MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

1. OBIECTUL MICROBIOLOGIEI. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI. CLASIFICAREA GENERAL A MICROORGANISMELOR1.1. OBIECTUL MICROBIOLOGIEI Microbiologia este o tiin fundamental care studiaz morfologia, fiziologia i sistematica microorganismelor, originea i evoluia lor, fenomenele de ereditate i variabilitate microbian. Etimologia cuvntului provine din limba greac: micros = mic; bios = via; logos = tiin. Microorganismele sunt sisteme cu organizare complex, monocelulare sau pluricelulare, cu metabolism propriu i continuitate genetic, cu o infinit diversitate a caracterelor morfologice i fiziologice. n sensul acestei definiii din imensul grup al microorganismelor fac parte fungii (drojdii levuri i mucegaiuri fungi filamentoi), bacterii, alge microscopice, protozoare etc. n funcie de natura microorganismelor i caracterul lor aplicativ, s-au dezvoltat n timp, urmtoarele tiine microbiologice independente: Microbiologia general studiaz legile de dezvoltare a tuturor grupelor de microorganisme i a rolului lor n circuitul substanelor n natur. Fiind o tiin de sintez, n funcie de natura microorganismelor studiate s-au desprins urmtoarele discipline: Virusologia (inframicrobiologia) studiaz virusuri entiti acelulare cu dimensiuni submicroscopice, ageni ai bolilor virale la om, animale, plante, insecte, microorganisme (bacterii, fungi). Bacteriologia studiaz bacteriile, celule monocelulare de tip procariot, care pot produce mbolnviri ale omului, animalelor, plantelor. Micologia studiaz fungi cu celule monocelulare sau pluricelulare de tip eucariot. Dintre tiinele microbiologice cu caracter aplicativ fac parte: - microbiologia chimic este o ramur a microbiologiei generale care s-a dezvoltat n ultimii 50 de ani, are ca obiect de studiu chimia i biochimia microorganismelor (compoziia chimic, structura, topologia, funcia moleculelor libere i asociate, metabolismul substanelor n celula microbian; - microbiologia solului, a apei, microbiologia geologic, fitopatologia, microbiologia sanitar, agricol, ecologic, cosmic, genetica microbian, biologia molecular; - microbiologia produselor alimentare are drept obiect de studiu cunoaterea naturii i activitii metabolice a microorganismelor care pot contamina ntregul lan alimentar, de la materiile prime la produsele finite, n scopul prevenirii alterrii lor i pierderea valorii alimentare sau a mbolnvirii prin consum de alimente, contaminate cu microorganisme patogene-toxicogene; - microbiologia industrial (tehnic) reprezint tiina de investigare i control al fermentaiilor, respectiv de folosire a microorganismelor n calitate de reactivi, n scopul obinerii industriale a unor produse cu valoare economic. Prin dezvoltarea microbiologiei industriale, cu ajutorul microorganismelor se obin avantajos aproximativ 200 de produse, printre care: alcoolul etilic i butanolul, acetona, acidul citric, acidul lactic, aminoacizi, enzime, proteine, vitamine, insecticide biologice, produse de biosintez ce se obin pe plan mondial n cantiti mari (milioane tone per an) sau vaccinuri, vitamine i enzime purificate, hormoni de cretere, interferonul, antibiotice, n cantiti 1

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE mici. Primul patent nregistrat pentru un produs de biosintez microbian dateaz din 1882 pentru enzime proteolitice folosite la tbcirea pieilor; biotehnologia reprezint un domeniu multidisciplinar al tiinei, tehnicii, tehnologiei i al produciei industriale ce se bazeaz pe potenialul microorganismelor rezultate prin tehnici de inginerie genetic i a enzimelor microbiene, n scopul obinerii de bunuri industriale, energetice, agricole, farmaceutice, alimentare i protecia mediului. 1.2. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI Dac apariia vieii pe pmnt se aproximeaz c a avut loc cu 3,8-4 miliarde de ani n urm, cele mai vechi celule aparinnd bacteriilor metanogene i bacterii ale genului Clostridium descoperite n lave vulcanice pietrificate, au existat de cel puin 2 miliarde de ani. Celulele eucariote s-au transformat cu 1500 milioane de ani n urm i diversificarea acestora acum 400 milioane de ani, a condus la apariia ntr-o lung perioad de timp a strmoilor plantelor de astzi. n contrast cu dimensiunile att de mici ale microorganismelor, rolul lor n natur este imens. Implicate direct n uriaele transformri ale materiei organice nevii, prin procese de putrefacie-putrezire, fermentaii etc., microorganismele asigur n natur un circuit al principalelor elemente universale ce intr n structura organismelor vii i au rol vital n meninerea ecosistemelor, deoarece fr activitatea lor pmntul s-ar transforma ntr-un uria cimitir. Dei procesele microbiene sunt cunoscute de la nceputul omenirii, explicaia tiinific a cauzelor care le determin, a fost posibil numai odat cu descoperirea microscopului. Cel care a utilizat pentru prima dat microscopul pentru studiul microorganismelor a fost Anthonie van Leeuwenhoek. Microbiologia apare ca tiin n a doua jumtate a secolului XVII i debuteaz cu o perioad lung de observaii morfologice cnd se acumuleaz un material vast privind caracterele i rspndirea n natur a microorganismelor. Cea de a doua perioad n dezvoltarea microbiologiei este perioada fiziologic, inaugurat de lucrrile marelui savant, chimist i medic, Louis Pasteur care a stabilit principiile de baz ale microbiologiei prin descoperiri de importan fundamental. Louis Pasteur studiaz condiiile de distrugere a microorganismelor stabilind procedee de sterilizare. Studiaz bolile microbiene ale vinului i berii produse de microorganisme ageni ai fermentaiei lactice i butirice i care pot s triasc i n absena aerului. Pasteur stabilete modalitatea de tratare a vinului prin nclzire la 60C care i asigur conservabilitatea, operaie denumit n prezent pasteurizare i este pe drept cuvnt, considerat printele microbiologiei industriale. Visul lui Pasteur era s descopere microorganismele care provocau mbolnviri ale omului i animalelor. A studiat boli ca holera ginilor, infecia crbunoas, rabia etc. i a realizat vaccinurile antiholeric i antirabic, dovedind c unul i acelai microb este cel care poate produce moartea, n schimb dup un tratament adecvat poate da doar forme uoare de boal i concomitent o imunitate organismului vaccinat. Pn n ultima clip a vieii a muncit neobosit pentru binele omenirii. Impresionant este crezul vieii lui, exprimat simplu n cuvintele: Voina, munca i succesul sunt cuprinsul vieii omeneti. Voina deschide porile, munca te trece prin ele, iar la sfritul drumului vine succesul ca o ncoronare a tuturor eforturilor.

-

2

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Robert Koch considerat printele colii germane de microbiologie stabilete c microbii sunt cauzele bolilor infecioase i descoper vibrionul holerei, agentul tuberculozei etc., studii ce-i aduc n 1905 premiul Nobel pentru fiziologie i medicin. Koch introduce n practica de laborator mediile de cultur solidificate ceea ce a permis izolarea n culturi pure a microorganismelor din natur. Folosirea culturilor pure s-a extins odat cu realizarea de aparatur destinat sterilizrii mediilor necesare pentru cultivare. Un rol important n introducerea culturilor pure n industrie aparine savantului german E.H. Hansen care a utilizat microorganismele drept inocul ai fermentaiilor, fapt ce a condus la microbiologia industrial modern. Descoperirea primului antibiotic, penicilina de ctre A. Fleming i stabilirea tehnologiei de producere i purificare a acestui antibiotic de ctre Florey i Chain reprezint una dintre cele mai importante realizri ale nceputului de secol XX. Omenirea devine astfel posesoarea unei noi arme mpotriva microorganismelor patogene i sunt intens stimulate cercetrile de descoperire i aplicare n terapeutic a noi antibiotice cu spectru specific de aciune. Fondatorul microbiologiei romneti este Victor Babe, care a condus prima catedr de nvmnt medical de anatomie patologic i bacteriologic. mpreun cu francezul V. Cornil este autorul primului tratat de bacteriologie aprut n lume: Les bactries, n anul 1885. Victor Babe a studiat boli ca turbarea, morva, lepra, holera, tuberculoza, parazitoze i a introdus pentru prima dat n ara noastr tratamentul prin serotapie imunizare cu serul provenit de la animale n prealabil vaccinate. Este considerat unul dintre cei mai mari savani, a rmas n microbiologie prin numeroasele sale descoperiri. Ioan Cantacuzino a creat o coal de microbiologie avnd ca centru institutul care i poart numele, organiznd i dezvoltnd activitatea de producie a serurilor i vaccinurilor folosite n combaterea bolilor infecioase. n domeniul imunologiei, virusologiei i microbiologiei generale, se remarc savanii: C. Lavaditi, D. Combiescu, M. Ciuc, t. Nicolau etc. care i-au consacrat activitatea tiinific, combaterii i eradicrii unor boli, pentru formarea i dezvoltarea colii contemporane de microbiologie. 1.3. CLASIFICAREA GENERAL A MICROORGANISMELOR Variabilitatea extraordinar a microorganismelor i capacitatea lor de adaptare la cele mai diferite condiii ale mediului ambiant, fac ca lumea microbian la nivel planetar s fie deosebit de numeroas i greu de clasificat. Clasificarea biologic a lumii vii propus de Whittaker (1969), acceptat de numeroi taxonomiti cuprinde un sistem de cinci regnuri n funcie de modul de organizare celular i modaliti de nutriie, avnd urmtoarea structur: - regnul Monera include organisme monocelulare de tip procariot cu nutriie de tip absorbtiv, cu metabolism fotosintetic sau chimiosintetic i reproducere prin diviziune asexuat; - regnul Protista include organisme monocelulare de tip eucariot (inclusiv drojdii). Modul de nutriie este diferit de la un grup la altul, prin absorbie sau ingestie i reproducere sexuat/asexuat; - regnul Fungi cuprinde organisme multinucleate de tip eucariot (mucegaiuri) cu nuclei dispersai n citosolul hifelor adesea septate, lipsite de plastide i

3

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE pigmeni fotosintetici, cu nutriie de tip absorbtiv i reproducere pe cale sexuat i asexuat; - regnul Plantae, cu organisme multicelulare de tip eucariot, cu perete celulozic, vacuole n citoplasm i pigmeni fotosintetici n plasmide. Modul principal de nutriie este cel fotosintetic i reproducerea predominant sexuat; - regnul Animalia, cu organisme multinucleate de tip eucariot fr perete celular, cu nutriie predominant prin ingestie i reproducere sexuat. Celula de tip procariot ce aparine primelor forme de via pe Pmnt, prezint un nucleoid nedifereniat, lipsit de membran nuclear. Molecula de ADN conine ntreaga informaie genetic; celula procariot nu conine n citozol organite libere (cu membran) i ribozomii au dimensiuni mici. Sunt puin difereniate din punct de vedere morfologic. Celula de tip eucariot, mai evoluat, prezint un nucleu bine difereniat n care este inclus partea predominant a genomului alctuit dintr-un set de cromozomi, care n timpul procesului de nmulire se divizeaz i se repartizeaz ntre celulele rezultate. n cromozomi, ADN-ul este cuplat cu proteine de tipul histonelor. n celula eucariot exist organe simple prevzute cu membran, iar ribozomii au dimensiuni mai mari dect la procariote. Pentru sistematizarea microorganismelor, se studiaz ntotdeauna caracterele morfologice, fiziologice, biochimice etc. ale culturii pure, cultur ce rezult prin nmulire dintr-o singur celul (sau unitate formatoare de colonie), n mediu nutritiv steril i deci cuprinde celule aparinnd unei singure specii. n clasificri, pe baz de criterii morfologice i fiziologice riguroase, stabilite de la general la particular, principalele grupe de microorganisme componente ale regnurilor citate sunt clasate n diviziuni, clase i subclase, ordine, familii, triburi, genuri i specii. La baza tuturor clasificrilor este situat specia, produs al evoluiei materiei vii, ca rezultat al adaptrii la condiiile existente ale mediului ambiant. Specia corespunde populaiei de indivizi cu numeroase proprieti comune, denumite caractere cu specificitate de specie, care le disting de alte specii. Microorganismele aparinnd unei specii au aceeai origine, sunt adaptate la un anumit mediu de via, au metabolism asemntor i sunt apropiate ntre ele prin caractere genetice. Specia la microorganisme este denumit din dou cuvinte, primul fiind numele genului, care include mai multe specii. Cel de al doilea cuvnt scris ntotdeauna cu liter mic, de obicei definete un caracter specific. n cadrul speciei se difereniaz prin caractere distinctive limitate, subspecii, tulpini, varieti. Genul cuprinde una sau mai multe specii pe baza unor caractere comune, specifice de gen. Denumirea genului este n limba latin. Tribul reprezint un grup de genuri nrudite. Familia este un grup de triburi sau genuri nrudite. Ordinul reprezint un grup de familii nrudite. Clasa reprezint gruparea ordinelor nrudite.

