Universitatea tefan cel Mare SuceavaFacultatea de Inginerie AlimentarProgram de studii: Protecia Consumatorului i a Mediului

Plante transgenice,rezistente la aciunea ierbicidelor i sau duntorilorMaterii prime vegetale si animale modificate genetic-Proiect-

Prof. ndrumtor: Student:s. l. dr. ing. Ropciuc Sorina Fini Constantinanul III PCM gr.1A

2015

CuprinsIntroducere3Rezistena la erbicide14Principii generale privind obtinerea plantelor transgenice20Aplicaii ale transgenezei la plante22Protecia plantelor fa de atacul insectelor23Tranformarea protoplatilor28Transformarea biolistic29Selecia transformanilor30Soia principalul produs al biotehnologiilor34Uniunea European, ntr-o situaie delicat35Soia modificata genetic36Porumbul modificat genetic36Cultivarea plantelor modificate genetic in UE36Plantele transgenice i noile lor proprieti37Avantajele plantelor transgenice, prezentate de productorii i aprtorii lor38Concluzie.................................................................................................................................39Bibliografie40

Introducere

Organism modificat genetic sau transgenic este termenul cel mai folosit pentru a defini o plant de cultur sau un animal aparent normal cruia, prin intermediul unor tehnici de inginerie genetic, i s-au transferat gene de la alte specii (plante, animale, bacterii, virusuri sau chiar gene umane), pentru a-i conferi anumite proprieti noi.n Romnia legislaia permite cultivarea hibridului MON810, rezistent la sfredelitorul porumbului. Condiia este obinerea unui aviz de la Ministerul Agriculturii i respectarea unei distane minime de 200 de metri fa de culturile convenionale nvecinate.n ultimii ani, suprafaa cultivat cu acest hibrid obinut prin modificare genetic a sczut constant, ajungnd la 217 hectare n 2012.Erbicidele sunt folosite in mod obisnuit in agricultura productiva iar eficacitatea acestora este deseori determinata de capacitatea lor de a distruge buruienile crescute in cmpurile de cultura si de toleran a culturii de baza fa de erbicidul aplicat. Daca cultura de baza nu este toleranta la erbicid, acesta, fie va diminua productivitatea culturii respective,fie o va distruge. Daca erbicidul nu este suficient de puternic, acesta va permite cresterea multor buruieni in timpul de cultura, care vor micora productivitatea culturii de baza. De aceea, producerea plantelor tolerante la erbicide, importante economic, este deosebit de oportuna. Selectivitatea unei specii de cultura la erbicide specifice, poate fi conferita numai prin folosirea ingineriei genetice si prin introducerea genelor in speciile de cultura, gene care codifica enzimele ce metabolizeaza erbicidul corespunzator.Tehnologia ADN recombinant reprezinta o noua oportunitate privind introducerea unor caractere valoroase in plante. De baza este introducerea genelor straine in plante, pentru a altera caile metabolice si a genera noi produsi datorita metabolismului modificat al plantei. Printre acesti produsi sunt incluse si plantele tolerante la erbicide. Multe plante de cultura sunt plante transgenice, care cuprind AND recombinant, ce le confera acestora caractere de rezistenta la erbicide si/sau la daunatori. Pentru a conferi culturii caractere imbunatatite si pentrua creste complexitatea acesteia, este necesara incorporarea in respectiva planta de cultura a unor constructi ADN recombinanti, aditionali. In anumite cazuri, introducerea unor caractere noi a fost posibila prin expresia sau supresia unei singure gene , in timp ce in alte cazuri este necesara expresia sau supresia mai multor gene in timpul dezvoltarii semintei.Strategii privind rezistenta la erbicide exista o varietate, prin a caror utilizare au fost obtinute plante transgenice, in care se exprima genele provenite din diferite organisme si care metabolic induc toleranta la o varietate de erbicide. Spre exemplu, acetohidroxy acid sintaza a fost introdusa in diferite plante, astfel inct plantele care exprima aceasta enzima sunt rezistente la multe tipuri de erbicide. Exista si alte gene care confera toleranta la erbicide,cum sunt: gena care codifica o proteina himeraacitocromului P4507A1 de la obolan si NADPH-citocromP450 oxidoreductaza de la drojdii, genele pentru glutation reductaza si superoxid dismutaza si genele pentru diferite fosfotransferaze.Genele care codific enzimele ce inactiveaz erbicidele si alti compusi cu efect duntor, au fost izolate dintr-o varietate de organisme procariote si eucariote. Uneori, enzimele i acizii nucleici care le codificau originea intr-o plant iar in alte cazuri,genele sunt construite genetic pentru a se exprima cu succes in plante.Plantele transgenice obinute sunt tolerante la erbicide ca: 2,4- dichlorophenoxyacetic acid, bromoxynil (denumirea comerciala-Bactril), fosfinothricin (denumireacomerciala-Basta),glifosat (denumireacomerciala - Round- Up). Glifosatul distruge att plantele cu frunza lat ct si pe cele cu frunza ingust,de tipul ierbii si se situeaz in topul vnzrilor de erbicide in lume. Nivelul de rezisten la glifosat al plantelor transgenice se datoreaz introducerii in plant a unui Agrobacterium modificat privind gena

CP4 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS synthase sau EPSPS ). Plantele transgenice reprezint tehnologia agricol cu cea mairapid rspndire din istorie a agricol.Astfel de plante au fost obinute nc din anii 1980 varieti de tutun i tomate rezistente la virusuri erau cultivate n China; tutunul rezistent la Virusul Mozaicului Castravetelui (Cucumber Mosaic Virus) a fost cultivat n scop comercial n China, ncepnd din 1992.Aplicatii ale transgenezei la plante

Speciile vegetale prezint o mare diversitate genetic, iar cele slbatice constituie un mare rezervor genetic, din care se pot obine gene importante din punct de vedere practic. Cercetrile de inginerie genetic la plante prezint o senmificaie teoretic deosebit, facilitnd cunoaterea modului de aciune a genelor acestor organisme, a efectelor fitohormonilor asupra dezvoltrii plantelor, a mecanismelor de inactivare a genelor etc. (Mayer, 1995). De asemenea, prin aplicarea tehnicilor de biologie molecular se pot obine informaii utile asupra particularitilor genomului plantelor folosite in ameliorare, a localizrii unor gene de interes, a gradului de inrudire dintre diferite specii, etc. (Greshoff, 1994; Edwards si Kar p, 1997).

n ceea ce privete aplicatiile practice, pn in prezent au fost obinute o serie de rezultate senmificative, unele aplicate deja in practic asa cum sunt: plantele transgenice rezistente la viroze, la atacul unor duntori, la ierbicide, plante transgenice de interes horticol, plante transgenice capabile sa sintetizeze metaboliti secundari in cantitati crescute si plante transgenice producatoare de anticorpi 'comestibili' etc.

In continuare sunt prezentate cateva dintre tipurile de aplicatii, insistandu-se pe cele care au un potential aplicativ spectaculos.

1. Protectia plantelor fa de atacul insectelor

Pierderile inregistrate anual de productia agricola globala datorita atacului, insectelor daunatoare sunt estimate la aproximativ 14%, in timp ce raportat la unele specii vegetale in parte pierderile sunt mult mai mari: 52% la grau, 83% la orez, 59% la porumb, 74% la cartofi, 58% la soia si 84% la bumbac (Oerke si colab., 1994). Insectele determina scaderea productiei agricole atat prin actiune directa cat prin actiune indirecta, ca vectori ai unor fitopatogeni variati. Limitarea actiunii acestora se realizeaza prin folosirea pesticidelor, estimata la un cost de aproximativ 10 miliarde de USD anual.

Obtinerea de plante rezistente la daunatori reprezinta poate domeniul cel mai spectaculos al ingineriei genetice aplicate la plante, deoarece a permis regenerarea de plante transgenice care contin gene de origine bacteriana ce le asigura protectie fata de anumite insecte daunatoare. Aceasta asigura, pe de o parte, obtinerea de recolte mai bogate si, pe de alta parte, reducerea cheltuielilor fermierilor pentru pesticide.

In ultimii ani, au fost descoperite o serie de noi gene pentru rezistenta la atacul insectelor, transferabile la plante. Dintre acestea sunt de amintit: gene ce codifica producerea 5-endotoxinei de la- Bacillus thuringiensis, gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici; gene de la plante ce codifica sinteza unor lectine specifice; gene care detennina inducerea sintezei unor compusi vegetali de tipul fitoalexinelor etc.

1.1. Genele pentru b-endotoxina de la Bacillus thuringiensis

Dupa descoperirea sa in 1901 de catre Ishiwata, aceasta bacterie a fost supusa unor cercetari asupra producerii unor substante inhibitorii pentru insecte, astfel ca in 1951 a fost elaborat un biopesticid care a stat la baza obtinerii unor produse cunoscute sub numele de Thuricid si Dipel.

In elaborarea metodologiei de clonare s-a pornit de la observatia ca exista un grup de bacterii Gram pozitive, apartinand speciei Bacillus thuringiensis, care produc o toxina, numita delta-endotoxina sau proteina cristal, capabila sa omoare o gama larga de insecte (coleoptere, lepidoptere, diptere), in functie de tulpina bacteriana. De mare interes este tulpina B.thuringiensis var.tenebrionis care sintetizeaza o 8-endotoxina eficienta impotriva gandacului de Colorado. Genele implicate in sinteza acestei proteine sunt localizate, la majoritatea tulpinilor bacteriene, pe plasmide de dimensiuni mari (75 kb), producerea toxinei facandu-se in cursul sporularii.

De asemenea, s-a dovedit ca proteina cristal (5-endotoxina) este exprimata, in mod normal, ca o pro-toxina inactiva, de dimensiuni mari, care sufera o prelucrare proteolitica in intestinul insectei sensibile, devenind toxina activa.

Aceasta recunoaste receptorii specifici de la nivelul celulelor intestinale si blocheaza functiile acestor celule, ceea ce conduce la moartea insectelor.

Studiile asupra genelor ce codifica proteinele inhibitoare produse de Bacillus thuringiensis au condus la gruparea acestora in patru tipuri pe baza specificitatii de actiune (de tipul insecta tinta) si a secventei de nucleotide:

genele cry de tipul I codifica proteine de 130kDa specifice pentru larvele de lepidoptere;

genele cry de tipul II codifica proteine de 70kDa active asupra larvelor de diptere si lepidoptere;

genele Cly de tipul III codifica proteine de 70kDa cu actiune specifica asupra larvelor de coleoptere;

genele cry de tipul III codifica proteine inhibitorii pentru larvele de diptere.

S-a reusit obtinerea genelor pentru proteina cristal de la mai multe tulpini de B.thuingiensis prin amplificare genetica (PCR). Deoarece s-a dovedit ca gena specifica pentru proteina cristal se exprima foarte slab in celulele vegetale transformate, s-a realizat o gena modificata, ce contine doar informatia pentru portiunea N-terminala a proteinei (aminoacizii 1-645). Mai mult, pentru a mari exprimarea genei in plante, secventa naturala pentru aminoacizii 1-415 bogata in AT a fost inlocuita de o secventa sintetica, bogata in GC, ce contine codonii preferati de celulele vegetale. Aceste gene recombinate au fost introduse in vectori derivati de la plasmida Ti (vectori binari ce contin promotorul CaMV duplicat, fapt ce mareste de 5 ori procesul de transcriere si gene marker de selectie-pentru rezistenta la antibiotice sau la erbicidul fosfinotricin), transferate in celule de A.tumefaciens ce contin plasmide Ti dezarmate.

