bioingineresc constituie coninutul urmatoarelor capitole cuprinse n lucrare.

Capitolul 4Obinerea, analiza i caracterizarea materialelor colagenice.

n derularea etapelor de obinere a materialelor colagenice tip (I) i (I-III), s-a luat n considerare sursa biologic avantajoas economic (tendon i piele de bovin) i tehnici neconventionale de procesare i obinere a urmtoarelor variante de materiale colagenice ca baz de experimentare:

- Colagen nativ (CN) tip (I-III) din piele de bovine, extras cu respectarea coordonatelor generale (Col 1999) descrise anterior cu unele elemente de cretere a performanei.

- Colagen nativ (CN) tip (I) din tendoane de bovine (Negroiu, Moldovan RO96291; Caloianu, Iordchel, Bucevschi, Brevet 114560B1).

- Colagen solubil (CS) tip (I-III) extras prin aplicarea procedeului clasic i enzimatic.

- Colagen hipoimunogenic (I-III) (atelocolagen) din piele de suine a fost realizat n cadrul colaborrii la Universitatea Politehnic Gh. Asachi Iai.

n funcie de aprecierea domeniului de utilizare, s-a optat pentru o serie de variabile n derularea fluxurilor tehnologice general descrise, la toate tipurile de materiale colagenice.

Aceste materiale colagenice au fost folosite n variante per se i respectiv modificate chimic sau asociate in sisteme compozite cu ali polimeri naturali i sintetici, cu respectarea compatibilitii i pstrrii calitilor funcionale ale biopolimerilor colagenici.

Rezultatele obinute consemneaz faptul c cele mai importante aspecte legate de obinerea materialelor colagenice sunt:

Proprietile lor fizico-chimice i corelarea strict cu destinaia, respectiv cu tipul de aplicaie preconizat.

Valorile proprietilor fizico-chimice nu sunt unice acestea avnd o toleran de 15% fa de medie, datorit variaiilor tipului de esut i calitii materiei prime (specie, vrst, etc.). Deci necesit atenie deosebit i testare difereniat.

Ca urmare problema optimizrii procedeelor de obinere a materialelor colagenice trebuie analizat prin prisma obiectivelor alese i anume:

sursa biologic cu caracteristici fizico-chimice variabile i optimizarea parametrilor tehnologici de obinere a unui material considerat etalon.produse cu caracteristici fizico-chimice impuse i optimizarea tehnologiei de obinere din punct de vedere al creterii randamentului de transformare i reducere a consumurilor specifice de chimicale, energie, etc.

Pentru analiza comparativ a variantelor fluxului tehnologic de extracie s-au folosit ca parametri: sursa biologic, pH-ul, tria ionic, utilizarea de acizi i baze, enzime, in funcie de tipul de colagen urmrit. Analiza i caracterizarea general a probelor s-au bazat pe: determinarea substanei uscate, azotului, proteinelor, substanelor minerale, solubilitii, vscozitii cu metode difereniate n funcie de tipul i destinaia materialului colagenic (colagen nativ, colagen solubil, colagen fibrilar).Rezultatele evideniaz pe lng parametrii general acceptai, o stare compoziional, conformaional i funcional stabil a materialelor colagenice tip nativ (CN) i solubilizat (CS). ntre cele dou grupe nu se constat deosebiri majore iar conformaia n soluie se consider cristalin. pH-ul este variabil n funcie de procedeul de extracie dar i de raportul ntre gruprile funcionale ale catenelor laterale ale aminoacizilor. Ca puritate se ajunge la circa 93-98% protein, iar alte asocieri de fracii proteice provin din specii necolagenice i se situeaz sub 14-12% fapt care asigur reducerea antigenicitii (CA). Domeniul de mas molecular medie variaz la colagen nativ (CN) 400.000-500.000, colagen solubil (CS) acid 250.000-300.000, colagen solubil (CS) neutru 290.000-340.000. Aceste caracteristici reprezint baza de la care s-a trecut la evaluarea procesrii de biomateriale n sisteme variabile condiionate sub form de matrici membranare, geluri, granule i experimentarea acestora n funcie de factorii i scopul urmrit.

Capitolul 5 Proprieti ale materialelor colagenice-poteniale indicatoare ale calitii i posibilitai de valorificare a matricelor colagenice membranareDatorit diversitii tipurilor de colagen existente n organismul animal i a procedeelor de extracie, materialele colagenice exprim structuri i relaii funcionale variabile. De aceea definirea general de colagen spre valorificare necesit aprofundri specifice. Referindu-ne la tipurile de colagen (I) i (I-III) extrase n variantele de colagen nativ (CN) i solubilizat (CS) s-a urmrit stabilirea prin experimentare a unor caliti mai puin investigate dar definitorii pentru lrgirea valorificrii per se a acestora.

