UNIVERSITATEA DIN CRAIOVA
Școala Doctorală de Științe
Domeniul Fizică
TEZĂ DE DOCTORAT
- REZUMAT -
PROCESARE LASER DE BIOPOLIMERI:
APLICAȚII ÎN BIOLOGIE ȘI MEDICINĂ
Conducător științific: Prof. C.S. I Dr. Maria Dinescu
Doctorand: Simona Brajnicov
Craiova
2019
2
Mulțumiri
Doresc să încep prin a mulțumi membrilor comisiei de evaluare a tezei de doctorat: C.S. I Dr. Mariana
Braic, C.S. II Dr. Alexandra Palla-Papavlu, Prof. Univ. Dr. Cristian Focșa, care au dedicat timp și energie
pentru citirea și evaluarea acestei teze de doctorat.
Aș dori sa îi mulțumesc doamnei Prof. Dr. Maria Dinescu pentru îndrumarea și încrederea pe care mi
le-a oferit încă de la primii pași făcuți în grupul „Procesare fotonică de materiale avansate” din cadrul
Institutului Național de Cercetare Dezvoltare pentru Fizica Laserilor, Plasmei și Radiației. Îi mulțumesc pentru
oportunitățile și sprijinul oferit pentru a mă dezvolta din punct de vedere profesional și nu numai.
De asemenea, le mulțumesc tuturor colegilor mei din grupul „Procesare fotonică de materiale
avansate” pentru ajutorul și sfaturile oferite ori de câte ori am avut nevoie.
În mod special, aș dori să le mulțumesc Valentinei Dincă, Andreei Matei, Alexandrei Palla-Papavlu,
lui Antoniu Moldovan și Mihaelei Filipescu pentru ajutorul necondiționat, răbdarea și înțelegerea cu care m-
au înconjurat permanent. Le sunt de-a dreptul recunoscătoare pentru susținerea, încurajările și sfaturile care
mi-au fost de mare folos pe tot parcursul tezei de doctorat și îmi vor fi de folos și pe viitor.
Mulțumesc doamnei Dr. Anișoara Cîmpean și doamnei Dr. Patricia Neacșu de la Facultatea de
Biologie a Universității din București, dar și doamnei Dr. Alina Vasilescu de la Centrul Internațional de
Biodinamică pentru contribuția adusă acestei tezei de doctorat.
Le mulțumesc pentru suport și disponibilitate colegilor din grupul „Procese în Plasmă pentru Materiale
Funcționale și Suprafețe”.
Doresc să le mulțumesc pe această cale prietenilor mei pentru toată dragostea, discuțiile constructive
și sacrificiile pe care le-au făcut pentru mine.
În cele din urmă, mulțumesc familiei mele și lui Ionuț pentru iubirea și sprijinul pe care mi le-au oferit
întotdeauna.
Toate mulțumirile sunt adresate din inimă și cu recunoștință!
3
PROCESARE LASER DE BIOPOLIMERI: APLICAȚII ÎN BIOLOGIE ȘI
MEDICINĂ
Cuprins:
1. Introducere ..................................................................................................................................................... 4
2. Structura tezei și o scurtă descriere a conținutului fiecărui capitol ............................................................... 5
3. Concluziile rezultatelor cercetărilor efectuate în cadrul prezentei teze de doctorat .................................... 19
3.1. Articole în reviste cotate ISI în perioada 2016-2019 ............................................................................ 19
3.2. Prezentări la conferințe internaționale .................................................................................................. 20
3.3. Participări la școli de vară și sesiuni științifice ..................................................................................... 21
4. Bibliografie .................................................................................................................................................. 22
4
1. Introducere
Tehnicile de depunere cu lasere sunt din ce în ce mai des utilizate în domeniul materialelor organice
și anorganice. Un progres tehnologic semnificativ îl constituie dezvoltarea tehnicilor de obținere a filmelor
subțiri, datorită necesității utilizării acestora într-o arie vastă de aplicații în domenii precum electronică,
senzoristică, optică, farmacologie, biologie sau medicină. În ceea ce privește filmele subțiri folosite pentru
aplicații în biologie și medicină, polimerii, proteinele, și bacteriile joacă un rol important. În funcție de tipul și
domeniul aplicației, polimerii pot fi folosiți sub formă de microemulsii, microsfere, hidrogeluri sau straturi
subțiri.
În particular, datorită proprietăților specifice, precum stabilitate în mediu biologic, rezistență
mecanică, protecție împotriva coroziunii sau biocompatibilitate, polimerii, proteinele și bacteriile pot oferi o
gamă largă de funcționalități, fiind utilizate în diverse aplicații în domeniile biomedicale și farmaceutice ca
materiale ortopedice, suprafețe antibacteriene, straturi cu eliberare controlată de medicamente, inginerie
tisulară și biosenzori [1].
Lucrarea de doctorat cu titlul "PROCESARE LASER DE BIOPOLIMERI: APLICAȚII ÎN
BIOLOGIE ȘI MEDICINĂ" este rezultatul muncii desfășurate în cadrul grupului “Procesare fotonică de
materiale avansate” din Secția Laseri a Institutului Național de Fizica Laserilor, Plasmei și Radiațiilor -
INFLPR în colaborare cu Facultatea de Biologie a Universității din București și cu Centrul Internațional de
Biodinamică. O parte din rezultatele prezentate în această teză au fost obținute în cadrul a trei proiecte naționale
finanțate de CNCS – UEFISCDI: PN-III-P2-2.1-PED-2016-1715 - HERMESH (rezultate prezentate în
capitolul II), PN-II-RU-TE-2014-4-2434 - BIOSINTEL (rezultate prezentate în capitolul III) și PN-III-P2-2.1-
PED-2016-0221 - IPOD (rezultate prezentate în capitolul V).
Obiectivul principal urmărit în această teză de doctorat este obținerea de acoperiri biopolimerice și
antibacteriene, precum și de acoperiri pe bază de materiale compozite hibride prin tehnici bazate pe laser,
pentru aplicații biomedicale și fabricarea de biosenzori.
Dintre tehnicile bazate pe laser, ca de exemplu depunerea laser pulsată (pulsed laser deposition −
PLD), transfer înainte indus laser (laser induced forward transfer − LIFT) și evaporare laser pulsată asistată de
o matrice (matrix assisted pulsed laser evaporation − MAPLE), aceasta din urmă a fost folosită în această teză
pentru obținerea de filme subțiri cu posibile aplicații în biologie și medicină.
Prezenta teză de doctorat a urmărit trei direcții pentru a pune în evidență versatilitatea tehnicii MAPLE
în crearea de interfețe bio funcționale și filme subțiri:
1. Crearea de interfețe bio-funcționale și filme subțiri pentru aplicații legate de funcționalizarea
plaselor comerciale de polipropilenă și poliester utilizate pentru repararea defectelor parietale, cât
și de funcționalizarea implanturilor osoase, și anume obținerea de acoperiri hibride
multifuncționale cu caracteristici chimice și fizice controlate care permit integrarea materialului
protetic străin în organism cu un risc minim de infecții.
5
2. Obținerea de suprafețe funcționalizate bazate pe celule de Micrococcus lysodeikticus (ML), astfel
încât acestea să poată fi folosite ca biosenzori optici celulari.
3. Obținerea acoperirilor de șelac prin metoda MAPLE cu posibile aplicații ca învelișuri enterice
pentru medicamente administrate pe cale orală.
În figura 1 sunt reprezentate schematic direcțiile urmărite în această teză, cât și capitolele în care au
fost descrise rezultatele corespunzătoare.
Figura 1. Reprezentarea schematică a structurii rezultatelor principale din teză.
2. Structura tezei și o scurtă descriere a conținutului fiecărui capitol
Lucrarea „Procesare laser de biopolimeri: Aplicații în biologie și medicină” este structurată în 6
capitole.
