5/19/2015

1

BiotehnologiiM k ii ti iMarkerii genetici

caracter –proprietate/insuşire/trăsătură/calitate observabilă dobandită sau moştenită

Caracterele şi markerii

ca răspuns la acţiunea mediului

înconjurător

determinată genetic

polimorfism – mai multe forme

Caracterele şi markerii

polimorfism – mai multe forme

Caracterele şi markerii

polimorfism – mai multe forme

Caracterele şi markerii

caracter –proprietate/insuşire/trăsătură/calitate observabilă dobandită sau moştenită

ca răspuns la d t i tă

Caracterele şi markerii

ca răspuns la acţiunea mediului

înconjurător

determinată genetic

marker genetic –morfologic (fenotipic)biochimicmolecular

polimorfism – mai multe forme

5/19/2015

2

Markerii geneticiTipuri

morfologici

biochimici hormoni, enzime (izoenzime/aloenzime), anticorpi

moleculari

Markerii (genetici) moleculari pot fi definiţi în mai multe feluri:

(a) a chromosomal landmark or allele that allows for the tracing of a specific region of DNA;

(b) a specific piece of DNA with a known position on the genome;

Markerii (genetici) moleculariDefiniţie

(c) a fragment of DNA that is associated with a certain location within the genome; molecular markers are used in molecular biology and biotechnology to identify a particular sequence of DNA in a pool of unknown DNA;

(d) a gene whose phenotypic expression is usually easily discerned, used to identify an individual, species or a cell that carries it, or as a probe to mark a nucleus, chromosomes, or locus;

(e) a short DNA sequence, such as a sequence surrounding a single base-pair change (single nucleotide polymorphism, SNP), or a long one, like minisatellites;

(f) are regions in the genome that are heritable as simple Mendelian traits, areeasy to document and can be used to quickly detect genetic variation.

Markerii (genetici) moleculariDefiniţie

Markerul molecular este reprezentat de un fragment (regiune) din molecula de ADN care permite deosebirea/identificarea• unui individ (separarea de alţi indivizi sau apartenenţa la un anumit

grup sau categorie)• unui caracter fenotipic (anatomic, morfologic)• unui caracter biochimic• unui caracter molecular (alt fragment/regiune de ADN).

Practic, se poate afirma că markerul molecular este asociat individului/caracterului.

Fragmentul de ADN poate avea • mărime (număr de nucleotide)• structură (secvenţă nucleotidică)• rol genetic (codificator sau ne-)• localizare la nivelul genomului (poziţie/locus)foarte variabile.

Poziţia markerului la nivelul genomului poate sau nu să fie cunoscută.

Metodele de studiu/analiză bazate pe markeri moleculari sunt de asemenea foarte variate.

Analiza diversităţii genetice şi înrudirii între sau în cadrul populaţiilor, speciilor sau indivizilor

analize/studii/discipline comparative

Markerii (genetici) moleculariAplicaţii

anatomie, morfologie, embriologie, psiohologie

+molecular

polimorfismul ADN-ului şi proteinelor aplicaţii în filogenie(-genetică), taxonomie, ecologie, genetică, ameliorare, medicină

• polimorfism – moderat, înalt

Markerii geneticiCaracteristici

• transmitere – codominantă • posibilitatea de discriminare precisă a alelelor

• detectare/observare – uşoară, ieftină, automatizare• creare/dezvoltare – uşoară, ieftină

• identificarea• deosebirea• discriminarea

• stabilitate• repetabilitate şi reproductibilitate• transferabilitate

Locus

Genă

Markerii genetici!

Alele (variante)

Genotip (combinaţia de alele)

Fenotip (caracter, combinaţia de...)

5/19/2015

3

Makerilor biochimici şi moleculari le sunt caracteristice două modele de transmitere:

(1) dominantă/recesivă

Markerii geneticiTransmitere

( ) /(2) codominantă.

În cazul în care structura genetică homozigotă poate fi deosebită de cea heterozigotă, markerul este codominant, iar acest tip este cel mai informativ.

