UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI - UFVJM
ELIANE CRISTINE SOARES DA COSTA
CRESCIMENTO E ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM MUDAS DE CEDRO
AUSTRALIANO (Toona ciliata M. roem. var. australis) INOCULADAS COM FUNGOS
MICORRÍZICOS
DIAMANTINA - MG
2019
Eliane Cristine Soares da Costa
CRESCIMENTO E ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM MUDAS DE CEDRO
AUSTRALIANO (Toona ciliata M. roem. var. australis) INOCULADAS COM FUNGOS
MICORRÍZICOS
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Produção Vegetal da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, área de concentração Produção Vegetal, para obtenção do título de “Mestre”.
Orientador Prof. Dr. Paulo Henrique Grazziotti
DIAMANTINA - MG
2019
FICHA CATALOGRÁFICA
OFEREÇO
A Deus, fonte de vida e amor sublime,
por me guiar e intuir minhas decisões.
DEDICO
Aos meus irmãos e meu pai, pelo amor e apoio
sempre fundamentais e à minha mãe (in
memoriam) pelo exemplo de amor, caráter e
humildade e por ainda me proteger.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela saúde, proteção, e, sobretudo por me capacitar e tornar digna desta
conquista.
A minha família pelo amor, apoio e incentivo fundamentais em todos os momentos.
A Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM) e ao
Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal (PPGPV) pela oportunidade da realização
do curso, concessão da bolsa e contribuição na minha formação profissional.
Ao Prof. Paulo Henrique Grazziotti pela orientação, paciência, ensinamentos e
experiências transmitidas nestes quase sete anos de trabalhos.
Ao professor Marco Aurélio Carbone e ao Sr. Yuri Maggi, bem como à Universidade
Federal de Lavras e a NovaTero pelo fornecimento dos inóculos de FMA para a realização
deste trabalho.
A Erika Vilela e a Bela Vista Florestal pela cessão da infraestrutura e apoio necessário
para a condução do experimento.
Aos colegas do laboratório de Microbiologia do Solo pela convivência, em especial a
Roberta e Caique, pelos momentos de descontração.
Aos professores do PPGPV, funcionários e técnicos do DAG, em especial Andrezza,
Abraão, Eglerson e Lindomar, pelo auxílio e paciência.
Aos meus amigos pelo amor, incentivo e torcida.
Ao meu namorado pela compreensão, carinho, incentivo e amor.
A todos que me acompanharam e contribuíram para o sucesso desta etapa de
formação.
Muito obrigada!
i
RESUMO
COSTA, E. C. S. Crescimento e atividade enzimática em mudas de cedro australiano (Toona ciliata M. roem. var. australis) inoculadas com fungos micorrízicos 2019. 41p. (Dissertação - Mestrado em Produção Vegetal) – Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Diamantina, 2019. O cedro australiano (Toona ciliata) tem se destacado em povoamentos florestais comerciais devido à qualidade da sua madeira, rápido crescimento, adaptação a climas tropicais e subtropicais e resistência ao ataque da Hipsiphyla grandella. Sabe-se que em viveiros florestais, a inoculação com fungos micorrízicos tem contribuído para o vigor das plantas e pode representar uma economia considerável da adubação química, principalmente a fosfatada, tornando, portanto, o cultivo mais sustentável. No entanto, são poucas as informações existentes sobre o efeito da inoculação de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) em mudas clonais de cedro australiano. Desta maneira, este estudo teve por objetivo avaliar a eficiência da inoculação de FMA no crescimento de mudas clonais de cedro australiano. Os tratamentos foram dispostos em esquema fatorial 2x4, sendo os clones BV1120 e BV1321 inoculados com inoculante comercial à base de FMA, Rootella BR®, com a mistura dos inóculos de FMA Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora
morrowiae, crescidos em substrato com redução da adubação fosfatada e dois controles não inoculados com e sem redução da adubação fosfatada. Para as mudas com redução da adubação fosfatada, a massa seca da parte aérea (MSPA) e massa seca total (MST) foram maiores nas inoculadas com Rootella BR®. Apesar de a colonização micorrízica ter sido maior nas mudas inoculadas com C. etunicatum + A. morrowiae. Independente do inoculante, a inoculação aumentou as atividades de superóxido dismutase e catalase nas folhas das mudas em relação às não inoculadas. A inoculação ou redução da adubação fosfatada influenciou os teores de P, N e Mn na parte aérea das mudas. Os clones se comportaram de maneira distinta em relação ao crescimento, as mudas exibiram maior diâmetro do coleto, MSPA, massa seca de raízes, MST, razão raiz parte aérea e Índice de Qualidade de Dickson no clone BV1321 do que no clone BV1120. A inoculação com fungos micorrízicos arbusculares aumenta o crescimento da parte aérea, os teores de P e a atividade das enzimas CAT e SOD de mudas de cedro australiano (Toona ciliata) em viveiro comercial, mas este efeito é dependente do clone.
