enzime teza

8/8/2019 enzime teza

1/52

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE IMEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCA

Domeniu: BIOTEHNOLOGII

Rezumatul Tezei de Doctorat

Studiul activitii unor enzime vegetale

(lipoxigenaze i lipaze) implicate n biotehnologia

i metabolismul lipidelor

Conductor tiinificProf.Dr. Carmen SOCACIU

DoctorandIng.Veronica Sanda CHEDEA

Cluj-Napoca2009


2/52

CUPRINS

CUPRINS..............................................................................................................................................2

INTRODUCERE: Scop i obiective.....................................................................................................3I. STUDII ALE ACTIVITII LIPOXIGENAZICE ..........................................................................8I.1. CINETICA DIVERSELOR LIPOXIGENAZE DIN BOABELE DE SOIA ESTEINFLUENAT DE pH, DISPONIBILTATEA SUBSTRATULUI I PROCEDURADE EXTRACIE..............................................................................................................................8I.2. CINETICA OXIDRII SN1-PALMITOIL, SN2-LINOLEOIL FOSFATIDILCOLINEI (PC) CA SUBSTRAT PENTRU LIPOXIGENAZA RECOMBINAT DINPORUMB (RM9-LOX) ..................................................................................................................11I.3. EVALUAREA COMPARATIV A ACTIVITII LIPOXIGENAZEI NDIFERITE CONDIII DE REACIE, UTILIZND PARAMETRII SI CINETICI .................14

I.3.1. Determinarea parametrilor cinetici KMi Vmax pentru LOX-1 standard avnd

ca substrat acidul linoleic n absena i prezena Tween 20 i a 13-HPOD namestecul de reacie ....................................................................................................................14I.3.2. Cinetica oxidrii acidului linoleic de ctre LOX-1 din soia ntr-un mediu dereacie saturat n oxigen ..............................................................................................................15I.3.3. Influena unor detergeni asupra oxidrii acidului linoleic i a 1-linolenoil-ras-glicerolului de ctre LOX-1 standard i RZM9-LOX.................................................................16I.3.4. Determinarea parametrilor cinetici (KM, Vmax) a LOX pure folosind ca substratacidul docosadienoic acid (acid brasic) (22:2)............................................................................19

II. STUDII PRIVIND INHIBIIA LIPOXIGENAZEI......................................................................21II.1. INHIBIIA LIPOXIGENAZEI DE CTRE QUERCETIN ...............................................21

II.1.1. Influena quercetinei pure asupra oxidrii linoleatului de sodiu de ctre

lipoxigenaza pur din boabele de soia LOX-1............................................................................21II.1.2. Interaciunea intermolecular ntre lipoxigenazi quercetin este influenatde pH i timpul de incubare ........................................................................................................26

II.2. EFECTUL INHIBITOR AL IZOFLAVONELOR DIN SOIA ASUPRAACTIVITII LIPOXIGENAZEI DIN BOABELE DE SOIA.....................................................28II.3. ACTIVITATEA LIPOXIGENAZEI N PREZENA CATECHINEI,EPICATECHINEI I A UNOR PROCIANIDINE N MEDIU BIOTIC I ABIOTIC.................32

II.3.1. Compoziia n polifenoli i stabilitatea extractului apos din smburi destruguri din soiul Merlot Reca...................................................................................................32II.3.2.Compoziia n polifenoli a extractului enzimatic LE ........................................................38II.3.3. Interaciunea dintre lipoxigenaza puri din extract i catechina puri dintr-

un extract polifenolic ca model de studiu al modulrii echilibruluioxidant/antioxidant n condiii abiotice i biotice.......................................................................39II.4. EVALUAREA UNOR CAROTENOIDE CA INHIBITORI DELIPOXIGENAZ43

CONCLUZII GENERALE.................................................................................................................49


3/52

INTRODUCERE: Scop i obiective

Lipazele i lipoxigenazele sunt enzime cheie implicate n metabolismul

lipidic att la nivelul celulei vegetale ct i al celei animale. Date extinse dinliteratura de specialitate se refer la implicaiile acestor enzime n bolile umane i

mult mai puin la implicaiile lor n fiziologia i patologia plantelor. Tehnologia i

biotehnologia alimentar au profitat de cunotintele deja acumulate despre lipaze

i lipoxigenaze, n special pentru gsirea unor soluii n vederea modulrii sau

inhibrii activitii acestora, evitndu-se distrugerea (prin hidroliz i oxidare) a

matricelor lipidice i formarea de mirosuri neplcute.

Lipoxigenazele, care se gsesc att n regnul vegetal ct i cel animal, sunt

o familie de proteine monomerice dioxigenaze care conin ionul de fier neheminic

ca i cofactor, nu conin sulf i catalizeaz oxidarea acizilor grai polinesaturai

cum ar fi, acidul linoleic, linolenic i arahidonic, acizi ce conin n molecula lor cel

puin un fragment structural 1Z, 4Z-pentadien. n urma reaciei lipoxigenazei se

formeaz hidroperoxizi folosind trecerea de la ionul Fe+2 la Fe+3 i oxigenul

molecular, prin transfer de electroni ntre radicali intermediari. Enzima poate s

catalizeze de asemenea i cooxidarea carotenoidelor, ducnd astfel la pierdera

culorii naturale i a anumitor nutrieni eseniali. LOX sunt implicate in generarea

aromelor n numeroase produse din plante, n decolorarea pigmenilor i n

poteniala compromitere a statusului antioxidant. De exemplu ele sunt

responsabile pentru mirosurile nedorite produse n timpul procesrii i depozitrii

produselor proteice derivate din seminele de leguminoase i dezvoltarea gustului


4/52

de nvechit a berii n timpul pstrrii acesteia. n cazul pastelor finoase LOX sunt

implicate n pierderea culorii, demonstrati prin corelaia pozitiv ntre scderea

coninutului n -caroten dup pastificare i activitatea lipoxigenazelor. n plus,

hidroperoxidarea i reaciile de decolorare a LOX sunt corelate, demonstrnd c

decolorarea poate fi datorat unei aciuni co-oxidative a LOX.

S-a demonstrat n literatura de specialitate c lipazele dein un loc secundar

n formarea de molecule cu potenial toxic i au mecanisme mai puin interesante

legate de stresul oxidativ, i prin urmare experienele ce fac obiectul acestei teze

au fost dezvoltate n direcia inhibrii lipoxigenazelor vegetale. Scopul prezentei

teze este cel de a contribui la dezvoltarea cunotinelor legate de activitatea

lipoxigenazelor de origine vegetal (utiliznd boabele de soia ca matrice i

surs de enzime i lipide), de implicarea acestor enzime n producerea de

molecule toxice, oxidate i mirosuri neplcute precum i de mecanismele

inhibrii acestora de ctre compui antioxidani naturali.

Cum deja a fost propus n urma cercetrilor anterioare, efectul inhibitor al

antioxidanilor asupra lipoxigenazei depinde de starea fizico-chimic a substratuluii de tipul de lipoxigenaz, i se poate schimba complet n funcie de condiii.

Stresul oxidativ, consecina dezechilibrului dintre prooxidani i

antioxidani la nivelul organismului, ducnd la formarea de hidroperoxizi toxici, a

ctigat rapid atenia cuvenit ca un fenomen cheie n bolile cronice: boli

cardiovasculare, hipertensiune, diabet i cancer.

Complexe ale radicalilor peroxil se formeaz n tipul ciclului catalitic al

LOX, complexe ce pot servi ca surs de radicali liberi. Din aceast direcielipoxigenazele pot fi vzute ca un inductor de stres oxidativ, stres oxidativ ce

favorizeaz la rndul lui un ntreg set de procese co-oxidative i peroxidri

lipidice, mediate sau nu enzimatic de LOX. Avnd n vedere efectele distructive la

nivelul organismului ale dezechilibrului cauzat de oxidarea acizilor grai, exist un

interes considerabil n gsirea i caracterizarea de noi inhibitori ai LOX.


5/52

Efectele distructive ale poceselor oxidative pot fi reduse printr-o diet

bogat n flavonoide i carotenoide, compui care se gsesc n fructe, legume i

anumite buturi. Antioxidani ca flavonoidele i carotenoidele care acioneaza

mpotriva radicalilor liberi pot aciona i ca inhibitori de LOX.

Principalele obiective experimentale ale tezei sunt:

1. Studiul activitii lipoxigenazei, pure sau n extract n diferite condiii de

reacie. Lipoxigenazele folosite au fost: lipoxigenaza pur, standard din

boabele de soia, lipoxigenazele din extractul nepurificat din boabele de soia

i lipoxigenaza recombinat din porumb. A fost studiat modul n care

cineticile diferitelor lipoxigenaze din soia sunt influentate de pH,

disponibilitatea substratului i diferitele proceduri de extracie folosite.

2. Studiul activitaii lipoxigenazei prin inhibiia specific de ctre dou clase

de inhibitori naturali : polifenolii (quercetina- inhibitor generic din clasa

flavonoidelor, izoflavone, catechina i ali flavan-3-oli, procianidine) i

carotenoide. Aceste studii au avut ca scop explicarea activitii enzimatice

n relaie cu interaciunea molecular direct sau indirect a lipoxigenazei

cu moleculele inhibitoare.

Structura tezei. Prima parte a tezei reprezint studiul de literatur iar

partea a doua conine procedurile experimentale: materiale i metode, rezultate i

discuii, concluzii.