Tulpinile bacteriene recombinate au fost apoi utilizate pentru infectarea plantelor test (cartof, tutun, bumbac). Selectia s-a realizat mai intai in functie de markerii de selectie purtati de vectori, iar in final, plantele regenerate au fost supuse atacului insectelor. Plantele transgenice regenerate au manifestat rezistenta la atacul insectelor daunatoare, caracterul mentinadu-se si exprimandu-se si in cazul experimentelor in camp. Prima planta transgenica obtinuta care manifesta rezistenta la atacul insectelor apartine speciei Nicotina tabacum (Vaeck si colab., 1987), ea exprimand gena crylA, intreaga sau trunchiata, clonata sub controlul unui promotor constitutiv astfel incat proteina inhibitoare reprezinta 0,02% din totalul de proteine vegetale (din frunze).

Fujimoto si colab. (1993) au utilizat o metodologie asemanatoare pentru a transforma plante de orez, iar Perlak si colab.(l993), prin donarea unei gene cry III sintetica au obtinut plante transgenice de tutun si cartof rezistente la atacul gandacului de Colorado.

Mai recent, Arencibia si colab. (1997) au utilizat pentru donare o gena modificata cry IA(b) sub controlul promotorului CaMV si au obtinut plante transgenice de trestie de zahar cu rezistenta la larvele de Diatraea saccharalis.

Data fiind semnificatia practica a rezistentei plantelor la insectele daunatoare, cercetarile au fost extinse si la alte specii de plante, obtinandu-se plante de vinete rezistente la atacul unor coleoptere (Arpaia si colab., 1997), brocoli cu rezistenta la anumite specii de lepidoptere (Selvapandian si colab., 1998), porumb cu rezistenta la Busseola fusca (RGnsburg si colab., 1999) etc. precum si o serie de progrese la pante leguminoase (Ortiz si colab., 2000).

1. Gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici cu efect de insecticid

Exprimarea de catre plantele transgenice a unor enzime, cum ar fi chitinaza, colesterol oxidaza, lipoxigenaza, fenol-oxidaza, peroxidaza sau izopentenil transferaza (ipt) ar putea constitui o alternativa la utilizarea genei pentru d-endotoxina (Shanna si colab.,2000).

Dintre enzimele care pot asigura protectie plantelor transgenice fata de atacul insectelor, un loc aparte este ocupat de chitinaze, enzime ce actioneaza asupra chitinei, component de baza al inve1isurilor insectelor. Astfel, plantele transgenice de tutun care exprima gene pentru chitinaza izolate de la insecte (Ding si colab, 1998) sau de la fasole (Gatehouse si colab., 1993) manifesta o rezistenta crescuta la lepidoptere.

O alta enzima de origine bacteriana care manifesta actiune insecticida este colesterol oxidaza. Spre exemplu, introducerea si exprimarea genei cho A pentru colesterol oxidaza de la Streptomyces sp. in plante de tutun a condus la o rezistenta crescuta a plantelor transgenice obtinute fata de larve de Anthonomus grandis (Cho si colab., 1995).

Utilizarea pentru clonare a genei pentru enzima izopentenil transferaza (ipt) bacteriana prin fuziune cu promotorul genei pentru inhibitorul proteazic II a determinat obtinerea unor plante transgenice de Nicotina plumbaginifolia rezistente la actiunea larvelor unor lepidoptere specifice (Smigocki si colab., 1993)

O serie de gene ce codifica diferiti inhibitori pentru serin-proteaze au fost izolate din diferite surse (plante, microorganisme) si clonate in diferite specii vegetale, cum ar fi Medicago sativa, tutun, porumb etc; plantele transgenice obtinute au manifestat o rezistenta crescuta fata de diferite insecte daunatoare romparativ cu plantele normale, nemodificate genetic (Edmonds si colab., 1996; Yeh si colab., 1997).

Ca o concluzie se poate spune ca, in ciuda rezultatelor remarcabile obtinute pana acum, genele utilizate pentru transformarea plantelor de cultura sunt fie prea specifice, fie doar partial efective asupra tinte1or reprezentate de insectele daunatoare. De aceea, pentru a folosi plantele transgenice ca adevarate 'arme' pentru controlul daunatorilor ar fi necesar ca la nivelul lor sa existe transgene care sa determine sinteza unor compusi cu actiuni diferite asupra aceleiasi tinte.

De asemenea, desi s-au obtinut plante transgenice cu rezistenta la daunatoare in cazul mai multor specii de plante cultivate, mai putine rezultate au fost raportate in cazul cerealelor, a legumelor si a plante1or oleaginoase. Mai mult, in cazul acestor plante sunt necesare studii suplimentare referitoare la siguranta lor, la posibila toxicitate pentru om si animale, a implicatiilor ecologice ale utilizarii lor si, nu in ultimul rand la pretul de cost care trebuie sa fie accesibil fermierilor si tarilor sarace (Riva si colab., 2000).

1.3. Gene de rezistenta la fitopatogeni microbieni, virali si la nematode

Rezistenta plantelor la diferite boli a constituit un subiect pentru studii efectuate de multa vreme, reusindu-se identificarea unui numar relativ mare de gene de rezistenta. Desi s-a crezut ca genele endogene de rezistenta ar asigura un efect durabil pentru plantele corespunzatoare, doar in foarte putine cazuri acest, lucru a fost adevarat. De exemplu, in cazul cartofului, programul de control al anumitor boli, cum este putregaiul provocat de Phytophtora infestans a trebuit abandonat deoarece rezistenta la aceasta boala a plantelor de cartor obtinute prin transferul celor 11 gene de rezistenta pe baza incrucisarilor cu specia salbatica Solanum demissum s-a dovedit a fi scurta durata (Landeo si colab., 1995). De asemenea, identificarea eventualelor gene de rezistenta in genomul diferitelor specii vegetale si transferul lor la alte plante de cultura este extrem de dificila si consumatoare de timp daca se utilizeaza metode traditionale (hibridarile intra- si interspecifice).

2. Plante transgenice producatoare de vaccinuri comestibile sau de anticorpi

Progresele inregistrate in ultimii 10 ani in biologia moleculara si in domeniul imunologiei au permis o mai buna intelegere a numeroase boli si au condus la dezvoltarea unor strategii noi pentru vaccinare. Una dintre directiile promitatoare in acest sens este obtinerea de plante transgenice in care sa se exprime gene pentru diferiti antigeni. Proteinele antigenice derivate de la plantele transgenice elimina sau previn unele boli la animale, iar in testele clinice in cazul oamenilor ele s-au dovedit a fi sigure si functionale (WalmsJey si Arntzen, 2000). S-a dovedit ca raspunsul imun al unui organism fata de un anumit patogen poate fi indus prin utilizarea unor polipeptide similare celor din structura epitopilor agentilor etiologici (Vior, 2000). In acest sens au fost elaborate tehnologii de obtinere a vaccinurilor subunitare care au avantajul ca elimina utilizarea de virusuri 'vii' sau de microorganisme patogene active, dar dezavantajul ca sunt termosensibile si foarte scumpe.

Producerea unor asemenea vaccinuri in plante elimina unele impedimente curente: pretul de cost ar fi mic, se elimina riscul contaminarii de patogeni animali, se asigura o stabilitate pentru produsul obtinut, iar administrarea se poate face pe cale orala si nu prin injectare.

Primele testari c1inice ale unui vaccin produs de plante au fost realizate in 1998, prin demonstrarea caracterului imunogen al unui antigen bacterian recombinat produs de plante transgenice de cartof: administrarea 'vaccinului' comestibil a condus la inducerea unui raspuns imun la nivelul mucoaselor (Tacket si colab., 1998).

Cele mai recente studii referitoare la vaccinurile 'comestibile' produse de plante transgenice tin de stabilirea metodelor optime de administrare si dozare, a tipului de raspuns imun, si a duratei sale in cazul patogenilor de tipul Vibrio dzolerae, Pseudomonas aeruginosa, HIV sau virusul hepatitei murine (Mason si colab., 1998).

Experimente recente efectuate de Brennan si colab. (1999) au evidentiat posibilitatea folosirii unor proteine antigenice derivate de la Staphylococcus sureus produse de plante transgenice ca vaccinuri orale sau nazale: prin administrarea la soareci a probelor respective si examinarea ulterioara a unor fluide recoItate de la animalele tratate (de la nivelul bronhiilor sau a intestinului) au fost detectate imunoglobuline de tipul IgA si IgG specifice pentru antigenul folosit in unele fluide testate.

O a doua strategie interesanta este clonarea in plante a genelor ce codifica sinteza unor anticorpi specifici, pentru obtinerea de 'anticorpi monoclonali vegetali'. Producerea primului tip de anticorp recombinat sintetizat de plante a fost descrisa de Hiatt si colab. (1989). Plantele transgenice au fost obtinute prin utilizarea sistemului de transformare mediat de Agrobacterium tumefaciens.

S-a dovedit ca anticorpii functionali au fost produsi doar atunci cand moleculele de ADNc ce codifica cele doua tipuri de catene ale unui anticorp contin o secventa senmal derivata de la genele pentru anticorpi de soarece. Acest fapt sugereaza ca echipamentul enzimatic al celulelor vegetale recunoaste secvente 'leader' heterologe, permitand exprimarea genelor clonate sub controlul lor. Desi promitatoare, aceste experimente sunt abia la inceput, fiind necesare studii suplimentare In vederea optimizarii producerii unor asemenea compusi de catre celulele vegetale, la nivel de bioreactor sau direct in camp, la un pret de cost convenabil (Whitelam si colab., 1994).

3. Plante transgenice folosite pentru cercetari asupra unor procese fiziologice fundamentale

Formarea tesuturilor tumorale ca urmare a introducerii unor gene bacteriene in genomul vegetal prin transformarea realizata de bacteriile din genul Agrobacterium constituie un exemplu de modificare genetica naturala a procesului si biosinteza a fitohormonilor.Astfel, prin integrarea in genomul plantelor gazda a genelor bacteriene care induc sinteza anormala a acidului indolilacetic (IAA) si a citokinelor (CK) determina proliferarea necontrolata a celulelor vegetale. Utilizarea drept plante test a speciilor Arabidopsis thaliana si Nicotina tabacum au evidentiat faptul ca exista mai multe cai posibile de biosinteza ale IAA, unele implicand triptofanul ca intermediar, iar altele presupunand implicarea indolului sau a unor alti precursori timpurii.

In concluzie, prelucrarea genelor ce codifica enzimele implicate in biosinteza fitohormonilor demonstreaza posibilitatea obtinerii de plante transgenice care sa prezinte niveluri mai ridicate sau mai scazute ale acestor hormoni, in functie de scopul urmarit cu aceste plante.

4. Clonarea genelor in celulele vegetale prin utilizarea bacteriilor din genul Agrobacterium

Pentru evidentierea particularitatilor procesului de clonare in celulele vegetale vor fi prezentate in continuare unele aspecte legate de sistemul natural de transfer de gene prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium precum si elementele specifice ale vectorilor de clonare si a markerilor de selectie pentru celulele vegetale.

4.1. Particularitatile bacteriilor din genul Agrobacterium

A.tumefaciens si A.rhizogenes sunt bacterii ce traiesc in sol, ele fiind capabile de a produce boli unor specii de plante dicotiledonate si gimnosperme. S-a dovedit ca tulpinile de A.tumefaciens determina aparitia unor tumori de tip 'crown gall' pe tulpinile ranite ale unor plante (in special la nivelul coletului), in timp ce tulpinile de A.rhizogenes induc formarea de radacini adventive (de tip 'hairy') la nivelul tesuturilor vegetale ranite.

