Metode Biochimice de Determinare a Glucozei Din Sange

7/23/2019 Metode Biochimice de Determinare a Glucozei Din Sange

1/20

Metode biochimice de

determinare a glucozei dinsange folosite indiagnosticarea si

monitorizarea diabetuluizaharat tip II

Masterand: Adriana Nisfoeanu(Danaila)

Anul I BMBA


2/20

Notiuni introductive Diabetul zaharat este o efectiune des intalnita in societateamoderna de obicei !ind diagnosticat tardiv care poate

actiona ireversibil la nivel sistemic" In urma publicarii rezultatelor studiului #$%DA&'$$

(evaluarea prevalentei diabetului in populatia adulta a$omaniei) !nalizat in prima parte a anului *+ a rezultat caprevalenta reala a diabetului in tara noastra este la peste**, (in populatia a-ata intre si ./ de ani) ceea cenumeric se traduce printr0un numar de apro1imativ 2.3"4.de persoane cu diabet diagnosticat"

Aceste cifre au relevat importanta diagnosticarii simonitorizarii stricte a populatiei afectate lucru realizat prinintermediul laboratoarelor de analize medicale"

Diabetul zaharat tip II este o afectiune de!nita de nivelulglucozei din sange


3/20

glucozei*" Determinarea glucozei din

sange In absenta unui mar5er biologic mai speci!c pentru a de!nidiabetul determinarea glucozei plasmatice a ramas elementul debaza al criteriilor de diagnostic"

6e pot recolta + tipuri de probe:

07lucoza plasmatica8serica determinata 9 eun (bazala)"

07lucoza serica determinata la ore postprandial"07lucoza plasmatica8serica determinata dintr0o proba de sange

recoltata intr0un moment oarecare al zilei indiferent de intervalulde la ultima masa (;randomalorile de referinta ale glicemiei sunt ?*@ mg8dl (@"// mmol8)

pentru glicemia bazala si ? mg8d in cazul testului de tolerantala glucoza"


4/20

*" Determinarea glucozei din sange(continuare)

#entru determinarea glucozei din sange in laboratorul clinic seutilizeaza mai frecvent modele colorimetrice bazate pe reactiiintre glucoza si o substanta cromogena"

*" M%&'DA ''$IM%&$IA C '0&'CIDINA#rincipiul metodei:

#rin conugarea aldo0 si cetohe1ozelor cu amine aromatice se obtincompusi colorati a caror intensitate se poate determina princolorimetrare sau fotometrare"#entru dozarea glucozei amina cea mai potrivita este o0toluidinacare da cu aldohe1ozele un compus intens colorat in verde"

a si reactivi se folosesc solutie de acid tricloracetic , solutie deacid tricloracetic 3, solutie de o0toluidina ".3M" 6e foloseste o

solutie standard de glucoza *mg," #roba si solutia standard lacare se adauga in mos egal solutie de acid tricloracetic , siapa distilata se centrifugheaza apoi supernatantul se amestecacu solutie de acid tricloracetic 3 , si de toluidina se incalzeste sidupa racire se masoara e1tinctiile probelor de analizat si probastandard in raport cu proba alb la @43nm"


5/20

*" Determinarea glucozei din sangeM%&'DA ''$IM%&$IA C '0&'CIDINA(continuare)

alcularea si interpretarea rezultatelor:alculul glicemiei se face conform relatiei:

Ml glucoza/100ml sange (ser sau plasma)=PA/PS x 100

#Ae1tinctia citita la proba de analizat

#6e1tinctia citita la proba standard'bservatii :

0ceto0sau aldopentozele dau coloratie cu o0toluidina dar deintensitate foarte slaba negliabila pentru concentratiaacestor substante in sange" 7alactoza poate interfera in

cazurile de galactozemie"0daca determinarea glucozei se face in mai putin de 4 ore dela recoltarea probei atunci nu este obligatorie recoltarea pesubstante anticoagulante"


6/20

*" Determinarea glucozei din sangeM%&'DA ''$IM%&$IA C AN&$'NA

#rincipiul metodei:7lucoza este deshidratata cu acid sulfuric obtinandu0sehidro1imetilfurfurol care cu antrona formeaza un compus decondensare colorat in galben0rosiatic" %1tinctia se citeste la @nm"Metoda foloseste ca si reactivi solutie de acid tricloracetic 3, si

reactiv cu antrona" 6e lucreaza cu o solutie standard de glucoza cuo concentratie de mg," 6e lucreaza cu trei eprubete decentrifuga: pentru proba de sange total8plasma8ser pentru probastandard si pentru proba alb" 6e centrifugheaza proba de analizat sisupernatantul respecti probele standard si alb se amesteca cuantrona" Dupa incalzirea si racirea eprubetelor se citesc e1tinctiilela @nm"alcularea rezultatelor : Mg glucoza/100ml sange(ser sau plasma)=PA/PS x 100