Prima parte include dou capitole (I-II):

Capitolul I - Lipoxigenaze: caracterizare general i mecanismele

biochimice specifice

Capitolul II - Lipaze: caracterizare general


6/52

Partea a Doua (Contribuii originale) este organizat n dou capitole:

Capitolul III Studii ale activitii lipoxigenazice. n prima parte a

acestui capitol s-a studiat comportamentul cinetic a diferitelor lipoxigenaze

extrase din boabele de soia i s-a artat c acesta este influenat de pH,

disponibilitatea substratului i procedurile de extracie. n partea a doua

sunt prezentate rezultatele legate de cinetica oxidrii sn1-palmitoil, sn2-

linoleoil fosfatidil colinei ca substrat al 9-lipoxygenazei din porumb

recombinate. n partea a treia a acestui capitol o evaluare comparativ a

activitii lipoxigenazei n diferite condiii de reacie este prezentat: mediu

de reacie saturat cu oxigen, prezena clorurii de sodiu sau a diverilor

detergeni n mediul de reacie.

Capitolul IV Studii privind inhibiia lipoxigenazei. n prima parte sunt

prezentate importana i mecanismele de inhibiie a lipoxigenazei.

Capitolul continu cu partea a doua, tratnd influena quercetinei pure

asupra oxidrii linoleatului de sodiu de ctre lipoxigenaza pur din boabele

de soia. Partea a treia este dedicat interaciunilor intermoleculare dintrelipoxigenazi quercetini cum acestea sunt influenate de pH i timpul

de incubare. n partea a patra este prezentat efectul inhibitor al

izoflavonelor din soia asupra lipoxigenazelor din soia. Activitatea

lipoxigenazei n prezena catechinei, epicatechinei i a procianidinelor n

mediu abiotic i biotic este prezentat n partea a cincea. n partea a asea

unele carotenoide sunt evaluate ca inhibitori de lipoxigenaz.

Experimentele ce alctuiesc aceast tez au fost efectuate n laboratoarele

Departamentului de Chimie i Biochimie a Universitii de tiine Agricole i

Medicin Veterinar Cluj-Napoca sub coordonarea Prof. Carmen Socaciu, n

cadrul Departamentului de Oxilipine, Institutul de Biochimie i Biofizic din

Kazan, filial a Academiei de tiine Ruse i n Departamentul de Biochimie a


7/52

Universitaii din Kazan, Federaia Rus sub coordonarea Prof. Alexander

Grechkin i n Departamentul de Chimie Organic, Facultatea de Inginerie n

Biotiine, Universitatea din Ghent, Belgium, sub coordonarea Prof. Roland

Verhe. Activiatea desfurat n cadrul acestei teze a fost n parte finanat de un

proiect CNCSIS, PNII, proiectul TD 392/2007.


8/52

I. STUDII ALE ACTIVITII LIPOXIGENAZICE

I.1. CINETICA DIVERSELOR LIPOXIGENAZE DIN BOABELE DE SOIAESTE INFLUENAT DE pH, DISPONIBILTATEA SUBSTRATULUI I

PROCEDURA DE EXTRACIE

Scop i obiective

Enzimele LOX s (MW 95 kDa) sunt active n diferite condiii, fiecare

enzim din familia LOX avnd un pH optim specific, acest fapt explicnd

diferenele de comportament kinetic.

Scopul experimentelor efectuate n cadrul acestui capitol a fost evaluarea

comportamentului cinetic a trei lipoxigenaze din extractul primar din boabele de

soia. Aceste enzime catalizeaz formarea mirosurilor neplcute n timpul

procesrii boabelor de soia n vederea obinerii de produse alimentare. Studiul de

fa se dorete a fi o etap premergatoare celei reprezentate de inhibiia

lipoxigenazelor de ctre compui naturali cu potenial antioxidant.

Experimentele au avut urmtoarele obiective:

1. Determinarea parametrilor cinetici a LOX-1 din soia pur, la diferite pH-uri.

2. Determinarea comparativ a parametrilor cinetici a diverselor extracte din

boabele de soia, extracte ce conin enzime LOX, n funcie de procedura de

extracie i testare.

3. Evaluarea parametrilor care influeneaz activitatea LOX: pH-ul i raportul

enzim substrat, ca indicatori ai afinitii enzimatice n diferite medii de reacie.

Rezultate

Curbele cinetice la diferite pHm (6.1, 7.1 i 9) prezint activitatea specific

a LOX-1, LOX-2 i LOX-3.

Am confirmat date din literatura de specialitate legate de dependena

enzimelor LOX de pHm (Siedow, 1991; Loiseau i col, 2001; Kosary i col,

2004). Influena pH-ului asupra activitii SLOX (LOX-1 din boabele de soia),


9/52

poate fi explicat prin faptul c la diferite pHm situsul catalitic al enzimelor de

LOX are conformaii i stri oxidative ale ionului de fier diferite. (Gardner, 1989).

Considernd rezultatele noastre obinute prin testul T0 (enzima pur)putem

afirma c cele mai bune condiii de evaluare a activitii LOX este s se aleag un

pHdil i un pHm de 9.0 (n tampon borat 0.2M) la E/LS = 0.09510 -3. Cnd

raportul E/LS a crescut de 2 ori, activitatea LOX-1 a sczut cu aproximativ 40%,

E/LS optim fiind observat ntre 0.05 i 0.110-3 mg protein/nmol substrat. Pentru

studiile de inhibare a LOX asemenea observaii pot fi utile, indicnd cel mai

potrivit pH i raport E/LS pentru msurtori cinetice.

Testele T1-T3 pentru extractul primar (E1) au evaluat activitatea LOX-1 la

pH=9 (T1), activitatea LOX-2 la pHm=6.1 (T2) i LOX-3 la pH=7.1 (T3).

Fig.I.1. Curbele cinetice ale activitii lipoxigenazei LOX-1, din diferite extractedin fina de soia (E1-E4), msurate la pHm =9.0. Extractele au fost preparate ladiverse pHdil, folosindu-se diferite rapoarte de concentraie enzim-substrat,exprimate ca mg protein10-3 /nmol substrate. Creterea n absorban (Abs) (0-300 sec) la 234 nm indic n fiecare caz formarea de 13-HPOD. A. pHdil= 6.1 iE1/LS = 1.44 ; B. pHdil= 6.1 i E1/LS = 11.56; C. pHdil= 6.1 i E2/LS = 6.12; D.pHdil= 6.8 i E3/LS = 2.52; E. pHdil= 7.1 i E4/LS = 2.64.


10/52

Fig.I.2. Curbele cinetice ale LOX-2 din extractele bogate n lipoxigenaz (E1-E4),msurate la pHm =6.1. Extractele au fost obinute la diferite pHdil folosindu-sediferite rapoarte (E/LS), exprimate ca mg protein10-3/nmol substrate. Creterea nabsorbie (0-300 sec) la 234 nm indic, n fiecare caz, formarea unui amestec de13- i 9-HPOD. A. pHdil= 6.1 i E1/LS = 2.88; B. pHdil= 6.1 i E1/LS = 2.32; C.pHdil= 6.1 i E1/LS = 1.44; D. pHdil= 6.1 i E2/LS = 1.52; E. pHdil= 6.8 i E3/LS

= 1.24; pHdil=7.1 i E4/LS = 1.64.

Fig.I.3. Curbele cinetice suprapuse ale activitii LOX-3, din extractele bogate nlipoxigenaz (E1-E4), msurate la pHm =7.1. Extractele au fost obinute la diferitepHdil folosindu-se diferite rapoarte (E/LS), exprimate ca mg protein10-3/nmolsubstrat. Creterea n absorbie (0-300 sec) la 280 nm indic, n fiecare caz,

0.6

1.5

0.8

1

1.2

1.4

0 300100 200

Abs

Time [sec]

ab

c


11/52

formarea de cetodiene; a-E1, pHdil=6.1 i E1/LS = 0.36; b-E2, pHdil=6.1 i E2/LS= 0.38, i E3 pHdil=6.8, E3/LS = 0.155; c-E4,pHdil=7.1 i E4/LS = 0.205.

n cazul testului T1, la pHm=9,extractele E2i E3,dar nu E1 au avut o faz

de lag corespunztoare unei viteze de reacie sczute. A fost demonstrate c faza

de lag crete la concentraii mari ale acidului linoleic i descrete cu creterea

concentraie de produs de reacie, respectiv HPOD (Wang et al, 1993). Faze de lag

au fost de asemenea observate pentru pHm=6.1 pentru toate extractele E1-E4.

T1 indic o mai bun extracie a LOX-1 n E1 i E3, T2 indic activitatea

sczut a LOX-2 n extractele din boabele de soia, n timp ce T3 indic faptul c

extractele degresate E3i E4 au avut o activitate mai bun a LOX-3 dect extractul

primar sau E2. Rezultatele msurtorilor efectuate prin testul T3 pentru cinetica

LOX-3 sunt mai dificil de interpretat deoarece produsul de hidroperoxidare este

parial transformat n cetodiene care absorb la 280nm (Axelrod et al, 1981).

I.2. CINETICA OXIDRII SN1-PALMITOIL, SN2-LINOLEOIL FOSFATIDILCOLINEI (PC) CA SUBSTRAT PENTRU LIPOXIGENAZA RECOMBINAT

DIN PORUMB (RM9-LOX)

Scop i obiective

Scopul acestui experiment (efectuat la Universitatea din Kazan, Federaia

Rus, Departmentul de Biochimie i la Institutul de Biochimie i Biofizic din

Kazan, filial a Academiei de tiine Ruse, Departamentul de Oxilipine sub

coordonarea Prof. Alexander Grechkin) a fost elucidarea supoziiei c 9-LOX

catalizeaz dioxigenarea lipidelor complexe cum ar fi PC n poziia 9 a lanului de

carbon. Am luat n studiu 9-lipoxigenaza din porumb recombinat (RM9-LOX),

care adaug oxigen la carbonul 9 a acidului linoleic i prezint activitate de

hidroperoxidare la pH cuprins ntre 6.5 i 7.5-activitatea maxim a fost observat

la pH 7.0 (Wilson et al, 2001).