Aspecte considerate importatnte pe baza experimentrilor sunt urmtoarele:

Caracteristici morfostructurale ale matricelor colagenice

Membranele obinute n variante (CN) i (CS) prezint o serie de caracteristici generale (transparen, opacitate, flexibilitate, adezivitate dar i diferenieri structurale evideniate prin microscopie electronic (fibrili colagenici, fibre cu structur periodic la colagen nativ, mai omogen la colagen solubil) datorit organizrii structurale cuaternare i teriare a colagenelor extrase.Compararea aspectelor ultrastructural (tripla elice 3(Gliy-Pro-Hyp)12) s-a fcut cu cea dat de modelarea molecular computerizat dezvoltat pe modelul ERRC i aprofundrile de nivel molecular (exemplu secvenele lanurilor tip (I) din tendon bovin (Brown and all 1997). Acestea definesc segmente cu diferite caracteristici ce ofer posibiliti noi de prelucrare i adiionare de substane ce vor spori valoarea i domeniul de aplicaie practic. n ce privete colagenul solubilizat (CS) care reprezint un amestec de forme asociate aproximativ similare atelocolagenului i configuraii ramificate se poate considera conform opiniei majoritare de orientare macromolecular, c (CS) poate fi ncadrat la categoria polimerilor cristalini chiar dac exist o proporie de faz amorf.

Aceste aprecieri asupra structurii colagenelor extrase au fost luate ca baz a aprecierilor funcionale urmrite n continuare n cercetrile noastre experimentale.

Proprieti biomecanice ale matricelor colagenice i comportarea lor la solicitri mecanice

Datele de referin la solicitri mecanice obinute funcie de caracteristicile membranelor realizate din surse i procedee de extracie a materialelor colagenice au evideniat importana aprofundrii difereniate a produilor finali urmrii pe baza celor trei componente esniale de deformaie i anume: elastic, vscos, plastic.Comportarea membranelor (CN) comparativ cu starea umed au prezentat rezisten la solicitarea static i dinamic datorit colagenului cu structur cristalin i a meninut constant valoarea modulului de elasticitate E=/y pe tot intervalul de deformabilitate.

Membranele (CS) au prezentat proprieti variabile influenate de structura i sursa materialului colagenic.

n ambele variante experimentale raportul sarcin/deformare dei diferit a exprimat o maleabilitate iniial fr deformare i orientarea fibrelor de colagen n direcia efortului, urmat de deformarea fibrilelor i a structurii membranelor (legea lui Hooke), iar comportamentul la traciune a corespuns fenomenologiei consemnate la majoritatea polimerilor naturali i sintetici (Tager).

n raport cu aceste proprieti asigurate de calitatea materialelor colagenice, variabilitatea comportamentului este determinat de diversitatea tipurilor de solicitri mecanice i necesit analize specifice pentru domeniul de utilizare.

Proprieti termice i comportamentul matricelor colagenice la variaia de temperatur n cadrul unui sistem termic T0 -Td i timp variabil de expunere, membranele colagenice (CN) i (CS) au exprimat rezultate asemntoare datelor ce definesc un comportament dependent de compoziia i structura colagenului, care se poate evalua prin fenomenul de contracie urmat de denaturare i degradare.

Analize calorimetrice (interval de temperatur +80 C -- +180 C), cu o vitez de nclzire de 20 C/minut definesc cele dou procese endotermice.

Materialele colagenice (CN), (CS) tip (I) i (I-III) nu au prezentat transformri semnificative n intervalul de temperatur +20C-- +100C. Aceast rezisten ofer lrgirea posibilitilor de utilizare n diferite situaii.

Supuse la temperatur sczut (-35C) prin congelare se obine o stare fibroas care n timp se impurific pe seama sublimrii apei care determin separarea de faz (Ellis).

n cazul liofilizrii, asocierea n proces a inclzirii cu cea de evaporare a apei, asigur obinerea de membrane transparente.

Proprieti electrice ale matricelor colageniceAdoptnd fenomenologia general pentru comportamentul materialului colagenic, investigaiile ntreprinse asupra membranelor de colagen nativ tip (I) i (I-III) au evideniat rspunsul la aciunea cmpului electric (8mv/cm) i variatia starii de polarizare spontana aparuta odata cu formarea membranei colagenice

Pentru stabilirea unui model al conductivitii la membranele colagenice sunt necesare nc noi studii experimentale asupra constantelor electrice de material, rezistivitatea de volum i de suprafa n funcie de interesul practic de utilizare i capacitatea de modelare a formelor solide de materiale colagenice, n special colagen nativ fibrilar sau unele variante de colagen solubilizat.

Pe baza proporionalitii ntre conducia electric prin membranele de colagen i temperatur variabil s-au definit aplicaii n care traductori constituii cu aceste tipuri de membrane pot deveni utili pentru medii biologice active lichide n care nu pot fi introduse traductoare tehnice de temperatur, respectiv medii n care traductoarele cu colagen pot fi mai uor integrate i adaptate. Condiia n ambele cazuri este stabilitatea parametrilor de reacie a membranelor finite. Importante s-au dovedit i fenomenele inverse: apariia i propagarea unor cmpuri termice la excitarea membranei n cmp electric continuu sau alternativ (comportarea invers a traductorilor sau ireversabilitatea lor) facnd astfel posibil aplicarea de traductoare senzori n sisteme biologice sau n sisteme termice. O serie de rezultate obinute n acest context sunt cuprinse in cadrul unor studii de fezabilitate.Proprieti de piezoelectricitate.

