METODE PENTRU EXAMENUL PREPARATELOR N MICROSCOPIA ELECTRONIC. TIPURI DE INFORMAII CARE SE POT OBINE PRIN MICROSCOPIE ELECTRONIC - ultrastructura diferitelor tipuri de celule i a componentelor acestora n stare normal i patologic PRELEVAREA PROBELOR Pentru a preveni schimbrile de orice natur care pot apare la nivel tisular sau celular chiar din momentul prelevrii, recoltarea trebuie s se fac rapid. Deoarece piesele trebuie s fie de mici dimensiuni 0,5x0,5x0,5 mm, tierea acestora se realizeaz sub o lup binocular. Fragmentele sunt preluate cu o pens i introduse n fixator rcit la 4C.

Alternativ, fragmentele de material biologic obinute prin puncii sau biopsii, sau fragmentele mici din esuturile i organele recoltate imediat dup sacrificarea animalului de experien sunt puse pe faa fr emulsie de azotat de argint a unei hrtii fotografice. Peste aceste fragmente se pun 2-3 picturi din lichidul fixator (4C) pentru a opri pe ct posibil aciunea distructiv a enzimelor celulare.

Cu ajutorul a dou lame de ras noi, bine degresate, prin micri de translaie se confecioneaz cubulee cu latura de maxim 1mm.

Cu o scobitoare se ridic fragmentele i se introduc ntr-un flacon cu fixator rcit la +4C.

FIXAREA 1. Metode fizice - au la baz folosirea temperaturilor foarte sczute, deshidratarea inert i metoda de substituie prin ngheare. 2. Metode chimice - O soluie fixatoare este format din: a) soluia tampon; b) agentul fixator Soluia tampon se alege n funcie de compatibilitatea cu agenii fixatori - tampon cacodilat (compatibil cu toi agenii fixatori) - tampon fosfat (compatibil cu toi agenii fixatori, incompatibil cu ionii de calciu i uranil) - tampon veronal (este incompatibil cu aldehide fixatoare) b) agenii fixatori: - anorganici (oxizi - OsO4, sruri-permanganat de potasiu i bicromatul de potasiu); - organici (aldehidele-formaldehidele, glutaraldehida, acroleina, acizi-acidul tanic i unele catechine). n practica curent se folosete o dubl fixare: - prefixare cu glutaraldehida tamponat; - postfixare cu tetraoxid de osmiu tamponat;

Tehnica de lucru. Fragmentele prelevate i fasonate sunt introduse cu ajutorul unei scobitori ntr-un flacona n care se gsete glutaraldehid tamponat (+4C) n care vor sta 1 or la frigider; flaconul se acoper cu un dop (glutaraldehida este toxic) pe care se noteaz numrul de ordine.

Fixatorul se vars ntr-o sticl cu dop rodat iar fragmentele rmase pe pereii flaconului se spal de trei ori a cte 1 or cu tampon fosfat 0,15 M la temperatura de 4C. Dup a treia splare fragmentele sunt post-fixate n acelai flacon cu fixatorul Milloning timp de 1 or i la +4C. Fixatorul Milloning conine: - tetraoxidul de osmiu ................................... 1g - tampon fosfat, 0,15 M .................................100ml

SPLAREA PIESELOR Dup fixare, urmeaz obligatoriu splarea pieselor. Piesele se spal timp de 5-20 min sau chiar peste noapte cu aceeai soluie tampon care a intrat n compoziia fixatorului. DESHIDRATAREA PREPARATELOR Prin deshidratarea preparatelor se urmrete eliminarea apei din esuturile fixate pe cale chimic sau fizic fr a produce modificri in structura molecular nativ a celulelor din esuturi. Alegerea solventului pentru deshidratare este n funcie de materialul de includere, acesta trebuie s fie miscibil cu agentul de deshidratare. n cazul folosirii vestopalului ca material de includere se folosete acetona iar n cazul eponului, alcoolul etilic i propilenoxidul. INCLUDEREA Cele mai utilizate medii de includere fac parte din grupa rinilor poliesterice (vestopal) a rinilor epoxidice (epon 812, epon 562, araldita) i mediile de includere hidrofile (durcopanul, hidroxipropilmetacrilatul) care prezint avantajul c evit deshidratarea i conserv lichidele i enzimele din celul. Includerea se face n capsule de gelatin sau polietilen (BEEM). Tehnica includerii n Epon 812 n compoziia mediului de includere intr urmtoarele substane: Amestecul A + Amestecul B + Accelerator DMP - 2 Epon 812 +DDSA Epon 812+MNA 5 ml 5 ml 0,15 ml unde DDSA = anhidrida dodecilsuccinic; MNA = anhidrida metilanadic Piesele din materialul biologic se introduc n capsule de gelatin, n eponul de lucru, n ni, la temperatura laboratorului.

Capsule de gelatin pregtite n suport de polistiren Epon de lucru

Adugarea eponului de lucru, pentru includere, n capsulele de gelatin

Se adaug iniial numai 1 picatur de epon

Piesele sunt preluate din mediul de impregnare, tot cu o scobitoare, apoi sunt trecute n capsulele de gelatin care conin deja 1 pictur epon.

n fiecare capsul de gelatin se introduce un numr de identificare scris numai cu creion negru

Se completeaz cu epon pn la umplerea capsulelor

SECIONAREA Preparatele biologice fixate i incluse n diferite medii de includere sunt supuse unor operaii de secionare prin tehnici speciale, cu ajutorul unor aparate speciale numite ultramicrotoame, pentru a realiza seciuni ultrafine, a cror grosime nu depete 1000 i care vor fi uor traversate de fasciculul de electroni. Fasonarea blocurilor nainte de a le supune procesului de secionare, blocurile cu preparate biologice trebuie fasonate. Prin acesta operaie o anumit zon din preparat capt aspect de piramid. Dac la includere s-au folosit capsule de polietilen, atunci blocul apare aproape gata fasonat n aceast form. Operaia de fasonare a blocurilor se face manual dup ndeprtarea capsulei de gelatin, sub o lup binocular, cu ajutorul unei lame de ras noi, dup fixarea blocului ntr-un portbloc.