Primul capitol, "Metode de depunere pentru obținerea de filme subțiri și tehnicile de
caracterizare folosite" este dedicat unei scurte clasificări a metodelor de depunere utilizate în obținerea de
filme subțiri, unde accentul este pus pe tehnici bazate pe laser, în particular pe metoda de depunere prin
evaporare laser pulsată asistată de o matrice. În acest capitol sunt prezentate: i) montajul experimental MAPLE
folosit pentru realizarea de filme subțiri, ii) tehnicile de investigare ce au fost folosite care oferă informații
legate de proprietățile acoperirilor obținute prin metoda MAPLE și descrise în această teză: microscopia
electronică cu baleiaj (SEM), microscopia de forță atomică (AFM), spectrometria în infraroșu cu Transformată
6
Fourier (FTIR), spectroscopie dispersiva de raze X (EDX), spectroscopie fotoelectronică cu raze X (XPS),
spectroscopie Raman, spectro-elipsometria (SE), precum și iii) determinarea proprietăților de udare și
evaluarea biocompatibilității in vitro.
Tehnica aleasă în experimentele prezentate în această teză pentru obținerea acoperirilor de materiale
cu aplicații biomedicale este evaporarea laser pulsată asistată de o matrice. În figura 2 se poate observa
reprezentarea schematică a tehnicii MAPLE. În ultimii ani, în literatură au fost raportate rezultate remarcabile
cu privire la depunerea unui număr semnificativ de polimeri, compuși bioactivi, proteine, materiale ceramice,
sub formă de filme subțiri prin MAPLE [2,3,4,5,6,7,8,9]. Această tehnică a fost dezvoltată încă de la sfârșitul
anilor 1990, la Naval Research Laboratory SUA [3], pentru transferul materialelor organice și anorganice pe
substraturi solide, dovedindu-se o metodă flexibilă pentru a depune în mod controlat compuși organici,
polimeri, proteine sau materiale biologice [4]. Există diverse aplicații în domeniul medicinei și biologiei,
pentru care MAPLE și-a dovedit versatilitatea în depunerea de polimeri naturali și sintetici [5,6], nanoparticule
[7] sau în încorporarea diverselor medicamente și proteine într-o matrice polimerică [8,9].
MAPLE s-a dovedit a fi eficientă pentru depunerea cu succes a materialelor alese. Chiar dacă este
considerată o tehnică relativ costisitoare (deoarece implică utilizarea surselor de laseri pulsați și a sistemelor
de vid), MAPLE este unică prin faptul că oferă simultan următoarele avantaje: (1) nu există o degradare
semnificativă a polimerului sau a biomaterialului; (2) posibilitatea de a monitoriza și de a controla în timp real
rata de depunere; (3) posibilitatea de a depune în zone selectate, prin utilizarea unor măști adecvate, evitând
astfel necesitatea de modelare ulterioară (litografie), care ar putea altera chimia materialului depus; (4) oferă
o gamă largă de grosimi, de la câțiva nanometri la câtiva microni, cu un control precis al grosimii; (5)
posibilitatea de a controla morfologia suprafeței (rugozitate, granulație etc.) în funcție de cerințele specifice;
(6) posibilitatea de a depune structuri multistrat, unde un strat ar putea fi degradat de solventul stratului
adiacent precum și posibilitatea obținerii de filme compuse prin iradierea unei ținte formate din mai multe
materiale dizolvate în același solvent sau solvenți diferiți [10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22]. În această
teză tehnica MAPLE a fost optimizată pentru obținerea de filme subțiri cu posibile aplicații în biologie și
medicină.
Figura 2. Reprezentarea schematică a tehnicii MAPLE.
7
Cel de-al doilea capitol, "Funcționalizarea de substraturi flexibile pentru aplicații în medicină1",
prezintă o aplicație a tehnicii MAPLE, și anume obținerea de acoperiri hibride pentru plasele comerciale de
polipropilenă și poliester utilizate pentru repararea defectelor parietale.
În prezent, plasele (meșele) sunt cele mai răspândite materiale de implant folosite în chirurgia generală,
peste 20 de milioane de implanturi de acest tip fiind utilizate în fiecare an, în lume [23]. Folosirea plaselor
pentru repararea defectelor parietale este acceptată ca standard general, atât în procedurile minim-invazive
(laparoscopice), cât și pentru procedurile chirurgicale clasice. Peste 70 de tipuri de implanturi de tip plasă sunt
folosite în acest domeniu (chirurgia generală), iar printre cele mai folosite sunt cele pe baza de polipropilenă
(PP) și poliester (PE) datorită proprietăților mecanice, a toleranței biologice optime, a caracterului inert din
punct de vedere chimic, dar și a flexibilității și biocompatibilității acestora [24]. Pe lângă proprietățile fizico-
chimice ale plaselor, un alt aspect ce trebuie considerat este aderența bacteriană la implantul de tip plasă și
formarea unui biofilm ce poate determina necesitatea creșterii dozajului de antibiotic și, în final, îndepărtarea
plasei din corp [25]. Deși utilizarea implanturilor de tip plasă în operațiile chirurgicale este din ce în ce mai
frecventă, integrarea optimă în organism este încă un subiect complex, iar riscul apariției infecției rămâne una
dintre principalele probleme nerezolvate [26].
În acest studiu propunem o soluție inovativă care permite limitarea riscurilor datorate infecțiilor.
Soluția propusă constă în acoperirea plaselor comerciale de polipropilenă și poliester (figura 3) cu filme subțiri
de oxid de polietilenă (PEO), dar și un amestec de oxid de polietilenă și nanotuburi de carbon (CNT) cu ajutorul
tehnicii de depunere MAPLE. Mai multe grupuri de cercetători au realizat deja straturi subțiri polimerice și
hibride folosind tehnica MAPLE. Prin urmare, utilizarea cu succes a tehnicii MAPLE pentru depunerea
filmelor subțiri a fost deja dovedită în mai multe articole publicate [27,28,29,30,31].
Figura 3. Imagini optice ale plaselor de polipropilenă(PP) și poliester(PE) folosite în experimentele de depunere.
1 Această secțiune a tezei a fost publicată în Applied Physics A ((2019) 125:424), titlul articolului fiind
„Tuning the physico-chemical properties of hernia repair meshes by matrix-assisted pulsed laser evaporation”,
autori: Alin, CD; Grama, F; Papagheorghe, R; Brajnicov, S; Ion, V; Vizireanu, S; Palla-Papavlu, A; Dinescu,
M.
8
Noutatea acestei abordări este aplicarea tehnicii MAPLE pentru obținerea de filme subțiri hibride (de
oxid de polietilenă și oxid de polietilenă cu diferite concentrații de nanotuburi de carbon) pentru a fi utilizate
ca straturi cu proprietăți antimicrobiene pentru plasele destinate tratării herniilor. De asemenea, proprietățile
morfologice și chimice ale straturilor subțiri depuse indică faptul că MAPLE este o metodă adecvată pentru
fabricarea de straturi subțiri ce pot fi folosite ulterior pentru eliberarea controlată de medicamente.
Metoda evaporării laser pulsată asistată de o matrice a fost optimizată pentru obținerea de filme subțiri,
cu posibile aplicații ca acoperiri pentru plasele comerciale de polipropilenă și poliester utilizate pentru
repararea defectelor parietale.
Acoperirile au fost obținute prin depunerea (în diferite experimente) de polimeri (PEO), nanotuburi de
carbon, cât și amestecul de oxid de polietilenă și nanotuburi de carbon (amestec PEO:CNT) pe plase pentru
repararea herniei. În figura 4 se pot observa imaginile SEM obținute pe diferite zone ale interfețelor plaselor
folosite în tratarea herniilor din polipropilenă și poliester (imaginile 4.a, 4.b și 4.c), și ale plaselor acoperite cu
un strat subțire de polimer PEO, nanotuburi de carbon sau amestec PEO:CNT (prezentate în imaginile d – g).