Modificarile morfogenice determinate de infectarea plantelor cu tulpini de A.tumefaciens si A.rhizogenes se datoreaza transferului unor gene de origine bacteriana in celulele vegetale. Bacteriile din genul Agrobacterium prezinta un sistem genetic organizat care permite introducerea de gene noi in celula vegetala, gratie prezentei in celula lor a unei plasmide Ti ('tumor inducing') sau Ri ('root inducing'), ce reprezinta factorul determinant al producerii tumori lor, respectiv'al radacinilor anormale, la plante. Transferul unei portiuni din aceste plasmide in genomul celulei vegetale determina modificari functionale, ce se concretizeaza prin aparitia fenomenului tumoral. Aceste plasmide constituie un sistem organizat si complex de transfer de informatie genetica naturala in celula vegetala, fara influenta asupra echilibrului ecologic.

In principiu, plasmidele Ti contin mai multe regiuni, cu functii distincte: regiunea ADN- T (continand genele de tumorigeneza), regiunea de virulenta (genele vir), regiunea de incompatibilitate (genele inc), regiunea ce controleaza transferul conjugativ al plasmidei (genele tra) etc.

4. Regiunea de virulenta cuprinde gene esentiale pentru transferul de ADN bacterian in celulele vegetale, fara a fi insa ele insele transferate. Regiunea vir cuprinde un segment de aproximativ 30-40kb (in functie de tulpina bacteriana), fiind formata din mai mult de 20 de gene organizate in cel putin sase unitati transcriptionale (operonii): virA(o gena), virB (11 gene), virC (2 gene), virD(4 gene), virE (2 gene) si virG (o gena) (Weising si Kahl, 1996). Toti acesti operoni sunt indusi in prezenta celulelor vegetale ranite, functiile lor fiind urmatoarele:

virA si virG codifica proteine responsabile de recunoasterea celulelor vegetale ranite si de inducerea celorlalte functii vir;

virC si virD codif1ca proteine ce asigura formarea unei copii de ADN-T monocatenar, transferabil in celula vegetala;

virD si virE codifica proteine ce formeaza un complex impreuna cu ADN-T ghidandu-l spre nucleul celulei vegetale;

virB codifica proteine ce raspund de transportul ADN- T proteine prin membrana plasmatica bacteriana.

Exprimarea genelor localizate in regiunea de virulenta a plasmidelor Ti este inductibila, fiind reglata de actiunea unor factori din exterior.

Experimental s-a demonstrat ca, sub actiunea unor molecule semnal din exsudatele plantelor sau la nivelul ranilor produse la plante are loc o puternica activare a acestor gene. Aceste molecule semnal sunt compusi fenolici de tipul acetosiringonei sau a al fahidroxiacetosiringonei, care au actiune asupra genelor reglatoare virA si virG.

Produsii acestor gene sunt asemanatori cu alte proteine membranare bacteriene cu rol in reglare.

Alaturi de genele vir plasmidiale au mai fost identificate unele gene, localizate la nivelul cromozomului bacterian implicate, se pare, intr-o mai mica masura in procesul de transformare genetica.

Dintre aceste gene mentionam: genele chvA si chvB implicate in sinteza si secretia beta-1,2 glucanului; gena chvE necesara pentru inducerea regiunii vir si pentru chemotactismul bacterian; locusul cel responsabil de sinteza fibrinelor de celuloza implicate in atasarea bacteriilor la celulele vegetale; gena psA (exoC) implicat in sinteza glucanului ciclic si a acidului succinoglicanic; locusul alt implicat in sinteza unor proteine celulare de suprafata

4.3. Mecanismul transferului ADN-T in celula vegetala

Primele etape ale interactiunii dintre plante si celulele de Agrobacterium sunt urmatoarele:

celulele vegetale ranite elibereaza o serie de compusi fenolici (ex.acetosiringona), aminoacizi sau glucide (acid D-galacturonic sau acid D-glucuronic) care servesc drept chemoatractanti pentru agrobacterii;

recunoasterea celulelor ranite si atasarea bacteriilor la nivelul acestora ca urmare a exprimarii constitutive a genelor vir cromosomale, procesul fiind denumit colonizare bacteriana;

inducerea functiilor vir plasmidiale si inceperea procesului de transfer al ADN-T in doua etape: una ce se desfasoara in celula bacteriana si o alta ce are loc in celula vegetala.

Etapa bacteriana include evenimentele ce conduc la producerea si exportul ADN-T incepand cu activare a functiilor vir plasmidiale de catre compusii fenolici sau glucidici eliberati din celulele vegetale ranite. Pentru ca ADN- T sa fie transferat este necesara prezenta secventelor marginale de 25pb si cel putin in cazul unor anumite plasmide Ti, existenta unui element suplimentar localizat in afara ADN- T ('overdrive').

Proteina virD2 recunoaste marginile ADN-T si le cliveaza generand un segment de ADN monocatenar lung de aproximativ 20kb, simultan avand loc sinteza catenei lipsa.

Pentru a ajunge in nucleul celulei vegetale, complexul ADN-T-proteine traverseaza membrana plasmatica si spatiul periplasmic bacterian, peretele celular vegetal, plasmalema celulei vegetale si membrana nucleara.

Rolul proteinelor vir este complex: pe de o parte protejeaza ADN-T de atacul exonucleazelor, asigura transportul intr-o forma corespunzatoare si participa la fonnarea unor pori la nivelul membranei plasmatice si la nivelul membranei externe a bacteriei. La procesul de translocare mai participa si proteinele codificate de operonii suplimentari virF si virH cu rol in directionarea complexului ADN-T spre nucleul celulei vegetale.

Odata patruns in citoplasma celulelor vegetale, complexul T (ADN si proteine) este preluat de proteinele vegetale si transportat in nucleu, unde ADN-T este integrat in genom.

4.4. Integrarea ADN- T in genomul celulei vegetale

Ultima etapa a procesului de transformare genetica a plantelor este integrarea ADN- T in genomul celulei vegetale.Date recente au evidentiat ca, dupa integrare, ADN- T adopta trasaturile cromatinei eucariote: formarea de nucleosomi si sensibilitatea la actiunea DN-azei.Acest din urma aspect sugereaza o integrare preferentiala la nivelul regiunilor din genomul vegetal care sunt transcrise (Kahl si colab., 1987).

De asemenea, o serie de date experimentale au condus la concluzia ca integrarea ADN- T are loc atat la nivelul exonilor cat si la nivelul intronilor fara a fi observata vreo preferinta pentru una sau alta dintre secvente. Mai mult, cercetari recente au aratat ca integrarea ADN-T s-ar realiza la nivelul unor 'puncte fierbinti' din genomul vegetal: la nivelul zonelor unde ADN au suferit unele modificari si unde este necesara interventia enzimelor implicate in procesul reparator (Tinland, 1996).

Patrunderea complexului ADN- T este facilitata de proteinele insotitoare virD2 si virE2, la care se adauga si proteina virF, cu rol mai mic in acest proces.

Mecanismul exact al integrarii ADN-T in genomul vegetal nu a fost clarificat, dar se considera ca integrarea se realizeaza prin recombinare nelegitima (Finberg si colab.,1995; Puchta, 1998).

Sintetizand datele de pana acum se pot enunta cateva concluzii referitoare la procesul de integrare:

integrarea ADN- T nu este situs-specifica si nu necesita prezenta in ADN vegetal a unor secvente omoloage, fiind deci vorba de un proces de recombinare 'nelegitima';

integrarea ADN- T conduce la aparitia unor mici deletii (13-73pb) ale ADN vegetal, la nivelul situsului de insertie;

5. Vectori de clonare pentru celula vegetala

Pentru realizarea transferului eficient de gene in celulele vegetale tinta au fost construiti vectori de donare specifici, de obicei derivati de la plasmidele Ti sau Ri sau de la unele virusuri caracteristice unor specii vegetale.

5.1. Vectori plasmidiali

Sistemul natural de transfer este impropriu pentru a fi utilizat, ca atare, in scopul ameliorarii plantelor. Pentru a putea fi aplicat, plasmidele Ti au fost modificate drastic, prin eliminarea genelor ce detelmina producerea tumorilor, prin mentinerea si clonarea in alte plasmide, mai mici, doar a regiunilor marginale si a unor promotori ce sunt recunoscuti de echipamentul de transcriere al celulelor vegetale. De asemenea, intre extremitatile ADN-T prelucrat, au fost introduse gene marker specifice (nptII, gus, cat, gfp) sub controlul unor promotori corespunzatori (tnos, P35S), obtinandu-se vectori de clonare foarte eficienti.

O alta strategie in transferul de gene in celula vegetala o constituie utilizarea, vectorilor 'binari', in care regiunile vir si ADN-T sunt separate fizic pe plasmide diferite. S-au obtinut astfel sisteme de vectori binari ce constau dintr-o pereche de plasmide, ambele capabile de replicare in Agrobacterium :

o plasmida Ti modificata, dezarmata total (fara ADN-T) ce contine genele vir;

o plasmida cu spectru larg de gazda (o plasmida tip 'naveta', capabila de replicare in E.coli si in A.tumafaciens), ce contine gena ce trebuie introdusa in celula vegetala, impreuna cu un marker de selectie pentru celulele vegetale transformate.

5. Vectori virali

Desi se cunoaste ca Agrobacterium tumefaciens nu infecteaza monocotiledonatele, prin prelucrarea plasmidei Ti a ADN-T, in sensul introducerii intre marginile acestei regiuni a genomului virusului variegarii pommbului sau a CaMV, s-a reusit transferul respectivelor gene la cereale. Acest tip de infectie a primit denumirea de agroinfectie.

In ultimii ani, pentru obtinerea de plante transgenice au fost testati si vectori derivati de la diferite virusuri specifice plantelor. Desi la animale cei mai utilizati vectori sunt cei derivati de la retrovirusuri, la plante acest lucru nu s-a realizat pentru ca virusurile ce infecteaza plantele sunt mai putin cunoscute la nivel molecular. Printre cele mai studiate virusuri vegetale se numara: virusul mozaicului amopidei (CaMV), virusul latent al maniocului (CLV), virusul piticismului la grau (WDV), virusul mozaicului galben al tomatelor (TGMV) etc.

6. Modalitati de introducere a genelor de interes in celulele vegetale

Pentru introducerea vectorilor de donare recombinati in celulele vegetale tinta au fost elaborate numeroase metode, a caror eficienta variaza in functie de specia vegetala testata sau de tipul de tesut utilizat in experimente. Dintre acestea mentionam:

metoda co-cultivarii celulelor bacteriene A. Tumefaciens sau A.rhizogenes ce contin vectori de clonare specifici) cu fragmente de tesut vegetal, cu suspensii celulare vegetale, cu protoplasti vegetali, cu lastari sau chiar cu seminte;

electrotransformarea celulelor vegetale (tesut intact, celule intregi sau protoplasti) folosindu-se ADN plasmidial modificat;

transformarea directa a protoplastilor vegetali cu ADN plasmidal purificat dintr-o gazda bacteriana;

microinjectarea ADN in celule sau in tesutul conducator (macroinjectarea);

metoda biolistica (bombardarea celulelor vegetale cu microproiecti1e reprezentate de particule de tungsten sau aur coloidal acoperi te cu ADN de interes);

utilizarea lipozomilor care sa asigure protejarea ADN de interes fata de actiunea nucleazelor celulelor transfonnate.