#Ae1tinctia citita la proba de analizat#6e1tinctia citita la proba standard


7/20


M%&'DA &I&$IM%&$IA(tehnica Eaghedorn si Fensen)

#rincipiul metodei: 7lucoza din sange prezenta in !ltratul de sange deproteinizat inprealabil prin incalzire cu un amestec de sulfat de Gn si hidro1id de Na reducefericianura de H la ferocianura de H" ericianura de H in e1ces elibereaza I dintr0o solutie de iodura de H in mediu acid" I eliberat este titrat cu o solutie detiosulfat de Na in prezenta solutiei de amidon ca indicator" #entru ca reactia sa!e completa ferocianura de H si de Na se precipita cu sulfatul de Gn"

$eactivii folositi sunt solutie de sulfat de Gn "+3, solutie de Na'E "* N si osolutie de fericianura de H "* N"&ehnica de lucru: In doua eprubete se pipeteaza cate 3 ml solutie de sulfat de Gn"+3, si * ml solutie de Na'E "* N"Intr0o eprubeta care contine proba deanalizat se adauga "* ml sange" ele doua eprubete se tin intr0o baie de apa la!erbere timp de 4 minutedupa care se !ltreaza" %prubetele se spala cu 4 mlapa !erbinte trecuta prin hartia de !ltru" In !ltrat se adauga * ml solutiefericianura de H "* N si * ml solutie de carbonat de Na "*g, se amesteca

prin agitare si se incalzeste la !erbere pe baia de apa timp de *3 minute" 6eraceste imediat" Daca fericianura s0a decolorat se mai adauga un ml solutiefericianura de H "* N si se mai incalzeste *3 minute" 6e raceste si se adaugaapoi ml sulfat de Gn ."3,* ml iodura de H ."3, si ml acid acetic 4,"Imediat se titreaza iodul eliberat cu o solutie de tiosulfat de Na "3 N folosindo microbiureta de ml" &itrarea se face in prezenta de 3 picaturi din solutia deamidon *, ca indicator pana la disparitia culorii albastre"


8/20

*" Determinarea glucozei din sangeM%&'DA &I&$IM%&$IA(tehnica Eaghedorn si Fensen)

(continuare)

alcularea rezultatelor :

A-and prin titrare volumul de tiosulfat de Na folosit se citeste din tabel mg de glucoza la * ml"

Daca se folosesc ml solutie de fericianura de H "* Nla titrareatunci se adauga 423mg la * ml" &otdeauna se vafolosi si o proba martor care ne ofera o masura a impuritatilorreducatoare din reactivi" Daca nu e1ista impuritatireducatoare titrarea blancului se ve face cu ml tiosulfat de

Na "3 N" valoarea martorului e1primata in mg glucoza8*ml se scade din valoarea probei"


9/20

*" Determinarea glucozei din sangeM%&'DA &I&$IM%&$IA(tehnica Eaghedorn si Fensen)(continuare)

&abelul *" orespondenta volum tiosulfat0 glucoza (mg8*ml)Na6'4 " "* " "4 "+ "3 "@ ". "2 "/

" 423 42 4./ 4.@ 4.4 4. 4@. 4@+ 4@* 432"* 433 43 43 4+2 4+3 4+4 4+* 442 44@ 444" 44* 4/ 4. 43 44 4* 4*2 4*@ 4*+ 4*"4 4* 42 4@ 4+ 4 4 /2 /@ /+ /"+ / 22 2@ 2+ 2 2 .2 .@ .+ ."3 . @2 @@ @+ @ @ 3/ 3. 33 34"@ 3* +/ +. +3 +4 +* + 42 4@ 4+". 4 4 2 @ + * */ *. *3"2 *4 ** / 2 @ + *// */."/ */3 */4 */* */ *22 *2@ *2+ *2 *2* *./*" *.. *.3 *.4 *. *. *@2 *@@ *@+ *@4 *@**"* *3/ *3. *33 *3+ *3 *3 *+2 *+@ *+3 *+4*" *+* *4/ *42 *4@ *4+ *4 *4* */ *. *3*"4 *+ * * **/ **. **3 **4 *** ** *2*"+ *@ *+ * ** // /. /3 /4 / /*"3 22 2@ 2+ 24 2* ./ .. .3 .+ .*"@ . @2 @@ @3 @4 @* 3/ 3. 3@ 3+