Oxidul de polietilenă, nanotuburile de carbon și amestecul de oxid de polietilenă și nanotuburi de
carbon pot fi depuse cu ușurință prin MAPLE, pe o varietate de substraturi. Acoperirile de PEO, CNT și
amestec PEO:CNT au fost depuse prin metode bazate pe laser, direct pe suprafața plaselor comerciale, fără a
fi nevoie de o funcționalizare anterioară a acestora. Au fost depuse acoperiri de PEO, CNT și amestec de
PEO:CNT pe plasele pentru repararea herniilor, fără nicio modificare chimică a materialului depus, fapt
confirmat prin investigațiile morfologice, structurale și optice (AFM și SEM), analiza FTIR, XPS și SE.
Proprietățile optice ale amestecului de PEO:CNT au fost determinate prin spectro-elipsometrie,
punându-se în evidență prezența nanotuburilor de carbon (prin compararea spectrului de absorbție al
materialului depus cu cel al produsului inițial) [32,33]. În plus, proprietățile de udare a suprafețelor plaselor
pentru repararea herniei sunt puternic schimbate după acoperirea cu un strat subțire de polimer PEO, CNT sau
amestec PEO:CNT, de la un caracter hidrofob (unghi de contact între 131° ̶ 96°), la un caracter hidrofil (unghi
de contact între 37° ̶ 11°). În plus o cantitate mai mare de nanotuburi pe suprafața filmelor subțiri hibride, a
condus la o suprafață mai hidrofilă, confirmată prin rezultatele măsurătorilor de unghi de contact. Prezența
nanotuburilor modifică atât topografia cât și chimia suprafețelor acoperite cu straturile protectoare.
În ultimii ani, proprietățile antimicrobiene ale CNT-urilor au beneficiat de o atenție deosebită, astfel
că în viitor ne propunem să investigăm efectul antimicrobian al acoperirilor de amestecuri de polimer cu
nanotuburi de carbon realizate prin MAPLE. În plus, va fi interesant să determinăm cantitatea minimă de
nanotuburi de carbon din amestecurile PEO:CNT care conduce la cel mai mare efect antimicrobian față de
diferite bacterii. Acest studiu oferă o soluție pentru posibile aplicații potențiale pentru repararea herniei.
9
Figura 4. Imaginile SEM ce reprezintă imaginea globala (primele doua coloane) și imaginea unui singur
fir (a treia coloană) ale plaselor comerciale monofilament macroporoase folosite în tratarea herniilor,
înainte și după depunerile prin MAPLE. Pe prima linie sunt imaginile SEM obținute pe diferite zone ale
plaselor din polipropilenă (PP) (a) și poliester (PE) (b) si imaginea mărită a unui singur fir dintr-o plasă
poliester (c), înainte de acoperirea acestora prin MAPLE; pe linia a doua sunt prezentate imaginile SEM
obținute pe diferite zone ale plaselor acoperite cu un strat subțire de polimer PEO (d); pe a treia linie sunt
prezentate imaginile SEM pentru plase acoperite cu nanotuburi de carbon (săgețile din figură indică
mănunchiuri de CNT) (e); pe a patra linie se găsesc imaginile SEM pentru plase acoperite cu amestec
PEO80: CNT20 (f); și pe ultima linie imagini pentru plasele acoperite cu amestec PEO98: CNT2 (g).
10
În capitolul trei, "Obținerea de noi acoperiri nanocompozite hibride2", sunt prezentate rezultatele
cu privire la obținerea de acoperiri multifuncționale cu caracteristici chimice și fizice controlate
(funcționalitate, morfologie și rugozitate) cu posibile aplicații în funcționalizarea implanturilor osoase.
În ultimele decenii există un interes crescut pentru utilizarea diferitelor tipuri de polimeri
biodegradabili sintetici în domeniul biomedicinei, ca materiale versatile care să conducă la un răspuns imunitar
scăzut și care să aibă caracteristici fizico-chimice, biologice, biomecanice și de degradabilitate bine definite
[34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,1]. Principala provocare o reprezintă optimizarea funcționalității materialului
în conformitate cu cerințele de aplicare. Prin urmare, au fost și sunt investigate diferite tipuri de polimeri
degradabili, pentru a fi corelate cu necesitățile aplicațiilor dorite.
Acoperirile biocompatibile și biodegradabile cu caracteristici chimice și fizice controlate (ex:
morfologie și rugozitate) prezintă un mare interes în aplicațiile legate de funcționalizarea implanturilor
ortopedice. Implanturile metalice folosite în ortopedie sunt fabricate de obicei din Ti sau aliaje ale acestuia și
prezintă o suprafață inertă la contactul cu țesutul, necesitând o anumită funcționalizare pentru a ușura
integrarea implantului în organism și pentru a minimiza răspunsul inflamatoriu.
În contextul acestei direcții de cercetare, în acest capitol sunt prezentate rezultatele a două studii
sistematice asupra:
(i) parametrilor de depunere ce influențează o serie de acoperiri noi biodegradabile bazate pe copolimeri
tribloc poli (lactidă-co-caprolactonă)-bloc-poli (etilen-glicol)-bloc-poli (lactidă-co-caprolactonă)
(PLCL-PEG-PLCL) și,
(ii) obținerii de noi acoperiri nanocompozite hibride ce urmăresc un răspuns îmbunătățit al osteoblastelor
prin încorporarea nanoparticulelor de β-fosfat tricalcic (TCP) și HidroMatrix în co-polimerul (PLCL-
PEG-PLCL) testat în primul studiu (i), obținute prin evaporarea laser pulsată asistată de o matrice cu
scopul utilizării acestora în aplicații din domeniul cercetării biomedicale.
Caracteristicile morfologice și rugozitatea acestora au fost modificate prin variația compoziției
materialului din țintă și a fluenței laser. Acoperirile au fost utilizate pentru testarea preliminară in vitro cu celule
pre-osteoblaste MC3T3-E1.
În prima parte a acestui studiu au fost depuse prin MAPLE noi acoperiri biodegradabile pe bază de
copolimeri tribloc PLCL-PEG-PLCL. Caracteristicile morfologice și rugozitatea au fost modificate prin
variația fluenței laserului, cu schimbări semnificative ale morfologiei de la acumularea de materiale în formă
de picături pentru suprafețele acoperirilor copolimerice PLCL-PEG-PLCL obținute folosind o fluența laser
variabilă (F1-F4), la structuri de tip valuri sau structuri de tip covor pentru suprafețele acoperirilor
copolimerice obținute la valori mai mari ale fluenței laser (F5-F8).
2 Prima parte din această secțiune a tezei a fost publicată în Applied Physics A ((2017) 123:707), titlul
articolului fiind "Tailored biodegradable triblock copolymer coatings obtained by MAPLE: a parametric
study", autori: Brajnicov, S; Neacsu, P; Moldovan, A; Marascu, V; Bonciu, A; Ion, R; Dinca, V; Cimpean, A;
Dinescu, M.
11
Datorită interacției dintre fasciculul laser și țintă, la creșterea fluenței, moleculele de polimer sunt
evacuate în clustere de solvent mai mari, iar evaporarea solventului în timpul transferului și după depunerea
pe substrat este responsabilă pentru formarea caracteristicilor polimerului la suprafață. Aceste caracteristici
sunt observate în imaginile AFM (figura 5.a) și SEM (figura 5.b) ale filmelor depuse prin MAPLE [44,45].