De asemenea, au fost obtinute plante tolerante la erbicidele din clasa acidului benzoic incluznd si dicamba, prin incorporarea in planta a genei antisens 1-aminocyclopropane- 1-carboxilic acid (ACC ) synthase, a genei antisens ACC oxidazei, a genei ACC deaminazei sau a combinatiei dintre ele.Dicamba(denumireacomerciala -Banvel) este un erbicid folosit pre-emergent si post-emergent pentru combaterea buruienilor anuale cu frunza lata si a ctorva buruieni cu frunza ingusta, din suprafetele cultivate cumai multe specii de cultura. Bacteria care metabolizeaza erbicidul dicamba este cunoscuta,iar genele specifice, responsabile pentru metabolizarea erbicidului pot fi izolate si folosite pentru a produce plante rezistente la dicamba si pentru alte organisme.Plantele transgenice din prima generaie au fost nzestrate cu nsuiri de rezisten la erbicide (soia, canola), la insecte (bumbac, porumb) si virusuri (papaia, dovlecel). Prin eliminarea sau prin reducerea semnificativ a pierderilor cauzate de buruieni, de boli si de duntori, culturile transgenice s-au remarcat prin producii superioare, contribuind totodat la conservarea solului, a apei, energiei si a altor resurse.

Rezistena la erbicide

Primele plante transgenice de bumbac, crora li s-a transferat gena ce codific sinteza toxinei Bt, au fost obinute n 1996. Deoarece bumbacul are o mare diversitate de duntori, nu se poate renuna la insecticide, n special din cauza Lepidopterelor care nu sunt susceptibile la endotoxina exprimat de plante, nici n cmp i nici n laborator, probabil datorit exprimrii continue a toxinei n plante, ceea ce a dus la o puternic presiune de selecie.Oamenii de tiin au observat i o bun conduit a rezistenei unor insecte, pentru c exprimarea toxinei n esuturile unor plante este inegal, iar ele vor ataca acele esuturi sau poriuni de esut n care concentraia toxinei este sczut. Mai mult, pentru c adesea concentraia toxinei scade n frunze i tulpin pe msur ce planta ajunge la maturitate, dozele sczute pot s omoare sau s slbeasc puternic larvele susceptibile (homozigote) i prin urmare adaptarea la toxina Bt se produce mult mai rapid atunci cnd concentraia rmne mereu nalt.

Suprafata cultivata in lume in anul 2007-2014 cu plante modificate genetic

Suprafetele cultivate cu plante transgenice au crescut semnificativ, de la 2 milioane hectare in 1996 la 80 milioane hectare in 2003, iar piata totala a semintelor transgenice a depit 3 miliarde dolari.

Biotehnologia vegetal a demonstrat c nu mai este o tiina abstracta, care prezint numai promisiuni si poteniale, ci o tehnologie agricol puternic, de cretere a productivitii, cu impact pozitiv att asupra snttii oamenilor si a mediului ct si asupra conservrii biodiversitaii, a terenului arabil, a apei si a resurselor energetice.In anul 2005 400 milioane ha au fost cultivate la nivel global cu plante biotech, de ctre 8,5 milioane fermieri din 21 de ri, dar SUA, urmate de Argentina, Brazilia, Canada i China s-au alat pe primele locuri, soia a ocupat primul loc ntre speciile biotech cultivate, urmat de porumb, bumbac i rapi, iar tolerana la erbicide a continuat s reprezinte nsuirea dominant n transformare.Primele culturi comerciale de plante modificate genetic (OMG) au fost introduse n Romnia n anul 1998, pornind de la 14 varietati de soia modificata genetic. n aprilie 2007, a fost aprobata tacit si cultivarea porumbului modificat genetic MON810 (patent Monsanto), singurul OMG autorizat n UE. Legislatia romneasca prevede etichetarea produselor modificate genetic ca fiind obligatorie nca din iunie 2006. Desi este n vigoare, aceasta lege nu este implementata.

Soiul de porumb transgenic

Numeroase gene utile au fost introduse n etapa urmtoare n genomurile speciilor de plante cultivate pentru alimente sau pentru fibre, n scopul mbuntirii calitii, a valorii nutriionale si a rezistenei la diveri factori abiotici si biotici de stres. Peste 50 de astfel de specii de plante transgenice au fost aprobate pentru cultivare la scara comerciala, iar alte 100 de specii se afla in faza de testare n cmp. Se prevede ca aceast a doua generaie de plante transgenice (Tabel nr.1) s fie introduse pentru producie comercial n urmtorii 5 ani.Suprafetele cultivate cu plante transgenice au crescut semnificativ, de la 2 milioane hectare in 1996 la 80 milioane hectare in 2003, iar piata totala a semintelor transgenice a depit 3 miliarde dolari.

Biotehnologia vegetal a demonstrat c nu mai este o tiina abstracta, care prezint numai promisiuni si poteniale, ci o tehnologie agricol puternic, de cretere a productivitii, cu impact pozitiv att asupra snttii oamenilor si a mediului ct si asupra conservrii biodiversitaii, a terenului arabil, a apei si a resurselor energetice.

In anul 2005 400 milioane ha au fost cultivate la nivel global cu plante biotech, de ctre 8,5 milioane fermieri din 21 de ri, dar SUA, urmate de Argentina, Brazilia, Canada i China s-au alat pe primele locuri, soia a ocupat primul loc ntre speciile biotech cultivate, urmat de porumb, bumbac i rapi, iar tolerana la erbicide a continuat s reprezinte nsuirea dominant n transformare.

Numeroase gene utile au fost introduse n etapa urmtoare n genomurile speciilor de plante cultivate pentru alimente sau pentru fibre, n scopul mbuntirii calitii, a valorii nutriionale si a rezistenei la diveri factori abiotici si biotici de stres. Peste 50 de astfel de specii de plante transgenice au fost aprobate pentru cultivare la scara comerciala, iar alte 100 de specii se afla in faza de testare n cmp. Se prevede ca aceast a doua generaie de plante transgenice (Tabel nr.1) s fie introduse pentru producie comercial n urmtorii 5 ani.

A doua generatie de plante transgenice: 2005- 2015

- rezisten la erbicide, duntori si patogeni;

- tolerana la secet, srturare, metale grele si extreme termice;

- mbuntirea calitii nutriionale (proteine, lipide, vitamine, minerale);

- mbuntirea aromelor si a parfumurilor;

- eliminarea alergenilor;

- producerea de vaccinuri, proteine umane terapeutice, compui farmaceutici;

- fitoremediere

Agricultura moleculara sau producerea dirijata de compui biofarmaceutici in plante constituie unul dintre cele mai promitoare domenii de cercetare, care utilizeaz plantele transgenice pentru producerea de vaccinuri, proteine profilactice si terapeutice si ali compui biofarmaceutici importani, cum sunt cei pentru tratarea fibrozei cistice, hepatitei B, limfomului non-Hodgkin, diareei, holerei, diabetului si a altor boli. In cea mai mare parte aceste medicamente si vaccinuri sunt produse n porumb, tutun, cartof, tomate sau in banane si se afl n diferite stadii ale testrilor clinice.

Progresele rapide nregistrate in secvenierea genomurilor vegetale si n elucidarea structurii, funciei si reglrii genice au contribuit foarte mult la nelegerea bazelor moleculare ale creterii si dezvoltrii plantelor. Dup ncheierea secvenierii genomului la Arabidopsis thaliana si la orez, cercetrile s-au concentrat pe specii precum Lotus, Brassica, Medicago, porumb, orz, gru, tomate, cartof, soia, plop i pin.

Majoritatea plantelor cultivate au atins deja limitele fiziologice ale productivitii, astfel ca prin metodele ameliorrii convenionale produciile nu mai pot fi crescute semnificativ. Ca urmare este ateptat cu interes cea de a treia generaie de plante transgenice (Tabel nr.2), mai productive si mai bine adaptate la stres abiotic si biotic. Totodat produsele alimentare transgenice vor fi mai nutritive si mai sntoase, iar o gama larga de compui farmaceutici vor fi disponibili dup 2015 pentru utilizare in terapeutica uman si veterinar.

A 3-a generaie de plante transgenice

- modificarea arhitecturii plantei;

- controlarea momentului nfloririi;

- manipularea calitii fructelor si a seminelor, a dimensiunii si a numrului acestora;

- creterea eficienei fotosintezei;

- ameliorarea asimilrii nutrienilor;

- exploatarea si manipularea heterozisului si a apomixiei

In mare parte oamenii de tiina consider transgeneza ca fiind precis, previzibil i sigur. Plantele transgenice sunt printre cele mai exhaustiv testate, caracterizate si reglementate produse din istoria ameliorrii, pentru a se demonstra c acestea si produsele lor sunt cel puin la fel de sigure pentru oameni i mediu ca i plantele care sunt rezultatul ameliorrii convenionale. De altfel, dup unele opinii, ncruciarea si selecia practicate pe parcursul secolelor, au condus la modificarea pronunat a structurii genetice a plantelor, astfel c aproape toate speciile de plante cultivate ar trebui s fie considerate modificate genetic. Prudena este ns necesar pentru a elimina riscul a ceea ce oponenii tehnologiei transgenice numesc efectele neintenionate asupra altor organisme i asupra mediului nconjurtor. Dezvoltarea transgenezei a generat polemici aprinse in care s-au angajat deopotriv oameni de tiina, politicieni, oameni de afaceri, jurnaliti, organizaii ne-guvernamentale si publicul larg. Spre deosebire de ameliorarea convenional, metodele biotehnologice permit transferul de gene intre specii care nu pot fi hibridate datorita barierelor naturale ale incompatibilitii sexuate, acesta fiind principalul argument al opozanilor care percep instrumentele ingineriei genetice ca fiind nenaturale. Exist teama c aceasta interferen nenatural n constituia genetic a speciilor ar putea n primul rnd avea consecine nedorite pentru sntatea oamenilor, care nu mai accept automat faptul c orice progres tiinific este neaprat benefic pentru umanitate. Multa ngrijorare este generata de driftul genic de la plantele transgenice la cele netransgenice, apariia de insecte tolerante la proteinele cu efect insecticid sintetizate de plantele transformate, apariia de microbi tolerani la mecanismele de rezisten ale plantelor transformate cu gene unice de rezisten, i ngustarea bazei genetice a plantelor cultivate prin reducerea numrului de varieti comerciale. Tehnologia transgenic ideal trebuie sa fie fezabil din punct de vedere comercial, s fie benign pentru mediul nconjurtor i uor de utilizat in diferite agroecosisteme.

Principii generale privind obtinerea plantelor transgenice

Plantele transgenice sunt obtinute in urma experimentelor 'in vitro' de transfer de material genetic exogen: la nivelul lor s-au integrat in mod stabil secvente de ADN provenite de la alte organisme, care le confera anumite insusiri fenotipice noi sau modificate. Obtinerea plantelor transgenice presupune o metodologie specifica, cu etape distincte, care prezinta elemente comune pentru toate tipurile de plante cu care se lucreaza. In cazul anumitor specii vegetale metodologia utilizata este modificata conform particularitatilor acestora astfel incat rezultatul sa fie cel dorit.

Transferul de gene la plante a devenit datorita descoperirii si utilizarii sistemului de transformare genetica prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium (A.Tumefaciens si A.rhizogenes). Rezultatele cercetarilor din domeniul geneticii vegetale, bazate in primul rand pe folosirea plasmidelor Ti de la Agrobacterium tumefaciens, se constituie intr-un material faptic deosebit de bogat.