*". 3 3 +2 +. +3 +4 +* 4/ 42 4@*"2 4+ 4 4* / . 3 + */*"/ *. *3 *+ * * 2 . 3 4


10/20


M%&'DA C 7C'G'JIDAGKPrincipiul metodei:Metoda de lucru este una enzimatica, bazata pe glucozoxidaza, o enzima cecatalizeaz oxidarea glucozei.

Glucoz + O2 + H2OAcid gluconic + H2O2

Peroxidul de hidrogen format reacioneaz cu 4- amino-antipirina i fenolul,

!n prezena peroxidazei i formeaz chinonimina. "ntensitatea culoriiprodusului rezultat este proporional cu concentraia de glucoz din probade analizat

2H2O2 + fenol + 4-amino-antipirina chinonimina +4H2O

6e folosesc patru reactivi: un amestec tampon0fenol un amestecde enzime o solutie standard der glucoza si acid tricloracetic 3,"

#roba poate ! ser nehemolizat plasma sau sange total"6e folosesctrei eprobete: una cu supernatant proba una cu solutia standard siuna cu acid tricloracetic in !ecare adaugandu0se amesteculenzimatic" Dupa agitare si incubare la 4. grade elsius se citesce1tinctiile la 3nm (+/033 nm)"


11/20

*" Determinarea glucozei din sangeM%&'DA C 7C'G'JIDAGK (continuare)

Calcularea rezultatelor:

#licemie $mg%& ' $(p)(s& x *++ $sau&

#licemie $mmol)l ' $(p)(s& x ,

alori normale:

/nge total: 0+ - *+ mg%

er, plasm: 0 - ** mg%

Valori de referinta pentru glicemie (minmax)

Adulti: .0*3 mg8d

!opii:@0*mg8d


12/20


"imite si interferente:

#ot sa apara cresteri usoare ale glicemiei insarcina normala la marii fumatori obezi si

persoanele sedentare" %fortul !zic intenspoate genera hipoglicemie" resteri aleglicemei pot sa apara dupa anestezieinterventii chirurgicale si dupa administrarei"v" de glucoza"6caderi ale glucozei serice se pot inregistrala pacientii cu eritrocitoza (hematocritL33,) sau leucocitoza marcata (leucemii)"


13/20

" Determinarea valorilor hemoglobineiglicozilate

1emoglobina glicozilata este produsul glicozilarii non enzimatice arestului de alina de la capatul 2 terminal al lantului beta alhemoglobinei. 3oncentratia ei depinde exclusi de aloarea glucozeiintraeritrocitare si creste proportional cu intoleranta la glucoza. 5apacienii diabetici, creterea nielului sanguin al glucozei a determinacreterea glicozilrii hemoglobinei la nielul globulelor roii. 6eoarece

durata de ia a hematiilor este de *7+ de zile, determinarea 1b8 lapersoanele diabetice, reprezint un indice important al controluluiglicemic, chiar i dup 7-9 luni. 6ei hemoglobina glicozilat prezintmai multe fraciuni, uzual se folosete doar fraciunea 8*c $1b 8*c&. "nprezent, 1b 8*c este folosita exclusi pentru monitorizareatratamentului si nu pentru diagnostic. tudii de data recentademonstreaza in numar din ce in ce mai mare rolul 1b 8*c in

diagnostic, cre/nd premisele introducerii cat mai rapide si ca test dediagnostic.

6eterminarea se poate face cromatografic, colorimetric sau prin metoderadioimunologice.