Expresia acestei proprieti n tesuturile vii este confirmat de colagen care ndeplinete pe aceast baz o serie de funcii importante n raport cu matricea extracelular i celulele din esuturile conjunctive.

Un aspect important din punct de vedere teoretic i practic dar sumar semnalat il reprezint influena temperaturii sczute asupra acestei proprieti.

Modelul experimental iniiat de Ionescu (1982), pe membrane de colagen tip (I) cu fibre de colagen ordonate n lungime a evideniat la -20C o amplitudine dubl asupra semnalului piezoelectric fa de cel exprimat la +20C.

ncercrile noastre considerate de nceput datorit construciei modelului experimental, le considerm de viitor prin aspectele noi asupra comportamentului determinat de transformrile graduale n structura intrinsec a fibrelor de colagen i a segmentelor lor. Dezvoltarea acestui subiect pe lng importana teoretic i efectele noi asupra organismului, deschide i perspective noi de valorificare practic n condiii de mediu cu temperaturi sczute.

Concluzii:

Din ansamblul rezultatelor obinute subliniem urmtoarele aspecte: Materialele colagenice de tip nativ sau parial solubilizat obinute prin tehnologiile de extracie folosite de noi pentru colagenul tip (I) i (I-III) din tendon i piele de bovin, reprezint asociate macromoleculare constituite din trei catene polipeptidice cu configuraia cristalin de tip helicoidal i deci cu capacitati specifice de a realiza combinaii cu efecte variabile n funcie de mediul nconjurtor. n stare uscat sub forma de membrane/folii manifest o serie de proprieti definitorii fa de aciuni mecanice, termice, electrice care demonstreaz conservarea calitii colagenului in vivo i ofer posibiliti noi de valorificare per se cu luarea n considerare a necesitii de aprofundare i precizare a tipului de colagen i a variantei de extracie.

Capitolul 6Comportamentul matricelor de colagen nativ (tip I i I-III) i modificat chimic la aciunea unor factori nocivi de mediu.Susceptibilitatea colagenului de a reaciona la ageni denaturani s-a manifestat proporional cu dimensiunea gradului de organizare a structurii macromoleculare a materialului colagenic utilizat i cu factorii denaturani.

Din multitudinea aspectelor de cercetare s-a optat pentru analiza transformrilor i efectelor generate de unele medii nocive acido-bazice mai puin abordate, asupra proprietilor matricelor din colagen nativ tip(I) i (I-III), (CN), (CS) i cunoaterea semnificaiei acestora. In acest context experienele au fost orientate pe dou aspecte viznd: Transformrile produse la nivelul matricelor colagenice sub influena naturii i concentraiei unor denaturani acido-bazici. Efectele aciunii unor acizi i baze (anorganice i organice) asupra colagenului (I) i (I-III) modificat dehidrotermic i prin reticulare sau cuplare cu polimeri (carboximetilceluloza (CMC), stiren-anhidrid maleic (SAM).

Cuantificarea interaciunii materialului colagenic cu agentul degradant fiind posibil prin evaluarea propritilor acestuia, s-au luat n considerare urmtoarele aspecte: variaia structurii materialelor colagenice solide condiionate sub form de matrici membranare, capacitatea de absorbie a vaporilor, a apei simple cu concentraii de ageni nocivi, viteza reaciei enzimatice, influena temperaturii. Materiale, metode i modele experimentale

Materialele colagenice folosite pentru realizarea formelor membranare au fost obinute i caracterizate conform tehnicilor descrise n capitolele anterioare.

Tipurile de matrici membranare au fost realizate pe baz de:

-colagen nativ (CN) i colagen solubilizat (CS) tip (I) i (I-III), colagen reticulat cu Agl, dehidrotermic(COL CMC) i (COL SAM). - colagen modificat cu cloruri acide (clorur de benzoil, clorur de acriloil)

Tipurile de factori denaturani folosii au fost: soluii i vapori de acizi i baze de concentraii diferite (acid clorhidric, acid azotic, acid acetic, amoniac, metilamina, unii dintre acetia fiind utilizai i n tehnologiile de extracie a biopolimerilor colagenici).

Modelele experimentale de laborator au inclus realizarea condiiilor de experimentare, realizarea atmosferei denaturante, stabilirea factorilor multifactoriali de analiz.

Pentru studiul i caracterizarea membranelor de colagen nedenaturate i denaturate s-au determinat: capacitatea de absorbie a apei, capacitatea de absorbie a vaporilor, temperatura de contracie a filmelor, proprieti fizico-mecanice, aciunea tripsinei i viteza de degradare enzimatic.