12/52

Rezultate

Fig.I.4. prezint cromatograma produilor de oxidare a 1- palmitoil, 2-linoleoil fosfatidil colina catalizat de 9-LOX din porumb recombinat. Au fost

identificate 6 semnale, patru dintre ele fiind identificate pe baza cromatogramelor

standard din baza de date lipidice (http://lipidbank.jp/image/DFA0014SP0001.gif)

pus la dispoziie de dr. T. Kasama. Semnalele 5 i 6 au fost identificate ca fiind

trimetilsilil eterii a 9-HPOD (semnalul 5) i a13-HPOD (semnalul 6).

Fig.I.4. Gaz cromatograma produilor de reacie n cazul oxidrii 1- palmitoil, 2-

linoleoil fosfatidil colina n prezena lipoxigenazei recombinate din porumb, 9-

LOX. 6 semnale au fost identificate ca fiind: 1-acidul miristic, 2- acidul palmitic,

3- acidul heptadecenoic (margaric, daturic), 4-acidul stearic, 5-, 9-OTMS-stearat,

6-, 13-OTMS-stearat.

Identificarea semnalelor este prezentat n Tabelul I.1.


13/52

Tabel I.1.Identificarea celor mai importani produi de reacie obtinui prin oxidarea 1-

palmitoil, 2-linoleoil phosphatidil colinei de ctre 9-LOX din porumb nconcordan cu timpii de retenie i raporturile m/z

PeakNo.

Semnalnr.

Retentiontime/min

Timpul deretenie/min

Identification

Identificarea

m/z ratio forthe base

peaks [M-H]-raportul m/z

pentrusemnalele debaz [M-H]-

Chemical structure

Structura chimic

1. 8.74 Acid Miristic

C14:0

211, 242

2. 11.05 Acid PalmiticC16:0

239, 270

3. 12.11 AcidMargaricC17:0

241, 284

4. 13.28 Acid StearicC16:0

255, 298

5. 16.02 9-HPOD* 229, 259

6. 16.30 13-HPOD* 173, 315

* Compuii identificai au fost prezeni n cromatogram ca trimetilsilil eteri.


14/52

I.3. EVALUAREA COMPARATIV A ACTIVITII LIPOXIGENAZEI NDIFERITE CONDIII DE REACIE, UTILIZND PARAMETRII SI

CINETICI

I.3.1. Determinarea parametrilor cinetici KMi Vmax pentru LOX-1 standard

avnd ca substrat acidul linoleic n absena i prezena Tween 20 i a 13-HPOD n amestecul de reacie

Scop i obiective

Folosind LOX-1 standard i acidul linoleic ca substrat am determinatparametrii cinetici KM i Vmax, i curba Michaelis-Menten ca date de referin

pentru studii viitoare n condiiile noastre experimentale. Pornind de la aceast

ideie am evaluat i influena Tween 20 i a 13-HPOD asupra oxidrii acidului

linoleic de ctre LOX-1 std.

Rezultate

n cazul activitii LOX n absena Tween 20 i a 13-HPOD n amestecul de

reacie (considerate condiii standard de reacie), curba Michaelis-Menten arat c

la concentraii mai mari de 100 M avem o inhibiie generat de substrat pentru

concentraia de enzim luat n studiu de aceast dat. Pentru a obine graficul

Lineweaver-Burke, 1/[S] i 1/v au fost calculate pentru concentraii diferite de

substrat (5-100M).

Valorile KMi Vmax calculate au fost:

KM=20 M, vmax=40 M* s-1*mg.enz.-1n cazul activitii enzimatice n absena

Tween 20 i a 13-HPOD n amestecul de reacie

i

KM=25 M, vmax=48 M* s-1*mg.enz.-1 n cazul activitii enzimatice n prezena

Tween 20 i a 13-HPOD n amestecul de reacie


15/52

I.3.2. Cinetica oxidrii acidului linoleic de ctre LOX-1 din soia ntr-un mediu

de reacie saturat n oxigen

Scop i obiective

Acest experiment a avut ca obiect de studiu oxidarea acidului linoleic de

ctre LOX-1 cnd mediul de reacie a fost saturat cu oxigen.

Rezultate

Tabelul I.2 prezint viteza oxidrii acidului linoleic de ctre LOX-1 n

absena i n prezena oxigenului adugat n amestecul de reacie.

Tabel I.2.Vitezele de reacie pentru oxidarea acidului linoleic n prezena sau absena O2adugat n amestecul de reacie.

Substr. conc.

(M)Conc.substr.

Reaction velocity for the oxidationof linoleic acid in oxygen

saturated mediumViteza de reacie pentru oxidarea acidului linoleic

n mediu saturat n oxigen

Reaction velocity for the oxidationof linoleic acid in medium

unsaturated in O2Viteza de reacie pentru oxidarea

acidului linoleic n mediu nesaturat noxigen

5 0,0005 0,0005

6,25 0,0005 0,0005

10 0,0004 0,0003

20 0,0019 0,0027

Oxigenul influeneaz viteza de reacie proporional cu creterea concentraiei desubstrat.


16/52

Influena s rii (NaCl) asupra comportamentului cinetic al oxid rii acidului

linoleic de ctre LOX-1

n acord cu experimente cinetice efectuate de alte grupuri de cercetare

(Coffa i col, 2005), a fost de asemenea evaluat oxidarea acidului linoleic de

ctre LOX-1 n prezena srii n amestecul de reacie.

Absorbanele nregistrate pentru vitezele maxime de reacie au fost 0,015

AU n absena srii i 0,015 AU n prezena acesteia.

I.3.3. Influena unor detergeni asupra oxidrii acidului linoleic i a 1-linolenoil-ras-glicerol de ctre LOX-1 standard i RZM9-LOX

Scop i obiective

Lipoxigenazele catalizeaz oxidarea acidului linoleic n mediu apos doar

dac substratul este disponibil pentru enzim n special ca emulsie. Starea instabil

de agregare a emulsiilor acizilor grai polinesaturai n faza apoas au dus la

concluzia c ar trebui utilizai detergeni pentru a stabiliza emulsiile substratului.Datele de literatur relev faptul c cele mai multe rezultate au fost obinute pentru

acil gliceroli i fosfolipide care sunt substrat pentru lipaze i fosfolipaze ns puin

s-a lucrat n acest sens pe lipoxigenaz.

Detergenii utilizai n urmatoarele experimente sunt: Tween 20, SDS,

zwittergent i deoxicolat i influena acestora asupra oxidrii 1-Linolenoil-ras-

glicerolului (18:3-G) de ctre LOX-1 standard i RZM9-LOX a fost evaluat.

Rezultate

ntr-un experiment precedent (Capitolul III.3.1.) s-a artat c Tween 20 a

crescut viteza de reactie a acidului linoleic de ctre LOX-1. Acest set de

experimente au urmrit influena anumitor detergeni asupra oxidrii lipidului


17/52

complex 1-Linolenoil-ras-glicerol de ctre RMZ-9LOX. Oxidarea acidului linoleic

de ctre LOX-1 i RMZ-9LOX au fost luate ca situaii control.

Adugnd SDS n amestecul iniial de reacie viteza acesteia nu a fost

modificat ns este nevoie de un timp mai ndelungat pentru a ob ine maximul de

produi de reacie. 13-HPOD adugat amestecului de reacie a dus la creterea

vitezei de reacie. Dublnd cantitatea de Tween 20 n prezena SDS-ului i a 13-

HPOD, 18:3-G a fost oxidat mai rapid rezultnd o mai mare cantitate de produs de

reacie. Acest fapt sugereaz c raportul dintre cei doi detergeni influeneaz de

asemenea disponibilitatea substratului pentru LOX-1.O foarte slab oxidare s-a

nregistrat n cazul RZM-9LOX avnd ca substrat 18:3-G fr a aduga SDS n

amestecul de reacie. n prezena SDS, enzima recombinat a fost inactivat , n

aceleai condiii n care 18:3-G a fost oxidat de ctre LOX-1 cu viteza maxim.

Este posibil c SDS afecteaz enzima recombinat deci detergentul ar

trebui nlocuit cu un altul, pentru a avea o mai bun oxidare a 18:3-G de

ctre RZM-9LOX

Adugnd SDS, 13-HPOD i dublnd volumul iniial de Tween 20, s-a

obinut o rat de oxidare a 18:3-G de ctre LOX-1 n comparaie cu situaia

cnd aceti compui nu au fost folosii.

Raportul Tween 20:SDS influeneaz disponibilitatea substratului n

vederea oxidrii lui de ctre LOX-1.