O analiz recent a situaiei privind plantele biotech (GM) la nivel global, efectuat n cadrul Universitii Cornell, SUA, (C. James, 2010), evideniaz faptul c beneficiile consistente i substaniale de ordin economic i social oferite de plantele biotech, milioane de fermieri din rile n curs de dezvoltare au continuat s planteze suprafee suplimentare cu aceste plante n cursul anului 2008, care reprezint cel de al treisprezecelea de comercializare al acestora. Pe lng creterea suprafeelor cultivate se menioneaz i creterea numrului rilor i al fermierilor la nivel global care au adoptat cultivarea plantelor biotech la nivel global, datorit contribuiei lor la rezolvarea principalelor provocri cu care se confrunt societatea la nivel global, precum securitatea hranei, preurile ridicate ale produselor alimentare, sustenabilitatea, alevierea srciei i a foametei, ca i provocrile asociate cu nclzirea global. Astfel, numrul rilor care au adoptat cultivarea plantelor biotech a crescut de la 6 n 1996, primul an al comercializrii, la 18 n 2003 i la 25 n 2008 ( 10 ri industrializate i 15 n curs de dezvoltare), astfel c suprafaa total cultivat cu aceste plante la nivel global a fost de 125 milioane hectare. La cele 7 specii experimentate n 1996 ( soia, porumbul, tutunul, bumbacul, canola, tomatele i cartoful) s-au adugat specii noi, precum, dovlecelul, papaia, lucerna, garoafele, plopul, petunia, ardeiul i sfecla de zahr. SUA se afl pe primul loc, cu 62,5 milioane ha, cultivate cu soia, porumb, bumbac, canola ( rapi), dovlecel, papaia, cartof, lucern i sfecl de zahr, urmat de Argentina, ( 21 milioane ha cultivate cu soia, porumb i bumbac, Brazilia ( 15,8 mil. ha cu soia, bumbac i porumb), Canada (7,6 mil. ha cu canola, porumb, soia, i sfecl de zahr), India( 7,6 mil.ha cu bumbac ) i China (3,8 mil. ha cu bumbac, tomate, plop, petunia, papaia i ardei). Intre rile care cultiv plante biotech pe o suprafa mai mic de 0,1 milioane ha este listat i Romania (porumb). Caracterele transgenice cu cea mai larg inciden sunt tolerana la erbicide (glifosat) la soia, porumb i sfecl de zahr, urmat de rezistena la insecte la porumb i bumbac. Alte caractere transgenice de interes includ rezistena la virusuri, sterilitatea masculin i calitatea uleiurilor (Q. Que i col., 2010). Dup C. James (2010), adoptarea continu i rapid a plantelor biotech de ct mai multe ri se datoreaz beneficiilor substaniale i consistente att pentru marii fermieri din rile industrializate ct i pentru cei cu mici gospodrii de subzisten din Africa, apreciat drept continentul cu cea mai urgent nevoie de avantajele oferite de biotehnologie. In perspectiv obiectivele prioritare urmrite vizeaz introducerea la orez a caracterului de toleran la secet, i comercializarea n SUA n 2012 i n zona sub- Saharian din Africa n 2017 a porumbului biotech tolerant la secet.

Fr s minimalizeze avantajele pe care le ofer plantele biotech (GM), A. Sonnino, reprezentantul FAO la Conferina REDBIO care a avut loc n Mexic, n Noiembrie 2010, a subliniat ns c, pentru rile n curs de dezvoltare, tehnologiile de cretere a productivitii i de conservare a resurselor naturale trebuie s fie accesibile, potrivite i adaptate la nevoile micilor fermieri, impunndu-se creterea substanial a propriilor investiii n cercetarea-dezvoltarea agricol din sectorul public. Fermierii trebuie s dispun de o palet larg de opiuni tehnologice, inclusiv biotehnologia agricol, care nu se reduce ns la OMG-uri i transgenez, aa cum a reieit din ampla documentaie ntocmit anterior (Martie 2010) cu prilejul Conferinei tehnice internaionale a FAO privind biotehnologiile agricole n rile n curs de dezvoltare (ABDC-10). Intru ct s-a pus prea mare accent pe OMG-uri, au fost trecute cu vederea meritele poteniale i beneficiile altor biotehnologii non- transgenice, care pot avea un rol pozitiv pentru securitatea alimentar i pentru dezvoltarea sustenabil a rilor n curs de dezvoltare. FAO consider c n prezent se produce la nivel global suficient hran pentru a hrni populaia existent, de aproximativ 7 miliarde, dar cu toate acestea unul din ase oameni din rile n curs de dezvoltare sufer de foame cronic, i acest fenomen se datoreaz discrepanelor existente in ce privete distribuia i accesul la hran. Asigurarea securitii alimentare n viitor este garantat numai prin creterea productivitii agricole corelat cu conservarea resurselor naturale, utiliznd instrumentele oferite de tiin i tehnologie, inclusiv de biotehnologiile agricole, n folosul fermierilor, productorilor i consumatorilor. A fost totodat subliniat faptul c guvernele trebuie s-i elaboreze propria viziune i politic naional privind rolul biotehnologiilor, i c s-au consumat prea mult timp i fonduri pentru argumentarea controverselor cu puternic ncrctur emoional privind OMG-urile, n detrimentul biotehnologiilor non-transgenice, cu potenial insuficient exploatat n rile n curs de dezvoltare ( mutageneza, hibridizarea interspecific, embrioculturile, selecia bazat pe markeri moleculari, micropropagarea, etc.).

Aplicaii ale transgenezei la plante

Speciile vegetale prezint o mare diversitate genetic, iar cele slbatice constituie un mare rezervor genetic, din care se pot obine gene importante din punct de vedere practic. Cercetrile de inginerie genetic la plante prezint o semnificaie teoretic deosebit, facilitnd cunoaterea modului de aciune a genelor acestor organisme, a efectelor fitohormonilor asupra dezvoltrii plantelor, a mecanismelor de inactivare a genelor etc. (Meyer, 1995). De asemenea, prin aplicarea tehnicilor de biologie molecular se pot obine informaii utile asupra particularitilor genomului plantelor folosite n ameliorare, a localizrii unor gene de interes, a gradului de nrudire dintre diferite specii etc (Gresshoff, 1994; Edwards i Karp, 1997).n ceea ce privete aplicaiile practice, pn n prezent au fost obinute o serie de rezultate semnificative, unele aplicate deja n practic aa cum sunt: plante transgenice rezistente la viroze; plante transgenice rezistente la atacul unor duntori, plante transgenice rezistente la erbicide (figura 10); plante transgenice de interes horticol (plante ornamentale cu fenotipuri noi, plante care produc fructe rezistente la nmuiere); plante transgenice capabile s sintetizeze metabolii secundari n cantiti crescute; plante transgenice productoare de anticorpi comestibili etc.

Figura 1. Comparaie ntre aspectul unor plante transgenice de tutun rezistente la aciunea erbicidelor i cel al unor plante normale (dup Tarano, 1993)

Protecia plantelor fa de atacul insectelor

Pierderile nregistrate anual de producia agricol global datorit atacului insectelor duntoare sunt estimate la aproximativ 14%, n timp ce raportat la anumite specii vegetale n parte pierderile sunt mult mai mari: 52% la gru, 83% la orez, 59% la porumb, 74% la cartof, 58% la soia i 84% la bumbac (Oerke i colab., 1994). Insectele determin scderea produciei agricole att prin aciune direct ct i prin aciune indirect, ca vectori ai unor fitopatogeni variai. Limitarea aciunii acestora se realizeaz prin folosirea pesticidelor, estimate la un cost de aproximativ 10 miliarde de USD anual.Tehnologia ADN recombinant ofer n prezent posibilitatea obinerii de noi insecticide biologice care pstreaz avantajele agenilor biologici clasici de control avnd n plus unele caracteristici noi. Cu toate acestea, din considerente comerciale, tehnologiile respective nu sunt accesibile tuturor utilizatorilor posibili, mai ales dac acetia sunt sraci i, n plus au generat o serie de dezbateri publice asupra utilitii lor, a efectelor asupra altor organisme dect cele int sau asupra mediului.Obinerea de plante rezistente la duntori reprezint poate domeniul cel mai spectaculos al ingineriei genetice aplicate la plante, deoarece a permis regenerarea de plante transgenice care conin gene de origine bacterian ce le asigura protecie fa de anumite insecte duntoare. Aceasta asigur, pe de o parte, obinerea de recolte mai bogate i, pe de alt parte, reducerea cheltuielilor fermierilor pentru pesticide.In ultimii ani, au fost descoperite o serie de noi gene pentru rezistena la atacul insectelor, transferabile la plante. Dintre acestea sunt de amintit: genele ce codific producerea -endotoxinei de la Bacillus thuringiensis; gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici; gene de la plante ce codific sinteza unor lectine specifice; gene care determin inducerea sintezei unor compui vegetali de tipul fitoalexinelor etc.

Genele pentru -endotoxina de la Bacillus thuringiensis

Dup descoperirea sa n 1901 de ctre Ishiwata, aceast bacterie a fost supus unor cercetri asupra producerii unor substane inhibitorii pentru insecte astfel c n 1951 a fost elaborat un biopesticid care a stat la baza obinerii unor produse cunoscute sub numele de Thuricid i Dipel. n elaborarea metodologiei de clonare s-a pornit de la observaia c exist un grup de bacterii Gram pozitive, aparinnd speciei Bacillus thuringiensis, care produc o toxin, numit delta-endotoxina sau proteina cristal, capabil s omoare o gam foarte larg de insecte (coleoptere, lepidoptere, diptere), n funcie de tulpina bacterian. De mare interes este tulpina B.thuringiensis var. tenebrionis care sintetizeaz o -endotoxin eficient mpotriva gndacului de Colorado. Genele implicate n sinteza acestei proteine sunt localizate, la majoritatea tulpinilor bacteriene, pe plasmide de dimensiuni mari (75 kb), producerea toxinei fcndu-se n cursul sporulrii.