Palavras-chave: produção de mudas, micorriza, enzimas, nutrientes.
ii
ABSTRACT
COSTA, E. C. S. Growth and enzymatic activity in australian cedar (Toona ciliata M. roem. var. australis) seedlings inoculated with mycorrhizal fungi 2019. 41p. Dissertation (Masters in Vegetable Production) – Federal University of the Jequitinhonha and Mucuri Valley, Diamantina, 2019.
Australian cedar (Toona ciliata) has excelled in commercial forest stands due to its wood quality, rapid growth, adaptation to tropical and subtropical climates and resistance to attack by Hipsiphyla grandella. It is known that in forest nurseries, inoculation with mycorrhizal fungi has contributed to the vigor of the plants and can represent a considerable economy of chemical fertilization, mainly phosphate, making the cultivation more sustainable. However, there is little information on the effect of inoculation of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on clonal Australian cedar seedlings. Thus, this study aimed to evaluate the efficiency of AMF inoculation in the growth of Australian cedar clonal seedlings. The treatments were arranged in a 2x4 factorial scheme, with BV1120 and BV1321 clones inoculated with commercial AMF based Rootella BR®, inoculum with the inoculum of AMF Claroideoglomus etunicatum and Acaulospora morrowiae, grown on substrate with reduced phosphate fertilization and two uninoculated controls with and without phosphate fertilizer reduction. For seedlings with reduced phosphate fertilization, shoot dry mass (SDM) and total dry mass (TDM) were higher in those inoculated with Rootella BR®. Although mycorrhizal colonization was higher in seedlings inoculated with C. etunicatum + A.
morrowiae. Regardless of the inoculant, the inoculation increased the superoxide dismutase and catalase activities in the seedlings leaves in relation to the uninoculated ones. The inoculation or reduction of phosphate fertilization influenced the P, N and Mn contents in the shoot shoots. The clones behaved differently in relation to growth, the seedlings showed larger stem diameter, SDM, root dry mass, TDM, shoot root ratio and Dickson Quality Index in clone BV1321 than in clone BV1120. Inoculation with arbuscular mycorrhizal fungi increases shoot growth, P content and CAT and SOD enzyme activity of Australian cedar seedlings in commercial nursery, but this effect is clone dependent.
Key words: seedling production, mycorrhiza, enzymes, nutrients.
iii
LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela 1 Classificação dos fungos micorrízicos arbusculares............................... 7
Tabela 2 Sobrevivência, diâmetro, massa seca de raízes, massa seca de parte aérea, massa seca total, razão raiz/parte, porcentagem de colonização e Índice de Qualidade de Dickson das mudas dos clones BV1120 e BV1321 de cedro australiano não inoculadas (Controle), inoculadas com inoculante comercial Rootella BR® e inoculadas com a mistura de inoculantes dos FMA Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora
morrowiae (MIX) e crescidas em substrato com redução da adubação fosfatada; mais o controle não inoculado e crescidas sem redução da adubação fosfatada (Comercial).......................................................
20
Tabela 3 Teores de P, N, Fe, K, Zn e Mn na parte aérea das mudas dos clones BV1120 e BV1321 de cedro australiano não inoculadas (Controle), inoculadas com inoculante comercial Rootella BR® e inoculadas com a mistura de inoculantes dos FMA Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora morrowiae (MIX) e crescidas em substrato com redução da adubação fosfatada; mais o controle não inoculado e crescidas sem redução da adubação fosfatada (Comercial)..............................................................................................
23
iv
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1 Tronco de cedro australiano, apresentando sapopemas baixas (A), detalhe da casca grossa e com deiscência em placas (B).....................
4
Figura 2 Detalhes de plantas de Toona ciliata var. australis, apresentando folhas e flores (A), frutos do tipo cápsulas(B), abertura dos frutos (C) e sementes....................................................................................