14/20

" Determinarea valorilor hemoglobineiglicozilate (continuare)

igura *- Mecanismul glicrii hemoglobinei $dup Pasteur 3erba)


15/20


igura


16/20


M#$% &%'A# A *A1

Metoda de referinta standardizata (IFCC) este cromatografia lichida de

inalta presiune cuplata cu electroforeza capilara (HPLC-CE) sau cu

spectrometria de masa (HPLC-MS) !ceasta metoda a fost apro"ata in

#$$% si pu"licata in #$$#& ulterior sta"ilindu-se corespondenta intre aceastametoda si standardele e'istente anterior (SP)& conform relatiei*

NGSP(%)=(0.915xIFCC)+2.15 (mmol/mol)

!lte metode de dozare folosite sunt electroforeza& cromatografia de

afinitate& cromatografia cu schim" de ioni si di+erse tehnici deimunoanaliza


17/20


M%&'DA %%&$''$%G%I A#IA$% %

#rincipiul metodei:Electroforeza capilara ,n sistem SEI! determina e'clusi+ H"!%c (fractiunea deH" ce a legat non-enzimatic glucoza la resturile de +alina -terminale alelanturilor .) su" forma unui pea/ total separat de celelalte hemoglo"ine glicate H"!%a si H" !%" In electroforeza capilara ,n solutie li"era& hemoglo"inele se separa

,n capilare de silica& pe "aza mo"ilitatii electroforetice si a flu'ului electroosmotic&la +olta0 mare si ,n tampon alcalin Separarea H"!%c se face la 12$$ 3& frac4iunilefiind detectate si cuantificate prin densitometrare la 2%5 nm& ,n urm6toarea ordine*H" !#7 C& E& S& 8& F& !$& !% minor glicozilate& H" !%c 9n paralel cudensitometrarea se realizeaz6 :i un calcul automat al raportului

Hb A1c/ (Hb A1c + Hb A0)

cu e'primarea rezultatelor at;t ,n unit64i IFCC(mmol7 mol H")& c;t :i ,n unit6tiSP (


18/20

" Determinarea valorilor hemoglobineiglicozilate (continuare)M%&'DA %%&$''$%G%I IN 7%

6epararea electroforetica a Eb A*c se face in gel de agaroza la pE acid3"/ si depinde de a!nitatea diverselor hemoglobine pentru gel si desarcina lor" Dupa uscare electroforegramele sunt densitometrate faracolorare la + nm lungimea de unda la care absoarbe hemoglobina"

#ro!lul electroforetic normal evidentiaza de la anod la catodurmatoarele fractiuni:

0 Eb A fractiunea maoritara ce corespunde Eb A si Eb A Eb A*abc (fractiunile neglicolizate ale Eb A adulte)"

0 Eb A* fractiune minoritara ce corespunde fractiunii glicolizate a Eb A" #ro!lul electroforetic evidentiaza in cazul prezentei hemoglobinelor

anormale urmatoarele fractiuni de la anod la catod:0 Eb 0 migreaza lent si se gaseste in spatele liniei de start"

0 Eb 6 0 ramane in linia de start"0 Eb D % A 0 migreaza grupat"0 Eb si A 0 migreaza grupat"


19/20

" Determinarea valorilor hemoglobinei glicozilate(continuare)

M%&'DA IMCN'&C$BIDIM%&$IA

6ngele total se hemolizeazO folosind reactivul hemolizant"Eemolizatul proaspOt este supus imediat testOrii= eventualel poate ! pOstrat la 02o " 6ngele total de asemeneapoate ! pOstrat la 02o " Metoda se bazeaza pe masurareaturbiditatii probei de analizat"

>alorile hemoglobinei glicozilate pot ! convertite in unitati deglicemie conform tabelului de mai os:

a!elul"# (chialentul dintre hemoglo!ina glicozilat i glicemie.

7licemie medie(g8l) EbA*c (,)

* @*3 .*2 2

#entru !ecare crePtere de 4 este ocrePtere de *


20/20

" Determinarea valorilor hemoglobinei glicozilate(continuare)

;biectiele terapeutice i de follo< up pentru diabetici !n funcie dealoarea 1b8*c sunt :

- 1b8*c = >, % : obiecti optimal

- 1b8*c !ntre >, % i ? % la dou controale succesie : !nseamnunechilibru glicemic acceptabil , cu o posibil modificare

terapeutic dar dup ealuarea raportului aanta@e)[email protected] 1b8*c A ? % la dou controale succesie: !nseamn un echilibru

glicemic prost, se recomand o modificare terapeutic .

5imite si interferente:

- Pot aparea alori false scazute sau crescute, ca urmare amodificare a duratei de iata a hematiilor.

- arcina poate determina cresterea sau scaderea alorilor 1b 8*c

Date post:	17-Feb-2018
Category:	Documents
Upload:	danaila-adriana
View:	323 times
Download:	3 times

Metode Biochimice de Determinare a Glucozei Din Sange

Documents