Rezultate

Analiza comparativ a datelor a evideniat aspecte considerate semnificative. O puternic sensibilitate a scleroproteinei la aciunea acizilor i bazelor n special a celor anorganice, n funcie de tipul de colagen (CN), (CS) tip (I) i (I-III), de natura i concentraia acestuia n mediu (aer,ap) i durata de contact. Denaturarea matricei colagenice se exprim prin reticulri, transformri polimer analoage, ruperea catenei macromoleculare, dezorganizarea molecular i modificarea aspectului pna la scindarea catenelor polipeptidice (hidroliz). Rezultatul final al proceselor depinde de mrimea concentraiei i a timpului de contact cu factorul nociv indiferent de mediul n care este prezent (aer, ap).

Sensibilitatea colagenului este mai mare fa de acizi i manifest variaii ale proprietilor fizico-mecanice i structurale, iar transformrile polimer-analoage se manifest la durate de 3-4 ore, dup care se produce ruperea catenelor.

Membranele din colagen nativ (CN) sunt mai reactive la denaturarea acido-bazic comparativ cu cele din colagen solubilizat (CS) datorit calitii peliculogene inferioare cauzate de prezena fibrelor i cristalinitii materialului, a mpachetrilor care favorizeaz transferul de mas al agentului denaturant.

Discontinuitile structurii morfologice favorizeaz i aciunea amoniacului care se finalizeaz ns cu formarea de legturi covalente transversale cu densitate mare i mai rezistente la factorul nociv.

Colagenul solubilizat (CS) spre deosebire de colagenul nativ (CN) la interaciunea cu amoniacul genereaz reele tridimensionale tip IPN valorificabile.

Datele privind variaia comportamentului filmelor de colagen (CN) i (CS) fa de apa lichid sau sub form de vapori i capacitatea de absorbie i umflare a acestora, au constituit baza formulrii unui biomaterial hiperabsorbant nscris spre brevetare.

Variaiile nregistrate pot fi luate n considerare ca posibile indicatoare rapide (biosenzori activi) n raport cu factorii mediului nconjurtor.

Membranele de colagen tip (I) i (I-III) reticulate cu compui micromoleculari (aldehida glutaric) i cu tratament dehidrotermic au manifestat n toate condiiile de experimentare o cretere diferit a rezistenei materialului proteic la aciunea factorilor degradani in funcie de natura concentraiei i durata contactului

Fa de agenii denaturani organici (acid acetic,acid formic, metilamina) n toate variantele de experimentare, membranele de colagen nativ s-au modificat fizico-chimic, dar au interacionat mai puin comparativ cu cei anorganici la aceleai valori ale concentraiei lor n mediu.

Manifestarea procesului de scdere a temperaturii de contracie Tc a membranelor colagenice expuse la denaturare, este marcat de influena naturii scleroproteinei; astfel filmele pe baz de colagen tip (I-III) au Tc mult mai mare comparativ cu cele pe baz de colagen tip (I).

Degradarea enzimatic a filmelor expuse aciunii agenilor denaturani este variat iar viteza reaciei s-a difereniat n funcie de tipul de colagen (I) i (I-III), de natura reticulrii, de tipul i concentraia factorului denaturant. Ca urmare fenomenologia proceselor i evaluarea efectelor necesit analiza fiecrui model funcional i luarea ca baz a caracteristicilor structurale (structur teriar, cuaternar) i a tipului de colagen folosit (I) i (I-III).Concluzii:

Din analiza general a datelor experimentale se evideniaz o diversitate a comportamentului materialelor colagenice funcie de caracteristicile tipului de colagen i formula de extracie, de gama agenilor denaturani i condiiile de interacie. n toate variantele proteina colagenic este sensibil i gradual exprimat la aciunea acizilor i bazelor iar efectele produc modificri morfostructurale datorit proceselor de reticulare, transformare polimer analoag, ruperea catenei macromoleculare, hidroliz.

Produsele pe baz de colagen nativ tip (I) cu grad redus de reticulare se preteaz aplicaiilor ca senzor chimic cu traductori opto-electronici, iar cei care prezint pierdere de mas cu traductori poteiometrici.

Capitolul 7 Studii privind realizarea de biosenzori performani prin valorificarea sensibilitii matricei colagenice la factori nocivi de mediu.

Rezultatele experimentrilor noastre intreprinse pe direcia evalurii sensibilitii i denaturrii materialelor colagenice (CN)(CS) la ageni chimici i organici, acizi i baze descrise n capitolele anterioare au stimulat ideea creterii performanelor de folosire a acestora sub forma unor matrici (membrane, gel, granule) ca senzori rapizi de identificare i monitorizare a prezenei (calitativ i cantitativ) a factorilor nocivi din mediul nconjurtor (aer, ap). Ca urmare am procedat la evaluarea datelor proprii cu cele existente i parial brevetate i s-au investigat urmtoarele aspecte privind creterea de performan n obinerea i utilizarea biomaterialelor senzoriale.

Compoziia matricelor colagenice (CN) (CS) tip (I) i (I-III) i tehnologiile aferente obinerii de matrici performante. Experimentarea i selectarea modului de funcionare a senzorului care implic forma de prezentare a acestuia i a mediilor denaturante precum i nivelul de transformare indus corelat cu sistemul de nregistrare i producere a informaiei. Aria de aplicare i existena unor poteniali utilizatori (activitate cotidian, mediul ambiant, reactiv chimic, utilizri speciale, etc.)