4

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

2. CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME UTILIZATE N SCOPURI INDUSTRIALEn procesele microbiologice industriale microorganismele sunt utilizate pentru urmtoarele scopuri: - multiplicarea celulelor n scopul obinerii de culturi starter sau biomas; - supersinteza intra/extracelular a metaboliilor primari, metaboliilor secundari, poliglucide capsulare i a enzimelor microbiene cu importan practic deosebit; - procese de bioconversie (biotransformarea substraturilor specifice) cu aplicaii industriale diverse i depoluarea mediului ambiant. Utilizarea microorganismelor n bioprocesele industriale este avantajoas datorit proprietilor lor biologice particulare i anume: - viteza deosebit de mare a reaciilor metabolice specifice microorganismelor face ca procesele de biosintez s aib loc extrem de rapid comparativ cu procesele similare la plante sau animale; - se dezvolt rapid pe diverse medii producnd degradri, modificri i substituiri ale componentelor diferitelor substraturi pe care se dezvolt i realizeaz cu uurin transformri a cror realizare prin procedee chimice ar necesita un numr mare de operaii laborioase i o tehnicitate ridicat; - datorit capacitii de adaptare la medii cu compoziii chimice foarte diferite, microorganismele pot utiliza o gam extins de materii prime, uneori lipsite de valoare economic, ceea ce permite utilizarea unor substraturi ieftine pentru obinerea pe cale biologic a unei game largi de produse utile; - posibilitatea creterii randamentului de biosintez prin metode culturale sau manipulri genetice. n orice proces microbiologic cultura microbian utilizat are importan primordial n desfurarea procesului i randamentelor obinute, ea reprezentnd cheia succesului sau eecului proceselor. Microorganismele utilizate n procesele microbiologice industriale trebuie s posede urmtoarele caliti: - s prezinte tulpini stabile genetic; - s produc mai multe tipuri de celule (vegetative, spori sau alte uniti reproductive); - s nu fie contaminate cu alte microorganisme; - s creasc viguros i rapid dup inoculare n vasele de cultivare utilizate pentru prepararea inoculului nainte de fermentaia industrial; - s realizeze bioprocesul dorit ntr-o perioad scurt de timp (preferabil n 3 zile sau mai puin) i s aib capacitatea de a crete pe medii cu componente ieftine i uor de procurat; - cultura microbian s poat fi uor conservat n timp fr a-i schimba proprietile biochimice i genetice; - s prezinte stabilitate metabolic i s asigure desfurarea de procese metabolice reproductibile; - s se preteze la schimbri sub aciunea agenilor mutageni sau prin inginerie genetic, n vederea obinerii de tulpini programate cu randamente sporite de biosintez i stabilitate metabolic deosebit.

5

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Microorganisme cele mai utilizate n scopuri industriale aparin urmtoarelor grupuri: - fungi: o drojdii (levuri); o mucegaiuri (micromicete, fungi filamentoi); - bacterii; - alge microscopice. 2.1. DROJDII (LEVURI) Drojdiile reprezint un grup complex i eterogen de microorganisme monocelulare de tip eucariot (celule cu nucleu difereniat), care se nmulesc prin nmugurire, ca form general de reproducere i n mod particular prin ascospori formai pe cale asexuat i sexuat. 2.1.1. Istoric Denumirea de drojdie semnific, n general, sedimentul care se formeaz dup ce a avut loc fermentaia alcoolic a musturilor dulci. Denumirea de levuri provine de la verbul lever (limba francez a ridica) ce sugereaz creterea n volum a aluatului la fabricarea pinii. Cunoscute din timpuri strvechi pentru activitatea lor fermentativ, drojdiile sunt studiate de Louis Pasteur (1863), studiu continuat de microbiologii: Meyen, Rees i Hansen care realizeaz o clasificare a drojdiilor n 1896, completat de Guillermond n 1928. Un studiu taxonomic de referin aparine lui Lodder (1952, 1970) i mai recent, lui Kreger van Rij (1984). 2.1.2. Importan i rol Drojdiile joac un rol foarte important n industria alimentar, biotehnologie, n natur. Avnd drept caracteristic principal capacitatea de a produce fermentarea glucidelor simple cu formare de alcool etilic i dioxid de carbon, drojdiile fermentative sunt utilizate n biotehnologii alimentare la fabricarea alcoolului, a vinului, berii i pinii. Drojdiile au o compoziie chimic valoroas i dup cultivare n condiii de aerare i prelucrare sunt utilizate ca surs de proteine n alimentaia uman, cu denumirea de SCP (single cell protein proteine din monocelulare) sau n alimentaia animalelor, deoarece pe lng 45-55% protein brut/100 g s.u., aduc n raie aminoacizi (lizin etc.) i vitamine ale grupului B (tiamin i riboflavin). n microbiologia industrial, din biomas de drojdie se obin: - extracte (plasmolizate, autolizate), folosite ca aditivi alimentari sau pentru mbogirea n substane azotate a mediilor de cultur destinate fermentaiilor; - vitamine hidrosolubile: B1, B2, PP, ergosterol; - enzime: -fructofuranozidaza i -galactozidaza; - prin hibridizri i inginerie genetic, din mutani ai speciei Saccharomyces cerevisiae s-a obinut interferonul substan cu efect antiviral i citostatic. 2.1.3.Rspndire n natur Drojdiile au o larg rspndire n mediul ambiant, fiind ntlnite n toate habitaturile naturale. n sol, celulele de drojdie se ntlnesc n straturile superficiale pn la adncimi de aproximativ 30 cm, n concentraii de 102- 2105/g. Din sol, prin aciunea unor factori (fizici, mecanici, biologici), microorganismele se pot afla temporar n aer i s se rspndeasc la distane mari; din sol i aer drojdiile pot

6

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE ajunge n ape i unele specii pot fi ntlnite chiar la adncimi de 4000 m. n regnul vegetal drojdiile se ntlnesc pe suprafaa frunzelor, fructelor, florilor, n rdcini. Rspndirea drojdiilor este favorizat de insecte care odat cu nectarul/sucul preiau i celulele de drojdie. O parte din drojdii supravieuiesc iarna n tubul digestiv al insectelor, iar primvara sunt eliminate. n regnul animal drojdiile sunt prezente n microflora intestinal i se elimin natural prin produse de dejecie; n cantiti mai reduse se ntlnesc n cavitatea bucal i pe piele. 2.1.4. Caractere morfologice generale Celula de drojdie are n mod obinuit form sferic, oval sau cilindric, cu dimensiuni medii de 4-14 m. Forma i dimensiunea celulelor este un caracter de gen i specie i acestea pot fi influenate de starea fiziologic i condiiile de cultivare. Dintre formele caracteristice unor genuri cu importan industrial se menioneaz: - forma oval (elipsoidal) specific drojdiilor fermentative ce aparin genului Saccharomyces; - forma sferic predomin la drojdii din genul Torulopsis; - forma apiculat (de lmie) la genurile Kloeckera i Hanseniaspora; - forma de sticl la drojdii din genul Saccharomycodes. Prin cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive solide sau solidificate (de exemplu: must de mal cu agar), n cazul n care la suprafa se afl o celul unic, cu caractere morfologice specifice. Coloniile de drojdii au diametrul ntre 0,2-2 cm au aspect cremos, lucioase sau mate, de culoare n general alb-crem; drojdii din g. Rhodotorula i Sporobolomyces formeaz colonii colorate n rou-portocaliu datorit pigmenilor carotenoizi sintetizai intracelular. n funcie de specie, colonia n seciune poate avea un profil lenticular, semicircular sau triunghiular cu perimetrul circular, umbonat, cu margini ondulate. Caracterele morfocoloniale reprezint criterii valoroase pentru identificarea drojdiilor. 2.1.5. Structura celulei de drojdie Ca i celelalte celule eucariote, drojdiile au structura compus din nveliuri celulare, citozol, nucleu, mitocondrii, ribozomi, vacuole i alte organite intracelulare. Fig.1. Organizarea intern a celulei de drojdie: cm - cicatrice mugural G - corp Golgi L - incluziuni lipidice Lz - lizozomi Mt - mitocondrie N - nucleu n - nucleol Pc - perete celular Pl - plasmalem RE - reticul endoplasmatic V - vacuol In - nveli nuclear prevzut cu pori Ipl - nvaginri plasmalemale

7

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE nveliurile celulare peretele celular i plasmalema sunt structuri ce limiteaz celula i determin forma de baz a acesteia i intervin n toate procesele biologice fundamentale care se desfoar la nivel celular. Peretele celular are o grosime cuprins ntre 150 i 250 nm i poate s reprezinte o pondere de 515% din biomasa uscat a drojdiei. Din punct de vedere structural, peretele celular are aspect laminar i este alctuit din 23 straturi. Difereniat dup stadiul de dezvoltare al celulelor, peretele celular se prezint subire i flexibil la celulele tinere, mai gros i rigid la celulele btrne. Stratul extern prezint o suprafa rugoas n care se observ cicatricile mugurale, rmase dup desprinderea mugurilor de celula mam. O celul normal de Saccharomyces cerevisiae poate nmuguri de circa 20 de ori, aa nct nainte de a-i pierde viabilitatea aproape ntreaga suprafa celular este acoperit cu cicatrici mugurale. Din punct de vedere chimic, n componena stratului extern s-au descoperit manani, glucani i chitina, care mpreun reprezint peste 90% din substana uscat a peretelui celular, alturi de prezena unor cantiti mici i variabile de lipide, enzime, cationi i ap. Stratul intern are o suprafa ornamentat cu riduri proeminente formate din fibrile constituite din molecule liniare de -glucan ce formeaz complexe cu proteinele asigurnd rigiditatea sau elasticitatea peretelui celular. La nivelul peretelui celular sunt localizate i enzime (invertaza, fosfataza, endoglucanaze, permeaze) implicate n biosinteza compuilor peretelui celular i n procese de transfer a substanelor. Rolul esenial al peretelui celular este cel de a asigura forma celulei i de protecie fa de factorii mediului ambiant. n cooperare cu plasmalema, particip la creterea i reproducerea celular, n biosintez i catabolism. De asemenea, peretele celular este implicat n reaciile de floculare i aglutinare ale drojdiilor, proprieti tehnologice importante pentru drojdiile fermentative. Prin ndeprtarea peretelui celular prin metode enzimatice, se obin protoplatii folosii n ingineria genetic pentru obinerea prin fuziune a hibrizilor cu importan practic. Prin amplasarea protoplatilor pe mediu nutritiv n timp de 812 ore are loc regenerarea peretelui celular. Plasmalema (membrana citoplasmatic), reprezint cel de-al doilea nveli al celulei de drojdii ce ader strns pe toat suprafaa sa cu peretele celular, cu care coopereaz funcional. La microscopul electronic apare ca un strat lamelar cu o grosime de circa 89 nm, care delimiteaz protoplastul la exterior. La celulele tinere apare ca un strat omogen, neted, fr nici o nvaginare, n timp ce la celulele mature n membran se evideniaz nvaginri - similare unor anuri care i mresc mult suprafaa. Din punct de vedere chimic plasmalema este constituit din lipoproteine, n care lipidele reprezint 2330%, iar proteinele 3033% din masa membranei, raportul proteine/lipide variaz n funcie de specie, fenofaz i procedeul de izolare utilizat, ntre 1,1 i 1,4. Dintre lipidele prezente n plasmalem predomin fosfolipidele care mpreun cu sterolii i acizii grai nesaturai au un rol esenial n procese de permeabilitate. Lipidele, cu rol de solvent hidrofobic, permit accesul n celul al unor substane utile (aminoacizi nepolari, vitamine). Proteinele plasmatice sunt glicoproteine ce au o mare mobilitate n plasmalem i sub form de molecule sau complexe moleculare ndeplinesc funcii de recepie i transport. Conform modelului stabilit de Robertson, plasmalema prezint dou straturi lipidice n care

