1

Raport stiintific sintetic

privind implementarea proiectului „Bio-platforma miniaturizata pentru testarea simultana a

terapiei combinate si tumorigenicitatii melanomului”

131PED - MiniBioLab

in perioada Ianuarie – Decembrie 2017

Context:

Statistici recente, plaseaza cancerul ca fiind una dintre pricipalele cauze ale morbiditatii si

mortalitatii din lume. Organizatia Mondiala a Sanatatii (WHO - World Health Organization) a

evidentiat ca ~14 milioane de cazuri noi de cancer au fost raportate in 2012, in timp ce 8.2 milioane

au fost cauzatoare de moarte. Din nefericire, perspectivele nu sunt deloc optimiste, incidenta

cancerului fiind asteptata sa creasca cu aproape 70% (22 milioane de cazuri) in urmatoarele doua

decenii [1]. Ne putem astfel gandi, ca populatia unei tari imaginare, avand populatia similara tarii

noastre ar putea probabil disparea complet! Cele mai agresive si mortale forme de cancer cunoscute

sunt cele ce afecteaza plamanii, ficatul si stomacul, insa si alte tipuri de cancer, ca de exemplu

melanomul (cancerul de piele) [2], s-a dovedit extrem de agresiv datorita rezistentei ridicate la

medicamente, ratei mari de recurenta si ratei de supravietuire foarte scazute [3]. La fel de agresive pot

fi considerate si alte tipuri de cancer ca cel de colon, de sani sau alte tipuri de boli degenerative.

Studii recente [4,5] au aratat ca celulele tumorale pot dezvolta un fenomen de „plasticitate”, ca

raspuns la caracteristicile micromediului. Lee et al. [6], au evidentiat cum proprietatile interfaciale ale

suprafetelor (ca de exemplu caracteristici geometrice ca forma si perimetru microstructurilor)

influenteaza o populatie de celule tumorale, care pot ghida celulele canceroase spre o stare

asemenatoare celulelor stem. Pe de alta parte, desi s-a demonstrat o eficienta terapeutica ridicata in

tratamentul cancerului ca urmare a utilizarii de nanomateriale, aceasta reprezinta doar o latura a unei

probleme mult mai complexe. O intelegere avansata a mecanismelor implicate in eliberarea de

medicamente controlata si a tumorigenicitatii celulare sunt la fel de importante pentru a adresa

probleme clinice reale [3].

Scopul proiectului MiniBioLab il reprezinta designul, dezvoltarea si testarea

performantelor unei bio-platforme miniaturizate pentru investigarea simultana a :

i) efectului sinergistic al unui amestec combinatorial precis de inhibitori de cai de

semnalizare si modulatori epigenetici asupra celulelor de melanom; si

ii) evaluarea tumorigenicitatii celulelor de melanom ghidata de caracteristicile geometrice

ale patternurilor asamblate pe substraturi solide.

Intr-adevar, melanomul este cel mai periculos cancer de piele, fiind cauzat de transformarea

melanocitelor ce au suferit modificari genetice, generand astfel o proliferare si diseminare anormala.

Melanomul malign este o tumoare heterogena ce poate fi tratata daca este descoperita devreme, dar

care odata ajunsa in noduli limfatici sau alte organe, face ca supravietuirea medie a pacientilor sa scada

sub 9 luni, doar 15% dintre ei traind mai mult de 3 ani. Principalele terapii s-au dovedit ineficiente

pentru cresterea ratei de supravietuire deoarece celulele tumorale, dezvoltand o subpopulatie rezistenta

la medicamente, se comporta ca o „tinta miscatoare”. Cercetarile recente din domeniu au evidentiat ca

doar o terapie combinata reprezinta solutia pentru tratarea melanomului cu rezistenta ridicata.

Acest proiect reprezinta o dezvoltare fireasca a proiectului TE186 intitulat „Sinteza de

biblioteci compozitionale de filme subtiri prin procedee laser combinatoriale pentru selectarea

de agenti cu tinta moleculara in melanom – COLASMEL”, implementat de catre aceeasi echipa de

cercetare si care a fost finalizat in luna Noiembrie 2017. Am demonstrat ca acoperiri combinatoriale

realizate prin tehnici laser inovative de nanomateriale din familia grafenelor (GFN – din engleza

Graphene Family Nanomaterials) functionalizate cu proteine si inhibitori de cai de semnalizare

(BRAFi) si modulatori epigenetici (HDACi) sunt eficiente, si mai mult, prezinta un efect sinergistic

asupra celulelor de melanom (linia celulara SK28 izolata de la un pacient ce prezenta mutatie genetica

a proteinei BRAFV600E).

2

Proiectul a demarat cu reuniunea echipelor de cercetare INFLPR si IB-AR pentru stabilirea

planului de experimente si a directiilor de urmat in cadrul Etapei I, dar si pregatirea strategiei de

achizitii din 2017, pentru ducerea la indeplinire a obiectivelor propuse. Am acordat o atentie deosebita

selectiei inhibitorilor de cai de semnalizare si a modulatorilor epigenetici astfel incat sa fie eficienti la

concentratii cat mai mici, in domeniul nM, pentru a creste sansele de reusita ale proiectului. Inhibitorii

propusi in proiect fac parte din doua categorii: inhibitori ai unor enzime care moduleaza aparitia

cancerului prin mecanisme epigenetice (HDACi) si inhibitori de cai de semnalizare (BRAFi) care

targeteaza grupul majoritar de pacienti cu mutatie in BRAF care activeaza calea constitutiv. Tot in

aceasta etapa au fost achizitionate marea majoritate a reactivilor si kit-urilor pentru testele biologice si

biochimice pentru a asigura cursivitatea necesara experimentelor si caracterizarilor. Pe baza

experientei anterioare, am selectat urmatorii inhibitori din fiecare clasa :

- Din clasa HDACi: Trichostatin A (TSA) – are formula chimica C17H22N2O3, greutatea

moleculara 302.4, si este solubil in apa, DMSO si etanol, astfel ca va putea fi relativ usor

de pregatit sub forma unei tinte criogenice. Coeficientul IC50 (half maximal inhibitory

concentration) reprezinta o masura a eficacitatii unei substante de a inhiba o functie

biologica sau biochimica specifica. Studiile au aratat o valoare IC50 de ~1.8 nM pentru TSA

fiind folosit de asemenea in studii privind cancerul mamar sau de plamani [7].