Figura 11. Reprezentarea schematic a plasmidelor recombinate ce conin gena cry A(b) de la Bacillus thuringiensis, folosite pentru obinerea de plante transgenice rezistente la atacul unor duntori

Plantele transgenice regenerate au manifestat rezisten la atacul insectelor duntoare, caracterul meninndu-se i exprimndu-se i n cazul experimentelor n camp.Prima plant transgenic obinut care manisfest rezisten la atacul insectelor aparine speciei Nicotiana tabacum (Vaeck i colab., 1987), ea exprimnd gena cry 1A, ntreag sau trunchiat, clonat sub controlul unui promotor constitutiv astfel nct proteina inhibitoare reprezint 0,02% din totalul de proteine vegetale (din frunze).Civa ani mai trziu (1992) au fost obinute plante de bumbac n care a fost introdus gena cry 1A(c) modificat, clonat sub controlul promotorul CaMV 35S sau sub controlul unui promotor i a unei secvene pentru o peptid de tranzit prin cloroplaste izolate de la Arabidopsis, astfel c nivelul exprimrii genei de interes a condus la obinerea unui nivel ridicat al toxinei: 0,1% din proteina total, respectiv 1%. O alt variant de clonare a genei pentru toxina bacterian a fost aceea a utilizrii unor elemente genetice care asigur exprimarea genei de interes exclusiv n poriunile verzi ale plantei (promotorul deriv de la gena pentru PEPC)(Hudspeth i Grula, 1989) sau n polen (prin folosirea unui promotor derivat de la gena pentru o protein kinaz dependent de calciu = CDPKCa o concluzie se poate spune c, n ciuda rezultatelor remarcabile obinute pn acum, genele utilizate pentru transformarea plantelor de cultur sunt fie prea specifice fie sunt doar parial efective asupra intelor reprezentate de insectele duntoare. De aceea, pentru a folosi plantele transgenice ca adevrate arme pentru controlul duntorilor ar fi necesar ca la nivelul lor s existe transgene care s determine sinteza unor compui cu aciuni diferite asupra aceleiai inte. Cercetrile efectuate sunt de dat relativ recent i vizeaz, n principal combinarea n aceeai gazd a genelor pentru o -endotoxin de la B.thuringiensis cu o alt gen cu efect inhibitor: de exemplu, gena pentru inhibitorul tripsinei de la Vicia faba (CpTI) sau pentru serin-proteaze (Cornu i colab., 1996, Zhao i colab., 1998); gena pentru proteina din nveliul virusului Y de la cartof (Li i colab., 1999). O alt abordare interesant este aceea prezentat de Herrera i colab.(1997) care au introdus gena cry1A(c) ntr-o tulpin de Pseudomonas fluorescens capabil s colonizeze trestia de zahr prin intermediul a dou plasmide, pDER405 i pKT240 la nivelul crora gena se gsete n 13, respectiv 28 de copii. Testarea tulpinilor bacteriene recombinate asupra unor insecte duntoare specifice trestiei de zahr a evideniat o rezisten mai mare a plantelor tratate cu bacteriile respective dect cele netratate. De asemenea, dei s-au obinute plante transgenice cu rezisten la insecte duntoare n cazul mai multor specii de plante cultivate, mai puine rezultate au fost raportate n cazul cerealelor, a legumelor i a plantelor oleaginoase. Mai mult, n cazul acestor plante sunt necesare studii suplimentare referitoare la sigurana lor, la posibila toxicitate pentru om i animale, a implicaiilor ecologice ale utilizrii lor i, nu n ultimul rnd la preul de cost care trebuie s fie accesibil fermierilor i rilor srace.

Plantele transgenice: metode i strategii pentru aplicaii practice

Transformarea genetic a plantelor, proces cunoscut i sub numele de transgenez reprezint la ora actual principalul instrument de cercetare din biologia plantelor dar i un instrument important din punct de vedere practic pentru ameliorarea plantelor de cultur. Prin caracteristicile noi dobndite de plantele transgenice sunt raportate cu o frecven foarte ridicat: rezistena la ierbicide, la insecte, virusuri, obinerea de plante cu sterilitate citoplasmatic masculin precum i obinerea de plante de interes n scop medical.Plantele reprezint principala surs de farmaceutice i substane chimice fine i de aceea, procesele cu privire la transformarea acestora au crescut n ultimii ani, astfel c se poate vorbi de procese care implic modificarea a peste 30 de specii de plante cu importan din punct de vedere economic.Transgeneza este unul din domeniile ingineriei genetice vegetale iar la ora actual cele mai importante strategii i probleme care se pun sunt concentrate asupra nelegerii tiinifice i dezvoltrii tehnice a unor sisteme bine puse la punct pentru transformarea a numeroase specii de plante.Capacitatea de a introduce i exprima diferite gene strine la plante a fost descris pentru prima dat n 1984 la tutun (De Block M., De Sonville A., Debrouwer D., 1995) i apoi a fost extins la peste 120 specii de plante aparinnd a cel puin 35 de familii. Succesul transformrii genetice a plantelor s-a concretizat prin obinerea de plante ornamentale, plante de cultur cu proprieti mbogite, plante medicinale, fructe, etc.Procesele de diversificare i rafinament a tehnicilor de transformare pentru convenien, eficacitate mare, genotipuri variate i caracteristici moleculare superioare vor continua cu efecte de lung durat, astfel c transferul genelor i regenerarea de plante transgenice sunt factori limitativi ai dezvoltrii i aplicrii sistemelor de transformare practic pentru multe specii de plante.Atenia cea mai mare n procesul transformrii este dat de studiul interaciei i expresiei genelor strine-transgenelor- introduse n plante i interacia acestora cu genomul plantei gazd.Ingo Potrykus n 1991 a ncercat s evalueze procesul transformrii genetice a plantelor bazndu-se pe definirea adevrat a transformrii integrative, recurgnd la combinaii genetice, fenotipice i date fizice (Potrykus I., 1991). Din pcate, combinaiile utilizate nu au putut fi dovedite i practic la unele specii de plante. De exemplu, analiza descendenilor unei populaii de copaci este foarte dificil deoarece reproducerea sexuat este nceat, iar propagarea vegetativ la unele specii de plante de cultura, cum ar fi sfecla de zahr, este foarte complicat datorit poliploidizrii sau aneuploidizrii genetice. Similar, o corelare strns ntre datele fenotipice i fizice nu este o caracteristic definitorie a metodelor de transfer a genelor, deoarece muli transformani nu exprim aceste copii de gene introduse. Capacitatea de a introduce i exprima (sau inactiva) genele specific n plante furnizeaz o putere nou instrumentului experimental permind testarea direct a ctorva ipoteze din fiziologia plantelor care sunt deosebit de dificil de rezolvat utiliznd alte caracteristici biochimice (Coruzzi G., Puigdomenech P., 1994). Cteva dintre aceste exemple includ: analize de genetic molecular a semnalelor celulare ce controleaz reproducerea sexuat i interacia microorganism-plant; rolul enzimelor specifice n procesele metabolice determinnd poziionarea fotosintezei i nu n ultimul rnd rolul enzimelor specifice i hormonilor specifici procesului de dezvoltare (Newbigen E., Smyth DR., Clarke AE., 1995).Principalele necesiti n procesele de transfer a genelor pentru obinerea de plante transgenice sunt: (a) capacitatea de a inti esuturi ce includ celule competente pentru regenerarea plantelor; (b) o metod de a introduce ADN n aceste celule regenerabile i (c) un procedeu de a selecta i regenera plantele transformate cu o frecven satisfctoare.La ora actual prin utilizarea sistemelor de transformare cu Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, precum i prin bombardamentul cu particule nvelite n ADN, este posibil introducerea de ADN n orice tip de celul de plant. Numai o mic proporie din aceste celule intite nu vor accepta molecula de ADN n timpul acestui tratament i numai o mic proporie din aceste celule vor supravieui tratamentului i integrrii stabile a ADN nou introdus. De asemenea, este general esenial de a detecta eficiena transformrii prin selecia celulelor transformate comparativ cu cele netransformate, care sunt n exces fa de primele i de a stabili aceast eficien a transformrii prin punerea la punct a unor condiii de regenerare de plante dintr-o singur celul transformat.Din punct de vedere practic este necesar utilizarea unor tehnici alternative de evaluare a transformrii i anume:(a) gsirea esutului int; ex: resursele necesare meninerii unui supliment continuu de explante cum ar fi embrioni imaturi la un stadiu corect de dezvoltare pentru transformare.(b) eficien ridicat, economic, reproductibil, pentru a produce muli transformani independeni pentru testare practic.(c) simplitate tehnic, implicnd un minim de manipulri variabile cum ar fi producerea de protoplati i regenerani.(d) cotransformarea frecvent cu gene multiple, cum ar fi o proporie ridicat de linii de plante selectate pentru expresia unor gene marker.(e) selecia sau screeningul eficient de a obine plante transgenice din celule transformate.(f) minimul de timp n realizarea culturilor de esuturi, reducerea costurilor asociate i evitarea indizerabil a variaiei somaclonale.(g) obinerea de transformani uniformi i stabili, pentru speciile cu propagare vegetativ sau linii germinale fertile pentru speciile cu propagare sexual.(h) capacitatea de a introduce secvene de ADN fr secvene de vectori.(i) patternul simplu de integrare i numr mic de copii a genelor introduse, minimizeaz probabilitatea indizerabil de dezagregare a genelor la situsul de inserie, sau multicopii asociate silenierii genelor (Birch R.G.,1997).(j) aplicabilitate opional de transformare a genomurilor organelare.

Strategii de realizare a transformrii n prezent cele mai utilizate tehnici de realizare a transformrii la plante sunt: Transformarea protoplatilor; Bombardamentul biolistic sau cu microproiectile; Transformarea mediat de Agrobacterium.Dar care dintre aceste metode este cea mai utilizat? Rspunsul la aceast ntrebare depinde de foarte muli factori, de exemplu, de interesele economice, cum ar fi transformarea la porumb, care depinde de accesibilitatea esutului, tipurile de echipamente accesibile. Metodele alese sunt extinse la obinerea de genotipuri de elit, care sunt uneori mai puin accesibile la condiiile de cultura in vitro(Haymes, K.M., Davis T.M., 1998).Este foarte instructiv s considerm c exist specii de plante cum ar fi orezul, care sunt considerat a fi recalcitrante la transformare, dar care acum pot fi transformate datorit utilizrii tehnicilor de bombardament cu particule a embrionilor imaturi, culturilor de celule sau utilizarea transferului direct mediat de Agrobacterium direct asupra calusului embriogenic (Hiei I., Ohta S., Komari T., Kumashiro T., 1994).n fiecare caz, succesul transformrii nseamn: identificarea (sau producerea de culturi de esuturi cu multe celule regenerative) optimizarea parametrilor pentru transfer de gene n celule i punerea la punct a proceselor de selecie i regenerare a plantelor transgenice obinute (fig.1)(Cao J., Duan X., McElroy D., Wu R., 1992).Identificarea relativ a transformrii

Dezvoltarea de sisteme de culturi de esuturi

Ageni de selecii/startegii

Identificarea celulelor regenerabile

Construci geniciSelecia sau screeningul

Transfer de geneRegenerareCaracterizareNesatisfctorExplante disponibileMedii i hormoni

Mod de regenerare

Frecvena regenerrii

Satisfctor NesatisfctorAccesibilitatea regeneranilor

Parametrii AgrobacteriumParametrii microproiectilelor

Expresie tranzient

Distrugere celular

Satisfctor

Figura 1. Caracteristici generale ale sistemelor de transformare la speciile de plante recalcitrante.

Tranformarea protoplatilorDintre sistemele de transformare, transformarea utiliznd protoplati este una dintre metodele care necesit mare finee. Protoplatii sunt izolai fiecare printr-un proces mecanic sau enzimatic prin ndeprtarea peretelui celular. Aceste rezultate de producere a unei suspensii cu milioane de celule individuale ofer avantajul probabil de intire a unei singure celule. Protoplatii sunt frecvent obinui de la o suspensie de linii celulare stabilite, de la calus obinut din embrioni imaturi, inflorescene imature, mezocotil, frunze imature bazale i antere (Maheshwari N., 1995). Interesant este faptul c multe suspensii celulare pot fi criopreservate i sileniate meninnd capacitatea de a forma calus i regenera plante (DiMaio,J.J., Shillito R.D.,1989).Protoplatii pot fi de asemenea transformai cu Agrobacterium, acest proces fiind facilitat de tratamentul cu polietilenglicol, electroporare sau lipozomi. Aceste sisteme de utilizare a protoplatilor pentru transformare sunt eficiente n cazul monocotiledonatelor (Shillito R., Carswell G., Kramer C.M., 1994).