8

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE moleculele de lipide sunt orientate cu partea hidrofob spre interior i cu cea hidrofil polar spre periferie i sunt delimitate n ambele pri de macromolecule proteice; particule globulare proteice se pot evidenia i ntre straturile lipidice, modificndu-i poziia n funcie de starea fiziologic a celulei. Plasmalema este o structur dinamic, nsuirile sale morfologice i biochimice ca i potenialul su funcional modificndu-se pregnant n funcie de stadiul ciclului celular i de influena unor factori ai mediului ambiant. n primul rnd este o barier osmotic cu permeabilitate selectiv ce regleaz transferul de substane nutritive necesare n celul pentru a fi metabolizate, precum i eliminarea de catabolii, iar prin sistemele enzimatice active la acest nivel, intervine n reglarea procesului de cretere i nmulire. Plasmalema interfereaz cu principalele ci metabolice ale celulei vii. Citoplasma este constituit din citosol i din organite citoplasmatice care sunt dispersate n el. Este componenta celular cu cel mai nalt dinamism, structura sa fizico-chimic i potenialul su fiziologic modificndu-se foarte rapid, corelndu-se permanent cu condiiile mediului ambiant i cu necesitile metabolice ale diferitelor etape de dezvoltare. Citoplasma reprezint mai mult de jumtate din volumul total al celulei. Hialoplasma sau matricea citoplasmatic este substana fundamental a citoplasmei prezent n toate celulele vii, localizat n spaiul celular n afara compartimentelor delimitate de membranele intracelulare. Ea este format dintr-o fracie solubil (citosol), citoschelet i o reea de filamente care interconecteaz elemente de citoschelet i organitele celulare n citoplasm (Dan, V., 1997). Citosolul este un sistem coloidal cu un coninut de 7085% ap, n care substanele componente se afl sub form de sol sau gel, formnd micele coloidale. Dintre substanele organice predomin proteinele cu rol structural sau catalitic, lipide cu rol plastic i glucide cu rol energetic. n compoziia chimic a citosolului intr i acizii nuceici (ARN I ADN), nucleosidele i nucleotidele cu implicaii majore n metabolismul energetic al celulei ca i unii alcooli, fenoli, acizi organici, etc. n citosol, n anumite faze ale creterii celulare, se pot acumula substane n exces sub forma unor incluziuni de rezerv i anume: Granule de glicogen, se prezint sub forma unor corpusculi sferici, cu diametrul de circa 40 nm i reprezint principala substan de rezerv a celulei care este metabolizat cnd aceasta este n stare de nfometare. Se pot evidenia prin suspendarea celulelor de drojdie n soluie de Lugol, cnd glicogenul n prezena iodului se coloreaz n brun-rocat. Sferozomii (oleiozomii) reprezint incluziuni lipidice acumulate n faza staionar de cretere celular delimitate de o membran simpl, ce conin fosfolipide i acizi grai nesaturai ce pot fi metabolizai n condiii de malnutriie, dup ce se produce liza enzimatic a membranei. Citoplasma joac un rol important n biochimia celulei i se gsete n strns interdependen cu organitele pe care le nconjoar. n acest sens, primul stadiu al respiraiei glicoliza i fermentaia alcoolic decurg n citoplasm, n timp ce urmtorul stadiu, ciclul ATC se realizeaz mitocondric. Organitele celulare. Dintre organitele celulare cu care citosolul interacioneaz n mod permanent formnd o unitate morfofuncional, fac parte urmtoarele: nucleul, mitocondrii, aparatul Golgi, sistemul vacuolar. Nucleul reprezint spaiul genetic n care are loc stocarea, replicarea i transmiterea informaiei celulare i poate fi secvenializat n urmtoarele pri: nveli,

9

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE nucleoplasm, cromonemat, nucleol i fus intranuclear. Are o form sferic sau oval, de obicei cu o poziie excentric n citosol i prezint o anvelop nuclear n care s-au evideniat pori care asigur legtura ntre nucleu i citosol. nveliul nuclear confer individualitate nucleului prin controlul riguros i medierea schimbrilor nucleocitoplasmatice. Nucleoplasma reprezint mediul n care sunt nglobate cromonemata, nucleolul i fusul intranuclear. Nucleolul const dintr-un miez denumit core, alctuit din histone n form de disc pe care sunt nfurate segmente de ADN, formnd aranjamente helicoidale sau solenoide. n nucleol sunt sintetizate proteine ribozomale i ARN ribozomal care apoi trec prin porii nucleari, n citosol. n funcie de caracterele genetice ale speciei de drojdie, numrul de cromozomi nu depete valori de 818, Saccharomyces cerevisiae are 17 cromozomi (Konovalov, 1980). Mitocondriile sunt organitele de baz sau structurile subcelulare n care se sintetizeaz substanele care nmagazineaz energia chimic a celulei, de aceea, nu ntmpltor sunt supranumite i uzine energetice celulare. Pot ocupa pn la 25% din volumul citosolului, n numr variabil, de 1050/celul, ntr-o continu metamorfoz, nct n unele faze fiziologice pot forma o mitocondrie unic, ramificat denumit condriom. Sunt organite puternic hidratate, apa reprezentnd pn la 70% din masa mitocondriei, ceea ce reflect un potenial fiziologic particular. Substana uscat este constituit n principal din proteine i lipide (peste 90%), acizi nucleici, nucleotide, ioni minerali. Proporia diferitelor componente variaz considerabil n funcie de starea fiziologic a celulei i de influena unor factori de mediu. Conform ultimelor date tiinifice, proteinele se afl repartizate n proporie de 5% n membrana extern, 20% n membrana intern i 75% n condriopasm. Mitocondriile posed sisteme de transport specifice, diversificate, care realizeaz transportul unor metabolii eseniali prin membranele mitocondriale ce separ condrioplasma de citosol. n mitocondrii exist enzime ce realizeaz procese de oxidare ale compuilor organici, enzimele lanului respirator i numeroase enzime oxidative, enzime ce asigur fosforilarea. Reticulul endoplasmatic face legtura ntre nucleu i vacuom i reprezint o reea de vezicule, caracterizate printr-o mare plasticitate morfologic. Reticulul endoplasmatic este sediul unor complexe enzimatice (citocromoxidaza, NAD+, enzime ale lanului transportor de electroni) i are rol n transportul substanelor nutritive, n declanarea procesului de nmugurire, n biogeneza sferozomilor, vacuolelor, corpilor Golgi; particip, de asemenea, la expansiunea nveliului nuclear i a plasmalemei n diferite etape de dezvoltare ale celulei. Aparatul Golgi este un sistem de endomembrane, alctuit din uniti funcionale corpi Golgi sau dictiozomi, care face legtura ntre reticulul endoplasmatic i plasmalem, ntre reticulul endoplasmatic i alte organite celulare. Aparatul Golgi este aparatul de sortare i dirijare a proteinelor i componentelor membranare spre locul de destinaie; au rol n expansiunea peretelui celular (Dan, V., 1999). Ribozomii denumii i granule Palade dup numele cercettorului de origine romn care i-a pus n eviden n anul 1953, sunt particule nucleoproteice implicate n sinteza proteinelor celulare rspndii n citosol citoribozomi, liberi sau n asociaii de 56 polizomi. Au n structur ARN ribozomal i proteine (n cazul ribozomilor de Sachharomyces cerevisiae valoarea raportului ARN/proteine variaz

10

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE ntre 1,04 i 1,12. ARN ribozomal este implicat n procese de transcripie a informaiei genetice pentru biosinteza proteinelor/enzimelor, necesare celulei. Lizozomii sunt structuri veziculare bogate n enzime: proteaze, fosfataze, lipaze (peste 40 de tipuri de enzime), active la pH = 5 cu rol n digestia unor compui ai celulei vii, care nu mai funcioneaz eficient; n exteriorul lizozomului, n citosol, enzimele nu sunt active deoarece pH-ul este de 7,3. Enzimele lizozomale sunt n mod normal inactive, latena lor este dependent de integritatea membranei lizozomale, care acioneaz ca o barier ce se interpune ntre enzim i substrat. Cnd sub aciunea unor factori, de exemplu n starea de nfometare, n absena apei care s asigure transportul n exteriorul celulei a cataboliilor formai, pH-ul n citosol scade, enzimele din lizozomi sunt activate i celula moare prin autoliz. Peroxizomii sunt structuri sferice sau ovale nconjurate de o membran simpl i cu o matrice fin granulat pe care sunt localizate oxidaze, cu rol n adaptarea celulei de drojdie la condiii aerobe i intervin n degradarea acizilor grai, a aminoacizilor, a apei oxigenate i a altor substane (de ex. a metanolului). 2.1.6. Caractere fiziologice generale ale drojdiilor O proprietate important a unor drojdii cu utilizri n industria alimentar este aceea de a fermenta n condiii de anaerobioz glucide (hexoze, diglucie, triglucide) cu formare de alcool etilic i dioxid de carbon i produse secundare care dau aroma caracteristic produselor fermentate: C6H12O6 ----- 2CH3-CH2-OH + 2CO2 + 117kj n condiii de aerobioz, drojdiile asimileaz glucidele transformndu-le prin respiraie la CO2 i H2O, iar energia eliberat favorizeaz creterea i nmulirea celulelor: C6H12O6 6CO2 + 6H2O + 2840 kj Celulele de drojdie reacioneaz activ la presiunea osmotic dat de concentraia substanelor dizolvate n mediul n care se afl suspendate. Dac mediul este hipotonic, cu o concentraie a substanelor dizolvate mai mic dect concentraia intracelular, apa va ptrunde n celula care i mrete volumul i dac se prelungete aceast stare de turgescen, celula sufer deteriorri fizice ireversibile. n mediu hipertonic, cnd concentraia mediului este superioar concentraiei intracelulare, apa din celul difuzeaz n exterior pentru a asigura izotonia, iar celula trece n starea de plasmoliz (Dan, V., 1999). Celulele de drojdie, n funcie de condiiile de cultivare si vrst pot prezenta activitate metabolic difereniat concretizat prin trei stri n care se pot afla celulele si anume: starea de metabioz (activ), n care celulele au activitate metabolic maxim. n condiii favorabile de cultur, celulele cresc, se reproduc i acumuleaz intracelular substane de rezerv glicogen i trehaloz; starea de anabioz (latent), celulele i menin caracteristicile vitale, dar nu se pot nmuli. Aceast stare apare cnd substanele nutritive ale mediului sunt epuizate, iar celulele consum din substanele de rezerv intracelulare; starea de autoliz (moartea fiziologic). Se produce o solubilizare a compuilor intracelulari sub aciunea enzimelor proprii celulei.