Din experimentul anterior a rezultat faptul c lipoxigenaza recombinat a

fost inactivat de SDS, i n consecin acesta a fost nlocuit cu zwittergent

(detergent zwitterionic) (3-dodecildimetilamoniu-1-propansulfonate) i deoxicolat.i de aceast dat cea mai nalt rat de oxidare s-a nregistrat pentru

reacia acidului linoleic n prezena LOX-1 i a Tween 20. Adugnd SDS n

amestecul iniial de reacie (soluie tampon+substr.+ enz.+Tween 20) viteza

reaciei a sczut la aproape jumtate (de la 0.00805, la 0.00383). Dac n

amestecul iniial de reacie am adugat 5 l ZW viteza a sczut de 8 ori iar prin

adugarea a 40 l DOX. La 1/5 din volumul iniial de DOX viteza de reacie a


18/52

nregistrat o cretere remarcabil, de la 0.00080 la 0.0062. Aceeai situaie s-a

nregistrat n cazul folosirii a 1/5 din volumul iniial de ZW cnd creterea a fost

de la 0.00111 la 0.00668-de 6 ori mai mare. Un raport adecvat Tween 20:ZW i

Tween 20:DOX duce la creterea vitezei de oxidare a acidului linoleic de ctre

LOX-1.

Dac SDS nu a influenat oxidarea acidului linoleic de ctre LOX-1 prin

creterea vitezei de reacie, pentru 18:3-G, cea mai bun rat de formare a

hidroperoxizilor s-a realizat cnd 5 l SDS au fost adugai amestecului de reacie

(0.00748 cnd 18:3-G a fost oxidat de LOX-1 n prezena SDS 0.00383 n

prezena ZW). 1/5 din volumul iniial de ZW a influenat diferit oxidarea celor

dou substraturi avnd o mai bun aciune n cazul acidului linoleic, viteza de

reacie crescnd de dou ori n comparaie cu 1-linolenoil-ras-glicerolul (0.00668

i 0.00368).

O proporie de 1/5 din volumul iniial de DOX a avut aceeai influen n

cazul 18:3-G i a 18:2 oxidai de ctre LOX-1 (0.00625 i respectiv 0.00662).

mpreun cu sonicarea SDS a avut de asemenea o influen pozitiv asupra vitezeide oxidare (0.00748) a 1-Linolenoil-ras-gliceroluluicea mai bun pentru acest

substrat oxidat de LOX-1-n comparaie cu cea a acidului linoleic.

Zwittergent a avut o influen pozitiv asupra oxidrii acidului linoleic de

ctre LOX-1 la 1/5 din volumul iniial (1 l 0.1%)

SDS are o influen mult mai bun asupra oxidrii 1-Linolenoil-ras-

glicerolului dect asupra celei a acidului linoleic implicnd LOX-1

DOX a avut aceeai influen asupra oxidrii 1-Linolenoil-ras-gliceroluluii a acidului linoleic de ctre LOX-1 la 1/5 din volumul iniial (5 l DOX

10mM)

n cazul folosirii 1-Linolenoil-ras-glicerolului ca substrat i RM9-LOX ca

enzima ce-i catalizeaz oxidarea, n prezena DOX viteza de reacie a fost

0.00227, aproape de 3 ori mai mic dect atunci cnd oxidarea a fost catalizat de

Tween 20. Adugnd mai mult Tween 20dublndu-i volumul-viteza de reacie nu


19/52

a suferit nici o modificare. n ceea ce privete volumul de DOX adugat, s-a

observat c dublnd volumul iniial sau sczndu-l la jumtate nu a dus la

creterea vitezei de reacie ci la scderea acesteia. Adugnd 13-HPOD la volum

dublu de DOX, a meninut viteza de reacie la un nivel inferior celui iniial.

Interesant a fost observaia ca scznd concentraia substratului la jumtate, fr

13-HPOD i la jumtate volum de DOX viteza de reacie a crescut fiind

nregistrat cea mai mare valoare a acesteia pentru acest experiment. n aceleai

condiii dar scznd concentraia substratului la 1/5 din cea iniial a fost

nregistrat o bun vitez de reacie, aproape 75% din cea prezentat mai sus, cnd

din cantitatea iniial de 18:3-G a fost utilizat. Cu 4l DOX 1.750l 1-

Linolenoil-ras-glicerol au fost oxidai de ctre RMZ-9LOX cu o vitez de reacie

de 0.00294 iar n prezena a 4l DOX, 0.5 l de 1-Linolenoil-ras-glicerol au fost

oxidai cu o vitez de 0.00193, aceasta demonstrnd faptul c viteza oxidrii

depinde de raportul 1-Linolenoil-ras-glicerol:DOX .

Viteza de oxidare a 1-Linolenoil-ras-glicerolului de ctre RMZ-9LOX este

influenat de raportul substrat:DOX

I.3.4. Determinarea parametrilor cinetici (KM, Vmax) a LOX pure folosind casubstrat acidul docosadienoic acid (acid brasic) (22:2)

Scop i obiective

Modelarea molecular (Gillmor i col, 1997; Browner i col, 1998) a

sugerat c volumul situsului catalitic poate fi important pentru specificitatea

poziional a reaciei lipoxigenazei, respectiv formarea hidroperoxizilor. Aceast

ipotez legat de volumul situsului catalitic a fost la nceput contrazis de teoria

bazat pe orientarea substratului care sugereaz posibilitatea alinierii substratului

n interiorul situsului cu gruparea carboxil nti i nu cu cea metil cum ar fi n mod

obinuit (Gardner, 1989; Prigge i col, 1998). Date experimentale recente

sugereaz c ambele teorii ar fi corecte (Meruvu i col, 2005). Experimentul de


20/52

fa a evaluat posibilitatea oxidrii substratului prin alinierea n situsul catalitic cu

gruparea carboxil la nceput.

Rezultate

Reprezentnd [A]/t unde [A] este absorbia iar t reprezint timpul de reacie

la care absorbia a fost determinat, n funcie de concentraia de substrat [S], s-a

observat c, la concentraii ale substratului mai mari de 200M, enzima a fost

inhibat de ctre substrat.

Din graficul Linewaver-Burke parametrii cinetici au fost determinai cafiind KM=27.8 M iar vmax=12.8 M* s

-1*mg.enz.-1


21/52

II. STUDII PRIVIND INHIBIIA LIPOXIGENAZEI

II.1. INHIBIIA LIPOXIGENAZEI DE CTRE QUERCETIN

II.1.1. Influena quercetinei pure asupra oxidrii linoleatului de sodiu de

ctre lipoxigenaza pur din boabele de soia LOX-1

Scop i obiective

Pentru a studia modul n care quercetina inhib reacia de oxidare a acidului

linoleic de ctre LOX-1, trei protocoale experimentale au fost folosite. Diferenele

ntre acestea este dat de ordinea n care reactanii (enzima, substratul, inhibitorul)

au fost amestecai, i de timpul de incubare a acestora. Parametrii cinetici au fostde asemenea determinai.

Fig.II.5. Reprezentarea schematic a protocoalelor experimentale (1,2,3).

Rezultate

Parametrii cinetici pentru oxidarea linoleatului de sodiu de ctre LOX-1

Parametrii cinetici calculai pentru LOX-1 oxidnd linoleatul de sodiu au

artat c enzima are o afinitate mare fa de substrat (KM=0.13mM) i c oxidarea

este rapid (vmax= 30.7 mM/s* g enzim).


22/52

Parametrii cinetici pentru oxidarea linoleatului de sodiu de c tre LOX-1 n

prezena quercetinei n diferite concentraii

Fig.II.6 prezint reprezentarea Lineweaver-Burk pentru LOX-1 oxidnd

linoleatul de sodiu n prezena quercetinei n urmtoarele concentraii: 100 M,

50M, 25M (A) i 10M (B).

A.

y = 1.3058x + 11.256R2 = 0.9866

y = 3.5445x + 17.774

R2 = 0.956

y = 7.8125x + 22.177

R2 = 0.7861

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4

1/[s]

1/v

100 uM

50 uM

25 uM

trendline (100 uM)

trendline (50 uM)

trendline (25 uM)

B.


23/52

y = 2413.6x - 59.178

R

2

= 0.878

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

500

600

-0.1 0 0.1 0.2 0.3

10uM

trendline (10 uM)

Fig.II.6. Reprezentarea Lineweaver-Burke pentru lipoxigenaza-1 oxidnd linoleatul desodiu n prezena quercetinei la concentraii de 100 M, 50M, 25M (A) and 10M (B);reprezentarea a fost realizat folosind programul Excel.

Pentru calcularea lui KM i a vmax ecuaiile liniilor de tendin au fost

folosite. n urma calculelor am obinut valorile prezentate n tabelul II.3. Din

Fig.II.6.(B) s-a constatat c la concentraia de 10 M quercetina nu are un efect

inhibitor ci mai degrab acioneaz ca un activator (existnd posibilitatea s fie i

ea oxidat alturi de substrat). Dup cum arat Fig. II.6.A inhibiia quercetinei este

una mixt.

Tabel II.3.KM, KMappi vmax calculate folosind ecuaiile liniilor de tendin a reprezentarilorgrafice Linewaver-Burk (Fig.II.6.), n cazul LOX-1 oxidnd linoleatul de sodiu nabsena i n prezena quercetinei n concentraii de 10 M, 25M, 50M i100M.

Quercetin

conc.