- Din clasa BRAFi: Dabrafenib/GSK2118436 – are formula chimica C23H20F3N5O2S2,

greutatea moleculara 519.56, si este solubil in apa, DMSO si etanol. Coeficientul IC50 este

de ~3.2 nM pentru B-raf si 0.8 nM pentru B-RafV600E fiind folosit de asemenea in studii

privind cancerul melanomului mutant si de colon [8].

Am stabilit impreuna achizitionarea unui echipament pentru investigarea caracterului

hidrofil/hidrofob al suprafetelor, deoarece atat morfologia cat si chimia suprafetelor pot influenta

decisiv comportamentul celular (in concordanta cu planificarea prevazuta in propunerea de proiect).

Sistemul permite masurarea unghiului de contact dintre picaturi de lichid (metoda sessile drop) si o

suprafata solida si a energiei libere a suprafetelor. A fost achizitionat de la firma Kruss GmbH,

Germania, model DSA25, o imagine de ansamblu a sistemului si a principalelor componente ale

acestui fiind prezentate in figura 1. Asa cum se poate vedea in figura, dispozitivul este prevazut cu

doua sisteme de dozare independente, controlate de calculator pentru dozarea precisa si reproductibila

a picaturilor, pana la volume de 0.5 µL. Unul dintre sisteme permite dozarea simultana a doua lichide

(apa si diiodometan) pe baza de presiune, denumit „double pressure dosing”, si care este utilizat pentru

determinarea rapida a energiei libere a suprafetelor (Figura 2).

Sistemul DSA25 este prevazut cu o camera rapida (2000 fps) de mare rezolutie (1200 x 800

px), conectata la calculator printr-un port USB 3.0. Colectarea imaginii se face cu un sistem optic cu

marire de 6.5x. Sursa de iluminare este LED monocromatic de mare putere, ce emite la lungimea de

unda dominanta de 470 nm. Proba de analizat se monteaza pe un sistem de translatie x-y micrometric.

Tot protocolul de masurare a unghiului de contact si determinare a energiei libere a suprafetelor este

realizat cu ajutorul software-ului Advance. Acesta ofera un protocol de lucru intuitiv pentru pregatirea

experimentului, masurarea, analizarea si exportul datelor catre calculator. In plus, dispunem de o larga

baza de date cu privire la lichidele de utilizat si proprietatile acestora. Este de asemenea posibila

realizarea de experimente de masurare a unghiului de contact la diverse temperaturi, intre temperatura

ambianta si 130°C, cu ajutorul unei camere speciale termostatate.

In continuare, am demarat experimente preliminare privind designul si fabricarea cu laserul de

masti ce vor fi utilizate pentru asamblarea micro-patternurilor si cofigurarea montajului experimental,

conform Obiectivului O.1 al proiectului. Prima activitate desfasurata a constat in selectia materialelor

si a designului asistat de calculator pentru fabricarea mastilor. Materialele utilizate vor trebui sa

indeplineasca simultan mai multe cerinte: sa prezinte rezistenta chimica si la coroziune ridicata fata de

solventii utilizati in experimentele ADD-MAPLE, sa fie stabile pe durata sterilizarii cu radiatie UV

sau la temperaturi ridicate, sa fie compatibile pentru a fi curatate in baia cu ultrasunete, sa aiba

stabilitate mecanica mare si sa asigure realizarea de patternuri cu rezolutie spatiala mare, sa fie

3

compatibile pentru procesare laser. Ne-am propus initial fabricarea de masti metalice din otel

inoxidabil si eventual polimerice.

Figura 1. Sistem pentru masurarea unghiului de contact si a energiei libere a suprafetelor.

Figura 2. Sistem pentru dozare simultana a doua lichide si determinarea energiei libere a

suprafetelor. Exemplu al unei astfel de masuratori cu softul Advance.

Experimentele de procesare laser a mastilor au fost efectuate in cadrul CETAL, INFLPR

(http://cetal.inflpr.ro/), in Laboratorul de Procesarea Materialelor. Am ales sa utilizam o platforma

laser cu picosecunde (Lumera, Coherent) ce este prezentata in Figura 3, datorita versatilitatii

experimantale ridicate. Principalele caracteristici ale acesteia sunt sintetizate in Figura 3. Asa cum se

poate observa, este vorba de un laser cu durata pulsului de 5 ps, ce poate fi operat atat in UV, la

lungimea de unda de 355 nm, dar si in vizibil la 532 nm. Puterea laserului poate fi variata intr-o gama

larga de valori (5-500 mW) si rate de repetitie de pana la 500 kHz, ceea ce poate diminua semnificativ

timpul de procesare.

Platorma contine de asemena axe de translatie XY motorizate de mare precizie (PlanarDL

Aerotech), cu viteza de deplasare variabila de pana la 750 mm/s, controlate de calculator. Toata

platforma de scriere directa cu laserul este controlata de un software dedicat, ce permite designul unor

patternuri cu orice tip de forme si dimensiuni, stabilite de catre utilizator. Procesul este monitorizat cu

ajutorul unei camere CCD, utilizata si pentru ajustarea focalizarii fasciculului laser pe suprafata sau in

volumul probelor.

4

Figura 3. Reprezentarea schematica si imagine a platformei de scriere directa cu laserul

utilizata pentru fabricarea mastilor.