4
Figura 3 Características dos torrões das raízes das mudas de cedro australiano correspondentes às notas: a) Nota 3 – torrão firme e bem enraizado; b) Nota 2 – torrão moderadamente firme e parcialmente enraizado; c) Nota 1 – torrão fraco e mal enraizado.............................................................................................
15
Figura 4 Frequência das notas atribuídas à formação das raízes das mudas dos clones de cedro australiano, inoculadas com fungos micorrízicos arbusculares, não inoculados com (Controle) e sem (Comercial) redução da adubação fosfatada do substrato de produção das mudas............................................................................................................
21
Figura 5 Mudas dos clones BV1120 de cedro australiano não inoculadas (Controle), inoculadas com inoculante comercial Rootella BR® e inoculadas com a mistura de inoculantes dos FMA Claroideoglomus
etunicatum e Acaulospora morrowiae (MIX) e crescidas em substrato com redução da adubação fosfatada; mais o controle não inoculado e crescidas sem redução da adubação fosfatada (Comercial)..............................................................................
21
Figura 6 Atividade enzimática de superóxido dismutase (A) e catalase (B) das mudas dos clones BV1120 e BV1321 de cedro australiano não inoculadas (Controle), inoculadas com inoculante comercial Rootella BR® e inoculadas com a mistura de inoculantes dos FMA Claroideoglomus
etunicatum e Acaulospora morrowiae (MIX) e crescidas em substrato com redução da adubação fosfatada; mais o controle não inoculado e crescidas sem redução da adubação fosfatada (Comercial)...................................................................................................
24
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................................. i
ABSTRACT ............................................................................................................................ ii
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................... iii
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ iv
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1
1 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 2
1.1 Cedro Australiano [Toona ciliata var. australis (F. Muell.) Bahadur] ........................... 2
1.2 Micorrízicas Arbusculares (MA) .................................................................................... 6
1.2.1 Aspectos gerais ......................................................................................................... 6
1.2.2 FMA em mudas de cedro ......................................................................................... 8
1.2.3 Inoculantes ............................................................................................................. 10
2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 11
2.1 Local do experimento ................................................................................................... 11
2.2 Delineamento experimental .......................................................................................... 11
2.3 Inoculantes micorrízicos ............................................................................................... 12
2.4 Substrato de produção das mudas, fertilização e inoculação ........................................ 12
2.5 Plantio de miniestacas e condução do experimento ...................................................... 13
2.6 Avaliações e colheita do experimento .......................................................................... 13
2.7 Análise nutricional das mudas ...................................................................................... 15
2.8 Porcentagem de colonização micorrízica ..................................................................... 15
2.9 Atividade de enzimas nas folhas ................................................................................... 15
2.9.1 Obtenção dos extratos enzimáticos ........................................................................ 15
2.9.2 Catalase (CAT) ....................................................................................................... 16
2.9.3 Superóxido Dismutase (SOD) ................................................................................ 16
2.10 Análises estatísticas .................................................................................................... 17
3 RESULTADOS ................................................................................................................... 17
3.1 Sobrevivência, crescimento e colonização das raízes ................................................... 17