M

KM(mM)

vmax

(nM/s* genzyme)

100 0.12 0.4050 0.20 0.2825 0.35 0.20


24/52

10 40.80 0.085*10-3

0 0.13 0.30

Influen a quercetinei 100 M asupra oxid rii linoleatului de sodiu de ctre

LOX-1 pentru diferite protocoale experimentale (Protocol 1, 2 i 3)

Din Fig.II.7. se poate observa c cea mai puternic inhibiie se realizeaz n

cazul protocolului 1 cnd inhibitorul a fost amestecat 5 min cu enzima. O form

diferit se observ pentru protocolul 2 cnd quercetina a fost adugat dup 15

minute n amestecul de reacie (soluia tampon+enzim+substrat).

inhibition of LOX reaction by Q100 microM

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

0,055

0,06

0,065

0 5 10 15 20 25

substr.conc.

v

protocol 1

protocol 2

protocol 3

without inhibitor

Fig.II.7. Efectul inhibitor al quercetinei 100 M asupra reaciei lipoxigenazei nconcordan cu Protocol 3, cu Protocol 2 i cu Protocol 1. Curba de cinetic,superioar reprezint formarea produsului de reacie n absena quercetinei

Pentru protocolul 1 am obinut o curb Michaelis-Menten tipic. La

concentraii de substrat sczute pentru protocoalele 2 i 3 (Fig.II.7.), curbele

cinetice ncep cu o faz de cretere rapid a vitezei de reacie. Urmeaz o scdere a

vitezei de reacie, care este rapid, n cazul protocolului 3 i mai nceat n cazul

protocolului 2. Pentru protocolul 2 graficul continu cu o uoar cretere, care n


25/52

cazul nostru nu a atins faza de platou, de echilibru. n cazul protocolului 3 o nou

cretere nu aa de mare comparat cu prima faz-urmeaz pentru concentraii ale

substratului cuprinse ntre 5mM i 7.5 mM, urmat de o uoar descretere pentru

concentraii ale substratului mai mari de 7.5mM.

Cnd substratul a fost amestecat cu inhibitorul pentru cteva secunde, iar

apoi enzima a fost adugat (Fig.II.7. protocol 3), curba cinetic prezentnd o

prim faz de cretere rapid, arat c hidroperoxizii se formeaz n cazul

concentraiilor mici de substrat chiar dac este prezenti quercetina n amestecul

de reacie iniial. LOX este parial inhibat de quercetin pentru concentraiasubstratului de 5mM, dar apoi la concentraii mai mari ale acestuia enzima devine

activ din nou, nu n aceeai proporie ns ca atunci cnd concentraia de substrat

este mic.

Dac LOX a fost incubat cu substratul pentru 15 secunde i apoi

quercetina adugat-protocolul 2-, curba cinetic arat c LOX oxideaz substratul

producnd cea mai mare cantitate de hidroperoxizi pentru concentraii foarte mici

de substrat oxidate. Quercetina inhib parial reacia la concentraii ale substratului

cuprinse ntre 5mM i 7.5mM.


26/52

\

II.1.2. Interaciunea intermolecular ntre lipoxigenaz i quercetin este

influenat de pH i timpul de incubare

Scop i obiective

Aceste experimente au avut ca scop studiul interaciunilor intermoleculare

dintre LOX-1 pur i quercetin prin spectroscopie UV-Vis, precum i studiul

influenei pH-ului i a timpului de incubare asupra acestei interaciuni.

Rezultate

Influena pH-ului asupra interaciunii dintre lipoxigenazi quercetin


27/52

n figura II.8 sunt prezentate spectrele amestecului LOX+quercetin. Trei

maxime de absorbie (1, 2, 3) se nregistreaz la momentul t=0 i la t=60 min de

incubare. Maximul 1 corespunde Benzii II, maximul 3 Benzii I, ambele

caracteristice spectrului UV-Vis characteristic flavonoidelor, n timp ce maximul 2

indic formarea unui nou compus ca rezultat al reaciei dintre lipoxigenaz i

quercetin.

Fig.II.8. Spectrele de absorbie ale amestecului LOX (S1)+quercetin (50M) la

momentul iniial (min 0) (A), i dup 60 min de incubare(B).

Analiznd maximul de absorbie pentru semnalele 1 i 3 dup 60 min de

incubare a LOX cu quercetin se poate vedea c efectul batocromic este meninut

i chiar accentuat (392 nm pentru pH=9 i 394,2 pentru pH=6.1) pentru semnalul 3

dar nu pentru 1. Aceast observaie indic faptul c pH-ul alcalin favorizeaz

structura mezomeric I a quercetinei. Structura mezomeric I este dat de tranziia

electronilor n cadrul sistemului cinamoil (nucleele benzenice B+C), sistem care ncontinuare constituie baza de formare a acidului protocatecuic. Acidul

protocatecuic reprezint produsul de degradare a quercetinei sub aciunea

lipoxigenazei (Borbulevych et al, 2004).

Dup 60 min de incubare, (Fig.II.8) se observ pe lng deplasarea

batocromic i o dscdere a intensitii de absorbiepentru ambele benzi I i II.

Zsila i col (2003) studiind interaciunea intermolecular dintre quercetin i


28/52

albumin, au observat ca o deplasare batocromic a maximului i descreterea

intensitii de absorbie indic legarea quercetinei n form anionic i n

conformaie ne-planar. n cazul nostru ruperea nucleului cinamoil este favorizat

la pH=9, i de asemenea de prezena quercetinei n form anionic. La pH alcalin

structura mezomeric I a quercetinei pierde protonul de la C4i forma anionic

dat de atomul de oxigen legat de C4 devine preponderent. De asemenea dup 60

min se inregistreaz un nou semnal; semnalul 2 (~321nm), apare indicnd c un

nou compus s-a format n amestecul de reacie dup 60 min.

Interaciunea lipoxigenaz - quercetin pentru concentraii diferite de

quercetin

Reprezentnd absorbia n funcia de lungimea de und se poate observa

(Fig.II.9) c absorbana crete proporional cu concentraia de quercetin.

Dependena interaciunii lipoxigenaz-quercetin ,de concentraia quercetinei este

ilustrat n Fig.II.9.

Fig.II.9. Spectrele suprapuse a lipoxigenazei diluat n tampon borat i aamestecului lipoxigenaz-quercetin la diferite concentraii a acesteia din urm

II. 2. EFECTUL INHIBITOR AL IZOFLAVONELOR DIN SOIA ASUPRAACTIVITII LIPOXIGENAZEI DIN BOABELE DE SOIA

Scop i obiective


29/52

Scopul acestui experiment este evaluarea spectroscopic a inhibiiei

lipoxigenazei pure din boabele de soia (sLOX-1) de ctre un extract bogat ngenisteini daidzein (SIE), prin determinarea parametrilor cinetici.

Rezultate

Caracterizarea SIE prin analiza HPLC

Izoflavonele agliconice majoritare din extractul din boabele de soia, au fost

daidzeina i genisteina (Fig.II.10).

Fig.II.10. Cromatograma HPLC a extractului de izoflavone din soia (SIE).Genisteina i daidzeina au fost identificate. SIE a fost analizat prin HPLC folosindun sistem Hewlett-Packard cu detector PDA i coloan Eclipse XDB-C18 (25cm x4.6mm, 5m). Faza mobil izocratic a fost metanol: acid orto-fosforic (50:50,v/v). Rata de injecie a fost ml/min. Volumul de injecie a fost de 10 l, iar

cromatogramele au fost nregistrate la 280 nm.

Inhibiia lipoxigenazei standard de ctre SIE

Curbele cinetice Michaelis-Menten ale reaciei de oxidare a lipoxigenazei

n prezena i absena quercetinei i a izoflavonelor standard i n extract la o

concentraie a acestora de 0.5 M (pentru inhibitorii standard nu i pentru extract)

sunt prezentate n Fig.II.11.

0 5 10 15 20 25 30

0

5

10

15

20

mAU

Retention time

Daidzein

Genistein


30/52

Fig.II.11. Curbele de cinetic Michaelis-Menten pentru inhibiia lipoxigenazei-1

de ctre quercetin, b, (--), genistein, c, (--), daidzein, d, (--), i extractulizoflavonic, e, (--) la aceeai concentraie (0.5 M) suprapuse cu curba cinetic areaciei lipoxigenazei fr inhibitor, a ().

Rata reaciei lipoxigenazei n absena i n prezena extractului izoflavonic

SIE este prezentat n Fig.II.12.

Fig.II.12. Rata reaciei lipoxigenazei n absena (A) sau prezena extractului SIE(B) (ce conine 2 mM genisteini 1.8 mM daidzein).

Ca i n cazul inhibitorilor standard, SIE a inhibit activitatea LOX. Trebuie

menionat faptul ca n extract concentraia izoflavonelor (2mM pentru daidzeini


31/52

1.8 mM pentru genistein) dect cea a standardelor luate n lucru. Rezultatele arat

ca extractul are o activitate inhibitorie crescut la concentraii mici de substrat

(2.5-5 mM), comparativ cu standardele. n cazul concentraiilor mai mari de

substrat (33-40 mM), SIE prezint o activitate inhibitorie slab raportata la

standarde, quercetin i izoflavone. Eficiena inhibitorie a izoflavonelor depinde

att de concentraia lor ct i de cea a substratului. Spre exemplu genisteina la

concentraiile de 0.5 i 2.5 M prezint cea mai bun activitate inhibitorie la

concentraii ale substratului ntre 5 i 10 mM.

Izoflavonele din boabele de soia inhib LOX fie ca agliconi fie n formglucozilat. Izoflavonele acioneaz ca inhibitori n dou moduri: alternd

formarea hidroperoxizilor i astfel prevenind generarea de enzim activ n stare

feric, activ (1) i reducnd enzima feric la starea sa inactiv, feroas (2)

(Mahesha i col, 2007). Mahesha i col, (2007) propun urmtorul mecanism prin

care izoflavonele inhib lipoxigenaza: un electron donat de izoflavone este

acceptat de forma feric (Fe3+) a LOX, care este redus astfel la forma sa inactiv,

feroas (Fe2+). Genisteina nu este nici consumat, nici nu sufer schimbristructurale n timpul acestui proces (Mahesha i col 2007), n timp ce quercetina

intrnd n situsul catalitic al lipoxigenazei este degradat la acid protocatecuic

(Borbulevych i col, 2004) poziionat n vecintatea ionului de fier, centrul

catalitic al lipoxigenazei.