11

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE 2.1.7. Reproducerea drojdiilor Forma general de reproducere a drojdiilor este nmugurirea vegetativ (calea asexuat) care are la baz un proces simplificat de mitoz, cnd din celula mam se formeaz noua celul, identic din punct de vedere genetic. Unele drojdii au capacitatea de a se nmuli prin sporulare, ce poate avea loc pe cale asexuat (prin procesul de meioz) i pe cale sexuat (prin procese de copulare). Sporularea este condiionat genetic are loc n anumite condiii de mediu. Reproducerea prin nmugurire. nmugurirea are loc cnd drojdiile se afl n condiii optime de mediu (nutrieni, pH, temperatur). O condiie necesar pentru nmugurire este aerarea corespunztoare a mediului, deoarece n prezena oxigenului din aer are loc asimilarea eficient a nutrienilor cu recuperarea energiei poteniale a acestora, energie folosit de celul n cretere pentru procese de biosintez, consumatoare de energie. n aceste condiii, n prima etap celula de drojdie crete n dimensiuni n urma creterii coordonate a compuilor intracelulari; creterea n volum fiind mai rapid dect a suprafeei nveliurilor celulare, are loc o nmuiere enzimatic a peretelui i apare o protuberan - mugurele. ntre celula parental i mugure se perfecteaz un canal - diverticulum prin care se transfer n celula nou format material nuclear i citoplasmatic (cariokinez i citokinez). Cnd celula fiic va conine toate componentele i organitele necesare unei viei independente, la nivelul canalului se formeaz un perete inelar cu o concentraie ridicat n chitin, ce se dezvolt centripet pn are loc obturarea i separarea (Dan, V., 1999).

Fig. 2. nmugurirea la drojdii: 1- mugure; 2- canal de legtur; 3- nucleu; 4- vacuol adiacent nucleului; 5nucleol. Celula fiic, cu activitate metabolic independent, poate rmne ataat de celula mam formnd asociaii sau pseudomicelii, sau se separ de celula parental, iar la locul de desprindere rmne vizibil cicatricea mugural. n condiii optime de via, o celul de drojdie poate forma 942 noi celule apoi celula moare din punct de vedere fiziologic. Reproducerea prin sporulare. Sporularea are la baz procesul de meioz, prin care numrul de cromozomi ai celulei parentale diploide se reduce la jumtate, iar celulele formate primind un singur rnd de cromozomi sunt haploide. Sporularea este iniiat dup circa 10 ore de expunere pe mediul de sporulare i este mai intens dup 2448 ore. n timp, celula generatoare de spori denumit i asc se poate rupe sau s se solubilizeze prin autoliz i ascosporii liberi, n condiii favorabile germineaz i formeaz prin reproducere vegetativ clone haploide. Ascosporii haploizi pot fi de tip a sau n funcie de natura feronomilor specifici; n condiii favorabile, celulele ajunse la maturitate fiziologic denumite i gamei pot s fuzioneze printr-un proces de conjugare pentru a forma din nou celule diploide. Dac

12

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE are loc conjugarea ntre celule de acelai tip a sau celulele diploide sunt viabile, dar ascosporii formai i pierd aceast calitate. Sub form de ascospori drojdiile rezist timp ndelungat n sol, n condiii de uscciune, n schimb termorezistena lor este apropiat cu cea a celulelor vegetative (inactivare la 75850C). Meioza este important din punct de vedere practic pentru c se pot realiza copulri dirijate cu obinerea unor hibrizi ce prezint proprieti superioare prelund de la celulele parentale caractere deosebite (Dan, V., 1999). 2.1.8. Clasificarea general a drojdiilor Potrivit Codului Internaional de Nomenclatur Botanic tulpinile de drojdii sunt grupate n specii, speciile n genuri, iar genurile n subfamilii i familii. O clasificare de referin este cea propus de Lodder i Kreger van Rij (1952) care clasific drojdiile n 38 genuri i 349 de specii de drojdii, iar clasificarea cea mai recent i cuprinztoare aparine lui Kreger van Rij (1984) (60 genuri cu aproximativ 500 de specii). Din aceast clasificare se vor meniona genuri i specii cu implicaii n industria alimentar, n calitatea lor de ageni ai fermentaiei alcoolice sau de alterare a produselor alimentare. Genul Saccharomyces cuprinde 45 de specii cu activitate predominant fermentativ. Se nmulesc prin nmugurire i sporulare, producnd 1-4 ascospori. Dintre speciile reprezentative ale genului: Saccharomyces cerevisiae este o drojdie de fermentaie superioar folosit la fabricarea alcoolului i la obinerea drojdiei de panificaie. Din biomasa de celule obinut n mediul nutritiv i n condiii de aerare, prin procedee biotehnologice se pot obine enzime (invertaz), vitamine din grupul B, interferon .a. Saccharomyces carlsbergensis este o drojdie de fermentaie inferioar, se utilizeaz industrial la fabricarea berii, iar din drojdia rezidual rezultat dup fermentare se pot obine extracte, substane de arom. Genul Brettanomyces cuprinde drojdii de form oval cilindric, n aerobioz pot s produc prin fermentarea lent a glucozei, alcool etilic 11-12% alcool, acid acetic, citric, lactic, succinic. Dau alterri ale berii, vinului (tulburare, iz de oarece) cu formare de esteri i substane cu gust amar, a buturilor nealcoolice, a murturilor. Genul Candida este un gen bogat n specii (81), eterogen din punct de vedere morfologic i fiziologic i care a suferit n timp multe modificri taxonomice. Candida mycoderma denumit i floarea vinului se dezvolt n prezena aerului la suprafaa lichidelor slab alcoolice formnd un voal caracteristic; prin oxidarea alcoolului la dioxid de carbon i ap are loc deprecierea vinului, berii. Alte specii Candida utilis, Candida robusta, Candida tropicalis, Candida lypolitica etc. se pot cultiva pe medii obinute prin prelucrarea unor deeuri ale industriei alimentare, a lemnului i celulozei, obinndu-se o biomas, cu un coninut de 45-55% protein, folosit n furajarea animalelor. Candida kefyri este util la fabricarea chefirului, Candida albicans, drojdie facultativ patogen nu se nmulete n alimente. Genul Debaryomyces cuprinde drojdii de form oval cilindric, poate produce mucus la suprafaa batoanelor de salam, se dezvolt la suprafaa brnzeturilor, iaurtului i dau alterri ale sucurilor concentrate de portocale. Genul Hanseniaspora include drojdii cu proprieti fermentative reduse (50 alcool), cu form apiculat i sunt rspndite n microbiota fructelor citrice, a

13

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE smochinelor; intervin n fermentarea natural a boabelor de cacao. Hanseniaspora apiculata poate reprezenta pn la 90% din microbiota mustului i i reduce viteza de fermentare la acumularea de 5-7% alcool. Se poate dezvolta n vin fiind responsabil pentru formarea de acizi volatili, esteri care dau un gust amar, strin vinului. Prin contaminarea vinului folosit la obinerea ampaniei la sticle, Hanseniaspora apiculata poate forma un sediment aderent la sticl i care se ndeprteaz greu la degorjare. Genul Pichia conine 35 de specii. Au o slab activitate fermentativ, sunt drojdii peliculare; prin dezvoltare i formare de voal produc deprecierea vinului, a berii. Se pot izola de pe suprafaa petilor i a creveilor, din saramura mslinelor conservate i pot produce alterri ale produselor vegetale murate. Genul Rhodotorula include celule cu form oval-cilindric, sunt drojdii oxidative i pot sintetiza pigmeni carotenoizi care imprim coloniei culoarea roucrmiziu. Rhodotorula glutinis i Rhodotorula mucilaginosa, predominante pe alimente: pui, pete, crevei, pe suprafaa untului, sunt specii psihrotrofe. Genul Saccharomycodes cu specia Saccharomycodes ludwigii prezint forme apiculate sau oval alungite, poate fi agent de alterare a musturilor i sucurilor de fructe i dau tulburarea cidrului, a vinurilor semidulci. Genul Saccharomycopsis cu specia important Saccharomycopsis fibuligera prezint celule ovale, fermenteaz lent glucoza, zaharoza, maltoza, asimileaz amidon, alcool etilic, acid lactic etc.; unele tulpini sunt folosite pentru producerea de glucoamilaz sau pentru obinerea de drojdii furajere. Genul Schizosaccharomyces cuprinde drojdii de form cilindric, oval. Schizosaccharomyces pomb este agent al fermentrii sucului de trestie de zahr i folosit pentru obinerea romului i a buturii arak. Genul Torulopsis prezint celule sferice, ovale sau cilindrice. Specii ale genului ntlnite n mustul de struguri, au putere alcooligen redus. Sunt osmotolerante, psihrofile, sulfitorezistente. Pot produce alterri ale laptelui concentrat, a siropurilor, a sucurilor. Genul Zygosaccharomyces cuprinde drojdii cu celule ovale, cu proprieti fermentative, osmotolerante. Pot produce fermentarea mierii, a siropurilor concentrate de zahr cu formare de alcool etilic, acid acetic, dioxid de carbon. 2.2. MUCEGAIURI (FUNGI FILAMENTOI, MICROMICETE) Mucegaiurile sunt microorganisme de tip eucariot, monocelulare sau pluricelulare, difereniate din punct de vedere morfologic i care se reproduc prin spori formai numai pe cale asexuat sau pe cale mixt (asexuat i sexuat). 2.2.1.Rspndire i rol Mucegaiurile sunt foarte rspndite n natur, habitatul preferat i cel mai populat este solul, n special n stratul superficial al solului care le asigur condiii de cretere i supravieuire. Prin activitatea lor de degradare a materiei organice vii, mucegaiurile particip la transformarea unor compui organici (celuloza, hemiceluloze, substane pectice, amidon, lipide) la compui mai simpli i sunt considerai ageni de putrezire. Mucegaiurile particip astfel la circuitul carbonului n natur i mbogesc solul n substane cu molecule mici care pot fi folosite de alte microorganisme sau de ctre plante. Din sol, prin intermediul factorilor naturali, sporii