3.2 Teores de nutrientes ...................................................................................................... 20
3.3 Atividade enzimática .................................................................................................... 22
4 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 23
5 CONCLUSÕES ................................................................................................................... 30
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 31
ANEXOS ................................................................................................................................ 39
1
INTRODUÇÃO 1
A indústria brasileira de base florestal é mundialmente reconhecida pela alta 2
produtividade das árvores plantadas no país. A crescente demanda por madeira serrada e 3
produtos florestais, aliada ao aprimoramento das indústrias deste setor, têm proporcionado 4
um incremento na produção e cultivo florestal, aumentando a pressão sobre as florestas 5
nativas. Visando protegê-las e simultaneamente atender a demanda, surge a necessidade de 6
pesquisas de novas espécies com alto potencial produtivo e econômico. 7
Apesar da predominância dos gêneros Eucalyptus e Pinus na participação da área 8
total de plantios florestais no Brasil, a produção de outras espécies florestais tem crescido, 9
totalizando aproximadamente 590 mil ha, 7,52 % da área total de plantios florestais 10
cultivadas no país (IBÁ, 2017). Dentre as novas espécies, com grande importância ecológica 11
e econômica no Brasil, o cedro australiano (Toona ciliata M. Roem. var. australis) 12
(FERDINAND VON MUELLER, 1825) vem ganhando destaque. 13
O cultivo desta espécie tem sido difundido no Brasil em razão da sua boa adaptação 14
às condições edafoclimáticas (MURAKAMI, 2008). Com ciclo relativamente curto, 15
produtividade de 250 a 300 m3 ha-1 aos 20 anos e alto valor agregado de sua madeira no 16
mercado interno e externo, o interesse por essa espécie tem aumento principalmente no 17
segmento de madeira serrada, o que a torna promissora para plantios comerciais 18
(CIFLORESTAS, 2019). Além disto, o cedro australiano apresenta resistência ao ataque da 19
praga Hypsipyla grandella, que inviabiliza o cultivo comercial das espécies nativas de cedro 20
(SOUZA et al., 2010). 21
Quanto ao cultivo do cedro australiano no Brasil são escassas informações sobre as 22
exigências nutricionais, frequência de adubações, manejo e produção de mudas. No entanto, 23
sabe-se que em geral, os solos brasileiros destinados para os reflorestamentos apresentam 24
baixa fertilidade natural, demandando a aplicação de estratégias biotecnológicas que possam 25
favorecer o aumento da produtividade no setor florestal, bem como reduzir o uso demasiado 26
de fertilizantes químicos, que contribuem para os altos custos de produção e impactos 27
ambientais. 28
Neste contexto, o uso de micro-organismos capazes de promover o crescimento e 29
fornecer nutrientes para o desenvolvimento das plantas tem sido cada vez mais comum, 30
podendo auxiliar seu desenvolvimento na fase de formação de mudas e estabelecimento a 31
campo. Associações simbióticas mutualísticas entre espécies florestais e fungos micorrízicos 32
além de promissoras para aumentar a produtividade das florestas (ANDREAZZA et al., 33
2004), representam uma alternativa biotecnológica viável ambiental e economicamente, uma 34
2
vez que, as principais fontes de fertilizantes não são renováveis e a ampliação das áreas 35
plantadas encontra restrições quanto à legislação ambiental e territorial. 36
Em geral plantas micorrizadas apresentam vantagens em relação àquelas sem 37
micorriza, como melhor crescimento e desenvolvimento devido, principalmente, ao aumento 38
na absorção de nutrientes, especialmente o P (SMITH e READ, 2008). Além disto, têm 39
maiores atividades fotossintética, enzimática e produção de substâncias reguladoras de 40
crescimento. Essas alterações metabólicas podem contribuir significativamente no processo 41
produtivo de mudas em viveiros florestais (FERREIRA et al., 2010) e conferem às plantas 42
maior resistência aos efeitos provocados por estresses de natureza biótica ou abiótica, 43
possibilitando a adaptação ao ecossistema, bem como a maior sobrevivência de mudas 44
transplantadas (FILHO & NOGUEIRA, 2007). 45
O presente estudo teve como objetivo avaliar a eficiência da inoculação de FMA no 46
crescimento, nutrição e atividade enzimática de mudas clonais de cedro australiano em 47
viveiro comercial. 48
49
1 REVISÃO DE LITERATURA 50
1.1 Cedro Australiano (Toona ciliata) 51
O cedro australiano pertencente à família Meliaceae, é uma espécie originária das 52
regiões tropicais da Austrália, distribuindo-se no leste, desde Ulladulla, ao sul de Sidney no 53