Asa cum spuneam, am inceput prin a testa posibilitatea de realizare a unor microprelucrari pe

probe din otel inoxidabil. Experimentele realizate (Figura 4) au evidentiat ca este posibila gaurirea

facila a unor folii cu grosimea de ~1 mm. Cu toate acestea, am observat ca gaurile realizate prezinta o

conicitate semnificativa, diametrele realizate intre fata de intrare si cea de iesire a laserului prezentand

o scadere de la ~50 µm (Figura 4.a stanga) la ~ 25 µm (Figura 4.a dreapta). Aceste efect este mai putin

evident atunci cand grosimea foliei este mai mica, 0.5 mm in Figura 4.b, diferenta dintre diametre

variind de la ~70 µm (Figura 4.b stanga) la ~ 60 µm (Figura 4.b dreapta). Pe de alta parte, folii cu

grosimea de sub 1 mm nu prezinta o stabilitate mecanica suficient de buna pentru a realiza patternurile

dorite. Mai mult, am observat ca si curatarea mastilor poate fi problematica (Figura 4.a necuratata

versus Figura 4.b curatata partial), astfel ca ne-am gandit la variante alternative.

Teste similare cu PTFE au fost de asemenea nesatisfacatoare. Iradierea laser de mare intensitate

a condus la topirea si arderea locala a polimerului, mai ales in conditii de focalizare a fasciculului laser

intr-un spot de 4 µm. Astfel, rezolutia spatiala a mastilor a fost compromisa, marginile prelucrate

prezentand o serie de neregularitati evidente.

Am schimbat astfel strategia din mers, si ne-am orientat spre posibilitatea de fabricare a

mastilor din sticla. Sticlele prezinta biocompatibilitate ridicata – deci nu va exista riscul de contaminare

a patternurilor, stabilitate mecanica si chimica superioara, si mai mult, posibilitatea de refolosire in

experimente multiple, printr-o curatare relativ usoara.

5

Figura 4. Gauri realizate prin iradiere directa cu laserul ps pentru o folie de hotel inoxidabil de 1

mm (a) si 0.5 mm (b). Imaginile din stanga reprezinta fata de intrare a laserului, cele din dreapta

fata de iesire. Imaginile de sus sunt realizate dupa prelucrare iar cele de jos dupa curatare. Bara de

marire este 200 µm in toate imaginile.

Am ales astfel sa utilizam sticle fotosensibile comerciale (Foturan), datorita avantajelor

enumerate mai sus. Cu toate acestea, protocolul de fabricare a mastilor este mai laborios, consumator

de resurse si timp deoarece consta in trei pasi succesivi, descrisi schematic in Figura 5. In prealabil,

sticlele avand dimensiunile 10 × 10 × 0.5 mm3, au fost curatate in bai cu ultrasunete succesive de

acetona, etanol si apa deionizata de cate 15 minute, urmate de uscare in flux de azot. Dupa realizarea

designului CAD/CAM al formelor si dimensiunii patternurilor, cat si a distantei de separare dintre

acestea, am realizat iradierea sticlelor fotosensibile cu pulsuri laser avand durata in domeniul

picosecundelor. Iradierile au fost realizate intr-o camera curata cu platforma de procesare descrisa mai

sus. Un exemplu reprezentativ al designului unei masti este prezentat in Figura 6, si contine forme

geometrice diferite (triunghi, patrat, cerc), avand dimensiuni in domeniul 50-500 µm. Primele teste au

fost efectuate la lungimea de unda de 532 nm, cu o viteza de scanare intre 0.05 si 0.1 mm/s, si o latime

a liniei de 10 µm. Fiecare pattern este realizat asadar prin iradierea unor forme cu dimensiuni din ce

in ce mai mici, plecand de la dimensiunea finala pe care dorim sa o obtinem. Initial scrierea laser a

formei se realizeaza pe suprafata sticlei, urmata de repetarea protocolului prin iradieri in volum, la

adancimi controlabile prestabilite. Am realizat un studiu parametric in care am investigat influenta

lungimii de unda (UV versus VIS) si a energiei, la rate de repetitie mari (500 kHz) pentru foto-

inscriptionarea substraturilor de sticla. Scopul a fost stabilirea unui protocol avansat pentru

identificarea conditiilor optime de procesare laser a mastilor.

Dupa iradiere, probele au fost supuse unui tratament termic la temperaturi si intervale de timp

specifice (Figura 5) pentru modificarea zonelor iradiate. Protocolul pentru tratamentul termic al

probelor, rezultat dupa optimizari multiple este descris in Figura 7. Pe scurt, probele au fost incalzite

pana la 500°C cu o rata de incalzire de 5°C/minut, mentinute 60 minute la aceasta temperatura,

incalzite pana la 605°C cu o rata de 3°C/minut, urmata de o noua mentinere la aceasta temperatura

pentru 60 de minute.

Figura 5. Reprezentarea schematica a protocolului pentru fabricarea laser a mastilor din sticla.

Ultimul pas din protocolul de fabricare a mastilor il repezinta corodarea chimica preferentiala

a zonelor iradiate si tratate termic din sticle. Experimentele au fost realizate sub nisa, utilizand 60 ml

de solutii de acid fluorhidric cu concentratia de 10%, timp de 20 de minute in baia cu ultrasunete. Dupa

corodare, probele au fost spalate de mai multe ori cu apa deionizata si uscate in flux de azot.

6

Figura 6. Exemplu de design CAD/CAM pentru fabricarea laser a mastilor din sticla.

Figura 7. Protocolul de tratament termic aplicat pentru fabricarea mastilor din sticla.

Imagini de microscopie optica ale probelor iradiate si tratate termic si corodate chimic sunt

prezentate in Figura 8.a si b. Asa cum se poate observa din imagini, mastile fabricate pe baza

protocolului substractiv de fabricare laser, ofera posibilitatea obtinerii de patternuri cu forme

geometrice si dimensiuni diverse cu o rezolutie spatiala mult imbunatatita fata de testele realizate pe

materiale metalice si polimeri. Ne asteptam la o posibila imbunatatire a calitatii acestora ca urmare a

iradierii cu lungimi de unda UV (355 nm) a acestora, asa cum vom vedea in continuare.