14

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE de mucegai sunt antrenai pe calea aerului la distane foarte mari, ceea ce asigur rspndirea nelimitat de granie geografice. n aer, mucegaiurile sub form de spori sau hife vegetative pot supravieui un timp ndelungat, iar n absena curenilor de aer se depun cu o vitez ce atinge valori de 3 cm/sec. n ap prezena mucegaiurilor este ocazional, apa fiind un mediu prin care se poate face rspndirea sporilor. Creterea mucegaiurilor n ap este dependent de coninutul acestora n compui organici i poate avea loc numai n condiii de aerare. Sporii de mucegai se ntlnesc frecvent la suprafaa plantelor, n tractul digestiv, n special la ierbivore. n industria alimentar activitatea de biodeteriorare este nedorit deoarece fungii cauzeaz pierderi prin mucegirea seminelor alimentelor. Ca efect secundar este formarea de micotoxine, de ctre unele mucegaiuri, nct alimentele devin inutilizabile. n afara mucegaiurilor saprofite ageni ai putrezirii, se ntlnesc mucegaiuri patogene care pot parazita: plante, animale, peti i insecte. Mucegaiurile sunt frecvent ntlnite n microbiota plantelor, pe suprafaa fructelor i legumelor. Dac produc mbolnviri la plante poart denumirea de mucegaiuri fitopatogene i sunt responsabile pentru aproximativ 70% din totalul mbolnvirilor ntlnite la cereale i legume. Dintre mucegaiurile fitopatogene se pot enumera cele care produc boli ca mlura, rugina, tciunele etc. ale plantelor industriale. La om i animale mucegaiurile patogene produc un numr mai redus de mbolnviri, se dezvolt pe piele, unghii, pr. Un numr mic de mucegaiuri pot produce mbolnviri interne atunci cnd sporii sunt inhalai (pe cale respiratorie) dnd micoze (de exemplu, Aspergillus fumigatus produce aspergillom pulmonar). 2.2.2. Rolul mucegaiurilor n industrie n afar de rolul important al mucegaiurilor n natur, n industria alimentar, culturi fungice selecionate se pot folosi la fabricarea brnzeturilor tip Roqueforti, Camemberti sau la maturarea salamurilor crude. Cu ajutorul mucegaiurilor pe cale biotehnologic se pot obine compui deosebit de valoroi: - antibiotice: peniciline cu Penicillium chrysogenum, cephalosporine (Cephalosporium), griseofulvine (Penicillium griseofulvum) acidul fusidic cu Fusidium coccinenum i antibiotice active fa de bacterii Gram pozitive cu Mucor ramannianus; - acizi organici (citric, lactic, gluconic, kojic, malic, fumaric); - vitamine (B2, ergosterol provitamina D2); - enzime (amilaze, proteaze, lipaze, celulaze etc.). Mucegaiurile se mai pot folosi pentru mbogirea n proteine a finurilor vegetale i ca ageni de depoluare a apelor reziduale. n tehnologiile moderne se obin SCP cu fungi din care: Fusarium graminearum n Marea Britanie i specii de Paecilomyces n procesul Pekilo n Finlanda unde sunt cultivate pe leii sulfitice i deeuri din industria hrtiei. 2.2.3. Caractere morfologice Mucegaiurile se rspndesc n natur sub form de spori rezisteni la uscciune, form n care se menin n stare viabil ani de zile. Dac un astfel de spor ajunge pe suprafaa unui mediu favorabil pentru cretere, cu o cantitate suficient de ap liber care s-i permit absorbia substanelor nutritive, n primul stadiu care

15

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE poate s dureze 3-4 ore, are loc absorbia apei i activizarea sistemelor enzimatice, apoi are loc germinarea celulei sporale i formarea tuburilor vegetative numite hife sau thal. Hifele cresc numai prin vrf i deci au o cretere apical, dup care se ramific. Hifele se extind pe suprafaa mediului, se diversific i ndeplinesc anumite funcii specializate. Hifele de extindere se pot dezvolta i n profunzimea mediului realiznd absorbia nutrienilor i au rol n susinere; hifele de rspndire se pot dezvolta de-a lungul mediului sau aerian. La un anumit grad de dezvoltare a acestor hife vegetative se formeaz hifele reproductoare, generatoare de spori, difereniate n funcie de gen i specie. Totalitatea hifelor vegetative i reproductoare alctuiete miceliul. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid n condiii favorabile, astfel n interval de 2-3 zile pe mediu nutritiv se formeaz colonii vizibile difereniate. n cazul mucegaiurilor inferioare caracterizate prin miceliu aseptat, coloniile se dezvolt rapid, sunt extinse, cu tendina de a ocupa tot spaiul disponibil, au aspect pslos i culori alb, bej, cenuiu, brun. Mucegaiurile superioare caracterizate prin miceliu septat formeaz colonii cu o cretere radial limitat i culoare ce difer de la alb la galben, brun, verde, portocaliu, albastru, cu diferite nuane specifice n funcie de gen i specie. Cnd sporii de mucegai ajung la suprafaa unui mediu nutritiv lichid, prin ntreptrunderea hifelor vegetative se formeaz o pelicul denumit derm, la nceput neted, n timp, prin creterea suprafeei derma se cuteaz i la suprafa se dezvolt hifele reproductoare, se produce sporularea i colorarea specific. Prin introducerea sporilor de mucegai n mediu lichid i cultivarea pe agitator rotativ, ca rezultat al agitrii, mucegaiurile formeaz prin cretere vegetativ, sfere vizibile, ntotdeauna de culoare alb. 2.2.4. Structura mucegaiurilor Mucegaiurile au la baz celula de tip eucariot ce include toate organitele descrise la celula de drojdie. Spre deosebire de drojdii, peretele celular este mai gros i n afar de i -glucani se gsete n cantitate mare celuloza. Celula poate conine 1-2 nuclei cu cte 2-4 cromozomi fiecare. n funcie de caracterele genetice pot fi: - mucegaiuri inferioare sunt monocelulare i se dezvolt sub forma unei celule gigantice ce prezint mai multe ramuri. n aceste celule migreaz liber nucleii citoplasmatici i organitele intracelulare. n cazul n care un spor ajunge pe un mediu nutritiv, atunci prin cretere are loc germinarea sporului care const ntr-o cretere n volum a acestuia producndu-se hife vegetative. Prima dat se formeaz hife de extindere care se dezvolt n paralel de-a lungul mediului nutritiv. Se formeaz apoi hife submerse ce se dezvolt n profunzimea mediului realiznd absorbia nutrienilor i au rol de susinere. Totalitatea acestor hife de extindere i submerse formeaz miceliul vegetativ. Odat cu creterea i dezvoltarea miceliului vegetativ ncep s apar hife aeriene care sunt i reproductoare; - mucegaiuri superioare sunt pluricelulare i au miceliu septat, aceasta pentru c la anumite distane apar perei despritori (septum) prevzut cu un por central prin care se poate face transfer citoplasmatic.

16

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE 2.2.5. Caractere fiziologice generale Mucegaiurile sunt microorganisme uor adaptabile, deoarece au capacitatea de a forma enzime induse n funcie de natura substratului pe care se afl, nct produc degradarea att a produselor alimentare ct i a fibrelor textile, a cauciucului, betonului etc. Mucegaiurile sub form de hife sau spori sunt foarte rezistente la uscciune i se menin n stare latent de via un timp ndelungat. Mucegaiurile sunt puin pretenioase la cantitatea de ap liber prezent n produs, de aceea ele pot produce mucegirea produselor care se conserv prin uscare numai cnd acestea ncep s absoarb ap din mediul ambiant. n raport cu oxigenul, mucegaiurile sunt microorganisme aerobe deci necesit pentru cretere prezena oxigenului din aer sau a oxigenului dizolvat n mediul lichid. Mucegaiurile se pot dezvolta n limite largi de pH (1,59) cu o valoare optim n domeniul acid (pH = 5,56). Mucegaiurile sunt microorganisme mezofile cu temperaturi optime de cretere la 25C, un numr restrns sunt termofile cele patogene au temperatura optim la 37C, iar altele sunt adaptate la temperaturi sczute (03C). Rezistena termic a mucegaiurilor sub form de hife sau spori este mic, majoritatea sunt inactivate la temperaturi de 80C, cei mai rezisteni spori sunt distrui la 88C n 10 minute. 2.2.6. Reproducerea mucegaiurilor Mucegaiurile se nmulesc pe cale vegetativ i prin sporulare. Reproducerea vegetativ se realizeaz prin intermediul fragmentelor de hife rupte sub aciunea unor factori mecanici atunci cnd acestea conin cel puin o celul. Fragmentele hifale chiar cnd, de exemplu n cazul mucegaiurilor superioare conin mai multe celule, vor forma o singur colonie. Din acest motiv la determinarea numrului de mucegaiuri din diferite produse exprimarea se face n uniti formatoare de colonii (UFC). Fungii filamentoi pot s creasc n dimensiuni fr s modifice raportul ntre volumul de citoplasm i suprafaa hifelor, astfel nct schimbul de substane ntre miceliu i mediu implic transport numai pe distane scurte. Se cunosc 3 mecanisme prin care are loc reglarea creterii miceliului i anume: prin reglarea extinderii hifelor, prin iniierea de ramificaii i prin distribuirea spaial a hifelor. Timpul de dublare a miceliului ca i intervalul ntre cicluri succesive de formare a septumului depind de specie i condiii de cultur i poate dura aproximativ 2 ore (Aspergillus nidulans). Se apreciaz c, pentru mitoza complet a nucleilor la mucegaiuri sunt suficiente 10 minute, iar intervalul ntre mitoz i apariia septumurilor este de 2040 minute. Reproducerea prin sporulare. Este forma cea mai rspndit la mucegaiuri i poate avea loc pe cale asexuat sau pe cale mixt. 2.2.7. Clasificarea general a mucegaiurilor Mucegaiurile reprezint un grup taxonomic complex, motiv pentru care clasificarea acestora este n continu transformarea. Numrul posibil de specii ce ar putea exista n natur este apreciat la aproximativ 250000. Mucegaiurile de interes alimentar sunt grupate n 20 de genuri i aproximativ 1000 de specii. Clasificarea are la baz anumite criterii morfologice, structur, caractere coloniale, pigmentogenez, integrate cu date fiziologice i genetice.

17

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Mucegaiurile fac parte din diviziunea EUMYCOTA cu urmtoarele subdiviziuni: 1. MASTIGOMYCOTINA cuprinde mucegaiuri inferioare cu miceliu aseptat care se reproduc prin oospori, pe cale sexuat, cu urmtoarele genuri: Genul Peronospora cu specii fitopatogene, produc mana viei de vie. Genul Phytium include ageni ce produc putrezirea plantelor de gru tinere. Genul Phytophtora cu specia Phytophtora infestans, agentul productor al manei la cartofi. 2. ZYGOMYCOTINA cuprinde mucegaiuri inferioare cu miceliu aseptat care se reproduc prin zigospori pe cale sexuat i prin sporangiospori i chlamidospori pe cale asexuat. Genul Mucor (88 specii) se caracterizeaz prin formarea de sporangiospori n stilosporange, la maturitate prin ruperea membranei i eliberarea sporilor rmne la baza columelei, un collar. n funcie de specie, columela poate avea dimensiuni i forme diferite. Dintre speciile mai importante ale genului: Mucor mucedo, denumit i mucegaiul alb al pinii, Mucor racemosus, agent de putrezire a fructelor i legumelor, Mucor pussillus i Mucor miehei, specii selecionate pentru obinerea de proteaze cu aciune similar cu cea a cheagului animal. Genul Rhizopus (11 specii) se caracterizeaz prin stilosporange de dimensiuni mari, cu columel semisferic, fr collar dup ruperea membranei sporangelui. Sporangiosporii se dezvolt n mnunchi dintr-un punct n care se dezvolt rhizoizi - hife de susinere cu rol absorbant. Extinderea coloniei are loc rapid ca urmare a formrii unor lstari micelieni denumii stoloni. Specia cea mai rspndit pe toate produsele alimentare este Rhizopus stolonifer, agent de mucegire a fructelor i legumelor. Tulpini selecionate pot fi folosite pentru obinerea pe cale fermentativ a acidului fumaric. Genul Thamnidium se caracterizeaz prin formarea de sporangiofori terminai cu un stilosporange mare sub care se dezvolt sporangiofori scuri purttori de sporangioli cu un numr mic de sporangiospori. Thamnidium elegans produce mucegirea produselor conservate prin refrigerare. Genul Absidia prezint sporangi mici cu columel de form conic. Unele specii sunt termofile i produc mbolnviri la animale i om. Poate produce mucegirea porumbului i elaboreaz toxine. 3. ASCOMYCOTINA cuprinde mucegaiuri superioare cu miceliu septat care se reproduc pe cale asexuat i sexuat prin ascospori. Genul Byssochlamys produce asci cu 8 ascospori termorezisteni i produc alterarea alimentelor conservate cu acizi. Byssochlamys fulva i Byssochlamys nivea produc alterarea conservelor de fructe. Genul Monascus cu specia Monascus ruber este folosit pentru obinerea de colorani roii de uz alimentar. 4. BASIDIOMYCOTINA cuprinde mucegaiuri superioare cu ciclu de via mai evoluat i care se reproduc pe cale sexuat prin bazidiospori. Genul Puccinia cuprinde specii fitopatogene ageni ai ruginii cerealelor. Genul Ustilago produc la gru i porumb boala denumit popular tciune. 5. DEUTEROMYCOTINA cuprinde numeroase genuri i specii de mucegaiuri superioare care se reproduc prin conidiospori i la care nu exist cale sexuat de sporulare sau aceasta nu a fost nc evideniat. Genul Aspergillus (132 specii) cuprinde numeroase specii cu importan biotehnologic. Se caracterizeaz prin formarea de conidiofori drepi, neramificai care poart capul conidial alctuit dintr-un suport anatomic denumit vezicul pe care