32/52

II.3. ACTIVITATEA LIPOXIGENAZEI N PREZENA CATECHINEI,EPICATECHINEI I A UNOR PROCIANIDINE N MEDIU BIOTIC I

ABIOTIC

Experimentele prezentate n acest capitol au avut ca scop evaluarea

inhibiiei lipoxigenazei standard (LS)i n extract (LE) de ctre catechina pur

(CS) i un extract polifenolic(PE) din smburi de struguri, ce are n compoziie

catechin, epicatechini procianidine. Evaluarea s-a fcut att n mediu abiotic

ct i n mediu biotic-cultur de leucocite. Ambele extracte au fost analizate prin

LC-MS.

II.3.1. Compoziia n polifenoli i stabilitatea extractului apos din smburi de

struguri din soiul Merlot Reca

Aceste experimente au fost parial finanate de proiectul TD 392/2007 i a

fost realizat n colaborare cu Departmentul de Chimie Organic a Facultii de

Inginerie n Biotiine a Universitii din Ghent, Belgia.Avnd n vedere aciunile benefice asupra sntii ale extractului apos din

smburii de struguri precum i poteniala exploatare a resturilor rmase de la

fabricarea vinului, compoziia extractului a fost determinat calitativ i cantitativ

prin LC-UV-DAD i LC-ESI -MS

Cum polifenolii sunt sensibili la oxygen, lumini mediu alcalin, dar mai

puin la temperatur, respectiv cldur, stabilitatea flavan-3-olilor i a

procianidinelor din extract a fost evaluat dup 6 luni de pstrare la 4C.

Rezultate

Caracterizarea prin HPLC-MS a flavan-3-olilor i a procianidinelor dinextractul proaspt (PE)

Determinarea compuilor fenolici a fost fcut la 220, 280 i 320 nm.

Pentru a verifica prezena sau absena antocianilor analiza a fost fcuti la 520


33/52

nm. Cromatogramele prezentate n Fig.II.13 (A i B) au fost obinute la 280 nm,

lungimea de und specific pentru absorbia catechinelor. La 520 nm, nu s-a

observat nici un semnal i n consecina s-a dovedit absena antocianilor att n

extractul proaspt ct i n cel pstrat.

A.

B.

Fig.II.13. (A and B). Cromatograma extractului PE nregistrat la 280 nm, obinutprin analiza LC-MS (A). Valorile m/z ale semnalelor indic prezena compuilorde tip catechinic. Aceti compui sunt prezeni ca monomeri, dimeri i trimeridup cum sunt prezentai n Tabelul II.4.Cromatograma extractului PES nregistrat la 280 nm, obinut prin analiza LC-MS (B). Valorile m/z ale semnalelor indic prezenta compuilor de tip catechinic.


34/52

Aceti compui sunt prezeni ca monomeri, dimeri i trimeri dup cum suntprezentai n Tabelul II.5.

Prin analiza HPLC a PE (Fig.II.13.A) s-a obinut cromatograma cu semnale

intense de-a lungul a mai mult de 16 min de eluie.Aceste semnale corespund

flavan-3 olilor monomerici i proantocianidinelor dimerice i trimerice. Acest

fingerprint cromatografic este datorat complexitii proantocianidinelor ce au o

mas molecular mare.

Compuii au fost identificai pe baza timpilor de retenie (tR), spectrul UV

(obinut cu DAD) i spectrul MS (obinut cu detectorul ESI). Structura compuilor

identificai a fost desemnat pe baza datelor de literatur (Pati i col, 2006; Amico

i col, 2004). Pentru catechin i epicatechin identificarea a fost fcut de

asemenea prin compararea cu tR, spectrele UV i MS obinute prin analiza HPLC-

MS a standardelor respective.

Compuii identificai asociai valorilor m/z obinute, precum i cantitatea n

care sunt prezeni n extract sunt prezentai n Tabelul II.4. Fragmentarea MS a

fost luat n considerare pentru elucidarea structurilor prezentate dup cum se

arat n Tabelul II.4.


35/52

Tabel II.4.

Timpii de retenie ai compuilor identificai n extractul PE n concordan cu Fig.II.13.(A), asociai cu valorile m/z a semnalelor din cromatogram, precum icuantificarea acestor compui determinat prin LC-MS.

Peak labelNumrul

semnalului

Retention time(tR) (min)Timpul de

retenie

AttributionAtribuirea

m/z ratio for the base peak [M-

H]- and other fragmentation [M-

H]- ionsraportul m/z pentru semnalul debaz[M-H]- precum i a altor ioni[M-H]- obinui prin fragmentare

Concentration(mg(CE)/kg

aliquotsa)Concentraia(mg(CE)/kg

proba)1 6.7 Gallic acid 169 740.2002 8.03 Galloyl glucose 331 260.200

3 9.3 Non identified 203, 365, 857, 905 860.2004 9.8 Procyanidine

dimmer577

940.200

5 10.3 Procyanidinedimer

331,432, 577890.200

6 10.5 Trimer 274, 483, 577, 865 870.3007 11.3 Catechin 289 3970.3008 11.7 Procyanidine

dimmer577

1930.300

9 12.2 Trimer (E)Ccoelutes with

12.33

289,577, 8651490.300

10 12.33 (E)C-(E)CG

dimer coeluteswith 12.2

289,443,577,729,865

1730.30011 12.7 Trimer (E)C

coelutes with(E)C-(E)CG

dimer

865, 729

1710.300

12 13.1 Epicatechin 289 5810.30013 14.02 Procyanidine

dimmer577 2341.000

14 14.7 Trimer 865 1931.10015 15.7 (E)CG 441 120 1.100IS 22.5 IS Coumaric acid 163

aBazat pe determinarea spectrofotometric (UV-DAD) i raportat la catechin. Valorile sunt exprimate n

mg/Kg extract din smburi de struguri uscai

Caracterizarea prin HPLC-MS a flavan-3-olilor i a procianidinelor dinextractul pstrat (PES )

Fig.II.13.B prezint cromatograma extractului PES pstrat timp de 6 luni la

4C. Comparat cu Fig.II.13.A, mai puine semnale se identific i cel mai

puternic dintre ele are tR=6.7 min.


36/52

Identificarea compuilor din PES s-a fcut, ca n cazul extractului proaspt,

prin corelarea cu caracteristicile (timpul de retenie LC-MS, spectrul UV-Vis i

tipul de fragmentare) compuilor standard pentru catechini epicatechin, i cu

datele din literatur pentru ceilali compui. Tabelul II.5. prezint compuii

corespunztori semnalelor obinute, mpreun cu fragmentele ionice, spectrul UV-

Vis i analiza cantitativ pentru extractul pstrat.Tabel II.5

Timpii de retenie a compuilor din extractul PES, dup cum se prezint nFig.II.13(B), identificai pe baza maximelor de absorbie a spectrelor UV-Vis i avalorilor m/z; cuantificarea acestor compui a fost fcut prin LC-MC.

Peak labelNumrul

semnalului

Retentiontime(tR)

(min)Timpul de

retenie

AttributionAtribuirea

m/z ratio for the basepeak [M-H]- and otherfragmentation [M-H]-

ionsraportul m/z pentru

semnalul de baz[M-

UV-Visabsorption

maximaMaximele

de absorbien UV-Vis

Concentration(mg(CE)/kg

aliquotsa)Concentraia(mg(CE)/kg

proba)


37/52

H]- precum i a altorioni [M-H]- obinui

prin fragmentare

16 6.7 Gallic acidoxidationproduct

189 217, 272 520.200

17 9.2 Nonidentifiedoxidationproducts

203, 351, 365, 723 220, 278

130.200

18 10.3 Oxidationproducts of

procyanidinedimers

139,419, 577, 940 280

130.200

19 10.5 Oxidationproducts of

procyanidinetrimer

249, 609, 915 280

150.300

7 11.3 Catechin 289 280 140.30012 13.1 Epicatechin 289 280 280.30020 16.1 Non

identifiedoxidationproducts

197, 808 220, 272

170.300

IS 22.5 IS Cumaricacid

163


38/52

aBazat pe determinarea spectrofotometric (UV-DAD) i raportat la catechin. Valorile sunt exprimate nmg/Kg extract din smburi de struguri uscai

II.3.2.Compoziia n polifenoli a extractului enzimatic LE

Aceste experimente au fost parial finanate de proiectul TD 392/2007 i a

fost realizat n colaborare cu Departmentul de Chimie Organic a Facultii de

Inginerie n Biotiine a Universitii din Ghent, Belgia.

Scop i obiective

S-a demonstrat deja c boabele de soia sunt bogate n izoflavone i pentru

acest experiment a fost fcut analiza LC-UV-DAD i LC-ESI -MS unui extract

metanolic (LE). Compuii separai au fost analizai i cantitativ.

Rezultate

Fig.II.14. prezint cromatograma LC-MS a extractului LE nregistrat la

280 nm. Compuii au fost identificai pe baza timpului de retenie (tR), spectrul

UV i spectrul MS (obinut cu detectorul ESI). Structura compuilor identificai a

fost determinat pe baza literaturii de specialitate (Klejdus i col, 2004; Otieno i

Shah, 2007; Deavours i Dixon, 2005).