Figura 8. Imagini de microscopie optica a patternurilor rezultate dupa tratamentul termic a) si

corodare chimica b) pentru fabricarea mastilor din sticla. Bara de marire 500 µm.

7

In continuare, am trecut la realizarea de masti continand patternuri cu care vom putea investiga

pe aceeasi MiniBioPlatforma atat efectul formei, cat si al periodicitatii acestora. Am folosit de asemea

sticle fotosensibile, dar care au fost microprocesate cu laserul cu picosecunde ca urmare a iradierii UV

(355 nm). Am realizat designul CAD/CAM ce este reprezentat schematic in Figura 9. Am pregatit

astfel seturi de masti distincte ce contin patternuri de 100, 200, 300 si 500 µm, dar in care pentru fiecare

masca a fost variata periodicitatea. Putem deja anticipa fabricarea de platforme MiniBioLab

multiple pentru aplicatii biomedicale dintre cele mai diverse. O reprezentare schematica a cestora

este prezentata on Figura 9. Asadar, fiecare masca de sticla (10 × 10 mm2) a fost impartita in patru arii

egale. In fiecare dintre acestea am fabricat matrici de patternuri (5 × 5) separate de distante variabile.

Figura 9. Reprezentare schematica a noilor masti pentru testarea simultana a dimensiunii, formei

geometrice si periodicitatii patternurilor.

Imagini reprezentative ale acestora sunt prezentate in Figurile 10 si 11. Am prezentat

comparativ imagini ale mastilor dupa tratamentul termic si dupa corodarea chimica a acestora pentru

diferite forme si dimensiuni ale patternurilor. Putem astfel observa atat o rezolutie spatiala imbunatatita

in comparatie cu foliile metalice micro-procesate, dar si o reproductibilitate foarte buna.

Figura 10. Imagini ale mastilor fabricate in sticle fotosensibile avand forme circulare si dimensiuni

intre 100 si 500 µm, prezentate dupa tratamentul termic si respectiv dupa corodare chimica.

8

Figura 11. Imagini ale mastilor fabricate in sticle fotosensibile avand forme patrate si dimensiuni

intre 100 si 500 µm, prezentate dupa tratamentul termic si respectiv dupa corodare chimica.

Activitatea urmatoare a constat in testarea procedeului ADD-MAPLE (din engleza Additive

Matrix-Assisted Pulsed Laser Evaporation) pentru fabricarea de patternuri cu forme, dimensiuni si

periodicitati diferite. Tehnica ADD-MAPLE, implementata in cadrul acestui proiect are la baza

protocolul experimental descris in capitolele de carte publicate de membri echipei [9,10]. Pe scurt,

aceasta consta in iradierea unei tinte criogenice cu un laser cu excimeri (KrF*, λ = 248 nm, τ = 25 ns)

in interiorul unei camere de reactie (Figura 12).

Figura 12. Reprezentare schematica a montajul experimental pentru sinteza de patternuri

prin tehnica ADD-MAPLE (a), imagini din timpul sintezei patternurilor (b).

Principala deosebire fata de metoda de Depunere Laser Pulsata (PLD - din engleza Pulsed Laser

Deposition), o reprezinta pregatirea si iradierea tintei. In cazul MAPLE, materialul de transferat in

proportie de pana la 10 %wt este dizolvat intr-un solvent corespunzator iar solutia rezultata este

inghetata in azot lichid pentru a obtine o tinta solida criogenica. Tinta este racita continuu pe durata

9

procesului MAPLE cu ajutorul unui dispozitiv „cooler” din cupru, prin care se circula in permanenta

azot lichid (Figura 12.b). Solventul trebuie sa indeplineasca mai multe caracteristici cum ar fi: sa nu

interactioneze cu materialele de interes, sa fie volatil si sa absoarba lungimea de unda a laserului folosit

pentru evaporare.

In cadrul acestei activitati am ales sa testam metoda ADD-MAPLE pentru transferul si

asamblarea sub forma de patternuri a unor precursori carbonici. Este vorba de un amestec de materiale

polimerice, cu care am demonstrat ca putem obtine filme subtiri de Carbon poros [11], si pe care dorim

de asemenea sa-l folosim pentru eliberarea de inhibitori BRAF si HDAC. In urma iradierii tintelor,

solventul este evaporat si evacuat de sistemul de pompaj, iar materialul de interes este colectat pe

substraturi plasate paralel cu tinta, la o distanta variabila de cativa cm pentru crearea patternurilor.

Tinta este rotita in permanenta cu o frecventa variabila, pentru a evita gaurirea si a asigura conditii de

iradiere identice pentru fiecare puls laser consecutiv. Inainte de depuneri substraturile (Siliciu si sticla)

au fost curatate in bai succesive de acetona, etanol si apa deionizata intr-o baie cu ultrasunete. In timpul

depunerilor, este posibila incalzirea controlata a substraturilor (sub pragul de descompunere a

materialelor de interes) pentru a elimina solventul, si pentru a imobiliza pe suporti filme cu aderenta

crescuta. Grosimea filmelor poate fi controlata cu mare precizie prin controlul parametrilor de iradiere

(lungime de unda, fluenta laser, numarul de pulsuri aplicat si rata de repetitie a acestora).

Conditiile experimentale pentru sinteza patternurilor sunt descrise in Referinta [11]. Pe scurt,

tinta criogenica continand precursorii carbonici a fost iradiata cu un laser cu excimeri KrF*. Laserul a

fost setat la o energie de 150 mJ si operat la o rata de repetitie de 5 Hz. Ca urmare a focalizarii intr-un

spor de 30 mm2 omogenizat, fluenta laser pe suprafata tintelor a fost de 0.5 J cm-2. Experimentele au

fost realizate intr-o incinta vidata, la o presiune partiala de 10-1 mbar, distanta de separare tinta substrat

fiind de 5 cm. Am aplicat cate 3000 de pulsuri laser consecutive pentru sinteza tuturor patternurilor.