Materiale, metode i modele experimentale

Materialele colagenice folosite au respectat caracteristicile descrise anterior n vederea experimentrii i interpretrii unitare a datelor.

membranele senzoriale au fost preparate pe baza urmtoarelor formule:

Colagen nativ (CN) (CS) tip (I) i (I-III) per se i variante de amestec cu: fuxin decolorat , sulfat de cupru stabilizat, PFDA. Biocompozit colagen carboximetil celuloz (CMC), fuxin decolorat, sulfat de cupru stabilizat. Biocompozit colagen-stiren anhidrid maleic (SAM) i variante de amestec cu adaos de sruri (NaCl, Al2 (SO4)3).Proporia i condiiile de combinare au variat n limitele modelului experimental iar selectarea reelei optime s-a efectuat pe baza variaiilor de extincie de und =364 m luat ca punct de referin stabilit pentru apa oxigenat.

Matrici sub form de gel i granule au fost realizate din soluii de colagen 2% i pH=10 reticulat cu soluii de aldehid glutaric 2% i combinat cu cantiti variabile de para-fenilen-diamin (PFDA). Tehnologia de obinere este diferit de cea a membranelor i a fost sintetizat pe fluxul tehnologic.

Matrici senzoriale sub form de granule s-au obinut pe baza tehnologiei de obinere a membranelor, iar condiionarea sub form de granule s-a folosit pentru medii nocive foarte agresive i risc de manipulare.

Testarea i evaluarea calitii de senzor a materialelor colagenice s-a realizat pe baza urmtorilor indicatori multifuncionali: Tipurile de biosenzori -membrane de colagen nativ tip (I) i (I-III).

Determinarea sensibilitii senzorilor pe baza analizei factorilor variabili de concentraie a componentelor, a agenilor nocivi, starea mediilor (vapori, lichide) a pH-ului i a tipurilor de contact cu factorii nocivi utilizai (acizi, baze, detergeni (TIDE, REX)). nregistrarea i evaluarea rspunsului senzorului prin efect de separare de faz i opacizare cu ajutorul unui fotocolorimetru; i schimbului de culoare; variaiile gradului de hidratare a membranelor (n special la acizi i baze)

RezultateStudiile i cerecetrile experimentale viznd definirea unor posibiliti de cretere a performanei i a gradului de utilizare a biosenzorilor pe baz de colagen, cumuleaz datele obinute asupra tehnologiilor i compoziiei materialelor senzoriale, a modului de funcionare, nregistrare i prelucrare a informaiilor i respectiv a ariei de aplicare i a potenialilor utilizatori.

Pe baza analizei seriilor experimentale s-a realizat: selectarea i optimizarea a dou tehnologii de obinere a matricelor cu sensibilitate superioar i formularea a trei sisteme de aplicare (membran/pelicul,gel, granule);

Evidenierea performanelor care sunt n primul rnd dependente de calitatea materialului colagenic i de compoziia amestecului de prelucrare urmat de asemenea efectul unor factori decizionali i anume: valoarea pH-ului, procedeul de profilare i inducere a modificrilor chimice (reticulare, transformare polimer analoag). De exemplu maximul diferenei dintre proba colagen-nativ i cea denaturat s-a inregistrat pentru compozitia cu fuxin CuSO4 in proportie de 1/2 prin culoarea i opacitatea membranei ca efect al degradrii structurii modificnd pH-ul amestecului de la 8 la 12, s-a constatat ca cea mai bun soluie tehnic este obinerea unui amestec colagen-fuxin-CuSO4 in proporie de 2/1. Acesta induce in prezena factorului denaturant un efect pronunat de turbiditate, i respectiv un efect pronunat de culoare (diferene de extincie de la 364 m la 440 m).In varianta cu PFDA sporirea gradului de sensibilitate i a vitezei de raspuns al biosenzorului s-a inregistrat la concentraia de 2% PFDA.

Ca urmare in condiiile respectrii recepturii, matricea de colagen nativ cu adaos de colorani poate constitui o gam de biosenzori ieftini pentru utiliti cotidiene, ca indicatori calitativi ai prezenei de noxe.

Complexarea colagenului cu polizaharidul (CMC) i polimerul (SAM) cu respectarea anumitor proporii de combinare crete progresiv sensibilitatea membranelor datorit transformrii polimer-analoage care se finalizeaz cu o stare metastabil uor de perturbat n prezena unui factor degradant i n special a oxigenului din aer, ap, substane chimice de tip oxo i peroxi.

Obtinerea i utilizarea larg a acestora ns necesit evaluarea procedeelor de combinare i preparare precum i estimarea agentilor denaturani.

In cazul prezentei a doi agenti nocivi (apa oxigenat i detergent) actiunea denaturant a acestora este sinergic i intensific efectul degradativ asupra senzorului indiferent de modul de condiionare al acestuia (membrana, gel, granule).

In varianta biosenzorului pe baz de colagen reticulat cu aldehid glutaric, se constat un scurt proces de denaturare (cca 30 de secunde) dup care aspectul rmne staionar datorit transformrilor moleculare care inhib trecerea agentului nociv n structura colagenului.