39/52


40/52

Efectul inhibitor al antioxidanilor asupra lipoxigenazei, depinde de starea

fizico-chimic a substratului i de tipul de lipoxigenaz, i se schimb complet n

funcie de condiiile de reacie (Noguchi i col, 2002). Prin spectroscopie UV-Vis

am evaluat interaciunea dintre extractul de lipoxigenaze LE i compuii de tip

catechinic din extractul apos din smburii de struguri att n condi ii abiotice, ct

i n condiii biotice-cultur de leucocite. Dei condiiile in vitro nu reprezint n

proporie de 100% condiiile in vivo, acest studiu i propune evaluarea proceselor

oxidative ce au loc prin interaciunea celulelor cu molecule cu valoare nutriional

nu doar n stare pur dar i ca extracte primare. Dependena de dozi de timpul

de incubare a oxidrii catechinelor la chinone este implicat n modificarea

echilibrului antioxidant/prooxidant determinat de acet flavan-3-oli. Rezultatele

prezentate aici coroborate cu cele ale altor grupuri de cercetare, pot oferi

informaii utile pentru gsirea de antioxidani ce se pot aduga n produsele

alimentare, i pot constitui de asemenea o baz pentru studiul inhibiiei

lipoxigenazei de ctre compuii de tip catechinic.

Rezultate

Datele prezentate dovedesc prin spectroscopie UV-Vis, formarea

chinonelor ca produi de oxidare a extractelor bogate n compui catechinici.

Starea acestor compui a fost evaluat n condiii abiotice i n mediul biotic extra-

i intracelular. Ca prooxidant s-a folosit lipoxigenaza standard din boabele de soia

precum i un extract primar bogat n aceste enzime (Chedea i col, 2008), din

cauza interesului manifestat pentru inhibarea acestei enzime de diferite clase de

polifenoli.

Literatura de specialitate prezint o multitudine de date evideniind

capacitatea antioxidant a catechinelor ca o nsuire esenial a utilizrii acestora

n prevenirea unor boli. Cu toate acestea alte studii au demonstrat c i ca

prooxidant aceste flavonoide ar putea contribui la efectele benefice asupra


41/52

sntii, prin faptul c se activeaz enzimele detoxifiante (Azam i col, 2004;

Lee-Hilz i col, 2006).

Diferite tipuri de oxidare au fost determinate, n cazul nostru, prin obinerea

de maxime de absorbie UV-Vis diferite pentru produii de reacie. Am artat

astfel c modelul de oxidare este diferit n cazul moleculelor standard comparativ

cu cel al extractelor.

Produii de oxidare a catechinei att ca molecul pur (CS), ct i ca extract

(PE) s-au format n mediul extracelular i n cel intracelular.

n condiii abiotice lipoxigenaza (pur) prezint un puternic efect

prooxidant asupra cetechinei pure i a polifenolilor din extract. Oxidarea

enzimatic a catechinei i a polifenolilor ia loc cu formare de dimeri.

Situaia este diferit n cazul culturii celulare. n mediul extracelular

catechina i polifenolii sunt oxidai n prezena lipoxigenazei standard pure

dar nu se mai formeaz dimeri. Aceasta demonstreaz faptul c reactivitatea

polifenolilor i a lipoxigenazei este modulat de celule prin aparatul

enzimatic. Hong i col (2002) au artat c stabilitatea EGCG a crescut npezena celulelor, acest efect putnd fi cauzat de proteine i alte molecule

antioxidante prezente n celul. n cazul nostru autooxidarea catechinelor i

a polifenolilor din extract are loc n mediul extracelular. Autooxidarea

flavonoidelor are loc de obicei n soluii alcaline apoase i este nsoit de

producerea de radicali anionici, superoxidul i peroxidul de hidrogen

(Dangles i col, 2000). In condiii tipice de culturi celulare la pH 7.27.4,

EGCG se autooxideaz rapid ducnd la formarea a doi compui cu structurdimeric (Hong si col, 2002). n matricea intracelular s-a observat

formarea chinonelor ca rezultat al interaciunii dintre catechine i

lipoxigenaz (Table II.6). Studiul de fa arat c chinonele formate prin

oxidarea catechinelor sunt implicate n modularea echilibrului

antioxidant/prooxidant la nivel celular n prezena sau absena lipoxigenazei

ca inductor de stres oxidativ.


42/52


43/52

Interesant este faptul c n stare pur catechina este oxidat intracelular producnd

o cantitate nsemnat de chinone i care genereaz un efect antioxidant. Aceast

situaie a fost observat i cnd pentru 24 de ore la jumtate de doz PE a fost

incubat cu leucocitele iar apoi LE a fost adugat pentru nc 1 or. Extractul PE a

avut o mai bun aciune asupra activitii prooxidante a LE, cnd a fost incubat

pentru o perioad mai lung (24 de ore versus 3ore) i la jumtate de doz.

Am demonstrat prin spectroscopie UV-Vis, c chinonele sunt implicate n

modularea activitii lipoxigenazei n celule ca rezultat al oxidrii catechinelor.

Aceast concluzie este n acord cu cele ale lui Sadik i col. (2003) i Banerjee

(2006). O modificare covalent ireversibil a LOX din soia generat de flavonoide

a fost sugerat de Sadik i col. (2003), cnd n timpul formrii radicalilor peroxil a

acizilor grai polinesaturai prin aciunea lipoxigenazei, flavonoidele sunt co-

oxidate la semi-chinone sau chinone, care la rndul lor se leag la gruprile

sufhidril i amino ale enzimei cauznd inhibarea acesteia (Banerjee, 2006).

II.4. EVALUAREA UNOR CAROTENOIDE CA INHIBITORI DELIPOXIGENAZ

Scop i obiective

Este cunoscut c anumii compui care sunt antioxidani, cum ar fi -

carotenul (Lomnitski i col, 1993), n adiie la -tocopherol i L-ascorbat (Packer,

1992; Buettner, 1993), sunt capabili s inhibe LOX din diverse sisteme.

Scopul acestui studiu a fost evaluarea efectului unor carotenoide, standard

i n extract asupra activitii lipoxigenazei standard oxidnd acidul linoleic.

Rezultate

Figura II.15 prezint curba de cinetic Michaelis-Menten considerat

standard pentru formarea hidroperoxizilor (HPOD) prin reacia lipoxigenazei de

oxidare a acidului linoleic. Graficul prezint o faz exponenial urmat de


44/52

atingerea echilibrului n faza de platou. Calcularea activitii enzimatice specifice

(ESA) a fost fcut pentru faza de cretere exponenial (I).

0.3

0.9

0.4

0.6

0.8

0 600200 400

Abs

Time [sec]

Fig.II.15. Curba cinetic pentru LOX-1 pur inregistrat la 234 nm.


45/52


46/52

Fig.II.16. Curba cinetic pentru activitatea LOX-1-pur nregistrat la 234 nm nprezena carotenoidelor pure: luteina + formula chimic a luteinei (A), -carotene+ formula chimic a -carotenului (B) i zeaxantina+ formula chimic azeaxantinei (C).

Adugnd -caroten, lutein i zeaxantin n amestecul de reacie (Fig.

II.16. A, B i C) forma curbei cinetice se modific. Trei tipuri de grafice, fiecare

dintre ele specific unui carotenoid, au fost inregistrate. Fiecare reprezentare poate

fi mprit n dou faze: una corespunztoare primelor 30 de secunde de reacie i

a doua pentru intervalul de timp 30 sec - 600 sec.Pentru lutein (Fig.II.16A) i -caroten (Fig.II.16B) prima etap a reaciei

este caracterizat printr-o cretere foarte rapid a vitezei de reacie urmat de o

scdere la fel de rapid. A doua etap este reprezentat de o uoar scdere a

vitezei pentru -caroten (Fig.II.16B) i de o uoar cretere pentru lutein

(Fig.II.16A). n cazul zeaxantinei pentru faza nti a curbei cinetice se observ tot

o cretere foarte rapid dar pentru primele 5 sec, apoi o descretere rapid pentru

urmtoarele 6 sec urmat de o nou uoar cretere i o scadere rapid a vitezei dereacie. n decursul fazei a 2-a nu se observ activitate enzimatic (Fig.II.16C).

Dei luteina i zeaxantina sunt izomeri nu prezint acelai comportament

inhibitor n cazul oxidrii acidului linoleic de ctre LOX (Fig.II.16A i II.16C). n

primele secunde ale reaciei, cinetica n prezena luteinei este identic cu cea n

prezena -carotenului (Fig.II.16A i II.16B).


47/52

0.63

0.75

0.65

0.7

0 600200 400

Abs

Time [sec]

Fig.II.17. Curba cinetic a activitii LOX-1 nregistrate la 234 nm n prezenaextractului din Physalis alkekengi.

Fig.II.17 prezint cinetica LOX-1 n prezena extractului de Physalis. Faza I

este identic cu cea a zeaxantinei (Fig. II.17 i Fig.II.16 C).