Montajul experimental, inainte si dupa experimentele ADD-MAPLE de sinteza a micro-structurilor

este prezentat in Figura 13. Patternurile au transferate pe substraturi de Siliciu, ce au fost curatate

conform ptotocolului descris anterior. Imaginea tintei dupa realizarea experimentului este prezentata

in insetul figurii.

Figura 13. Suport pentru masti si substraturi de Si inainte (stanga) si dupa depunere (dreapta).

Vom prezenta in continuare imagini reprezentative cu patternurile sintetizate in cadrul

proiectului prin tehnica ADD-MAPLE (Figura 14). Asa cum se poate observa din imagini, fiecare

substrat de Si, cu dimensiunea de ~10 × 10 mm2, contine cate 4 zone cu retele de 5 × 5 patternuri cu

dimensiuni de 100, 200, 300 si 500 µm, si periodicitati diferite. Este o prima confirmare a faptului ca

metoda functioneaza foarte bine, si ca activitatea propusa a fost indeplinita cu succes.

10

Figura 14. Imagini cu mastile si patternurile transferate pe substraturi de Siliciu.

Analiza detaliata a patternurilor obtinute prin protocolul ADD-MAPLE este prezentata in

continuare. Asa cum spuneam, ne-am propus testarea posibilitatii de obtinere de forme geometrice,

dimensiuni si periodicitati diferite si mai mult decat atat, controlate. Vom prezenta in continuare

imagini de microscopie pentru a investiga patternurile obtinute (Figura 15).

Figura 15. Imagini ale patternurilor transferate pe substraturi de Siliciu. Sus – Patternuri cu forme

patrate cu dimensiuni intre 100 si 500 µm si periodicitati diferite. Jos – aceleasi tipuri de structuri,

dar cu forme circulare.

Imagini SEM reprezentative ale unor patternuri circulare cu diametrul de aproximativ 200 µm

si periodicitati diferite sunt prezentate in Figura 16. Putem observa o similitudine cu imaginile de

microscopie optica, distantele de separare din imagini fiind in concordanta. Mai mult, efectul de

„umbrire”, ce apare frecvent in Figurile 14 si 15 este mult mai putin evident, merginile patternurilor

fiind mult mai bine definite. Rezultate fizico-chimice suplimentare ca urmare a investigatiilor (AFM,

FTIR, Raman, UV-Vis, …) a acestor compusi transferati se regasesc in Referinta [11].

11

Figura 16. Imagini SEM ale unor patternuri circulare cu diametrul de 200 µm si periodicitati

diferite transferate pe substraturi de Siliciu.

Studii recente, au demonstrat necesitatea absoluta de a crea suprafete bioactive inteligente

pentru a controla comportamentul celular, si mai mult, pentru a raspunde unor probleme clinice

specifice [12]. Stiintele combinatoriale in intreg spectrul lor de aplicatii, s-a situat in fruntea celor mai

eficiente domenii de cercetare deoarece s-au realizat progrese remarcabile in domenii diverse ale

nanostiintelor si nanotehnologiilor [13,14].

Sinteza de filme subtiri combinatoriale din materiale hibride prin Evaporare Laser Pulsata

Asistata Matriceal Combinatoriala sau C-MAPLE (din engleza Combinatorial Matrix-Assisted Pulsed

Laser Evaporation) a fost introdusa pentru prima data de catre membri echipei proiectului (Sima si

Axente et al. [15, 16]). Am demostrat recent posibilitatea de a controla proprietatile materialelor

(morfologie si/sau caracteristici chimice de suprafata) pentru a genera acoperiri bioactive, capabile sa

moduleze si sa controleze comportamentul celular [15,16].

In cadrul acestui proiect, am utilizat tehnica C-MAPLE pentru identificarea concentratiilor de

inhibitori ce vor fi transferati sub forma de patternuri, din matrici de GFN functionalizate cu proteine.

Pe scurt, in geometria de iradiere de baza, doua tinte criogenice sunt evaporate simultan de catre doua

fascicule laser. Designul experimental utilizat de noi a constat in divizarea optica a fasciculului unui

laser in doua fascicule, si focalizarea acestora pe suprafata tintelor, fiecare continand solutii din

materiale diferite, solidificate prin imersare in azot lichid. Materialele evaporate sunt colectate si

asamblate sub forma de filme subtiri pe substraturi solide, dar in acelasi timp este generat natural un

gradient compozitional datorita inter-amestecului celor doua fluxuri de molecule evaporate. Procesul

este controlat prin ajustarea independenta a parametrilor experimentali (realizarea protocolului de

procesare), pentru fabricarea de filme subtiri combinatoriale hibride, uniforme si functionale. Marea

versatilitate a metodei permite asadar controlul parametrilor cheie de depunere cum ar fi: fluenta laser

si rata de repetitie, tipul atmosferei de lucru si presiunea dinamica din interiorul camerei de reactie,

numarul de pulsuri laser ce va fi aplicat pentru fiecare compus, distanta de separare tinta-substrat si

distanta de separare dintre spoturile laser focalizate pe suprafata tintelor pentru controlul dispersiei

moleculelor evaporate. In plus, distributii compozitionale variate in cadrul bibliotecilor pot fi obtinute

usor prin simpla modificare a concentratiei initiale a materialelor de interes din compozitia tintelor

criogenice.

Stadiul cercetarilor dar si principale provocari in sinteza laser de biblioteci combinatoriale de

filme subtiri pentru aplicatii biomedicale a facut obiectul redactarii unui capitol ce a fost acceptat

pentru publicare in cartea “Advances in the Application of Lasers in Materials Science”, Editori M.

Dinescu. D.B. Geohegan, A. Miotello si P.M. Ossi, ce va fi publicata de editura Springer in 2018.