Transformarea biolisticBiolistica este o metod ce utilizeaz microproiectile de tungsten sau de aur care sunt acoperite cu ADN i propulseaz n celulele int prin acceleraie. Aceast acceleraie poate fi produs de o puc cu putere, cu gaze sau cu dioxid de carbon sau heliu, sau prin descrcare electric (Finer J.J., Finer K.R., Ponnapa T., in press). Prin aceast metod se pot introduce secvene de ADN n orice esut, dar succesul depinde de capacitatea esutului int de a prolifera i da natere la o plant fertil.Alternane minore n protocolul standard biolistic produc risipe destul de ridicate. Acest proces include: Precultura adecvat a explantelor materiale; Utilizarea unor microproiectile de dimensiuni mici; Supunerea esutului la un pretratament osmotic prin uscare parial ntr-o capot cu flux laminar sau cultivarea ntr-un mediu ce conine un agent osmotic.Un exemplu elocvent n acest sens l reprezint transformarea porumbului care a fost deosebit de ridicat n aceste condiii (Radolph-Anderson, B., 1995).Analiza molecular a plantelor obinute prin transformare biolistic, n general, relev un patern destul de complex al genelor integrate. La aceasta se adaug faptul c introducerea unor fragmente mari de ADN se realizeaz datorit rupturilor care exist n ADN-ul introdus. Pe de alt parte, destinul ADN-ului introdus nu este foarte clar, ligarea fragmentelor de ADN transgenic naintea integrrii este propus a justifica dac ADN transgenic se introduce n acelai situs n genomul plantei (Pawlowski W.P., Somers D.A., 1998). Acesta poate rezulta prin reducerea expresiei transgenei prin co-supresie.

Transformarea mediat de AgrobacteriumCapacitatea natural a microorganismelor de a transforma plante este la ora actual cea mai utilizat metod cunoscut i sub numele de metod de transformare mediat de Agrobacterium. Bacteriile de sol din genul A.tumefaciens i A.rhizogenes sunt ageni cauzali ai unor boli la plante si anume producerea de gale n form de coroan, respectiv rdcini firoase (Tepfer D., 1990).n timpul procesului de transformare, un segment specific al vectorului, ADN-T, care poate conine markeri de selecie i/sau gene de interes, este transferat de la bacterie n celula gazd a plantei i inserat n genomul nuclear. Aceste funcii sunt mediate de un set de gene de virulen cu o expresie optim la un pH acid i n prezena inductorilor fenolici, cum ar fi acetosiringona, care se produc prin rnirea celulelor plantei (Hamilton C.M., 1996) (fig.2). Sistemul Agrobacterium este foarte utilizat deoarece este uor de realizat iar costurile de realizare sunt foarte sczute. Mai mult, plantele transgenice obinute prin aceast metod conin frecvent inserii de copii unice. Aceste avantaje au condus la adaptarea acestui sistem la multe specii de plante dicotiledonate dar i monocotiledonate. Acum, este posibil de a tranfera fragmente mari de ADN (150kb) n genomul nuclear al plantelor.

Figura 2. Diagrama schematic a procesului de infecie cu Agrobacterium. Cile critice care au loc n bacterie (semnale chimice, genele vir de inducie, Procesarea ADN-T), i n plant (ataarea bacteriei, transferul ADN-T, intirea nucleului, integrarea ADN-T), precum i genele i/sau proteinele cunoscute a media aceste evenimente.

Agrobacterium rhizogenes este utilizat cu succes pentru transferul de gene la multe specii de dicotiledonate, la locul infeciei formndu-se multe rdcini adventive, fenomen cunoscut sub numele de hairy roots. Infecia este urmat de transferul unui fragment din ADN, ADN-T, coninut ntr-o plasmid Ri-ADN, direct n genomul nuclear al plantei. Plasmida Ri const din ADN-T, secvene de grani i suprafaa de virulen. ADN-T conine genele rol (loci rol) A,B,C,D, care confer capacitatea de difereniere de rdcini n celulele transformate. Exist i gene care activeaz sinteza diferitelor clase de opine, cum ar fi cele implicate n procesul de catabolism. Opinele sunt substane naturale unice, pseudoaminoacizi cum ar fi octopine, nopaline, agrocinopine, care servesc ca nutrieni, ca surs de carbon i azot, i ca substane specifice de cretere a patogenitii bacteriei. Suprafaa de virulen conine diferite gene vir care sunt sileniate, deoarece ele nu intr n genomul plantei dar sunt necesare pentru transferul ADN-T. Similar cu transformarea mediat de A.rhizogenes, A.tumefaciens este de asemenea capabil s infecteze plantele. ADN-T de transfer este inserat ntr-o plasmid Ti care induce schimbri metabolice i genetice n celulele plantei rezultnd gale sub form de coroan. Aa cum s-a menionat la A.rhizogenes, plasmida Ti de la A.tumefaciens este i ea purttoare de gene care codific pentru enzime responsabile de sinteza i catabolismul unor aminoacizi cunoscui sub numele de opine. Aceste tipuri de opine, depind de tulpina bacterian utilizat i de asemenea reprezint un caracter de distincie ntre cele doua tulpini de Agrobacterium.Importana i avantajul utilizrii sistemului Agrobacterium este c prin tehnologia ADN-recombinant i ingineria genetic se pot transfera o multitudine de gene ntr-o celul gazd.

Selecia transformanilorSelecia este o parte importan a proceselor de transformare. n general, genele de interes sunt co-integrate cu markeri selectabili pentru identificarea cu uurin a celulelor recipiente transformate. Markerii de selecie cei mai utilizai confer rezisten la ageni chimici, cum ar fi antibiotice i ierbicide (Wilmink A., Dons J.J. M., 1993). Manozo-6 fosfat izomeraza (MPI) este unul dintre cei mai receni markeri de selecie. Enzima este codificat de gena manA de la E.coli, care convertete monoza-6P n frucozo-6P. Astfel, transformanii ce conin manA pot crete pe manoz ca surs de carbon. Aceast selecie este un mod pozitiv al aciunii de cretere a esuturilor transformante cu o rat care s-i permit acest lucru. Markerul MPI este extrem de eficace pentru selecia transformanilor de sfecl (0,94%), porumb (50%) i gru (25%) (HansenG., Wright M.S., 1999).Markerii de selecie pot fi utilizai ntr-o prim generaie i eliminai mai trziu prin ncruciare convenional. O posibilitate este de a obine dou ADN-T separate; una cu gene de interes i alta cu markeri de selecie, n aceeai sau dou celule diferite de Agrobacterium. Cele dou ADN-T sunt inserate n situsuri nelincate n genomul plantei gazd, permind mai trziu segregarea genetic (Yoder J.I., Goldsbrough, A.P., 1994).Transformarea optim se caracterizeaz printr-o singur copie a transgenei care va segrega mendelian cu o expresie uniform de la o generaie la alta. Transformanii ideali pot fi identificai cu dificultate, depinznd de materialul vegetal care va fi transformat i de cantitatea i complexitatea transgenelor. O gen inserat este esenial randomizat n genom, se observ o variabilitate de la o plant transgenic la alta, fenomen cunoscut sub numele de variaie cu efect de poziie (Gelvin S.B., 1998; Matzke A.J., Matzke M.A., 1998;Vaucheret H., 1998).

PerspectiveTransformarea genetic a plantelor rmne totui o art, deoarece procesul difer de la o plant la alta iar condiiile de mediu sunt caracteristice fiecrei specii n parte. Eficacitatea procesului de transformare const n faptul c cel puin una dintre speciile de plante care nu au fost manipulate anterior n cultur, trebuie s se adapteze la protocolul stabilit i s dea natere la o plant nou, cu caracteristici noi. Exist de asemenea o practic necesar pentru metodele de transformare care vor scade n complexitatea paternului de integrare i expresie a transgenelor. n prezent, sunt comercializate multe plante transgenice ce prezint alteraii ale unei singure gene. Pe de alt parte, nelegerea evenimentelor referitoare la procesele de integrare i expresie a ADN-ului strin n genomul celulei gazd este aparent, multe ntrebri au rmas totui fr rspuns. Exist celule int sau esuturi care sunt mai mult receptibile la transformare? Exist un stadiu fiziologic care permite o transformare mai eficient? Pot fi ele manipulate astfel nct s se obin o eficien ridicat a transformrii? Toate esuturile alese ca int prezint modificri ale nivelului de expresie genic? Dac Agrobacterium este utilizat cu susses n transformare prin faptul c expresia transgenelor este mult mai frecvent, atunci poate fi acest lucru atribuit pe seama integrrii ADN-T n regiunea telomeric? ( Hoopen R.T., 1996).Tehnologiile de transformare prezint avantaje din punct de vedere al comercializrii multor plante. Introducerea multor transgenice pe pia este o cale multipl a procesului de nregistrare a noi varieti de plante. n cele mai multe ri comercializarea cu plante transgenice este mai nti cercetat i aprobat prin stabilirea unor reguli stricte de autoritile fiecrui guvern naional al rii respective, care trebuie s se asigure c produsele sunt inofensive att pentru mediu ct i pentru consumatori.

Anumite varieti de porumb, deja introduse n cultur n SUA i alte cteva state ale lumii, au fost modificate genetic pentru a deveni rezistente la unul dintre duntorii cu impact negativ puternic asupra recoltei Ostrinia nubilalis (sfredelitorul european al porumbului). Larvele de Ostrinia sfredelesc tulpina i tiuleii, cauznd frngerea acesteia i respectiv cderea tiuleilor pe sol. Pierderile de recolt ating 4% la nivel mondial i pn la 20% n regiunile puternic infestate. Sfredelitorul porumbului este controlat n mod obinuit prin aplicarea unor tratamente cu insecticide chimice sau biologice. Aceste insecticide sunt ns eficiente numai pe parcursul primelor trei zile ale ciclului de via al larvelor. Noile varieti de porumb conin gena Bt ce codific o protein letal pentru sfredelitor. In anul 1997 a fost aprobat importul n rile Uniunii Europene a unor forme procesate ale porumbului transgenic, utilizate n produsele alimentare. Noile varieti de porumb modificat genetic sunt de asemenea importate sub forma de semine, n scopul prelucrrii pentru producerea de siropuri de amidon i glucoz. Porumbul transgenic include o gen marker pentru rezistena la ampicilin n celulele bacteriene, ns aceasta este inactiv i nu este exprimat n porumb. Deoarece ampicilina este un antibiotic utilizat n tratamentul medical, cteva ri europene au exprimat reinere fa de folosirea produselor rezultate din porumbul transgenic i au impus obligativitatea precizrii prezenei genei marker pentru ampicilin pe etichetele produselor n care a fost utilizat porumb modificat genetic

Plantele transgenice cu rezisten la boli i duntori (aceasta fiind n fapt aplicaia cea mai important pentru agricultur n viitorul apropiat) sunt considerate ca fiind o component major a agriculturii moderne, adic a unei agriculturi a crei principal caracteristic este creterea productivitii n condiiile reducerii sau eliminrii folosirii de substane chimice, cum sunt pesticidele. Evident, orice societate uman i dorete o agricultur care nu duneaz mediului i ofer produse mai sntoase. Prin urmare, acesta ar fi un argument puternic pentru introducerea n cultur a plantelor modificate genetic. Nu este vorba ns numai de plante folosite ca hran pentru om sau animale, ci i de plante folosite n alte scopuri, de exemplu n industria textil, aa cum este cazul bumbacului. Pentru moment, o certitudine este creterea an de an a numrului de specii de plante cultivate la care s-au obinut forme transgenice, multe dintre acestea aflndu-se n faza testrii n cmp sau fiind deja introduse n cultura comercial.