+interacţiunea dintre gene şi mecanismele de formare a caracterlor

Markerii biochimici

alozime – enzime produse de alele (forme) diferite ale aceleiaşi gene-izoenzime – enzime produse de gene diferite dar care catalizează aceeaşi reacţie

în trecut, au reprezentat cea mai utilizată clasă de markeri (cost redus, simplitate şi expeditivitate dpdv. tehnic, uşor de dezvoltat), dar au fost surclasaţi de markerii moleculari, care sunt mai informativi (pot evidenţia un grad mai ridicat de polimorfism şi la nivelul mult mai multor loci) şi mai stabili (nu sunt influenţaţi de vrstă sau anatomie)-se bazează pe mobilitatea electroforetică diferită determinată de mici diferenţe în secvenţa de aminoacizi-variabilitatea/diversitatea evidenţiată astfel este cea de la nivelul funcţional al genelor-caracteristici: transmitere simplă, exprimare codominantă, penetranţă completă, lipsa interacţiunilor epistatice şi pleiotropice

Markerii biochimici Markerii biochimici,allozymes ≡ isozymes

Secvenţierea Markerii moleculari

Markerii moleculari au revoluţionat domeniul analizelor moleculare genetice, depăşind limitările markerilor biochimici.-În prezent, există un mare număr de astfel de sisteme ce permit evaluarea directă a informaţiei genetice şi la nivelul permit evaluarea directă a informaţiei genetice şi la nivelul întregului genom.-Influenţa factorilor de mediu şi stadiului ontogenetic este neglijabilă.-Există două mari grupuri de markeri moleculari:(1) bazaţi pe hibridarea moleculară (ADN-ADN) (ex. RFLP)(2) bazaţi pe reacţia PCR – amplificarea fragmentelor de ADN

(ex. RAPD, ISSR, SSR, SCAR, AFLP, SNP, CAPS)(3) secvenţierea.

5/19/2015

4

Markerii moleculari

Fiecare tip de markeri (moleculari şi genetici) prezintă avantaje şi dezavantaje, de aceea, utilitatea şi aplicabilitatea unui sistem de markeri nu au caracter universal.-Alegerea markerilor depinde, în principal, de sopul urmărit.-De ex.:(1) sistemul RFLP este destul de mult utilizat, dar necesită

ADN de foarte bună calitate şi caracterizare moleculară prealabilă

(2) markerii AFLP au un grad mare de reproductibilitate, dar prezintă dezavantaje tehnico-materiale

(3) sistemele RAPD şi ISSR sunt preferabile în cazul lipsei caracterizării moleculare şi a resurselor materiale

(4) markerii SCAR necesită o foarte bună caracterizare moleculară (i.e. secvenţiere)

(5) CAPS, SSR, SNP etc.

Markerii moleculari

Amprentare genetică/molecularăProfil geneticGenotip(iz)areTestare genetică

DNA profilingDNA profilingDNA fingerprintingDNA (geno)typingGenetic testing

Tipuri de markeri markeri moleculari – ex. #1

Tipuri de markeri markeri moleculari – ex. #2

Tipuri de markeri markeri moleculari – ex. #2

Tipuri de markeri markeri moleculari – ex. #3

5/19/2015

5

Tipuri de markeri markeri moleculari – ex. #3

Tipuri de markeri markeri moleculari

Tipuri de markeri markeri moleculari – ex. #3

S l ţi i t tă d k i (+ li it tă d k i)

Variabilitate genetică – genetica populatiilor (+ gen. evoluţionistă + filogen. moleculară etc.)-studiul frecvenţei genelor/alelelor şi a interacţiunilor dintre acestea sub influenţa principalelor procese evolutive: selecţia naturală, driftul genetic, mutaţia, fluxul genelor

Markerii geneticiAplicaţii

Selecţia asistată de markeri (+ ameliorarea asitată de markeri)-selecţia indirectă a formelor ce prezintă o caracteristică genetică dorită (şi implicit un fenotip dorit)

Variabilitatea genetică şi modele

de diversitate de diversitate genetică intra- şi interspecifică şi

intra- şi interpopulaţională

Variabilitatea genetică

Studiul variabilităţii genetice şi modelelor de diversitate genetică intra- şi interspecifică şi intra- şi inter populaţională ajută la dezvoltarea metodologiilor de

(1) ameliorare (selecţie)(2) domesticire(3) conservare

Pentru atingerea acestor obiective este necesară selectarea (şi utilizarea) unor markeri genetici (moleculari) corespunzători.