Concluzii

Diversitatea tipurilor i formelor posibile de obinere si de utilizare a biosenzorilor au la baz prezenta componentei colagenice, a proprietilor sale funcionale conservate ex vivo i calitatea reactiv a matricei exprimat prin transformri structurale. Preluarea acestei informaii in timp util pentru msuri de protecie stimuleaz creterea performanei dispozitivelor opto-electronice de preluare i cuantificare a informaiei. n aceast direcie s-au iniiat i vom dezvolta n continuare studii de fezabilitate viznd sisteme miniaturizate de nregistrare i prelucrare de date.

Rezultatele obinute aduc elemente de susinere a inovrii i creterii performanei de valorificare a biosenzorilor cu component colagenic prin dezvoltarea produciei i diversificarea domeniilor de aplicaie (utilizare analitic i monitorizare n mediul ambiant, industrial, incinte inchise, laboratoare chimice, viata cotidian, etc.) Susin de asemenea posibilitatea procesrii i utilizrii per se a colagenului nativ (in special tip (I)) n formule simple necostisitoare, ca markeri calitativi n via.

Date privind unele elemente originale sunt cuprinse n dosarul propunerii de brevet de invenie.

Capitolul 8 Poteniale aplicaii biomedicale ale matricelor colagenice membranarePentru lrgirea cadrului de interes viznd valorificarea materialelor colagenice membranare n domeniul biomedical investigaiile s-au concentrat opional asupra: obinerii de membrane (matrici, pelicule) prin formularea i definirea de caliti performante i standardizabile pentru aplicaii medicale i paramedicale. realizarii de matrici biocompatibile suport/substrat pentru stimularea creterii i dezvoltrii celulare in vitro n sisteme funcionale necesare ingineriei celulare i tisulare respectiv ca markeri ai citotoxicitii unor ageni i produse destinate uzului uman .Materiale, metode, modele experimentale Materialele de baz folosite au reprezentat colagen nativ (CN) i (CS) tip (I) i (I-III) extras i caracterizat anterior. Obinerea i caracterizarea membranelor s-au bazat pe metodele analitice folosite (cap.4-6) n corelare cu specificaia tehnic cuprins n Farmacopeea Romn ed. IX-X.

Pentru creterea performanei membranelor de colagen (I) i (I-III) s-au utilizat i metode de analiz (cap.5) viznd caracteristici structurale i ultrastructurale proprieti de permeabilitate , rezisten la rupere , alungire la rupere, permeabilitate la vapori de ap, umflare la ap , porozitate.Pentru membranele compozite (COL-CMC) i (COL-SAM) i membranele cu colagen reticulat cu AGl s-au adugat analize suplimentare privind variaia funcional a componentelor i a condiiilor de preparare care conduc la formulri finale cu proprieti variabile. Pentru sterilizare s-au folosit radiaii UV.

Testarea dezvoltrii celulare in vitro n raport cu suporturile membranare prezente n mediul de cultur s-a bazat pe modele funcionale cu factori variabili: tipul de celule i metode de analiz i caracterizare; tipul de biomaterial folosit ca substrat; durata experimentrii i evaluarea evoluiei celulare i a interrelaiei celul-substrat.

Analiza datelor s-a realizat prin experiene conduse pe serii paralele de culturi celulare fibroblast-like i celule epiteliale cu condiii i medii de cultur identice.

Rezultate

Studiile analitice i caracterizarea celor 4 tipuri de membrane colagen nativ (I) i (I-III ) i biocompozite (COL-CMC) (COL-SAM) au relevat corespondena cu specificaia tehnic din Farmacopeea Romniei IX i X pentru tip produs Membran (membrane ,pelicule , filme) din colagen cu diferite destinaii . Pentru destinaia considerat terapeutic, materialele realizate (colagenice, compozite) pot fi integrate la grupa protectoare i absorbante i utilizate ca pansament extern.

Ca soluii propuse pentru analiza i evaluarea suplimentar (performant) a matrialelor colagenice membranarese detaaz prin rezultatele obinute: utilizarea spectroscopiei IR ca indicator n evaluarea modificrilor structurale induse prin procedeul de obinere a membranelor; corelarea tipului de colagen cu concentraia i rapoartele de combinare cu ali compui (ali polimeri, plastifiani, concentraia de sare, etc.). Acestea condiioneaz: permeabilitatea la ap i vapori de ap, rezistena la rupere i alungire, capacitatea de umflare a membranelor, biocompatibilitatea, etc. Aceste caracteristici contribuie la aprofundri ale mecanismelor de aciune i se constituie ca indicatori suplimentari de calitate n funcie de destinaia de utilizare a membranelor.Procedeele de analiz folosite suplimentar au permis identificarea de rezultate importante tiinific cu implicaii directe n logica diversificrii modului de aplicare practic.

Materialul colagenic trebuie definit de asemenea dup tipul de colagen, n cazul nostru (I) i (I-III) i structura conservat prin procedeele de extracie i procesare care pot constitui indicatori suplimentari de calitate n funcie de destinaia utilizrii membranelor.