18

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE se dezvolt celulele conidiogene respectiv fialide, generatoare de lanuri lungi de fialospori. Specia Aspergillus niger formeaz colonii radiale de culoare brun-negru, prezint dou rnduri de fialide pe toat suprafaa veziculei, capul conidial este sferic. Numeroase tulpini selecionate sunt folosite pentru obinerea de enzime: amilaze, proteaze, glucozoxidaze, invertaze, enzime pectolitice sau pentru obinerea acizilor organici: acid citric, acid lactic, gluconic. Specia Aspergillus oryzae formeaz colonii de culoare bej-oranj cu conidiofori drepi i cap conidial sferic cu un singur rnd de fialide. Este numit pe drept cuvnt arsenalul enzimelor deoarece se cunosc peste 200 de enzime elaborate de mucegai i obinute n stare purificat. Pentru obinerea de amilaze mai pot fi folosite speciile Aspergillus awamori, Aspergillus phoenicis, Aspegillus usamii, Aspergillus cinnamommeus. Aspergillus flavus formeaz colonii de culoare alb-glbui la maturitate galben-verzui spre brun cu revers colorat n galben brun. Este rspndit n sol, pe produse vegetale i are capacitatea de a produce aflatoxine, micotoxine cu efect cancerigen. Genul Penicillium (453 specii) se caracterizeaz prin formarea unui aparat reproductor ramificat alctuit din ram, metule, fialide i fialospori cu diferenieri morfologice n funcie de specie. n cadrul genului, specii selecionate sunt folosite la obinerea brnzeturilor cu past albastr Penicillium roqueforti, a brnzeturilor cu past moale Penicillium camemberti, la maturarea salamurilor crude uscate Penicillium nalgiovense. Pentru obinerea de antibiotice din grupa penicilinelor se fosesc tulpini de Penicillium notatum i Penicillium chrysogenum. Numeroase specii sunt ageni de putrezire i pot produce micotoxine: Penicillium expansum, Penicillium islandicum, Penicillium citrinum etc. Genul Botrytis formeaz colonii extinse, psloase, de culoare cenuie. Botrytis cinerea este denumit mucegaiul cenuiu i poate produce putrezirea vulgar sau nobil a strugurilor. Specii fitopatogene dau boli la floarea soarelui i alterri n depozit ale fructelor i legumelor. Genul Fusarium include specii saprofite rspndite n sol i specii patogene parazite ale plantelor superioare. Dau putrezirea brun a fructelor citrice, putrezirea umed a smochinelor, mucegirea cerealelor (orz, gru) cu producerea de micotoxine trichothecene: Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Fusarium nivali etc. Genul Cladosporium formeaz colonii cu aspect catifelat de culoare brun-oliv cu revers colorat n bleumarin-negru. Se reproduc prin blastospori n form de lmie. Este prezent n microbiota cerealelor proaspt recoltate. Este agent al putrezirii negre a strugurilor i pepenilor galbeni. Genul Alternaria formeaz colonii pufoase cu miceliu septat i conidii mari cu septumuri longitudinale i transversale. Dau putrezirea brun a fructelor. Este considerat mucegai de cmp i este prezent pe suprafaa seminelor proaspt recoltate fiind folosit ca indice de prospeime a cerealelor. Genul Geotrichum formeaz colonii extinse, catifelate de culoare alb. Produce miceliu septat din care se separ arthrospori ce au tendina de aranjare n zig-zag. Geotrichum candidum este ntlnit n industria laptelui i la fabricarea pastei de tomate, drept contaminant al utilajelor. Genul Trichoderma formeaz colonii extinse pufoase sau pulverulente de culoare glbui spre verde. Trichoderma reesei produce activ celulaze i un antibiotic gliotoxina cu efect fungistatic fa de mucegaiuri care produc putrezirea lemnului. Genul Trichothecium formeaz colonii cu aspect pufos de culoare rozportocaliu. Dintre cele 4 specii ale genului Trichothecium roseum este cel mai ntlnit

19

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE pe reziduuri vegetale, ca agent al putrezirii fructelor. Este ntlnit pe suprafaa boabelor de cereale: gru, orz, porumb i poate produce mucegirea pinii. 2.3. BACTERII Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot cu un cromozom unic, cu dimensiuni medii ntre 0,5-0,8 m, care se nmulesc asexuat prin sciziune binar, izomoforf. Bacteriile sunt microorganisme cu o larg rspndire n natur, ca rezultat al adaptrii lor n cursul procesului de evoluie. Rezervorul natural al bacteriilor este solul unde concentraia de celule poate ajunge la valori de 10 7-109 g-1 att n straturile superficiale (bacterii aerobe), ct i n straturile de profunzime (bacterii anaerobe). Din sol, bacteriile s-au adaptat s triasc n ape, unde concentraia de celule poate fi ntre 10/cm3 n apa de izvor, pn la valori de 1012/cm3, de exemplu, n ape fecalomenajere. Bacteriile se pot ntlni la adncimi mari n apa mrilor i oceanelor, n ape termale. Existena n aer a bacteriilor este temporar i prin intermediul curenilor de aer sunt rspndite la distane foarte mari. Din aer, sunt antrenate din nou n sol prin intermediul precipitaiilor atmosferice. Bacteriile pot avea forme extrem de diferite. Astfel pot avea form sferic (coci), de virgul (vibrioni), de bastonai (bacili), sau de spiral (spirili). Rolul bacteriilor n natur i industrie. Bacteriile au un rol imens n transformarea compuilor macromoleculari n compui simpli, prin mineralizarea materiei organice nevii, contribuind astfel la realizarea natural a circuitului unor elemente de importan vital: carbon, azot, sulf, fosfor, fier .a. Fr activitatea bacteriilor ageni ai putrefaciei pmntul s-ar transforma treptat ntr-un uria cimitir. n industria alimentar bacteriile lactice sunt folosite la fabricarea produselor lactate, a brnzeturilor, n industria panificaiei, la conservarea legumelor, mslinelor, furajelor verzi etc., bacteriile propionice sunt utilizate la fabricarea brnzeturilor tip schwaitzer, iar bacteriile acetice la fermentaia alcoolului etilic obinerea industrial a oetului. Pe ci biotehnologice s-au obinut cu ajutorul bacteriilor: - enzime, proteine, aminoacizi, acid lactic, acid acetic, solveni (aceton, alcool izopropilic, alcool butilic); - hormoni insulina produs de un mutant de Escherichia coli; - ngrminte biologice Azotobacter; - insecticide biologice Bacillus thuringiensis; - antibiotice Streptomyces sp. - vitamine de ex. vitamina B12 Propionibacterium shermani Ca aspecte negative putem aminti: - n industria alimentar bacterii ageni de alterare a produselor alimentare (acrirea berii, vinului, putrefacia crnii .a.); - bacterii patogene ingerare alimente contaminate toxiinfecii alimentare; - bacterii patogene pot s paraziteze organismele vii dnd mbolnviri grave (tuberculoza, febra tifoid, dizenteria, sifilis, bruceloza, antrax, .a.), bacterioze la plante.

20

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE Structura celulei bacteriene. Peretele celular. Fiecare bacterie este acoperit de un rigid perete celular, care este alctuit din peptidoglucan. Peretele celular bacterian este considerat de muli un adevrat biopolimer. Acest perete i d celulei o form i nconjoar membrana citoplasmic, protejnd-o de mediul nconjurtor. Peretele celular bacterian de asemenea menine integritatea celular. Acesta este att de puternic, nct mpiedic celula bacterian s explodeze, atunci cnd presiunea osmotic dintre citoplasm i mediu este prea mare. Compoziia peretelui celular difer de la o celul la alta, astfel alctuind un factor important n analiza i diferenierea celulelor bacteriene. Astfel, n 1884, Hans Christian Gram, un fizician danez, a realizat o metod de a diferenia structurile peretelui celular. Peretele celular gram pozitiv se coloreaz in violet prin tehnica Gram. Este gros, dar simplu structurat, unitatea de baz fiind peptidoglicanul, format din uniti repetitive. Mureina este structura rezultat din unitile de peptidoglicani cu ajutorul unei enzime: transpeptida. Are rolul de a menine forma bacteriei (la presiuni de 2-2,5 atmosfere) in cazul in care bacteria ii pierde peretele sub aciunea penicilinei. Sferoplastul (cu urme de perete celular) si protoplastul (fara perete celular) sunt fragili, usor de atacat de fagocite sau sub aciunea variaiei presiunii osmotice. Membrana citoplasmic. Membrana citoplasmic procariot const dintr-un strat dublu de fosfolipide i proteine, i se aseamn foarte mult cu membrana eucariot. Aceasta este o barier, ce le permite s interacioneze selectiv cu mediul nconjurtor. Membranele sunt asimetrice, constnd fiecare din 2 pri, fiecare parte constnd din suprafee i funcii diferite. Citoplasma. Nucleoidul, plasmidele i cromozomii. Nucleoidul reprezint regiunea citoplasmei, unde este concentrat ADN-ul cromozomal. Nu este un nucleu propriu-zis, ca la eucariote. Plasmide. Plasmidele pot pstra informaia genetic adiional. Ele se afl n special n nucleoid. Informaia pstrat de acestea nu este vital, ns poate oferi avantaje selective n anumite circumstane. De ex: unele plasmide pot codifica anumite toxine, iar alte plasmide pot pstra informaie genetic mpotriva antibioticelor. Cromozomi. Cromozomii bacterieni sunt n form circular i pstreaz informaia genetic a bacteriilor. Ribozomii i alte structuri multiproteinice. Ribozomii sunt structuri prezente n orice celul. Ribozomii bacterieni sunt similari celulelor eucariote, ns sunt mult mai mici i au o alt structur. Unele antibiotice ar inhiba funcionarea ribozomilor celulelor procariote, astfel cauznd moartea bacteriei. Caractere morfologice coloniale Mediul de baz pentru cultivarea bacteriilor bulionul de carne lichid sau solidificat cu agar-agar (BCA). Prin reproducere pe mediu nutritiv solidificat ia natere o colonie alctuit din biomasa de celule rezultate prin sciziune din celula unic: - colonii de tip S (smooth neted lucios) - colonii de tip R (rough rugos, aspru, zbrcit) - colonii de tip M la bacterii productoare de capsule, cu consisten gelatinoas, mucoid Coloniile bacteriene pot prezenta n seciune un profil lenticular, crateriform, triunghiular i perimetru circular, dantelat sau cu ramificaii rizoidale. Pe BCA coloniile devin vizibile dup 24-48 ore i pot avea culori de alb, albcrem, galben-auriu, oranj-rou, albastru, fluorescen, caractere microscopice