Primele plante transgenice de bumbac, crora li s-a transferat gena ce codific sinteza toxinei Bt, au fost obinute n 1996. Deoarece bumbacul are o mare diversitate de duntori, nu se poate renuna la insecticide, n special din cauza Lepidopterelor care nu sunt susceptibile la endotoxina exprimat de plante, nici n cmp i nici n laborator, probabil datorit exprimrii continue a toxinei n plante, ceea ce a dus la o puternic presiune de selecie.Oamenii de tiin au observat i o bun conduit a rezistenei unor insecte, pentru c exprimarea toxinei n esuturile unor plante este inegal, iar ele vor ataca acele esuturi sau poriuni de esut n care concentraia toxinei este sczut. Mai mult, pentru c adesea concentraia toxinei scade n frunze i tulpin pe msur ce planta ajunge la maturitate, dozele sczute pot s omoare sau s slbeasc puternic larvele susceptibile (homozigote) i prin urmare adaptarea la toxina Bt se produce mult mai rapid atunci cnd concentraia rmne mereu nalt.De-a lungul timpului, au fost semnalate peste 500 de cazuri cnd insectele au dezvoltat rezisten la spectrul de insecticide convenionale sau la produsele insecticide care conin Bacillus thuringiensis. De altfel, cercetri recente realizate n Anglia au artat c larvele de Plutella xylostella manifest rezisten la toxina cry1Ac, remarcndu-se totodat o dezvoltarea mai rapid i o greutate mai mare a pupelor n prezena toxinei. Acesta poate fi un efect genetic, legat indirect de prezena unei gene alele ce le confer rezisten fa de toxina cry1Ac sau poate fi determinat de abilitatea lor sporit de a supravieui i de a digera aceast toxin. Deci, prezena toxinei poate avea efecte nutritive favorabile, dar nedorite. Cu toate acestea, nu se poate concluziona c toate insectele duntoare plantelor de cultur vor manifesta caracterul de rezisten la insecticide, incluznd i actualele plantele transgenice.Soia transgenic reprezint de departe principalul produs al biotehnologiilor mondiale. Prin suprafaa cultivat, de 70 miliarde ha, aceast plant a cunoscut n ultimii ani cea mai spectaculoas extensie n plan productiv i economic.

ansa cea mai mare de progres o are n prezent porumbul transgenic, singura cultur important recunoscut de cei care frneaz la nivel european asimilarea celui mai mare progres tiinific al zilelor noastre.

Suprafaa cultivat cu plante modificate genetic la nivel mondial nsumeaz 134 milioane de hectare.

Creterea de 84 de ori ntr-un interval de numai 14 ani reprezint cea mai rapid rat de evoluie a unui progres tiinific din ntreaga istorie a agriculturii moderne.Principalele plante transgenice aflate n culturi comerciale

Cele mai importante nsuiri agronomice care au fost inta modificrii genetice fac cultura plantelor mai uoar pentru fermieri:

tolerana la erbicide, care faciliteaz extinderea sistemului cu lucrri minime ale solului ce diminueaz eroziunea, faciliteaz refacerea humusului i reduce energia consumat pentru arturi (i, implicit, eliberarea CO2 n atmosfer); rezistena la insecte, care determin o reducere semnificativ a utilizrii insecticidelor; rezistena la virusuri, care are importante beneficii socioeconomice, mai ales pentru rile n curs de dezvoltare.

Soia principalul produs al biotehnologiilor

Soia transgenic rezistent la principiul activ erbicid glifosat este principalul produs al biotehnologiei moderne cultivat n scop comercial. n anul 2009, a ocupat 69,2 milioane de hectare, echivalentul a 53% din suprafaa global alocat PT. Urmeaz porumbul transgenic (tolerant la erbicide i/sau rezistent la atacurile unor insecte duntoare), cultivat pe 41,7 milioane de hectare (31% din suprafaa global alocat PT), bumbacul transgenic (tolerant la erbicide i/sau rezistent la atacurile unor insecte duntoare), cultivat pe 16,1 milioane de hectare (12% din suprafaa global alocat PT) i rapia transgenic (tolerant la erbicide), cultivat pe 6,4 milioane de hectare (5% din suprafaa alocat PT la nivel global). Tot n anul 2009, numrul fermierilor care cultivau aceste plante era de 14 milioane, dintre care, peste 90% erau din China i Africa de Sud i cultivau bumbac Bt.

n Statele Unite ale Americii este comercializat din anul 2002 porumbul modificat genetic cu dou gene cumulate: rezisten la glifosat i la atacul sfredelitorului european al tulpinilor. n anul 2005, tot n SUA, au fost introdui n culturi comerciale hibrizi de porumb care cumuleaz trei transgene: tolerana la erbicide pe baz de glifosat i rezistena la sfredelitorul european al tulpinilor, la viermele rdcinilor. n anul 2009, a crescut semnificativ suprafaa alocat porumbului i bumbacului care nsumeaz dou sau trei caractere modificate genetic (MG). n 11 ri (SUA, Argentina, Canada, Filipine, Africa de Sud, Australia, Mexico, Chile, Columbia, Honduras i Costa Rica) au fost cultivate plante cu 2 sau 3 caractere MG cumulate.

Uniunea European, ntr-o situaie delicat

n anul 2009, n ase dintre statele membre ale Uniunii Europene a fost cultivat pe o suprafa total de 94,750 hectare porumbul rezistent la atacul unor insecte lepidoptere duntoare. Singura plant transgenic a crei cultivare era autorizat n UE este MON 810. Cele 6 ri au fost: Spania, Republica Ceh, Romnia, Portugalia, Polonia i Slovacia. n martie 2010, a fost aprobat cultivarea cartofului modificat genetic Amflora.

n alte state (Frana, Germania), dup o perioad de cultivare, s-a decis politic interzicerea porumbului rezistent la atacurile unor insecte lepidoptere duntoare. Exist i state membre care refuz cu obstinaie s aplice legislaia european, adic s cultive porumbul MON 810: Austria, Grecia, Ungaria, Luxemburg. Acestea produc dovezi tiinifice care s le permit, ciclic, invocarea clauzei de salvgardare. n tot acest timp, n cele mai dezvoltate ri ale lumii suprafeele alocate acestor culturi se extind, iar numrul i veniturile fermierilor care adopt noile tehnologii cresc n mod constant.

n UE, Romnia are o situaie aparte. Pn n anul 2006, a cultivat soia transgenic tolerant la principiul activ erbicid glifosat. n anul 2007, devenind membr a UE, a fost obligat s renune la aceast cultur foarte profitabil. Putea cultiva ns porumbul transgenic rezistent la sfredelitorul european al tulpinilor, a crui introducere n culturi comerciale era aprobat n Uniunea European.Soia transgenica AvantajeImpactul receptat ca pozitiv din partea cultivatorilor de soia pentru cultura de soia transgenic a avut la baz urmtoarele avantaje:1.Produciile mai ridicate care se pot obine comparativ cu soia convenional;2.Calitatea superioar a produciei;3.Flexibilitatea tehnologiei;4.Compatibilitatea soiei transgenice cu preparate bacteriene romneti i strine pentru tratarea seminelor de soia;5.Selectivitatea perfect a soiurilor de soia la produsul Roundup Ready; 6.Eficacitatea tratamentelor cu Roundup Ready n combaterea buruienilor;7. Posibilitatea eliminrii prailelor mecanice n cadrul sistemului de cultur la 25 cm ntre rnduri;8. Pstrarea biodiversitii populaiilor de buruieni la sfritul perioadei de vegetaie;9. Limitarea dependenei de condiiile de mediu prin limitarea efectelor concurenei cu buruienile;10.Aprovizionarea cu azot biologic surs de economie pentru culturile postmergtoare;11.Economia de energie realizat la realizarea culturii prin flexibilitatea tehnologiei i la procesarea recoltei;12.Eficien economic superioar la cultura soiei;13.Eficien economic n cadrul asolamentului

Soia modificata genetic

Primele culturi comerciale de plante modificate genetic (MG) au fost introduse in Romania in anul 1998. Este vorba de 14 varietati soia modificata genetic.

Cifre oficiale arata ca:- in anul 2004 au fost cultivate 5 523 ha cu soia MG,- in anul 2005 au fost cultivate 87 600 ha cu soia MG- iar in 2006 au fost cultivate 137 275,5 ha.

Cand Romania a devenit stat membru al UE in anul 2007, soia MG a fost oficial interzisa pentru cultivare pe teritoriul Romaniei, conform reglementarilor europene (soia MG nu era autorizata pentru cultivare pe teritoriul UE, fiind considerata nefezabila din punct de vedere economic).

Porumbul modificat genetic

Totusi, in acelasi an, in luna aprilie, a fost aprobat tacit pentru cultivare in Romania un soi de porumb MG cu denumirea MON810 (ce apartine companiei Monsanto). Acesta era singurul OMG autorizat in UE, pe care Romania l-a autorizat automat. In Romania nu au fost efectuate studii de evaluare a porumbului modificat genetic pentru a se vedea care sunt efectele asupra mediului.In privinta porumbului modificat genetic MON810, cifrele oficiale arata ca:- in 2007 au fost raportate 332,5 ha cultivate cu porumbul MON810,- iar anul trecut in 2008, suprafetele au crescut semnificativ pana la 6 130,44 ha,- in timp ce anul acesta, 2009, s-a raportat insamantarea unor terenuri de suprafata totala de 3093,5177ha.

Cultivarea plantelor modificate genetic in UE

Doar doua culturi transgenice sunt autorizate sa fie cultivate in UE, porumbul Bt de la Monsanto, MON810 si cartoful Amflora de la BASF. Porumbul a fost modificat genetic pentru a produce propria toxina impotriva daunatorului comun Ostrinia Nubilialis (vierme sfredelitor al tulpinii porumbului).

Cartoful Amflora a fost modificat genetic pentru un continut sporit de amidon dar totodata contine si o gena marker de rezistenta la antibiotice precum kanamicina si neomicina.

In 2008, suprafata totala cultivata cu plante transgenice din EU a scazut. Acest fapt se datoreaza interzicerii porumbului Bt MON810 Monsanto in Franta (2008) si Germania (2009) din cauza unor motive de sanatate si mediu. Ca si rezultat suprafata totala aflata sub cultivare de plante transgenice in EU a scazut cu 2%, la 107719 hectare. In cele 27 de tari ale Uniunii Europene, cultivarea organismelor modificate genetic reprezinta 0,21% din suprafata agricola.

Doar 6 din 27 membrii UE cultiva MON810 (cu 2 mai putin decat in anul 2007). Cele 6 tari care cultiva porumbul modificat genetic MON810 sunt:Spania,Republica Ceha,Slovacia,Polonia, Romania si Portugalia

6 tari europene au interzis MON810 pe termeni ecologici si de sanatate, cea mai recenta fiind Germania si Franta, unele din principalele tari agricole din UE. Cele 6 tari care au interzis cultivarea porumbului modificat genetic MON810 sunt:Austria,Franta,Germania,Grecia,Ungaria si Polonia.Dei ultimele decenii au fost marcate de numeroasele succese n ameliorarea diverselor specii de plante de interes economic, exist nc pierderi grele la plantele cultivate, datorit stresului biotic i abiotic. n ciuda popularitii cartofilor ca aliment, acetia sunt foarte greu de cultivat. n fiecare an, fermierii nregistreaz pierderi importante datorit gndacului de Colorado (Leptinotarsa decemlineata), n condiiile n care repetarea operaiunilor de stropire cu insecticide este absolut necesar pentru controlul