Datorit faptului c luteina i -carotenul au aceeai form a curbei cinetice

pentru prima faz a reaciei LOX-1, am asociat aceast asemnare cu cea a

structurii lor chimice. Comparnd structurile luteinei i a -carotenului poate

fi remarcat faptul c lanul polienic de 9 legturi conjugate este elementul comun

ambelor molecule. Corelaia acestor nsuiri comune ale curbelor cinetice i ale

structurilor chimice ne-a dus la concluzia c n primele secunde ale oxidriiacidului linoleic de ctre LOX-1 se produce o modificare a structurii

carotenoidelor la nivelul sistemului polienic cum a fost artat i de Kennedy i

Liebler (1991). Rezultatele obinute de Serpen i Gkmen (2005) sugereaz c-

carotenul reacioneaz cu radicalul linoleil (L ) la nceputul lanului de reacii

prevenind formarea de diene conjugate (LOO , LOO- and LOOH). Din timp ce L

revine la forma iniial LH, enzima nu poate completa ciclul de reacie i astfel

rmne n stare inactiv Fe(II) (Serpen

i Gkmen, 2005).Absorbia la 234 nm nregistreaz formarea de duble legturi conjugate prin

producerea de hidroperoxizi prin oxidarea acidului linoleic de ctre LOX-1 i de

asemenea cele date de lanul polienic al carotenoidelor, deci ESA este influenat

de aceste dou elemente.


48/52

n timpul fazei I a reaciei ESA pentru carotenoidele saponificate descrete

n ordinea descreterii numrului de duble legturi n lanul polienic dup cum

urmeaz Zeaxantin, P.A., -caroten i Lutein.


49/52

CONCLUZII GENERALE

n concordan cu scopul i obiectivele acestui studiu, am folosit sisteme

experimentale diverse pentru a demonstra comportamentul catalitic al

lipoxigenazei pure i a extractului mbogit n lipoxigenze n condiii abiotice i

biotice, influena diverilor parametrii de reacie asupra activitii enzimatice,

considernd de asemenea interaciunile dintre enzim i diferitele clase de

inhibitori luate n lucru.

Concluziile principale ale acestor variante experimentale pot fi enumerate

dup cum urmeaz:

1. Fiecare lipoxigenaz prefer un anumit pH pentru a avea o activitate

optim, dependent de stadiul de extracie, diluie i raportul enzim/substrat, cnd

acidul linoleic a fost utilizat ca unic substrat. Am gsit c LOX-1 are activitate

maxim la pHm= 9.0, LOX-2 la pHm=6.8 i LOX-3 la pHm=7.1 Dependena

bilateral a activitii LOX-1 de pHm i E/LS sugereaz posibilitatea de modulare

a activitii acestor enzime prin modificarea parametrilor menionai. Pentru ainhiba activitatea LOX este recomandat un nivel ridicat al raportului

enzim/substrat i un pHm sczut.

2. Experimentele cu lipoxigenaza pur din boabele de soia LOX-1 i din

extractele din boabe de soia (cu sau fr degresare) au avut ca rezultat diferite

tipuri de curbe cinetice: de tip convenional corespunznd la LOX-1 pur i

extractelor primare din boabele de soia, prezentnd o faz exponenial urmat de

o faz de platou (1). Pentru extractele degresate (2) graficele au prezentat 3 fazedistincte incluznd o faz rapid exponenial (15 sec), urmat de o perioad de

lag pentru ca n final s aib o nou cretere pn la atingerea fazei de echilibru

(platou).

3. Extractul primar conine n principal LOX-1, dar i LOX-3, ntr-un raport

aproximativ de 3:1. LOX-2 n acest extract se gsete n cantiti foarte mici.

Degresarea inhib aproape complet activitatea LOX-1 la pH acid. Presupunem c


50/52

degresarea elimin substratul (acidul linoleic) ce se gsete n extractul primar i

acesta este un mecanism simplu de inhibare a LOX-1. Prin restabilirea pH-ului la

neutru sau alcalin, o parte din activitatea enzimatic a fost restabilit, fapt ce poate

fi explicat prin conversia oxidativ a Fe2+ la Fe3+, ce se gsete n LOX-1 activ.

Cele trei extracte degresate (E2, E3i E4) aduse la pH 6.8 i 7.1 au avut, n general

o imagine asemntoare a activitii lor lipoxigenazice: activitate scazut a LOX-1

i LOX-2, dar crescut pentru LOX-3, pentru E3 chiar mult mai intens dect

pentru E1.

4. Am analizat prin GC-MS produii de reacie n cazul LOX din porumb

recombinat. Acidul linoleic luat ca substrat d doar doi produi de reacie formai

prin autooxidare, n cantiti echivalente, n timp ce foto-oxidarea genereaz un

amestec de patru derivai cu radicalul OOH la atomii de carbon 9, 10, 12 sau 13.

Folosind fosfolipide (lecitina) ca substrat pentru RM9-LOX, am identificat produi

ca 9- i 13-hidroperoxizi. Rezultatele GC-MS au artat de asemenea c

hidroperoxizii rezultai au fost n cantitate mai mic de 1% din totalul produilor

de reacie n cazul oxidrii PC i prin urmare aceast reacie nu este specific,enzima noastr recombinat neavnd n acest caz activitate oxidant fa de PC.

5. Parametrii cinetici ai, KM i vmax au fost calculai pentru LOX-1 din

boabele de soia pur, oxidnd acidul linoleic la dou intervale ale concentraiei (5-

100 M i 10-200 M) fie n etanol fie n prezena 13-HPOD i a Tween 20.

n prima situaie vmax=40M/s*mg enz. i KM=20 mol iar pentru al doilea

caz vmax=48M/s*mg enz. i KM=25 mol. Adiia lui Tween 20 i a HPOD-ului au

crescut viteza de reacie dar i KM. Creterea KM poate fi explicat att prin

formarea unui complex LOX-HPOD ct i prin formarea unui acid linoleic micelar

prin adugarea Tween-ului, substratul fiind mult mai disponibil pentru reacie,

detergentul avnd un rol important n acest caz.

6. Saturnd mediul de reacie a LOX cu O2 sau adugnd clorur de sodium

nu s-a mbuntit viteza de reacie. La concentraii de substrat sczute, adugarea


51/52

O2 n mediul de reacie a sczut viteza oxidrii, conversia substratului la produsul

de reacie fiind ncetinit prin saturarea cu oxigen.

7. Studiind influena quercetinei pure asupra oxidrii linoleatului de sodium

de ctre LOX-1 pur s-a artat c viteza reaciei scade cnd concentraia de

inhibitor descrete (de la 100 la 10 M) i KM crete n aceleai condiii. Valoarea

mai ridicat a constantei de inhibiie indic o bun corelaie ntre afinitatea sczut

a inhibitorului fa de enzim i viteza de reacie. Cel mai bun protocol

experimental pentru inhibarea lipoxigenazei a fost acela cnd inhibitorul a fost

adugat naintea substratului n amestecul de reacie.

8. Aceste studii au demonstrat c LOX poate fi inhibat de quercetin n

funcie de diveri factori, cum ar fi, pH-ul i concentraia de quercetin. Valorile

pH-ului pot influena interaciunile moleculare dintre LOX-1 pur i quercetin,

pH-ul alcalin favoriznd forma ionic a quercetinei ce interacioneaz cel mai bine

cu lipoxigenaza. Inhibiia lipoxigenazei, ca rezultat al interaciunii intermoleculare

dintre enzimi quercetin, este dependent de concentraia inhibitorului. Aceast

interaciune a fost demonstrat prin semnalul spectrului UV-Vis avnd absorbiaspecific la at =321 nm dup 60 min de reacie dintre lipoxigenazi quercetin,

indicnd formarea unui complex intermolecular LOX-quercetin. Cnd

concentraia de inhibitor crete, formarea acestui nou compus este stimulat; cel

mai puternic semnal nregistrndu-se n cazul quercetinei 100M urmat de

50M.

9. Efectul inhibitor al izoflavonelor din soia asupra activitii lipoxigenazei

a fost confirmat. Cinetica lor specifici caracteristicile de inhibiie sunt diferite,genisteina fiind mult mai activ dect daidzeina (ca i compui puri). Extractul

izoflavonic din boabele de soia, cu concentraie controlat de genistein i

daidzein (mai mare dect a standardelor) a artat un potenial inhibitor similar

standardelor. Rezultatele noastre indic o aciune sinergic a acestor dou

componente ale extractului.


52/52

10. Activitatea lipoxigenazei n prezena catechinei, epicatechinei i a

procianidinelor n mediu abiotic i biotic a fost de asemenea studiat. Un mediu

prooxidant n exteriorul i interiorul celulei a fost indus de LOX i a fost observat

oxidarea polifenolilor cu formare de quinone i dimeri. Catechina este mult mai

oxidat ca molecul pur dect n extractul polifenolic. Am observat o perturbare a

echilibrului prooxidant/antioxidant indus diferit de lipoxigenaza pur i de

extractul lipoxigenazic i dependent de timpul de incubare a polifenolilor.

Relaiile doz-efect i timp-efect a fost observat.

11. Evaluarea aciunii inhibitorii a carotenoidelor asupra lipoxigenazei

standard a fost fcut n sistem abiotic. Extractul carotenoidic (coninnd luteini

-caroten) are o aciune inhibitorie asupra LOX-1 similar cu cea a compuilor

standard. Structura carotenoidic ce prezint un lan polienic mai lung induce o

activitate enzimatic mai intens n primele secunde ale reaciei. Aceast situaie

nu este valabil dup 600s de reacie, cauza putnd fi distrugerea structurii prin

cooxidarea carotenoidelor alturi de reacia clasic a LOX.

Parte din rezultatele prezentate au fost publicate n revista de

specialitate cotat ISI, Journal of Food Biochemistry, sau au fost acceptate

spre publicare (2 articole n Journal of Food Biochemistry). Parte din

rezultate au fost de asemenea prezentate n cadrul unor conferine i

simpozioane naionale i internaionale.

Date post:	10-Apr-2018
Category:	Documents
Upload:	cupuyc3643
View:	245 times
Download:	0 times

enzime teza

Documents