21

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE importante n identificare. Pe medii nutritive lichide bacteriile pot da tulburare i sediment bacteriile anaerobe sau formeaz la suprafaa lichidelor voal caracteristic, fragil, cutat, gelatinos bacteriile aerobe. Bacteriile prezint forme celulare foarte diversificate, dintre care forme de baz, monocelulare, precum i forme derivate ale acestora ce rezult n urma asocierii celulelor rezultate prin reproducere. Dintre formele de baz fac parte urmtoarele: - forma sferic denumit coccus, n care sfera este perfect, de exemplu la micrococi sau ovalar, de exemplu la enterococi, lanceolat la pneumococi i reniform la gonococi; - forma bacilar cilindric, este cel mai frecvent ntlnit, este denumit i bacterium. Formele pot fi drepte cu capete rotunjite genul Enterobacter, cu capete retezate genul Bacillus, fusiforme, mciucate genul Corynebacterium, cu diametruvariabil genul Mycobacterium; - dintre formele spiralate-elicoidale, specifice bacteriilor patogene, fac parte: forma vibrio, forma spirillum sub forma unor filamente rigide cu spire largi, forma spirocheta sub forma unor filamente flexibile cu mai multe spire; - formele filamentoase sunt caracteristice bacteriilor miceliene cu habitatul n sol i ape (actinomicete, chlamydobacterii etc.). Caractere fiziologice generale ale bacteriilor Bacteriile se caracterizeaz prin complexitate metabolic, cu o mare capacitate de adaptare, rspndire pe cele mai diverse medii, ca urmare a producerii de enzime care le permite utilizarea n nutriie a compuilor organici macromoleculari (protide, poliglucide, lipide). n raport cu temperatura, bacteriile se dezvolt ntr-un domeniu larg, ntre 10C i 90C; majoritatea bacteriilor ageni de alterare a alimentelor sunt bacterii mezofile i dau alterri la temperatura camerei (bacterii de putrefacie). Bacteriile n form vegetativ sunt inactivate pe cale termic la temperaturi de pasteurizare, iar sub form de endospori, la temperaturi de sterilizare. n raport cu oxigenul majoritatea bacteriilor sunt aerobe (ex. bacterii acetice), care cresc n semiaerobioz (ex. bacterii lactice), dar un grup restrns de bacterii sunt adaptate s creasc n strict anaerobioz (ex. genul Clostridium). Bacteriile se pot dezvolta n domeniul de pH1-11 cu zone optime la valori acide pentru bacterii acidotolerante (bacterii acetice, lactice) sau la valori neutre pentru bacterii de putrefacie. Clasificarea general a bacteriilor Pentru identificarea unei specii sunt uneori necesare 40 pn la 100 de teste. Criteriul de baz afinitatea tinctorial; familia ca unitate taxonomic conine acelai tip de bacterii: Gram pozitive sau Gram negative. Criterii fiziologice: teste de asimilare sau fermentare a glucidelor, relaia fa de oxigen, temperatur, pH, rezisten la inhibitori .a. Clasificarea de baz Bergey (1952) bacteriile sunt grupate n 10 ordine i 47 familii clasificare reluat n 1984 dup criterii morfologice n 33 seciuni. Regnul PROCARIOTAE dou diviziuni: - SCOTOBACTERIA bacterii care folosesc pentru cretere i multiplicare energia rezultat din reacii chimice: o clasa BACTERIA

22

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE o clasa ACTINOMYCES o clasa MOLICUTES - PHOTOBACTERIA bacterii ce conin pigmeni celulari similari clorofilei i care pot folosi energia luminoas n procese de biosintez celular Clasa BACTERIA Ordinul PSEUDOMONADALES bacterii Gram negative cu habitat n sol i ape, aerobe, nesporulate. Familia Pseudomonadaceae genuri: - Pseudomonas bastonae tipice, rspndite pe produse vegetale, carne, pui; dau alterarea produselor refrigerate - Acetobacter bacterii acetice, produc oxidarea alcoolului etilic la fabricarea acidului acetic de fermentaie - Xanthomonas dau alterri ale legumelor, produc un polimer xanthanul - Zymomonas bacterii care pot produce fermentarea glucidelor cu formarea de alcool; sunt folosite la obinerea alcoolului carburant din materii celulozice. Familia Nitrobacteriaceae, cu genurile Nitrobacter i Nitrosomonas care produc oxidarea compuilor cu azot rezultai din putrefacie, cu transformarea azotului amoniacal n azotii i azotai, form asimilabil de ctre plante. Familia Thiobacteriaceae produc oxidarea compuilor cu sulf. Bacterii din genul Thiobacillus ageni ai coroziunii biologice. Familia Spirillaceae produc degradarea celulozei n condiii aerobe. Bacterii ale genului Cellulomonas prelucrarea deeurilor de hrtie pentru obinerea de protein bacterian folosit n scop furajer. Ordinul EUBACTERIALES bacterii propriu-zise, foarte rspndite ce cuprind bacterii n form de coccus, bacterium i forme derivate prin sciziune Familia Achromobacteriaceae bacterii nesporulate Gram negative, produc putrefacia: - g. Achromobacter produc prin degradarea proteinelor amine biogene toxice, sunt bacterii aerobe, produc alterarea produselor refrigerate - g. Alcaligenes sunt ntlnite n lapte, carne, pui, pete i materii fecale - g. Flavobacterium se prezint sub form de bastonae, produc un pigment galben-rou i alterarea produselor la refrigerare. Familia Azotobacteriaceae bacterii care folosesc azotul atmosferic n nutriie, au rol n circuitul natural al azotului i pentru obinerea de ngrminte biologice Azotobacter chroococcum Familia Bacillaceae bacterii sub form de bastonae, Gram pozitive, productoare de endospori: - g. Bacillus 25 specii bacterii de putrefacie aerobe,anaerobe; unele specii selecionate se folosesc pentru obinerea de enzime: amilaze, proteaze, glucanaze - g. Clostridium 93 specii bacterii de putrefacie anaerobe, productoare de toxine, bacterii butirice, bacterii productoare de solveni - familia Enterobacteriaceae bacterii Gram negative, nesporulate, aerobe/facultativ anaerobe, patogene/facultativ, cu habitatul n tractul digestiv - g. Escherichia bacterii de putrefacie, facultativ patogene (ageni ai gastroenteritelor) se pot nmuli n produse alimentare, pot produce toxine

23

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE E.coli indicator sanitar pentru verificarea condiiilor de igien la fabricarea produselor alimentare - g. Enterobacter face parte din microflora intestinal - g. Proteus bacterii de putrefacie, mobile, aerobe, produc alterarea crnii, a oulor pstrate la temperatura camerei - g. Shigella bacterii enteropatogene ( agentul dizenteriei) - familia Lactobacillaceae bacterii lactice Gram pozitive, nesporulate, facultativ anaerobe, sub form de bacili (bastonae subiri sau sub forme derivate de la coccus. - g. Streptococcus cuprinde bacterii sub form de streptococi. O parte din speciile genului au trecut n g. Lactococcus, folosite drept culturi starter n industria laptelui - g. Lactobacillus bacterii lactice acidotolerante, folosite n industria laptelui i pentru conservarea prin murare a produselor vegetale - g. Pediococcus bacterii lactice sub form de tetrade. Pot produce acrirea berii - g. Leuconostoc bacterii lactice heterofermentative, ageni de alterare a sucurilor, siropurilor de zahr .a. Pot produce biosinteza dextranului Familia Micrococcaceae bacterii Gram pozitive cu forma coccus sau forme derivate prin sciziune - g. Micrococcus bacterii aerobe/anaerobe,de putrefacie - g. Sarcina bacterii aerobe de putrefacie - g. Staphylococcus bacterii facultativ patogene; produc enterotoxine i sunt ageni ai intoxicaiilor alimentare Familia Propionibacteriaceae bacterii nesporulate Gram pozitive, produc fermentaia propionic. - g. Propionibacterium bacterii folosite la fabricarea brnzeturilor cu past tare i desen pentru obinerea vitaminei B12. CLASA ACTINOMYCES Ordinul ACTINOMYCETALES bacterii filamentoase, Gram pozitive, saprofite sau facultativ patogene, folosite industrial pentru obinerea de substane biologic active Familia Mycobacteriaceae bacterii patogene Mycobacterium tuberculosis (agentul tuberculozei) i Mycobacterium leprae Familia Actinomycetaceae bacterii patogene pentru animale i plante. Au rol n formarea humusului i la nchiderea la culoarea solului. Familia Streptomycetaceae bacterii filamentoase: - g. Streptomyces numeroase specii sunt folosite pentru obinerea de antibiotice (tetracicline,streptomicina, cloramfenicol etc.) sau pentru enzime (glucozizomeraze). Ordinul RICKETSIALES cuprinde bacterii obligat parazite ale insectelor, transmisibile prin nepturi la animale i om. - g. Ricketsia cu sp. R. prowazecki agent al tifosului eczantematic - g. Coxiella bacterii patogene, produc febra Q hemoragic. C. bruneti se poate transmite prin lapte

24

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

3. NUTRIIA MICROORGANISMELORNutriia este un proces fiziologic complex prin care microorganismele i procur elementele necesare i energia pentru biosinteza compuilor celulari, pentru cretere, reproducere i ntreinerea funciilor vitale. Procesul de nutriie se desfoar n cadrul metabolismului celular prin reacii de degradare a compuilor macromoleculari n compui cu mas molecular redus ce pot fi transportai n interiorul celulei, reacii exergonice ce au loc n cadrul catabolismului celular. Concomitent cu reaciile de catabolism, folosind compui simpli i energie, celula vie sintetizeaz compui celulari eseniali pentru cretere, n cadrul anabolismului. Viaa celulei microbiene este posibil att timp ct cele dou procese se desfoar concomitent. Celula bacterian poate utiliza ntre 300-600 tipuri de molecule diferite din care aproximativ 50% sunt reprezentate de molecula de ap i ioni. Se apreciaz c fr a lua n calcul moleculele de ap celula de drojdie poate utiliza pn la 500 molecule mici i peste 4000 de macromolecule. Microorganismele ntlnite n industria alimentar sunt microorganisme chimiosintetizante i i obin energia prin degradarea compuilor organici cu eliberarea energiei poteniale a substratului nutritiv pe care aceasta se dezvolt dnd de cele mai multe ori alterarea specific a acestuia. Prin substrat nutritiv se nelege acel mediu care conine ap, surse de energie (de natur glucidic), surse asimilabile de azot, sruri minerale i facultativ factori de cretere. 3.1. TIPURI NUTRIIONALE I SURSE NUTRITIVE Microorganismele care pot folosi CO2 ca surs unic sau principal de carbon sun numite autotrofe spre deosebire de cele heterotrofe care folosesc ca surs de carbon moleculele organice preformate de la alte organisme. Ca rezultat al adaptrii microorganismelor la diferite condiii de mediu ambiant , n funcie de sursele accesibile, acestea pot aparine la 4 tipuri nutriionale: - chemoorganotrofe heterotrofe i obin energia pe cale chimic, prin procese de oxidare a compuilor organici i procur oxigenul i hidrogenul din compui organici i anorganici (fungi i bacterii); - fotolitotrofe autrotrofe (alge, bacterii din ape) folosesc energia luminoase n procese de biosintez i folosesc sursa de carbon, hidrogen i oxigen din compui anorganici; - fotolitotrofe heterotrofe folosesc energia luminoas iar ca surs major de carbon, CO2 din aer (bacterii sulfuroase); - chimiolitotrofe autotrofe (sulfobacterii, ferobacterii) i obin energia pe cale chimic, iar ca surs de carbon i hidrogen servesc compuii anorganici. Microorganismele cu rol n industria alimentar (drojdii, mucegaiuri, i bacterii aparin primului tip nutriional. Fiind adaptate s se dezvolte prin asimilarea carbonului din materie organic sunt cunoscute ca ageni selecionai pentru dirijarea proceselor fermentative industriale, ca ageni de alterare sau patogeni . n primul tip nutriional al microorganismelor organotrofe se disting urmtoarele subgrupe: - microorganisme saproorganotrofe (saprofite) se dezvolt folosind ca surs de carbon i energie, materia organic nevie. n aceast categorie intr