(a) (b)
Figura 5. Imagini AFM (~ 40 μm x 40 μm)(reprezentate în stânga) și imagini SEM ( reprezentate în dreapta)
pe straturile PLCL-PEG-PLCL depuse prin MAPLE la diferite fluențe: F1=0,228 J/cm2; F2=0,261 J/cm2;
F3=0,333 J/cm2; F4=0,377 J/cm2; F5=0,437 J/cm2; F6=0,640 J/cm2; F7=0,900 J/cm2; F8=1.300 J/cm2;
Bara de scară laterală este 10 μm pentru imaginile AFM și 50 μm pentru imaginile SEM; toate scalele
verticale sunt reprezentate în nm.
Analiza FTIR corelată cu morfologia suprafeței a condus la selectarea acoperirilor din copolimer
tribloc care prezentau proprietăți optime; acestea au fost utilizate în experimente preliminare in vitro privind
adeziunea celulară și morfologia pre-osteoblastelor MC3T3-E1, cu scopul de a evalua biocompatibilitatea
relativă a substraturilor testate.
Celulele MC3T3-E1 au prezentat diferențe în ceea ce privește capacitatea lor de adeziune și
caracteristicile morfologice ca răspuns la variațiile suprafețelor polimerice analizate (figura 6). Astfel, pe
acoperirile copolimerice PLCL-PEG-PLCL obținute prin MAPLE la valori diferite ale fluenței laser (F1 - F3)
pre-osteoblastele au aderat în mod corespunzător și s-au răspândit bine după 24 de ore de cultură, sugerând că
aceste suprafețe oferă condiții de creștere favorabile. Dimpotrivă, adeziunea și morfologia celulelor MC3T3-
12
E1 induse de acoperirile copolimerice PLCL-PEG-PLCL obținute la valori mai mari ale fluenței laser (F4 -
F5) au fost afectate negativ de caracteristicile fizico-chimice ale suprafețelor acestora.
Figura 6. Imagini de microscopie de fluorescență care prezintă capacitatea de adeziune a celulelor MC3T3-
E1, după 2 ore de cultură (a) și caracteristici morfologice, la 24 ore după însămânțare (b) induse de diferite
acoperiri de PLCL-PEG-PLC (F1=0,228 J/cm2; F2=0,261 J/cm2; F3=0,333 J/cm2; F4=0,377 J/cm2;
F5=0,437 J/cm2). Celulele au fost colorate cu AlexaFluor 488-Phaloidină pentru a detecta actina (verde) și
cu DAPI pentru a detecta nucleul (albastru). Scala este de 20 μm.
În cea de-a doua parte a acestui studiu au fost distribuite particule de TCP și HydroMatrix într-un mod
controlat în copolimerul sintetic biodegradabil PLCL-PEG-PLCL cu scopul de a obține noi biointerfețe
compozite biodegradabile ce urmăresc răspunsul îmbunătățit al celulelor osteoblaste MC3T3-E1 in vitro.
Imaginile SEM au confirmat ca nanoparticulele de TCP și HydroMatrix au fost încorporate cu succes
în copolimer PLCL-PEG-PLCL prin metoda MAPLE. Acoperirile obținute cu metoda MAPLE prezintă o
distribuție relativ uniformă a materialului pe întreaga suprafață, spre deosebire de cele obținute prin drop-cast,
13
în care materialul formează aglomerări. În figura 7 sunt prezentate imagini SEM obținute pe diferite zone ale
acoperirilor compozite depuse prin metoda drop-cast și prin MAPLE.
(a) (b)
Figura 7. Imagini SEM obținute pe diferite zone ale acoperirilor compozite de referință obținute prin drop-
cast (a) și ale acoperirilor compozite obținute prin MAPLE (b).
Evaluarea biologică in vitro a tuturor biomaterialelor analizate a confirmat funcționalitatea acestora
prin teste bio cu celule osteoblaste (figura 8).
Rezultatele prezentate în acest capitol subliniază versatilitatea tehnicii MAPLE în crearea de interfețe
bio funcționale ca straturi de acoperire pentru studiile legate de interacțiunea celulelor de mamifere la interfața
celulă-material.
14
Figura 8. Caracteristicile morfologice a osteoblastelor MC3T3-E1 cultivate pe materiale la 24 h de la
însămânțare (40x); Marcarea fluorescenta: actină citoscheletală - verde; vinculină (proteina de adeziune) –
roșu; nucleul - albastru
Capitolul al patrulea, "Fabricarea de straturi bacteriene funcționale de Micrococcus
lysodeikticus (ML) depuse prin MAPLE pe substraturi de sticlă, pentru detecția optică a lizozimului în
ser3", pune în evidență o altă aplicabilitate a metodei MAPLE: obținerea de suprafețe funcționalizate bazate
pe celule de Micrococcus lysodeikticus (ML), astfel încât acestea să poată fi folosite ca biosenzori optici
celulari.
Tehnicile de depunere bazate pe laser – relativ noi în domeniile biointerfețelor și biosensibilizării, în
special în ceea ce privește transferul celulelor – oferă perspective promițătoare pentru obținerea de acoperiri
cu proprietăți controlate, din compuși naturali sau sintetici. Aceste tehnici elimină majoritatea neajunsurilor
asociate de obicei tehnicilor “clasice” de funcționalizare a suprafețelor (drop-cast, acoperirea prin imersie sau
acoperirea prin centrifugare): neuniformitatea suprafețelor, contaminarea, utilizarea solvenților etc.
Biosenzorii celulari pentru detecție optică [46,47] sau prin metode electrochimice [48,49,50], realizați
prin imobilizarea de celule întregi și funcționale (alge, celule bacteriene, celule de mamifere) pe diferite
suporturi, au aplicații în diverse domenii, de la testarea ecologică și ecotoxicitate până la producția
biofarmaceutică [51] sau diagnosticarea medicală [52].
În acest studiu am urmărit obținerea de suprafețe funcționalizate bazate pe celule de Micrococcus
lysodeikticus [ML], ce pot fi folosite ca biosenzori pentru detectarea optică a lizozimului în ser.
Lizozimul este o enzimă prezentă în fluide biologice / secrețiile organismului (lacrimi, urină, ser sau
salivă), a cărei concentrație în serul uman este un marker biologic specific pentru afecțiuni precum SIDA,
3 Această secțiune a tezei a fost publicată în Colloids and Surfaces B: Biointerfaces ((2018) 162: 98-
107), titlul articolului fiind "Functional Micrococcus lysodeikticus layers deposited by laser technique for the
optical sensing of lysozyme", autori: Dinca, V; Zaharie-Butucel, D; Stanica, L; Brajnicov, S; Marascu, V;
Bonciu, A; Cristocea, A; Gaman, L; Gheorghiu, M; Astilean, S; Vasilescu, A.
15
tuberculoza pulmonară, sarcoidoză, bolile inflamatorii intestinale (IBD) [53], nefroză, infecție bacteriană
acută, colită ulcerativă [54] etc.
ML, bacterie gram-pozitivă aparținând familiei Micrococcacea, este un substrat tipic pentru această
enzimă și este utilizat pentru a determina activitatea enzimatică a lizozimului prin turbidimetrie [55].
În acest studiu au fost stabilite condițiile optime de obținere a interfețelor bacteriene funcționalizate
prin metoda MAPLE, stabilite prin caracterizarea morfologică și structurală a interfețelor, cât și prin testarea
acestora cu concentrații diferite de lizozim uman, astfel încât acestea să poată fi folosite ca biosenzori optici
celulari. Pentru a valida rezultatele acestui studiu s-au folosit interfețe de referință pentru detectarea optică a
lizozimului în ser ̶ obținute prin metoda depunerii strat cu strat (LBL – layer by layer).