Pentru membranele reticulate i biocompozite (COL-CMC) i (COL-SAM) datele relev necesitatea unor analize suplimentare privind variaia compoziional i funcional a componentelor, a proporiilor de combinare i a condiiilor de preparare a biomaterialului. Referine concrete privind aceste aspecte sunt folosite la elaborarea dosarului privind propunerea de brevetare.Analiza i evaluarea evoluiei celulare n serii paralele cu combinaii multifuncionale (tip celular-tip de membrane suport, martor) i parametri specifici, au demonstrat caracteristici generale asemntoare ca manifestare i ritm de dezvoltare. Unele diferene au fost influenate de tipul i metabolismul celular, de relaiile interfaciale i de compoziia suportului. Date experimentale au evideniat de asemenea i modificri morfostructurale, viabilitate, multiplicare, migrare, aderare la substrat i tendine de multistratificare celular n raport cu tipul de suport/substrat.

Cele patru tipuri de membrane utilizate ca substrat/suport n mediul de culturare a celulelor fibroblast-like i epitelial, nu au indus modificri cu caracter citopatic care s conduc la aprecierea de incompatibilitate cu sistemele vii. Comparativ cu probele martor (fr substrat) au exprimat un accentuat chemotactism i un ritm mai rapid de multiplicare i dezvoltare celular.

n cazul fibroblastelor i celulelor epiteliale cultivate n prezena de membrane de colagen nativ tip (I) i tip (I-III), ritmul de transformare a fenotipului i de migrare orientat spre suport este generalizat. Capacitatea de biotransformare structural i funcional n interrelaie cu cele dou tipuri de colagen n intervalul 24-72 de ore nu exprim diferene notabile i procesul de alctuire a monostratului este evident.

Comportamentul celulelor n raport cu suporturi de colagen reticulat cu aldehid glutaric marcheaz o evoluie mai sczut progresiv n funcie de concentraiea aldehidei glutarice 0,1-1%. Peste aceast concentraie, biocompatibilitatea se anuleaz.

n interrelaie cu suporturi biocompozite (COL-CMC), (COL-SAM) evoluia ambelor tipuri celulare, corespunde caracteristicilor descrise la variantele cu colagen nativ i chiar unele tendine de depire a ritmului de dezvoltare, multiplicare i formare de monostrat. Rezultatele positive s-au obinut pe baza stabilirii stricte a proporiilor i condiiilor de combinare a componentelor.

Corelarea evoluiei celulare asemanatoare tuturor variantelor utilizate cu tipurile membranelor suport a condus la o serie de precizri: la 48 de ore de culturare populaiile celulare pot fi evaluate prin toi parametrii indicatori. Prezena n procent mare de celule tinere dovedete o dezvoltare urmat de dublare, dar n ritm de multiplicare superior martorului i tendina de aderare i iniiere a monostratului.La 72 de ore de culturare se costat continuarea dezvoltrii celulare i ca elemente noi: modificarea morfologiei la suprafaa suportului, dezvoltarea contactelor i jonciunilor intercelulare i aspectul tipic de monostrat cu inceput de pluristratificare.

Proba martor acopera 68%-78% din suprafa, suporturile colagenice 90-92,9 %, suporturile biocompozite 91-93%. Multistratificarea dovedete evoluia la o etap nou de organizare supracelular.

Generaliznd rezultatele experimentale obinute se poate considera c realizarea de membrane (pelicule, filme) suport, cu caracteristici performante comparativ cu standardele cunoscute, poate contribui la numeroase aciuni viznd ingineria celular i tisular, medicina regenerativ, etc.

n acelai timp matricele colagenice realizate pot fi utile n modele funcionale de testare in vitro a biocompatibilitii unor produse i modelarea unor procese celulare i moleculare, n diverse situaii ce necesit calitatea de biocompatibilitate i interrelaiile cu sistemele vii.CONCLUZII GENERALE:

Colagenul este considerat n continuare subiectul a numeroase studii de aprofundare i dezvoltare a cunotinelor asupra complexitii structurale i funcionale n organismul animal, precum i asupra valorificrii acestui compus macromolecular ex vivo sub form de matrici, materiale colagenice i biomateriale cu aplicaii multiple.

n acest sens cercetrile proprii aduc dovezi experimentale n definirea de valorificri noi ale: caracteristicilor i proprietilor materialelor constituite din colagen tip (I) i tip (I-III) extrase n variante de colagen nativ (CN) i solubilizat (CS); a calitilor senzoriale n raport cu factori de mediu i ageni nocivi a biocompatibilitii i funcionalitii n raport cu sistemele vii.