în funcţie de:numărul locilor studiaţigradul de polimorfism detectabilcosturi (resurse)

5/19/2015

6

Variabilitatea genetică

Variabilitatea genetică evaluabilă cu ajutorul markerilor este reprezentată de diferenţele de la nivelul moleculei de ADN, determinate de mutaţii – inserţii, deleţii, duplicări, inversii.

Mutaţiile pot determina modificări de natură funcţională, ce determină, la rândul lor, schimbări metabolice sau fenotipice, sau pot fi neutre.

Variantele mutante pot:(1) avea eficienţă metabolică sporită sau redusă (2) avea diferite niveluri sau tipare de expresie genică în

diferite stadii fizologice sau de dezvoltare(3) să îşi piardă complet funcţionalitatea(4) să capete funcţii noi.

Variabilitatea genetică

Provocarea constă în alegerea celor mai potriviţi markeri moleculari, pentru identificarea/evidenţierea variaţiei din cadrul populaţiilor.

Variabilitatea genetică Variabilitatea genetică

Variabilitatea genetică Variabilitatea genetică

5/19/2015

7

Variabilitatea genetică Variabilitatea genetică

Variabilitatea genetică

Selecţia asistată de k imarkeri

Selecţia asistată de markeri

Aplicaţiile potenţiale ale markerilor moleculari: selecţia asistată de markeri – selecţia indivizilor ce prezintă caracteristici dorite, pe baza analizei genotipice moleculare; se poate utiliza singură sau în combinaţie cu metode de selecţie clasice;ameliorarea asistată de markeri – orice aplicaţie a ameliorarea asistată de markeri orice aplicaţie a markerilor moleculari în cadrul programelor de ameliorare, în vederea eficientizării acestora.

Selecţia asistată de markeri poate fi:selecţia indirectă bazată pe markeri QTLselecţia directă bazată pe genele codificatoare a caracterelor de interes.

Selecţia asistată de markeri

QTL – quantitative trait locus – locus asociat unui caracter cantitaitv (!poligenic)

QTL l i tă i lă î d l ă i QTL-ul reprezintă o regiune cromozomală în cadrul căreia este situată o genăsunt situate mai multe gene

ce influenţează semnificativ (controlează) un caracter cantitativ. De obicei, regiunile QTL identificate includ mai multe gene asociate unui caracter cantitaiv, dar nu pe toate.

5/19/2015

8

Selecţia asistată de markeri

SELECŢIA INDIRECTA BAZATĂ PE MARKERI QTL-Toate formele de selecţie indirectă presupun selecţia unui caracter (i.e. markerul) corelat cu o variantă superioară a altui caracter (caracterul ţintă sau de interes).-Principiu: populaţii corespunzătoare (i.e. segregante) sunt utilizate pentru identificarea

i il (î lă i /li k ) di k i l l i (d bi i asocierilor (înlănţuirea/linkage) dintre markeri moleculari (de obicei necunoscuţi) şi QTL-uri; asocierea înseamnă că anumite alele ale locusului ce reprezintă markerul corespund unei frecvenţe ridicate a alelelor QTL favorabile; practic, corelaţia (asocierea) markerului şi caracterului de interes este determinată de linkarea markerului cu o regiune cromozomală pe care

este prezentă şi o genă ce influenţează semnificativ caracterul ţintă (i.e. QTL)sunt prezente mai multe gene care influenţează caracterul ţintă (i.e. QTL).

-De obicei, markerii QTL se pot utiliza cu succes doar în cadrul familiilor în care au fost identificaţi; în cadrul altor familii, s-ar putea ca înlănţuirea iniţială (între alele) să nu existe.-Selecţia asistată de markeri indirectă reprezintă o extindere a selecţiei indirecte clasice.

Selecţia asistată de markeri

SELECŢIA INDIRECTA BAZATĂ PE MARKERI QTL

Se încrucişează doi indivizi cu forme extreme ale fenotipului de interes. Aceştia sunt caracterizaţi dpdv. genetic (i.e. structura genetică pentru cei trei markeri este cunoscută).

Din generaţia F1, se încrucişează două forme cu fenoptip intermediar şi structură genetică heterozigotă.g

În generaţia F2 are loc segregarea, atât fenotipică, cât şi genotipică.

Fiecare descendent este genotipat pentru cei trei markeri.

Markerul B-b este codominant.