Ca prim pas pentru funcționalizarea interfețelor bacteriene, lamelele din sticlă au fost acoperite cu
clorura de poli-(dialil dimetilamoniu) (PDDA - Poly Diallyldimethylammonium Chloride) ̶ polimer cationic
cu densitate mare de sarcină ̶ folosit ca adsorbant încărcat pozitiv pe suprafața sticlei pentru facilitarea
adeziunii bacteriilor ML încărcate negativ.
Imaginile AFM și SEM și determinările prin FTIR pe filmele cu bacterii au confirmat că bacteriile
ML au fost depuse cu succes ca celule funcționale pe stratul de PDDA, prin tehnica MAPLE. Straturile depuse
prin MAPLE au fost mai puțin dense, având un aspect diferit față de cele depuse prin LBL.
Înainte de testarea cu ser, interfețele PDDA / ML, obținute prin MAPLE sau LBL, au fost acoperite
suplimentar cu oxid de grafenă (GO). Această etapă a fost considerată necesară pentru a evita desorbția
bacteriilor în ser în absența lizozimului, similar cu observațiile din literatură [56].
Interfețele PDDA / ML / GO au fost investigate pentru utilitatea lor în detectarea lizozimului, prin
aplicarea unui volum de 15 µl de ser fetal bovin (FBS) cu concentrații diferite de lizozim uman (0-10 µg/ml)
pe o zonă a suprafeței senzorului. Modificările intensității zonelor analizate după expunerea laser, corelate cu
imaginile de microscopie cu contrast de fază, au fost evaluate prin două metode alternative: 1) prin
spectrofotometrie UV-VIS, măsurând absorbția pe lamelele cu ML în intervalul 350-700 nm și 2) prin scanarea
lamelelor și analizarea imaginii optice prin ImageJ.
Valoarea optimă pentru perioada de incubare a biosenzorilor cu probele cu ser a fost de 10 min. După
incubarea cu probele cu ser, spectrele de absorbție ale filmelor ML se modifică semnificativ. Lizozimul
distruge bacteriile și induce desorbția acestora de pe interfața de PDDA în funcție de concentrația lui în ser. În
particular, absorbția la 700 nm este un parametru analitic de încredere, permițând construirea unor curbe de
calibrare care indică dependența proporțională a absorbției de concentrația de lizozim, pentru concentrații
cuprinse între 1 și 10 µg/µl (figura 9), cu limita de detecție calculată de 0,5 µg/µl. Aceste date au confirmat
fezabilitatea utilizării interfețelor funcționale ML pentru detectarea cantitativă a lizozimului în ser.
16
Figura 9. Spectrele de absorbție ale probelor PDDA / ML / GO după incubarea cu ser bovin cu concentrații
diferite și cunoscute de lizozim de la 0 la 1, 3, 5, 7 și 10 µg/µl (a). Curba de calibrare corespunzătoare
pentru lizozim obținută prin considerarea ca parametru analitic a variației absorbției la 700 nm după
incubarea cu serul probă (b)
Interfețele bacteriene funcționalizate obținute prin MAPLE au fost testate și pentru a analiza probe cu
ser uman provenit de la pacienți care suferă de IBD. Două probe cu ser uman și două probe cu FBS au fost
analizate cu lamelele funcționalizate obținute prin MAPLE și LBL. După cum se observă în tabelul 1, există
un acord bun între rezultatele obținute pe interfețele ML depuse prin MAPLE și cele de referință depuse prin
LBL. Mai mult decât atât, valorile de recuperare (recovery values) calculate pentru concentrația de lizozim în
serul bovin, detectate cu lamelele de ML și comparate cu valoarea teoretică a concentrației de lizozim, indică
o bună precizie a detectării lizozimului cu ambele interfețe ML.
Tabelul 1 Analiza probelor cu ser cu ajutorul interfețelor funcționalizate ML
Lizozim (µg/ml)
proba Interfețelor bacteriene
funcționalizate prin metoda MAPLE
Interfețe bacteriene
funcționalizate de referință (strat-
cu-strat)
ser uman 1 5,14 ± 0,06 5,13 ± 0,87
ser uman 2 6,10 ± 0,24 6,72 ± 0,91
ser bovin nu s-a identificat / detectat nu s-a identificat / detectat
ser bovin cu 7 µg/ml
lizozim
6,75 ± 0,35 7,23 ± 2,14
În concluzie, bacteriile depuse prin MAPLE și-au păstrat sensibilitatea la lizozim și au condus la
rezultate similare pentru detecția lizozimului în probe serice reale cu interfețele „de referință” obținute prin
LBL. În comparație cu LBL, unde etapele de funcționalizare a lamelelor au fost executate manual, MAPLE
oferă un bun control al depunerii. Având în vedere importanța arhitecturii interfețelor de detectare, MAPLE
este o tehnică promițătoare pentru transferul în mod controlat al altor compuși, pentru a crește stabilitatea și
sensibilitatea interfețelor pentru detectarea lizozimului în ser.
17
În capitolul cinci, "Acoperiri de șelac testate pentru învelișuri enterice", este descrisă obținerea
acoperirilor de șelac prin metoda MAPLE cu posibile aplicații ca învelișuri enterice pentru medicamente
administrate pe cale orală.
În acest capitol sunt prezentate rezultatele unui studiu sistematic asupra obținerii de acoperiri de șelac
prin evaporarea laser pulsată asistată de o matrice, cu posibile aplicații ca învelișuri enterice pentru
medicamente administrate pe cale orală. Învelișurile enterice sunt acoperiri polimerice aplicate
medicamentelor care se administrează pe cale orală, cu rolul de a preveni dezintegrarea sau dizolvarea acestora
la nivelul stomacului.
Transportul medicamentelor cu absorbție directă în colon sau eliberarea întârziată a substanțelor
active, sunt procese deosebit de importante în domeniul farmacoterapiei, pentru tratarea mai eficientă a unor
afecțiuni. Printre acestea se numără sindromul colonului iritabil [57], sindromul Crohn [58], astmul nocturn,
angina sau artrita [59]
Șelacul este un biomaterial, o rășină secretată de insecta femelă Laccifer (Tachardia) Iacca Kerr (Fam.
Coccidae) pe mai multe specii de copaci. Se compune din esteri și poliesteri ai acizilor polihidroxi.
Componentele principale ale șelacului sunt acidul aleuritic și acidul shellolic [60]. Alte componente pot fi
acidul butilic și acidul jalaric [61]. Culoarea poate varia între galben deschis și roșu închis, în funcție de zona
de colectare a materiei prime din care rezultă șelacul. Datorită unor proprietăți remarcabile precum rezistența
la radiații UV, impermeabilitatea, rezistivitatea electrică relativ mare [62], șelacul este întrebuințat în domenii
diverse. Astfel șelacul poate fi utilizat pentru încapsulare și micro încapsulare [63], ca înveliș enteric [64,65,66]
(în domeniul farmaceutic), ca înveliș protector pentru fructe [67], poate fi adăugat și în compoziția materialelor
de ambalare [68] (în industria alimentară). De asemenea poate fi folosit la prepararea diverselor lacuri
protectoare [69], la protecția obiectelor de artă [70], poate fi utilizat ca substrat pentru tranzistoare cu efect de
câmp din materiale organice (OFET ̶ tranzistori organici cu efect de câmp) cât și ca material dielectric pentru
poartă [60], etc.
Obiectivele din cadrul acestui studiu au fost realizate în trei etape: obținerea straturilor de șelac prin
tehnica MAPLE; analiza morfologică și structurală a straturilor; testarea straturilor în lichid gastric simulat
(SGF), pentru evaluarea capacității de a fi utilizate ca acoperiri enterice.
În urma experimentelor, MAPLE s-a dovedit a fi o metodă de depunere eficientă pentru obținerea de
acoperiri de șelac aderente la substrat și netede. După optimizarea parametrilor de depunere s-au obținut filme
cu o grosime de 2000 nm, cu valoarea rugozități mai mică de 1% din grosime. Filmele obținute nu prezintă
picături. S-a observat că fluența laserului este un factor important în păstrarea structurii chimice a șelacului.