Titlul capitolului este “Combinatorial laser synthesis of biomaterial thin films: selection and

processing for medical applications”, avand ca autori pe: Emanuel Axente, Carmen Ristoscu,

Adriana Bigi, Felix Sima, si Ion N. Mihailescu, si aduce multumiri proiectului 131PED – MiniBioLab.

12

Mai mult, interesul comunitatii stiintifice pentru Nanomaterialele din Familia Grafenelor este

foarte ridicat, tocmai datorita proprietatilor fizico-bio-chimice fascinante ale acestora. Am redactat

astfel un capitol de carte ce prezinta un review critic asupra ultimilor progrese din domeniu, privind

sinteza, functionalizarea si aplicatiile grafenelor si derivatilor acestora in nanomedicina, cat si posibile

dezvoltari ulterioare. Capitolul nostru este intitulat “Recent Advances of Graphene Family

Nanomaterials for Nanomedicine”, avand ca autori pe Irina NEGUT, Valentina GRUMEZESCU,

Livia SIMA* si Emanuel AXENTE*, si va fi publicat de catre editura Elsevier in 2018 in cartea

“Fullerens, Graphenes and Nanotubes: A Pharmaceutical Approach” 1st Edition, ISBN

9780128136911, ce aduce de asemena multumiri proiectului 131PED – MiniBioLab.

In cadrul acestei etape, am realizat sinteza de biblioteci combinatoriale de filme subtiri din

amestecurile GFN-BSA (GONB) si inhibitori prin C-MAPLE utilizand conditiile experimentale din

Tabelul 1.

Tabelul 1. Conditiile experimentale de sinteza a filmelor subtiri GONB-INH prin C-MAPLE.

Cod Tinta Substrat d

(cm)

Energie

(mJ)

Spot

(mm2)

Presiune

(mbar)

Rata

rep.

(Hz)

t°

(C)

No

pulsuri

GON-

BSA-

TSA

(x3)

GON-

BSA-

TSA

5x Sticla in

gradient

1x Siliciu 4

115

~13 2-4x10-2 10 RT

25000

25000

24500

GON-

BSA-

DAB

(x3)

GON-

BSA-

DAB

5x Sticla in

gradient

1x Siliciu 4

105

~10 2-4x10-2 10 RT

25000

25000

In continuare am realizat experimente ADD-MAPLE pentru transferul de materiale GFN

functionalizate prin masti fabricate conform detaliilor prezentate anterior. In Figura 17 sunt prezentate

imagini de microscopie a patternurilor obtinute. Acestea au forme si dimensiuni diferite ce variaza

intre 50 si 500 µm. Am investigat de asemenea suprafetele patternurilor prin profilometrie optica si

am obtinut detalii despre rugozitatea acestora. Putem evidentia astfel patternuri uniforme, cu grosimi

in intervalul 600-650 nm obtinute prin ADD-MAPLE. Au fost realizate de asemenea cu sistemul

DSA25 (Drop Shape Analizer) masuratori de unghi de contact si energia libera a suprafetelor

nanocompozitelor GONB-INH, datele fiind in curs de prelucrare.

Figura 17. Imagini SEM ale unor patternuri circulare cu diametrul de 200 µm si periodicitati

diferite transferate pe substraturi de Siliciu.

13

Caracterizarea in vitro avansata a structurilor nanocompozite

Selectia liniilor celulare si achizitia materialelor; Metode experimentale in vitro.

Linii celulare. In cadrul proiectului a fost folosit un panel de liniile celulare umane model din stocurile

Institutului de Biochimie, cum sunt:

a. melanocite normale, pigmentate (NHEM, Lonza CC-2504),

b. celule de melanom amelanotice (SKmel28 BRAF V600E),

c. celule de melanom pigmentate (SKmel23 BRAF wt).

d. fibroblaste dermale umane, utilizate ca si control.

Microscopie de imunofluorescenta pentru testarea efectului inhibitorilor. Am monitorizat prin

microscopie de fluorescenta expresia proteinei ERK fosforilate si a histonei 3 acetilate folosind

anticorpi anti-fosfo-ERK si anti-histona 3 acetilata. Dupa 72 de ore de cultivare in prezenta filmelor

de GONB ce incorporeaza inhbitori ce tintesc fie BRAF fie enzimele responsabile de deacetilarea

histonelor (HDAC), celulele au fost spalate cu PBS pentru indepartarea celulelor neatasate si a

proteinelor serice. Celulele aderate au fost fixate in urmatoarele conditii:

- pentru marcarea proteinei pERK celulele au fost fixate cu o solutie PFA 4%, pentru 15 minute

la temperatura camerei;

- pentru marcarea acetil histonei 3 celulele au fost fixate cu o solutie de metanol 100% pentru

5 min la -20 °C.

Celulele fixate au fost incubate, pentru o ora la temperatura camerei, intr-o solutie continand

BSA 1% și ser normal de capra 10%, in solutie PBS-Tween 0.1 % - glicina 0.3 M, pentru blocarea

situsurilor de legare nespecifice. Incubarea cu anticorpi primari a fost realizata in aceeasi solutie peste

noapte la 4°C:

-anticorpii primari anti-pERK (1:1000) peste noapte la 4°C;

-anticorpi primari fata de acetil histona 3 (1:1000) peste noapte.

Dupa indepartarea excesului de anticorp primar legat nespecific prin spalari repetate, detectia

antigenelor a fost realizata cu anticorpi secundari cuplati cu Alexa Fluor 594 pentru fiecare preparat

timp de jumatate de ora la temperatura camerei. Simultan s-a realizat si marcarea faloidinei cuplata cu

Alexa Fluor 488 pentru preparatele marcate cu anticorpi pentru pERK. Dupa indepartarea excesului

de anticorp legat nespecific, nucleii celulelor au fost marcati cu Hoechst - un colorant ce se leaga

specific de ADN-ul dublu catenar. Ulterior preparatele au fost montate pe lame utilizand Prolong Gold

Antifade Reagent ca mediu de montare. Celulele au fost vizualizate si analizate la microscopul ZEISS

Axio Imager Z1.