Cu ajotorul testelor statistice se identifică o asociere între clasele genotipice (markerul B-b) şi formele fenotipului de de interes: genotipul BB este asociat dimensiunii marigenotipul Bb este asociat dimensiunii intermediaregenotipul bb este asociat dimensiunii reduse.

Selecţia asistată de markeri

SELECŢIA DIRECTĂ BAZATĂ PE GENELE CODIFICATOARE A CARACTERELOR DE INTERES-Această formă de selecţie asitată de markeri presupune selecţia directă a alelelor individuale specifice unuia sau mai multor loci directă a alelelor individuale specifice unuia sau mai multor loci ce influenţează caracterul poligenic. Pentru aceasta, este necesară cunoaşterea, la nivel molecular, a uneia sau mai multor gene implicate în controlul caracterului de interes. Practic, markerii sunt reprezentaţi de polimorfisme (variante) ale genelor ce controlează direct caracterul poligenic.-Pentru a fi eficientă, selecţia moleculară directă trebuie aplicată mai multor (tuturor) loci ce controlează caracterul poligenic de interes. -Toate formele de selecţie asistată de markeri pot fi utilizate separat sau împreună cu metodele de selecţie clasică.

Selecţia asistată de markeri

AVANTAJE ŞI DEZAVANTAJE-Selecţia asistată de markei prezintă numeroase beneficii, fie utilizată împreună cu metodele clasice, fie singură:

(1) posibilitatea reducerii duratei ciclui de ameliorare;(2) reducerea costurilor legate de testarea populaţiilor de descendenţi;(3) creşterea intensităţii selecţiei;(3) creşterea intensităţii selecţiei;(4) creşterea eficienţei de selecţie a caracterelor cu heritabilitate redusă.

-Există şi câteva dificultăţi semnificative în utilizarea eficientă a selecţiei asistate de markeri, care se întâlnesc la orice tip de organisme (i.e. plante agricole şi horticole, animale, specii forestiere). Cel mai important aspect se referă la structura genetică a caracterului de interes. Dacă acesta se află într-adevar sub controlul a zeci/sute/mii de loci, fiecare cu având un mic efect fenotipic, atunci este imposibilă detecţia tuturor locilor, iar identificarea unor markeri asociaţi poate fi de asemenea imposibilă, sau foarte dificilă.Un alt factor ce limitează eficienţa selecţei bazate pe markeri QTL, este posibilitatea variabilităţii caracterului de interes în funcţie de factorii de mediu sau de genomul analizat.

Ameliorarea asistată de markeri

AMELIORAREA ASISTATĂ DE MARKERI

Deşi au fost obţinute realizări importante cu ajutorul metodelor clasice de ameliorare, selecţia asistată de markeri oferă potenţialul de sporire a eficienţei acestora.Ameliorarea asistată de markeri se referă deci la diferite aplicaţii ale markerilor moleculari în cadrul programelor de ameliorare de ameliorare. -Astfel, pe lângă procesul de selecţie, markerii moleculari pot fi utilizaţi şi în alte etape/faze ale acestor programe:

alegerea schemelor de hibridaretestarea (genetică a) descendenţei (genotipare)management şi controlul calităţiietc.

-Se doreşte:

sporirea valorii genetice, reducerea costurilor, scurtarea intervalul dintre generaţii şi eficientizarea controlului calităţii.

Selecţia asistată de markeri

Eucalyptus grandis

Eucalyptus urophylla

♀ E. grandis x E. urophylla ♂

F1 E. urograndis

distanţă de izolare

5/19/2015

9

Selecţia asistată de markeri

E. urograndis

vârstă 6 aniA – circumferinţa trunchiului

n1 – îndeplinesc criteriul An2 – aleşi la întâmplaren3 – nu îndeplinesc criteriul A

Markeri moleculari microsateliţiţ

distanţă de izolare

Selecţia asistată de markeri

Analiza ♀ E. grandisnu toţi descendenţi provin din clona utilizată în plantaţie

Analiza ♂ E. urophylla două dintre clonele utilizate ca polenizatori sunt identice -nu toţi descendenţi provin din clonele utilizate în plantaţie-n1 – cea mai mare parte dintre descendenţi 1 p ţprovin doar din trei clone-autopolenizare – lipseşte în n1; proporţie mică în n2; proporţie mare în n3

distanţă de izolare

validarea sistemuluiîmbunătăţirea managementului

Selecţia asistată de markeri