Pentru fluențe mici, s-au păstrat toate benzile caracteristice de absorbție IR și s-a obținut cea mai bună
concordanță cu șelacul inițial.
Cele mai bune filme subțiri din punct de vedere al structurii chimice și al rugozității suprafeței, obținute
la lungimea de undă de 266, fluența de 0,6 J/cm2, din ținte cu concentrație de 2% șelac, au fost folosite pentru
testele cu SGF. Filmele au fost imersate intr-o soluție lichid gastric simulat timp de 15, 30, 60, 120 și 240 de
minute. Intervalele de timp alese pentru acest studiu a fost selectat conform Ref. [71], perioada de 240 de
minute corespunzand treceri tipice a unui element prin sistemul digestiv.
18
După imersare în SGF, grosimea filmelor nu s-a modificat după 240 de minute de imersie. Suprafața
s-a schimbat, prin apariția găurilor, chiar și pentru un timp de imersie de până la 15 minute, așa cum se poate
observa în figura 10, iar rugozitatea a crescut. Densitatea și dimensiunea găurilor a crescut o dată cu creșterea
perioadei de expunere la SGF, dar cea mai mare gaură măsurată după 240 de minute în SGF a avut o adâncime
de doar 85 nm (figura 11).
Figura 10. Imagini AFM ( 5 μm x 5 μm) pe un film de referință si pe straturile expuse la SGF.
Figura 11. Variația rugozității și numărul de pori pe o suprafață de 5 μm × 5 μm a filmelor, în funcție de
timpul de expunere la SGF. Filmele obținute prin MAPLE au o grosime de 2000 nm.
19
Analiza prezentată în acest capitol confirmă faptul ca filmele de șelac realizate prin evaporarea laser
pulsată asistată de o matrice pot fi utilizate ca învelișuri enterice pentru aplicații farmaceutice.
În ultimul capitol, capitolul șase, "Concluzii", sunt prezentate concluziile și contribuțiile personale
din teză.
3. Concluziile rezultatelor cercetărilor efectuate în cadrul prezentei teze de doctorat
În capitolul de concluzii generale, pe lângă concluziile prezentate anterior după fiecare capitol, sunt
incluse și contribuțiile personale din cadrul tezei.
Diseminarea rezultatelor:
3.1. Articole în reviste cotate ISI în perioada 2016-2019
1. Ioniță, I; Bercea, A; Brajnicov, S; Matei, A; Ion, V; Mărăscu, V; Mitu, B; Constantinescu, C; "Second
harmonic generation (SHG) in pentacene thin films grown by matrix assisted pulsed laser evaporation
(MAPLE)"; APPLIED SURFACE SCIENCE 480, 212-218 (2019);
2. Alin, CD; Grama, F; Papagheorghe, R; Brajnicov, S; Ion, V; Vizireanu, S; Palla-Papavlu, A; Dinescu, M;
"Tuning the physicochemical properties of hernia repair meshes by matrix-assisted pulsed laser
evaporation"; APPLIED PHYSICS A-MATERIALS SCIENCE & PROCESSING 125 (6) 424 (2019);
3. Icriverzi, M; Rusen, L; Sima, LE; Moldovan, A; Brajnicov, S; Bonciu, A; Mihăilescu, N; Dinescu, M;
Cîmpean, A; Roșeanu, A; Dincă, V; "In vitro behavior of human mesenchymal stem cells on poly(N-
isopropylacrylamide) based biointerfaces obtained by matrix assisted pulsed laser evaporation"; APPLIED
SURFACE SCIENCE 440, 712-724 (2018);
4. Dincă, V; Viespe, C; Brajnicov, S; Constantinoiu, I; Moldovan, A; Bonciu, A; Toader, CN; Ginghină,
RE; Grigoriu, N; Dinescu, M; Scărișoreanu, ND; "MAPLE Assembled Acetylcholinesterase-
Polyethylenimine Hybrid and Multilayered Interfaces for Toxic Gases Detection"; SENSORS 18 (12)
4265 (2018);
5. Brajnicov, S; Bercea, A; Mărăscu, V; Matei, A; Mitu, B; "Shellac Thin Films Obtained by Matrix-
Assisted Pulsed Laser Evaporation (MAPLE)"; COATINGS 8 (8) 275 (2018);
6. Dinca, V; Zaharie-Butucel, D; Stanica, L; Brajnicov, S; Mărăscu, V; Bonciu, A; Cristocea, A; Găman, L;
Gheorghiu, M; Aștilean, S; Vasilescu, A; "Functional Micrococcus lysodeikticus layers deposited by laser
technique for the optical sensing of lysozyme"; COLLOIDS AND SURFACES B-BIOINTERFACES 162,
98-107 (2018);
20
7. Mitran, V; Dincă, V; Ion, R; Cojocaru, VD; Neacșu, P; Dinu, CZ; Rusen, L; Brajnicov, S; Bonciu, A;
Dinescu, M; Răducanu, D; Dan, I; Cîmpean, A; "Graphene nanoplatelets-sericin surface-modified Gum
alloy for improved biological response"; RSC ADVANCES 8 (33) 18492-18501 (2018);
8. Brajnicov, S; Neacșu, P; Moldovan, A; Mărăscu, V; Bonciu, A; Ion, R; Dincă, V; Cîmpean, A; Dinescu,
M; "Tailored biodegradable triblock copolymer coatings obtained by MAPLE: a parametric study";
APPLIED PHYSICS A-MATERIALS SCIENCE & PROCESSING 123 (11) 707 (2017);
9. Rusen, L; Brajnicov, S; Neacșu, P; Mărăscu, V; Bonciu, A; Dinescu, M; Dincă, V; Cîmpean, A; "Novel
degradable biointerfacing nanocomposite coatings for modulating the osteoblast response"; SURFACE &
COATINGS TECHNOLOGY 325, 397-409 (2017);
10. Rusen, L; Neacșu, P; Cîmpean, A; Valentin, I; Brajnicov, S; Dumitrescu, LN; Băniță, J; Dincă, V;
Dinescu, M; "In vitro evaluation of poly(ethylene glycol)-block-poly(epsilon-caprolactone) methyl ether
copolymer coating effects on cells adhesion and proliferation"; APPLIED SURFACE SCIENCE 374, 23-
30 (2016).