Identificarea raportului optim de inhibitori BRAFi si HDACi

Figura 18. Efectul eliberarii DAB si TSA din filme subtiri, asupra celulelor distribuite pe

intrega suprafata a dispozitivului ce contine filmele de compusi depuse prin C-MAPLE . Celulele au

14

fost marcate cu anticorpi anti-fosfo-ERK sau acetil histona, cuplata cu marcarea nucleilor utilizand

Hoechst.

In vederea identificarii unui raport optim al concentratiilor inhibitorilor folositi a fost comparat

efectul citotoxic al inhibitorilor eliberati din filme subtiri depuse prin C-MAPLE din tinte criogenice

de GONB cu inhibitor BRAF (DAB), in gradient compozitional (C1-C4) si GONB cu inhibitor HDAC

(TSA), in gradient compozitional (C3-C1). S-a observat ca pentru ambii inhibitori concentratia optima,

cu un efect vizibil este la nivelul concentratiei maxime folosite, respectiv concentratia C1 pentru DAB

si concentratia C3 pentru TSA.

Studiile prezentate anterior pentru a determina corelatia compozitie-structura proprietati au fost

corelate cu evaluarea parametrilor optimi pentru evaluarea aspectelor biologice si biomedicale. In

prima etapa am urmarit evaluarea potentialului citotoxic al filmelor de nanoparticule de grafene

oxidate, si apoi am evaluat efectul inhibitorilor selectati asupra celulelor de melanom, dupa

incorporarea lor in matricea de grafene. Pentru a atinge acest obiectiv au fost folosite pentru

experimente linii de melanom in paralel cu linii celulare normale (fibroblaste sau melanocite) cultivate

2D pe suprafata grafenelor. In aceasta etapa am determinat expresia proteinei ERK fosorilate (pERK)

si traslocarea nucleara a acesteia in celule normale: fibroblaste dermale-FBD si melanocite umane

normale-NHEM si celule de melanom: SK23, linie de melanom metastatic care exprima B-Raf normal,

SK28 linie de melanom metastatic care exprima B-Raf cu mutatia V600E, ceea ce activeaza constitutiv

aceasta enzima. In Figura 19 se observa ca inhibitori ai B-Raf nu afecteza celulele normale FBD si

NHEM, insa acestia afecteaza proliferarea celulelor de melanom SK28, observandu-se o reducere a

expresiei proteinei pERK.

Figura 19. Imagini de microscopie de fluorescenta obtinute pe celule de melanom uman si

celule din piele normala cultivate pe filme subtiri depuse prin C-MAPLE din tinte criogenice de

pERK Nuclei

DAB

15

GONB cu inhibitor BRAF (DAB), in gradient compozitional (C1-C4). Celulele au fost marcate cu

anticorpi anti-fosfo-ERK pentru punerea in evidenta a starii de activare a caii MAPK si in paralel

nucleii celulelor au fost marcati cu Hoechst.

De asemenea, folosind liniile celulare de melanom SK23 si SK28 si linia de melanocite normale

(NHEM) am urmarit expresia acetil-histonei H3 in celulele care au fost crescute pe filme subtiri in

prezenta inhibitorului proteinei HDAC (TSA) pentru a determina eficienta acestui inhibitor ce este

corelata cu acumularea de histone acetilate in nucleu. Dupa cum se observa in Figura 20, in liniile

celulare de melanom observam o crestere a acetilarii histonei H3 corelata cu concentratia de inhibitor

depusa in stratul subtire.

Figura 20. Imagini de microscopie de fluorescenta obtinute pe celule de melanom uman si

melanocite normale cultivate pe filme subtiri depuse prin C-MAPLE din tinte criogenice de GONB

cu inhibitor HDAC (TSA), in gradient compozitional (C1-C4). Celulele au fost marcate cu anticorpi

anti-acetil Histona H3 pentru punerea in evidenta a acumularii histonelor acetilate in nucleu in

prezenta inhibitorului proteinei HDAC (TSA) si Hoechst pentru marcarea nucleilor.

Pe baza observatiilor de mai sus, am decis sa testam efectul amestecului celor doi inhibitori

depusi simultan in stratul subtire asupra liniilor de melanom uman model. Astfel, dupa 72 de ore de la

insamantare, celulele crescute pe filmele de GONB ce incorporeaza cei doi inhibitori au fost fixate si

pregatite pentru imuonfluorescenta urmarind protocolul descris mai sus. In figura 21 sunt prezentate

Acetil-Histona Nuclei

TSA

16

imagini corespunzatoare pentru celulele SK23 (ctrl) si SK28 (BRAF V600E) care au fost marcate cu

anticorpi fata de proteina pERK, a carei expresie scade in linia SK28 proportional cu concentratiile

folosite de inhibitori, sugerand faptul ca inhibitorii incorporati in nanostructuri sunt eliberati si

actioneaza eficient asupra celulelor de melanom.

Celule de melanom SK28 si melanocitele, NHEM, crescute in aceleasi conditii ca mai sus au

fost folosite pentru monitorizarea expresiei histonei 3 acetilate cu anticorpi specifici. Imagini

reprezentative sunt prezentate in Figura 22.

Figura 21. Imagini de microscopie de fluorescenta obtinute pe celule de melanom uman SK23 si

SK28 cultivate pe filme subtiri depuse prin C-MAPLE din tinte criogenice de GONB cu gradient

combinatorial de inhibitori BRAF (DAB) si HDAC (TSA), in patru concentratii diferite (C1-C4).

Celulele au fost marcate cu anticorpi anti-fosfo-ERK pentru punerea in evidenta a starii de activare

a caii MAPK; marcarea nucleilor a fost facuta cu Hoechst.

DAB TSA

17

Figura 22. Imagini de microscopie de fluorescenta obtinute pe celule de melanom uman SK28 si

melanocite (NHEM) cultivate pe filme subtiri depuse prin C-MAPLE din tinte criogenice de GONB

cu gradient compozitional de inhibitori HDAC (TSA) si B-Raf (DAB), in patru concentratii diferite.