Se confecioneaz un trunchi de piramid, al crui vrf trunchiat ce conine piesa, trebuie s aib forma unui ptrat cu latura de 0,1-0,2 mm.

Fasonarea blocului se poate face cu ajutorul ultramicrotomului i cu cuite de sticl.

Secionarea propriu-zis i colectarea seciunilor Secionarea se face cu ajutorul unui ultramicrotom

Ultramicrotomul folosete cuite de sticl sau de diamant

Vizual, grosimea seciunilor se poate aprecia prin reflexia n bi pe suprafaa apei, culoarea seciunilor n lumin reflectat fiind n funcie de grosimea acestora (Peachey 1958, Zelander i Ekholm 1960). Culoare Grosime () cenuie sub 600 argintie 600 - 900 aurie 900 - 1500 purpurie 1500 - 1900

albastr 1900 - 2400 verde 2400 - 2800 galben 2800 - 3200 Seciunile semifine se fac cu ajutorul ultramicrotomului prin folosirea avansului manual (cu o grosime de 1500-3200 ) cu scopul de a verifica dac blocul respectiv conine elementele pe care ni le-am propus s le examinm. Dup colorare se analizeaz la microscopul fotonic. Pentru colorarea seciunilor semifine exist mai multe metode: colorarea cu albastru de toluidin. Colorarea se face aplicnd pe lam 2-3 picturi din soluia de albastru de toluidin; lamele se pun n termostat la 60 grade C timp de 10-30 min. apoi se spal n ap curgtoare apoi n aceton 100%, se trec rapid prin xilol, se sugativeaz, se monteaz i se examineaz la microscopul fotonic. Seciunile ultrafine rezultate n urma secionrii urmeaz s fie depuse pe un portobiect care n microscopia electronic este o gril metalic. APLICAREA SECIUNILOR ULTRAFINE PE GRILE n prezent exist o gam variat de suporturi pentru preparate (grile i discuri), confecionate pe cale electrolitic din cupru, nichel, oel inox, argint, aur, platin, molibden sau tungsten. Grilele electrolitice sunt de mai multe feluri: a) standard; b) de identificare; c) duble. Pentru ca grilele s devin un bun suport pentru preparat, se acoper cu pelicule organice sau anorganice fine, transparente la fasciculul de electroni a cror grosime nu trebuie s depeasc 200 . Grilele cu preparatul n sus se plaseaz ntr-o cutie Petri pe fundul creia se afl hrtie de filtru i pe care se noteaz numrul preparatului din registrul de eviden. Contrastarea preparatelor biologice Pentru mrirea contrastului biomoleculelor, al virusurilor, al diferitelor microorganisme i al seciunilor de esuturi, se recurge n practic la o serie de metode de contrastare, cele mai utilizate fiind: colorarea pozitiv, colorarea negativ i umbrirea sau metalizarea. Colorarea pozitiv are la baz interaciunea chimic dintre structurile biologice i un colorant format din sruri ale unor metale grele. Contrastarea cu acetat de uranil. Un numr de godeuri fcute pe o plac de plexiglas se umplu cu o soluie de acetat de uranil 13%, utiliznd o pipet cu par de cauciuc. Faa cu seciuni ale grilelor se aplic pe suprafaa soluiei din godeuri lsndu-le n contact 10 min, la ntuneric. Cu ajutorul unei pense foarte fine se iau grilele de pe suprafaa picturilor de acetat de uranil pe care plutesc i se spal trecndu-le prin 3 bi cu alcool etilic 50%. Contrastarea cu citrat de plumb (soluia Reynolds) se execut n al doilea timp. Pe o plac de parafin curat se pune un numr de picturi din soluia Reynolds (nitrat de plumb + citrat de sodiu + ap distilat), corespunztor numrului de probe de colorat. Peste aceste picturi se aplic grilele cu preparatul n jos i se in 3 min dup care se spal cu ap distilat.

Procedeu complet: 1. Recoltare 2. Fixarea n G. A.tamponat 3. Splarea n tampon fosfat 4. Postfixare n OSO3 tamponat 5. Splare n tampon fosfat 6. Deshidratare cu:

alcool 30% ........................................................ 10 min. alcool 50% ........................................................ 10 min. alcool 70% ........................................................ 10 min. alcool 90% ........................................................ 10 min. alcool 100% (2 bi) .............................. 20min. fiecare aceton 100% (2 bi) ............................... 20min. fiecare (acesta ultim etap nu este obligatorie, dar se recomand pentru o mai bun impregnare)

7. Impregnare aceton 100% + epon de lucru 1/1 ....................... 1 or epon de lucru .........................................................1 or

8. Includere: piesele din materialul biologic se introduc n capsule gelatin n eponul de lucru, n ni, la temperatura laboratorului.

9. Polimerizarea eponului la termostat, la 60C. esuturile se pun n capsule de gelatin cu amestec de Epon proaspt preparat. Se las pn cnd piesele cad la fundul capsulelor i apoi polimerizarea are loc la 60C peste noapte.