3.2. Prezentări la conferințe internaționale
1. Brajnicov, S; Mărăscu, V; Rusen, L; Moldovan, A; Dincă, V; Dinescu, M; "Copolymer PLCL-PEG-PLCL
functional bio-coating obtained by Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation: a deposition parametric
study";10th International Conference On Photoexcited Processes And Applications (ICPEPA-10), August
29 – September 2, 2016, Brasov, Romania; P77 – poster;
2. Brajnicov, S; Neacșu, P; Dincă, V; Mărăscu, V; Bonciu, A; Cîmpean, A; Dinescu, M; "Polylactide-co-
caprolactone based coatings deposited by Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation: an optimization
study", 17th International Conference On Plasma Physics And Applications, June 15 – 20 Magurele 2017,
Romania, Topic 8: Laser plasmas and their applications, P8_02 – poster;
3. Brajnicov, S; Neacșu, P; Dincă, V; Mărăscu, V; Bonciu, A; Cîmpean, A; Dinescu, M; "Tunability of the
surface morphology of PLCL-PEG-PLCL co-polymer coatings deposited by Matrix Assisted Pulsed Laser
Evaporation", IONS Balvanyos 2017 (International OSA Network of Students), Balvanyos, Transylvania,
Romania, 25-28 July 2017 – poster – premiul III pentru cel mai bun poster;
4. Brajnicov, S; Dincă, V; Mărăscu, V; Dinescu, M; "Thin films of PLCL-PEG-PLCL co-polymer coatings
deposited by Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation", "The fifth edition of the International
Colloquium 'Physics of Materials' - PM-5",November 10-11, 2016, București, Romania; O.2.6 –
prezentare orala;
5. Brajnicov, S; Ion, V; Mărăscu, V; Rusen, L; Dincă, V; Dinescu, M; "Characterization and degradation
behavior of hybrid coatings obtained by Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation" ; 16th International
Balkan Workshop on Applied Physics (IBWAP 2016), July 7-9, 2016, Constanta, Romania; S2 P4 –
poster;
21
6. Brajnicov, S; Mărăscu, V; Bonciu, A; Moldovan, A; Vlad, A; Dincă, V; Dinescu; M; "Tailored
biodegradable triblock copolymer coatings obtained by MAPLE for bioresponsive interfaces",
EMRS2017, Section X:New frontiers in laser interaction:from hard coatings to smart materials; May 22-
26, Strasbourg, France - poster presentation EMRS2017, X P_1.32 – poster;
7. Brajnicov, S; Bonciu, A; Mărăscu, V; Moldovan, A; Dincă V; Dinescu, M; "Biofunctional PLCL based-
coating obtained by Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation", 17th International Balkan Workshop on
Applied Physics and Materials Science (IBWAP 2017), Constanta, Romania,11-14, July, 2017 - S2 –
Laser, Plasma and Radiation Physics and Application, S2 P1 – poster.
3.3. Participări la școli de vară și sesiuni științifice
1. Dinca, V; Zaharie-Butucel, D; Stanica, L; Brajnicov, S; Marascu, V; Bonciu, A; Cristocea, A; Gamang,
L; Gheorghiu, M; Astilean, S; Vasilescuc, A; Dinescu, M; "Functional Micrococcus lysodeikticus layers
deposited by laser technique for the optical sensing of lysozyme"; Sixth Intl. School on Lasers in Materials
Science - SLIMS,8-14 iulie 2018, S. Servolo Island, Venice, Italy – prezentare orala și poster;
2. Brajnicov, S; "Functional Polymeric Coatings Obtained by Matrix-Assisted Pulsed Laser Evaporation"
LASER IGNITION SUMMER SCHOOL 2017, Brasov, Romania, 19-22 iulie 2017, P12_37 – poster;
3. Brajnicov, S; Dinca, V; Marascu, V; Rusen, L; Neacsu, P; Cimpean, A; Dinescu, M; "Multifunctional
coatings obtained by Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation" 15th IUVSTA School - Lasers for the
Nano-Engineering of Surfaces Intl. School on Lasers in Materials Science - SLIMS S. Servolo Island,
Veneția, Italia, 10-17 iulie 2016 – poster;
4. Brajnicov, S; Marascu, V; Dinca, V; Dinescu, M; "Tunability of the surface morphology of PLCL-PEG-
PLCL co-polymer coatings deposited by matrix assisted pulsed laser evaporation", Sesiunea Științifică a
Facultății de Fizică, 17 iunie 2016, București, Romania, 10:00 - 10:15 – prezentare orală.
22
4. Bibliografie
1 J.R. Smith, D.A. Lampro, Trans. IMF 92, 1 (2014)
2 A.P. Caricato, G. Wangyao, A. D. Stiff-Roberts, „UV- and RIR-MAPLE: Fundamentals and Applications” in
Advances in the Application of Lasers in Materials Science, SSMATERIALS, 274, 275-308 (2018)
3 R.A. McGill, D.B. Chrisey, Method of producing a film coating by matrix assisted pulsed laser deposition Patent
No. 6.025.036 (2000)
4 A. Piqué, Appl. Phys. A 105, 517–528 (2011)
5 L. Rusen, P. Neacșu, A. Cîmpean, I. Valentin, S. Brajnicov, L.N. Dumitrescu, J. Băniță, V. Dincă, M. Dinescu,
Appl. Surf. Sci. 374, 23–30 (2016)
6 L. Rusen, V. Dincă, B. Mitu, C. Mustăciosu, M. Dinescu, Appl. Surf. Sci. 302, 134–140 (2014)
7 A.P. Caricato, R. Buonsanti, M. Catalano, M. Cesaria, P.D. Cozzoli, A. Luches, M.G. Manera, M. Martino, A.
Taurino, R. Rella, Appl. Phys. A 104, 963–968 (2011)
8 V. Dincă, P.E. Florian, L.E. Sima, L. Rusen, C. Constantinescu, R.W. Evans, M. Dinescu, A. Roșeanu, Biomed.
Microdevices 16, 11–21 (2014)
9 A. Vișan, R. Cristescu, N. Stefan, M. Miroiu, C. Niță, M. Socol, C. Florica, O. Roșoga, I. Zgura, L.E. Sima, M.
Chiritoiu, M.C. Chifiriuc, A.M. Holban, I.N. Mihăilescu, G. Socol, Appl. Surf. Sci. 417, 234 (2017)
10 A. Matei, J. Schou, C. Constantinescu, P. Kingshott, M. Dinescu, Appl. Phys. A 105, 629–633 (2011)
11 A. Sellinger, E. Leveugle, J.-M. Fitz-Gerald, L.V. Zhigilei, Appl. Phys. A 92, 821–829 (2008)
12 L. Rusen, V. Dincă, C. Mustăciosu, M. Icriverzi, L.E. Sima, A. Bonciu, S. Brajnicov, N. Mihăilescu, N.
Dumitrescu, A.I. Popovici, A. Roseanu, M. Dinescu, Modern Technologies for creating thin film systems and coatings
171-191 (2017)
13 L. Rusen, S. Brajnicov, P. Neacșu, V. Mărăscu, A. Bonciu, M. Dinescu, V. Dincă, A. Cîmpean, Surf. Coatings
Technol. 325, 397-409 (2017)
14 S. Brajnicov, P. Neacșu, A. Moldovan, V. Mărăscu, A. Bonciu, R. Ion, V. Dincă, A. Cîmpean, M. Dinescu,
Appl. Phys. A 123 (11) 707 (2017)
15 I. Țîrcă, V. Mitran, V. Mărăscu, S. Brajnicov, V. Ion, F. Stokker-Cheregi, I.A. Popovic, A. Cîmpean, V. Dincă,
M. Dinescu, Appl. Surf. Sci. 425, 1040-1051 (2017)
16 A. Bercea, M. Filipescu, A. Moldovan, S. Brajnicov, D. Colceag, V. Ion, L.C. Nistor, A. Zorilă, M. Dinescu,
Rom. J. of Phys. 63 (43528) 606 (2018)
17 V. Mitran, V. Dincă, R. Ion, V.D. Cojocaru, P. Neacsu, C.Z. Dinu, L. Rusen, S. Brajnicov, A. Bonciu, M.
Dinescu, D. Răducanu, I. Dan, A. Cîmpean, Rsc Adv 8 (33) 18492-18501 (2018)
18 V. Dincă, D. Zaharie-Butucel, L. Stanica, S. Brajnicov, V. Mărăscu, A. Bonciu, A. Cristocea, L. Găman, M.
Gheorghiu, S. Aștilean, A. Vasilescu, Coolloids and Surf. B Biointerfaces 162, 98-107 (2018)
19 M. Icriverzi, L. Rusen, L.E. Sima, A. Moldovan, S. Brajnicov, A. Bonciu, N. Mihailescu, M. Dinescu, A.
Cîmpean, A. Roșeanu, V. Dincă, Appl. Surf. Sci. 440, 712-724 (2018)