25

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE majoritatea microorganismelor cu aplicaii industriale, dar i bacteriile de putrefacie, microorganismele care se dezvolt pe alimente; - microorganisme comensale se dezvolt la suprafaa sau interiorul organismelor vii (plante sau animale) beneficiind de aceast asociere i hrnindu-se cu substane ce rezult n mod natural din activitatea metabolic a acestora. Se pot exemplifica microorganisme din microbiota epifit a plantelor, a pielii, din microbiota intestinal; - microorganismele patogene sau parazite pot fi strict patogene fiind specializate s se hrneasc i s triasc parazitnd celula vie; - microorganismele potenial patogene pot s creasc pe produse alimentare bogate n nutrieni i pot n anumite condiii s elaboreze toxine, ns prin ngerarea alimentului contaminat se produc stri de toxiinfecii alimentare sau toxicoze. Surse de nutriie preferate de microorganismele organotrofe Surse de carbon Nu exist nici o surs de carbon care s nu fie utilizat pe cale microbian. Exist microorganisme care pot utiliza foarte mult sursa de carbon, exemplu Pseudomonas cepacia care pot utiliza peste 100 surse diferite de carbon, alte bacterii, de exemplu din genul Letospira folosesc ca surs principal de C i energie numai acizii grai cu numr mare de C n molecul. Dintre sursele de C naturale ntlnite n materii prime alimentare sau utilizate n compoziia mediilor de cultur sunt preferate urmtoarele: - poliglucide: amidon, celuloz, substane pectice, care pot fi folosite n special de ctre bacterii i microorganisme productoare de enzime specifice extracelulare; - monoglucide (hexoze, pentoze), diglucide, reprezint att sursa de carbon ct i de energie pentru toate microorganismele i sursa de baz n nutriia drojdiilor; - acizi organici (acid lactic, malic, acetic) pot fi o surs de C pentru microorganisme i unele drojdii; - alcoolii sunt utilizai de ctre drojdii oxidative (g. Candida, g. Pichia) i de bacterii (g. Acetobacter). Deoarece carbonul reprezint max. 50% din substana uscat a celulei la alctuirea mediilor de cultur se calculeaz cantitatea de nutrient ce trebuie adugat (n funcie de masa molecular i de coninutul n carbon) pentru obinerea unei cantiti corespunztoare de biomas. Nutrieni cu N,P,S Pentru cretere, microorganismele necesit cantiti mari de azot, fosfor i sulf, iar organotrofele le pot procura fie din sursele organice cu carbon, fie din compuii anorganici. Se tie c azotul (10-14% din substana uscat a celulei) este necesar pentru sinteza de aminoacizi, purine, puridine, unele lipide, coenzime. Multe microorganisme pot folosi azotul din aminoacizi i amoniac prin ncorporarea direct, cu ajutorul unor enzime. Unele bacterii pot reduce i asimila azotul atmosferic folosind un sistem de nitrogenaze i au un rol vital n asigurarea circuitului natural al azotului. Proteinele pot fi folosite n nutriie numai de ctre microorganismele ce produc proteaze extracelulare, respectiv bacterii - ageni cu putrefacie i mucegaiuri - ageni de putrezire. Se mai pot folosi n mediile de cultur a drojdiilor - sulfatul de amoniu i

26

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE ureea. Ali compui cum ar fi nitraii sunt asimilai de ctre mucegaiuri i bacterii, nitriii numai de ctre bacterii (g. Nitrosomonas) i cu efect toxic pentru drojdii (nmulirea este oprit la concentraii de 200 mg nitrai /dm3). Nutriia mineral Pentru procurarea elementelor minore, sunt preferate de ctre microorganisme srurile acestora n urmtoarea succesiune: fosfai, sulfai, azotai, carbonai. Efectul pe care l are adugarea diferitelor substane minerale asupra creterii poate fi diferit prin indicele de utilitate specific, ce reprezint raportul dintre biomasa format pe un mediu de cultur complet i cea rezultat n mediul carenat n substana /elementul respectiv. Factorii de cretere Factorii de cretere sunt substanele organice ce sunt eseniale pentru creterea microbian i nu pot fi sintetizate de microorganismul respectiv. Conform exigenelor nutritive ale microorganismelor ncadrate n primul tip de nutriie se poate stabili o anumit succesiune; cele mai pretenioase din punct de vedere nutritiv sunt bacteriile gram pozitive urmate de bacterii Gram-negative i respectiv drojdii i mucegaiuri. Factorii de cretere ca structur si funcie metabolic intr in urmtoarele 3 categorii: - aminoacizii sunt necesari pentru sinteza de proteine / enzime; - purine si pirimidine , pentru sinteza acizilor nucleici; - vitamine, care functioneaz ca grupari prostetice ale unor enzime sau cu funcie de coenzime. n funcie de natura microorganismelor necesarul de aminoacizi variaz ntre 0 si 18 aminoacizi. Dintre microorganismele din industria alimentar drojdiile din genul Saccharomyces necesit biotin si acid paraaminobenzoic bacteriile lactice ale genului genului Lactobacillus necesita acid folic, acid nicotinic, biotin, vitamina B, piridoxina, bacteriile acetice necesit acid p-aminobenzoic, iar Enteracoccus faecales are nevoie de 8 vitamine diferite pentru cretere. Exist i un grup restrns de substane denumite factori stimulatori de cretere care fr s fie indispensabile, prezena lor accelereaz ritmul de cretere celular. Cunoaterea condiiilor de cultur i a exigenelor de nutriie a fiecrui microorganism are o importan deosebit att n practica de laborator ct i la cultivarea industrial, deoarece permite reglarea activitii fiziologice fie n direcia obinerii de biomas, fie a unor produse de metabolism cu importan economic. 3.2. MODALITI DE TRANSPORT A NUTRIENILOR N CELULA MICROBIAN Pentru realizarea procesului de nutriie este obligatoriu ca nutrienii s ptrund n interiorul celulei pentru a fi metabolizai. Nutrienii solubili cu molecule mici pot ptrunde n celula microbian pe diferite ci. Una din cile cele mai frecvente este ptrunderea prin difuzie i anume prin: - difuzie pasiv este difuzia ce se realizeaz ca urmare a unui gradient de concentraie posibil cnd n exteriorul celulei concentraia nutrientului este superioar celui din interiorul celulei. Prin anumii pori ai membranei plasmatice nutrientul ptrunde n interior si este metabolizat.

27

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE difuzie facilitat se realizeaz ca urmare a prezenei n biomembrane a unor proteine receptoare denumite permeaze, localizate la nivelul plasmalemei sau n spaiul periplasmic. Permeaza recunoate i leag molecula solubil a apei schimbndu-i conformaia i o elibereaz in interiorul celulei. Apoi aceasta i reia poziia orientat spre exteriorul membranei plasmatice si este pregtit pentru a prelua o nou molecul. Acest proces poate avea loc atta timp ct concentraia moleculelor nutrient este mai mare n exteriorul celulei fa de cea intern. Difuzia facilitat este mai important la celulele de tip eucariot pentru transportul aminoacizilor si al glucidelor, n timp ce la procariote servete pentru transportul glicerolului. Microorganismele adesea se ntlnesc in habitate n care coninutul n nutrieni este foarte redus nct pentru cretere este important transportul i concentrarea lor in celul. n aceasta situaie, transportul se face contra gradientului normal de concentraie, cu consum de energie, prin transport activ i translocaie de grup. Transportul activ transportul n celul este asigurat chiar n absena gradientului de concentraie i se realizeaz cu consum de energie. Transportul se activeaz ca urmare a energiei eliberate prin transformare ATP n ADP. Translocaia de grup este un transport activ ntlnit la drojdii i mucegaiuri n care intervine un sistem enzimatic complex de transferaze, care permit ptrunderea glucidelor prin membrane sub forma esterilor fosforici. Celulele pot face schimb cu mediul exterior nu numai cu ioni i glucide ci i cu glucide compui macromoleculari. Astfel, bacteriile de exemplu pot secreta proteine printr-un proces de exocitoz. Este posibil si ptrunderea unor astfel de macromolecule in interiorul celulei prin procese de endocitoz. 3.3. MEDII DE CULTUR Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, cu rol de aliment, care trebuie s asigure microorganismului ce urmeaz a fi cultivat, cantitatea necesara de ap, surse de carbon, azot, substane minerale, factori de cretere, substane care s i furnizeze cantitatea de energie ct i toate elementele folosite de celul n procese de cretere, reproducere i ntreinerea funciilor vitale. Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: - s corespund din punct de vedere nutritiv; - s aib o concentraie a substanei dizolvate n mediu care s nu influeneze negativ schimburile osmotice ale celulei; - s nu conin substane toxice sau s genereze compui toxici n urma creterii culturii microbiene; - s aib un anumit pH sau rH; - s fie steril astfel nct s nu dezvolte numai celule introduse prin inocul. n practica de laborator mediile de cultur se folosesc pentru izolarea din medii naturale a diferitelor microorganisme pentru obinerea de culturi pure, pentru cultivarea acestora n scopul obinerii de biomas sau pentru ntreinerea culturilor pure selecionate. n scop industrial mediile de cultur se folosesc pentru obinerea de celule sau a compuilor rezultai prin activitatea microorganismelor selecionate. n funcie de destinaia lor, mediile de cultur se difereniaz astfel:

28

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE a. medii de cultur generale care asigur dezvoltarea unui numr mare de specii i genuri deoarece includ n compoziia lor substane nutritive diversificate. Dintre mediile de cultur generale folosite n practica laboratorului de microbiologie menionm: - bulionul de carne lichid sau gelozat (BCA); - mediul tripton - extract de drojdii - glucoz agar; - mustul de mal agar (MMA) pentru cultivarea drojdiilor i mucegaiurilor; b. medii de cultur selective sunt medii cu o compoziie chimic definit care permit dezvoltarea unui grup restrns de microorganisme sau chiar a unei specii. Aceste medii conin pe lng substane nutritive i substane cu efect inhibitor asupra altor microorganisme nsoitoare ntlnite n microbiota din care se face izolarea culturii ce dorim s o selecionm. Un mediu selectiv folosit la determinarea bacteriilor coliforme este BLBV (bulion bil lactoz verde briliant) n care srurile biliare inhib alte bacterii, n timp ce coliformii sunt adaptai. Numrul mediilor selective este foarte mare i permit izolarea unor specii de interes industrial sau se folosesc pentru identificarea, determinarea microorganismelor contaminante n produse alimentare. c. medii de cultur de difereniere aceste medii permit separarea speciilor n funcie de anumite caractere biochimice, atunci cnd acestea au fost selectate dintr-o microbiot eterogen. d. medii de mbogire (fortifiate) sunt destinate separrii i cultivrii unor microorganisme pretenioase din punct de vedere nutritiv i care se afl n numr redus n produsul analizat din punct de vedre microbiologic. n funcie de compoziie i provenien, mediile de cultur pot fi medii naturale i medii sintetice. a)mediile naturale sunt cele mai utilizate deoarece reproduc condiiile n care se dezvolt microorganismele. Mediile naturale de origine vegetal sunt sucuri de fructe, de legume, mustul de mal, legume fierte/ terciute, fructe, infuzii de plante. Ca medii de origine animal se folosesc dup sterilizare, laptele, snge (pentru bacterii facultativ patogene), zerul, carnea, bulionul de carne, ficat, ou. n condiii de laborator se folosesc att medii lichide, n special pentru cultivarea microorganismelor facultativ anaerobe, pentru studiul proceselor fermentative, medii solide pine, cartofi felii, .a. i frecvent medii solidificate obinute prin adugarea n mediile lichide a unor ageni de solidificare. Pentru solidificarea mediilor de cultur se folo