Celulele au fost marcate cu anticorpi anti-acetil Histona H3 pentru punerea in evidenta a acumularii

histonelor acetilate in nucleu in prezenta inhibitorului HDAC (TSA) si Hoechst pentru maracrea

nucleilor.

In continuare ne propunem sa analizam efectul inhibitorilor prin testarea efectului acestora in

culturi 3D, pentru care am demarat experimentele de optimizare a cresterii celulelor pe suprafete de

plastic cu aderenta redusa, pentru a obtine sferoizi functionali care vor fi folositi pentru testarea

eficientei inhibitorilor descrisi mai sus. Pe baza acestei expuneri de motive apreciem ca obiectivele

propuse in cadrul acestui contract pentru anul 2017 au fost pe deplin indeplinite si asigura

premisele continuarii activitatilor prevazute pentru anul urmator.

Rezultate livrate Etapa I:

√ 1. Am elaborat un protocol elaborat pentru fabricarea laser a mastilor; un montaj experimental al

tehnici laser ADD-MAPLE si am realizat seturi de masti cu forme, dimensiuni si periodicitati specifice.

√ 2. Am efectuat experimente complexe pentru identificarea amestecului optim de inhibitori in

nanostructuri pentru inhibitori cu coeficientul IC50 in domeniul nM. Am elaborat un protocol ADD-

MAPLE pentru cresterea de patternuri cu forme complexe (pentru materiale specifice), care pastreaza

proprietatile materialelor initiale.

√ 3. Am realizat multiple bioplatforme miniaturizate constand in 100 de patternuri cu forme,

dimensiuni si periodicitati diferite pe suprafete de 10 x 10 mm2, caracterizate prin diverse metode ex-

Acetil-Histona Nuclei DAB TSA

18

situ. Am investigat in-vitro dozarea inhibitorilor si raspunsul celular fata de caracteristicile

suprafetelor. Am demarat teste preliminare pentru investigarea tumorigenicitati si cultura de sferoizi

3D ce vor continua in 2018. Am realizat premisele pentru realizarea si a altor tipuri de patternuri

pentru alte tipuri de cancer sau boli degenerative.

√ 4. A fost realizat website-ului dedicat proiectului care este activ la adresa

http://lspi.inflpr.ro/2017/PED/PED131/Home.html.

√ 5. Au fost acceptate spre publicare doua capitole de carte: unul privind sinteza laser avansata de

filme subtiri combinatoriale pentru aplicatii biomedicale si unul referitor la utilizarea

nanomaterialelor din familia grafenelor pentru nanomedicina care aduc multumiri proiectului. Au

fost efectuate prezentari de postere la conferinte internationale si nationale, care au adus multumiri

proiectului. Am demarat redactarea unui Brevet pe tematica proiectului.

√ 5. A fost redactat prezentul raport stiintific si s-a realizat raportul financiar aferent acestei etape a

proiectului.

In numele Echipei proiectului 131PED,

Director proiect,

Dr. Emanuel AXENTE

Referinte: [1] B.W. Stewart, C.P. Wild, editors (2014). World Cancer Report 2014. Lyon, France: International Agency

for Research on Cancer, ISBN 978-92-832-0429-9.

[2] http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/melanoma/patient.

[3] J. Li et al., Recent advances in targeted nanoparticles drug delivery to melanoma, Nanomedicine:

Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11 (2015) 769–794.

[4] J. Liu et al., Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nature Mater. 11, 734-741

(2012).

[5] Y. Tan et al., Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and

Sox2 expression. Nature Commun. 5, 4619 (2014).

[6] J. Lee et al., Interfacial geometry dictates cancer cell tumorigenicity, Nature Materials (2016),

doi:10.1038/nmat4610.

[7] Vigushin DM, et al. Clin Cancer Res, 2001, 7(4), 971-76.

[8] Richon VM, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(6), 3003-3007.

[9] Axente E, Sima F, et al. “Biopolymer thin films synthesized by advanced pulsed laser techniques” Chapter

4, in "Recent Advances in Biopolymers", Ed. F. Parveen, InTech ISBN 978-953-51-4613-1, 2016.

[10] Sima F, Axente E et al. “Bioresponsive surfaces and interfaces fabricated by innovative laser approaches”

Chapter 12, in “Advanced Materials Interfaces” (eds A. Tiwari, H. K. Patra and X. Wang), John Wiley & Sons,

Inc., Hoboken, NJ, USA. doi: 10.1002/9781119242604.ch12, ISBN 9781119242451, 2016.

[11] Axente E, Sopronyi M, Matei Ghimbeu C, Nita C, Airoudj A, Schrodj G, Sima F „Matrix-Assisted Pulsed

Laser Evaporation: A novel approach to design mesoporous carbon films” Carbon 122 (2017) 484-495.

[12] Hanawa, T., Biofunctionalization of metallic materials: creation of biosis–abiosis intelligent interface, in

Interface Oral Health Science 2014. 2015, Springer. p. 53-64.

[13] Wang, X. and X. Sun, G. Bricen o, Y. Lou, K.-A. Wang, H. Chang, WG Wallace-Freedman, S.-W. Chen

and PG Schultz. Science, 1995. 268: p. 1738-1740.

[14] Buenconsejo, P.J.S., et al., A New Prototype Two‐Phase (TiNi)–(β‐W) SMA System with Tailorable

Thermal Hysteresis. Advanced Functional Materials, 2011. 21(1): p. 113-118.

[15] Sima, F., et al., Combinatorial matrix-assisted pulsed laser evaporation: single-step synthesis of biopolymer

compositional gradient thin film assemblies. Applied Physics Letters, 2012. 101(23): p. 233705.

[16] Axente, E., et al., Combinatorial MAPLE gradient thin film assemblies signalling to human osteoblasts.

Biofabrication, 2014. 6(3): p. 035010.