20 S. Brajnicov, A. Bercea, V. Mărăscu, A. Matei, B. Mitu, Coatings 8 (8) 275 (2018)
21 V. Dincă, C. Viespe, S. Brajnicov, I. Constantinoiu, A. Moldovan, A. Bonciu, C.N. Toader, R.E. Ginghină, N.
Grigoriu, M. Dinescu, N.D. Scărișoreanu, Sensors 18 (12) 4265 (2018)
23
22 I. Ionița, A. Bercea, S. Brajnicov, A. Matei, V. Ion, V. Mărăscu, B. Mitu, C. Constantinescu, Appl. Surf. Sci.
480, 212-218 (2019)
23 K. Baylón, P. Rodríguez-Camarillo, A. Elías-Zúñiga, J. A. Díaz-Elizondo, R. Gilkerson, K. Lozano, Membranes 7,
47 (2017)
24 P.T. Hammond, Materials Today 15 (5), 196 (2012)
25 K. Hori, S. Matsumoto, Biochem Eng J 48, 424 (2010)
26 S. Elango, S. Perumalsamy, K.R.B. Tech, K. Vadodaria, BioMedicine 7(3), 14 (2017)
27 I.A. Păun, A.M. Acasandrei, C.R. Luculescu, C.C. Mustăciosu, V. Ion, M. Mihăilescu, E. Vasile, M. Dinescu,
Appl. Surf. Sci 357, 975–984 (2015)
28 R. Cristescu, A. Doraiswamy, T. Patz, G. Socol, S. Grigorescu, E. Axente, F. Sima, R.J. Narayan, D. Mihaiescu,
A. Moldovan, I. Stamatin, I.N. Mihailescu, B. Chisholm, D.B. Chrisey, Appl. Surf. Sci 253, 7702 (2007)
29 I.A. Păun, V. Ion, A. Moldovan, M. Dinescu, Appl. Phys. Lett 96, 243702 (2010)
30 R. Rella, J. Spadavecchia, M. G. Manera, S. Capone, A. Taurino, M. Martino, A.P. Caricato, T. Tunno, Sens
Actuators B 127, 426 (2007)
31 A.P. Caricato, A. Luches, R. Rella, Sensors 9 (4), 2682 (2009)
32 www.sigmaaldrich.com product no. 704148
33 E. Lioudakis, C. Kanari, A. Othonos, I. Alexandrou, Diamond & Related Materials 17, 1600–1603 (2008)
34 A.K. Mohanty, G.P. Mohanta, J Pharm Pharm Sci 1, 40 (2014)
35 Y.M. Kang, G.H. Kim, J.I. Kim, Da..Y. Kim., B.N. Lee, S.M. Yoon, J.H. Kim, M.S. Kim, Biomaterials 32,
4556 (2011)
36 J. Rydz, W. Sikorska, M. Kyulavska, D. Christova, Int. J. Mol. Sci. 16564 (2015)
37 P. Gentile, V. Chiono, I. Carmagnola, P.V. Hatton, Int. J. Mol. Sci 15, 3640 (2014)
38 S.S. Liow, Q. Dou, D. Kai, A. Abdul Karim, K. Zhang, F. Xu, X.J. Loh, ACS Biomater. Sci. Eng 2, 295–316
(2016)
39 A. Kumari, S.K. Yadav, S.C. Yadav, Colloids Surf. B 75, 1 (2010)
40 B.D. Ulery, L.S. Nair, C.T. Laurencin, J. Polym. Sci. Pol. Phys 49, 832 (2011)
41 H. Tian, Z. Tang, X. Zhuang, X. Chen, X. Jing, Prog. Polym. Sci 37, 237 (2012)
42 D. Vianney, N. Julien, Nat. Chem 7, 771 (2015)
43 I. Manavitehrani, A. Fathi, H. Badr, S. Daly, A.N. Shirazi, F. Dehghani, Polymers 8, 20; (2016)
44 A.T. Sellinger, E. Leveugle, K. Gogick, G. Peman, L.V. Zhigilei, J.M. Fitz-Gerald, J. Phys. Conf. Ser. 59, 314
(2007)
45 E. Leveugle, L.V. Zhigilei, A. Sellinger, J.M. Fitz-Gerald, Appl. Surf. Sci 253, 6456 (2007)
46 E. Michelini, L. Cevenini, M.M. Calabretta, S. Spinozzi, C. Camborata, A. Roda, Anal Bioanal Chem 405,
6155-6163 (2013)
47 X. Liu, K.J. Germaine, D. Ryan, D.N. Dowling, Sensors 10, 1377-1398 (2010)
48 F. Lagarde, N. Jaffrezic-Renault, Anal Bioanal Chem 400, 947 (2011)
49 A. Qureshi, A. Pandey, R.S. Chouhan, Y. Gurbuz, J.H. Niazi, Biosens Bioelectron, 67, 100-106 (2015)
50 S. David, C. Polonschii, M. Gheorghiu, D. Bratu, A. Dobre, E. Gheorghiu, Lab on a Chip 13, 3192-3198 (2013)
51 L. Goers, C. Ainsworth, C.H. Goey, C. Kontoravdi, P.S. Freemont, K.M. Polizzi, Biotechnol Bioeng 114, 1290-
1300 (2017)
52 Q. Gui, T. Lawson, S. Shan, L. Yan, Y. Liu, Sensors 17 (2017)
24
53 S.K. Jha, M. Kanungo, A. Nath, S.F. D'Souza, Biosens Bioelectron 24, 2637-2642 (2009)
54 S. Seuss, A.R. Boccaccini, Biomacromolecules 14, 3355-3369 (2013)
55 S. Saxena, Immobilisation and Biosensors, Applied Microbiology, Springer India, New Delhi,179-190 (2015)
56 A. Vasilescu, S. Gáspár, M. Gheorghiu, S. David, V. Dincă, S. Peteu, Q. Wang, M. Li, R. Boukherroub, S.
Szunerits, Biosensors and Bioelectronics 89, 525-531 (2017)
57 DR. Friend, Adv Drug Deliv Rev. 7, 149-99 (1991)
58 E. Schacht, A. Gevaet, E.R. Kenawy, K. Molly, W. Verstraete, P. Adriaensens, R. Carleer, J. Gelan, J. Control.
Release 39, 327–338 (1996)
59 V. Ravi, TMP. Kumar, Siddaramaiah, Indian J Pharm Sci 70, 111-113 (2008)
60 P. Yates, G.F. Field, J. Am. Chem. Soc.82, 5764–5765 (1960)
61 M.P. Colombini, I. Bonaduce, G. Gautier, Chromatographia 58, 357–364 (2003)
62 M. Irimia-Vladu, E.D. Głowacki, G. Schwabegger, L. Leonat, H. Zekiye Akpinar, H. Sitter, S. Bauer, N.S.
Sariciftci, Green Chem. 15, 1473–1476 (2013)
63 A.L. Campbell, S.D. Stoyanov, V.N. Paunov, Chem. Phys. Chem. 10, 2599–2602 (2009)
64 V.R. Sinha, R. Kumira, Acta Pharm. 53, 41–47 (2003)
65 Y. Farag, C.S. Leopold, Eur. J. Pharm. Sci. 42, 400–405 (2011)
66 B. Schad, H. Smith, B. Cheng, J. Scholten, E. VanNess, T. Riley, Pharm. Technol. 2013 (2013)
67 L. Palou, S.A. Valencia-Chamorro, M.B. Pérez-Gago, Coatings 5, 962–986 (2015)
68 E.L. Hult, M. Iotti, M. Lenes, Cellulose 17, 575–586 (2010)
69 M. Loy, L. Riddell, Anaesthesia 69 (Suppl. S3), 42 (2014)
70 K. Sutherland, J.C. del Río, J. Chromatogr. A 1338, 149–163 (2014)
71 M. Camilleri, L.J. Colemont, S.F. Phillips, M.L. Brown, G.M. Thomforde, N. Chapman, A.R. Zinsmeister, Am. J.
Physiol. 257, 84–90 (1989)