Din ansamblul concluziilor prezentate pe capitole se pot grupa ca importan o serie de aspecte viznd:

Cercetare stiinific i aplicativ

1. Necesitatea corelrii conceptului surs biologic-tip de colagen cu mbuntirea unor parametri ai tehnologiilor de extracie ce asigur obinerea ex vivo de variante de colagen nativ sau parial denaturat (CN) (CS) de tip (I) i (I-III) reprezentnd: asociate macromoleculare constituite din trei catene polipeptidice cu configuraie cristalin de tip helicoidal, cu caracter ionic variabil, funcionalitate divers, compoziie cu grad avansat de puritate. Aceste materiale colagenice cu grad de apropiere de starea colagenului in vivo ofer posibiliti de analiz, modelare i experimentare a unor procese biologice normale i patologice, de evaluare i valorificare n diverse domenii de aplicaie practic.

2. Condiionarea n stare uscat (membrane/matrici/folii) a materialelor colagenice manifest difereniat pe tipurile de colagen proprieti structurale biomecanice, electrice, termostabilitate, cuantificabile pentru nelegerea mecanismelor de biotransformare, pentru definirea unor noi valorificri.

3. Evaluarea comparativ a proceselor de transformare i denaturare a membranelor din colagen nativ tip (I) i (I-III) i modificat prin reticulare cu aldehid glutaric i dehidrotermic, la contactul cu ageni denaturani, (acizi, baze, factori oxidani) evideniaz evoluia i intensitatea reactivitii n funcie de natura concentraei i a duratei timpului de expunere.

Membranele de colagen nativ (CN) sunt cele mai sensibile la aciunea acizilor (n special anorganici, acid clorhidric) i parcurg transformri polimer analoage, dezorganizare molecular pna la hidroliz. La denaturarea cu baze (amoniac) colagenul nativ (CS) manifest procese de reticulare cu generarea de reele tridimensionale de tip IPN care conduc la creterea rezistenei la factorul nociv.Membranele de colagen de tip (I) i (I-III) reticulate cu compus micromolecular (aldehid glutaric) sau tratate dehidrotermic manifest n toate condiiile experimentale o cretere variabil a rezistentei la aciunea factorilor denaturani.

n raport cu apa (lichid sau vapori) membranele manifest capacitatea evident de absorbie i umflare. Ca urmare fenomenologia proceselor i cuantificare a efectelor este condiionat de caracteristicile structurale, tipul de colagen i natura factorilor nocivi i necesit analiza fiecrui model funcional pentru destinaie precis de valorificare.4. Cercetrile experimentale viznd creterea calitilor senzoriale ale materialelor colagenice confirm gradul de sensibilitate i viteza de rspuns n funcie de calitatea i tipul de colagen compoziia amestecului, concentraia, timpul i modul de contact cu factorul denaturant. Selectarea variantelor optime au implicat: optimizri ale tehnologiilor de procesare, nregistrarea efectelor denaturrii i prelucrarea informaiilor.

Specificitatea rspunsului la tipul de agent degradant definete posibilitatea diversificrii biosenzorilor cu utilizare analitic i monitorizare n mediul ambiant, industrial, laboratoare chimice, activiti cotidiene, etc.

Realizarea de membrane senzoriale modificate prin reticulare sau complexarea colagenului cu biopolimeri naturali sau sintetici poate contribui la creterea sensibilitii i a vitezei de rspuns la factorul denaturant prezent n ap sau n aer.

5. Obinerea i experimentarea unei game de membrane biocompatibile (CN)(CS) tip (I) i (I-III) i biocompozite (COL-CMC, COL-SAM) demonstrez corespondena calitativ cu specificaia tehnic din Farmacopea Romn IX i X i au adus elemente noi de evaluare pentru calitti performante i anume: structura, porozitatea, permeabilitatea, rezistivitatea la rupere, umflarea n ap, termostabilitatea.

6. Testarea biocompatibilitii in vitro pe culturi celulare de tip epitelial i fibroblastic confirm capacitatea de utilizare a membranelor ca suport/substrat pentru evoluia mai rapid a celulelor, realizarea de metode funcionale experimentale cu aplicaii n ingineria celular i tisular; testarea biocompatibilitii pentru avizarea de bioproduse i utilizri paramedicale.

Dezvoltare inovare

ntocmirea documentaiilor pentru 3 propuneri de brevete depuse la O.S.I.M.

Elaborarea a 2 tehnologii pentru prepararea de matrici naturale cu calitai senzoriale.

Acumularea unui buget de idei inovante n sprijinul dezvoltrii i diversificrii ariilor de valorificare a proprietilor i calitilor funcionale ale colagenilor nativi (I) i(I-III) respectiv de aplicaie practic a matricelor naturale (membrane, geluri, granule)n formule per se sau complexate. Iniierea de investigaii privind dispozitive performante de investigare i producere a informaiei.Interes general

Comportamentul difereniat al celor dou tipuri de colagen la parametri experimentali identici confirm influena caracteristicilor structurale ale acestora i necesitatea reconsiderrii proprietilor comportamentului n raport cu sistemele vii, cu factorii denaturani, respectiv cu diverse procedee de valorificare.

Termenul de colagen/materiale colagenice folosite n general pentru diverse situaii trebuie corectat cu precizarea tipului i procedeului de extracie a colagenilor acestea condiionnd definirea, proiectarea i procesarea de biomateriale pentru aplicaii cu efecte benefice asupra strii de sntate i a proteciei mediului nconjurtor.

0