Estado de New South Wales, até Atherton, no norte do estado de Queensland (GRIJPMA e 54
RAMALHO, 1969), ao longo de quase 3.200 km de extensão (IBF, 2016). 55
A espécie é de ampla distribuição natural também nos países do sudeste asiático 56
como Bangladesh, Birmânia, China, Filipinas, Índia, Indonésia, Malásia e Tailândia 57
(LAMPRECHT, 1990). O cedro australiano é a espécie do gênero Toona mais 58
abundantemente encontrada em seu habitat natural, abrangendo o oeste da Índia e Paquistão 59
até o sul da China e o sudoeste da Austrália (BYGRAVE e BYGRAVE, 2005). Porém, 60
configura uma das espécies vegetais mais ameaçadas de desaparecimento do mundo (IBF, 61
2016). 62
O gênero Toona, destaca-se pelo seu rápido crescimento e potencial produtivo 63
(BYGRAVE e BYGRAVE, 2005), por isto a espécie T. ciliata tem sido atualmente 64
introduzida em regiões tropicais e subtropicais, incluindo o Brasil (GRAU; ZAPATER; 65
NEUMANN, 2006), onde encontrou condições favoráveis para o seu desenvolvimento, 66
especificamente na região Sudeste e Sul da Bahia (CIFLORESTAS, 2019). 67
3
O cedro australiano é uma árvore de grande porte, podendo atingir até 50 m de altura 68
e 2 m de diâmetro (PINHEIRO et al, 2006) e possui tronco retilíneo, às vezes bifurcado, 69
(Figura 1A). A casca é grossa com deiscência em placas (Figura 1B), de coloração cinza a 70
marrom. 71
72
Figura 1. Tronco de cedro australiano, apresentando sapopemas baixas (A) e detalhe da 73
casca grossa e com deiscência em placas (B). Fonte: Pereira (2012). 74
Possui folhas alternas, pecioladas e paripenadas (Figura 2A). As flores são 75
unissexuais com 3 a 4 mm de comprimento (PINHEIRO et al., 2003), pendentes e de cor 76
branca (Figura 2A). O fruto é cápsula deiscente com 15 a 20 mm de comprimento (Figura 77
2B), castanho escuro, com lenticelas, abrindo-se do ápice em direção à base (SOUZA et al., 78
2010) (Figura 2C). As sementes são aladas e pequenas, de 10 a 20 mm de comprimento, de 79
cor castanho-clara e germinam de 7 a 21 dias, dependendo do vigor da semente e da 80
temperatura e umidade (GOUVÊA, 2005) (Figura 2D). 81
A B
A B
4
82
Figura 2. Detalhes de plantas de Toona ciliata var. australis, apresentando folhas e flores 83
(A), frutos do tipo cápsulas (B), abertura dos frutos (C) e sementes (D). Fonte: 84
www.plants.usda.gov 85
Esta espécie cresce em regiões com altitudes que variam de 0 até 1500 m. Prefere 86
precipitação anual entre 800 e 1800 mm, porém, não tolera longos períodos de 87
encharcamento, o que desacelera o seu crescimento (LAMPRECHT, 1990). A temperatura 88
média para o seu bom desenvolvimento está entre 20 e 26º C, apesar de sobreviver a 89
temperaturas mínimas pouco abaixo de 0º C, tolerando geadas leves (RIBEIRO et al., 2011). 90
O cedro australiano se desenvolve bem principalmente em solos profundos, úmidos e 91
com boa drenagem, preferencialmente naqueles com textura argilosa a areno-argilosa 92
(EMBRAPA, 2010). Além disso, possui pouca tolerância a solos ácidos e a solos rasos com 93
algum impedimento físico, podendo comprometer o seu estabelecimento e crescimento 94
(PINHEIRO et al., 2003). 95
Em clima apropriado, a espécie apresenta rápido crescimento, quando comparado ao 96
das espécies nativas brasileiras, chegando a atingir oito metros de altura e 15 cm de diâmetro 97
com três anos de idade (PINHEIRO et al., 1994). Além disso, possui a capacidade de 98
sobreviver a danos de seca, fogo e geada, brotando prontamente de todas as partes afetadas 99
(BYGRAVE, BYGRAVE, 2005). 100
A espécie é semelhante botanicamente a outras espécies nativas brasileiras da 101
Família Meliaceae, como a C. fissilis, a C. odorata (cedro) e a Swietenia macrophilla 102
(mogno) (LORENZI et al., 2003), muito procuradas pelas características de sua madeira, tais 103
DC
5
como cor, grã estreita e alta durabilidade. Portanto, seu uso representa uma alternativa para 104
reduzir a pressão de exploração destas espécies nativas. 105
No Brasil a espécie apresentou alta resistência ao ataque da broca-do-cedro 106
(Hypsipyla grandella), importante praga que afeta os cedros nativos e o mogno brasileiro 107
(BYGRAVE, BYGRAVE, 2005). Esta espécie é susceptível à Hypsipyla robusta, que causa 108
danos semelhantes ao do ataque de H. grandella, porém não há relatos de ocorrência de H. 109
robusta no Brasil (CUNNINGHAM et al., 2005). A principal praga que ataca o cedro 110
australiano são as formigas saúvas, sendo Atta sexdens rubropilosa (saúva-limão) e Atta 111
laevigata (saúva-cabeça-de-vidro) as espécies mais importantes. 112
Ainda aqui no Brasil, o cedro australiano encontrou condições favoráveis ao seu 113
desenvolvimento, que é comparável ao do eucalipto ainda que não seja equivalente. Em 114
plantios comerciais essa espécie tem o potencial para atingir um incremento médio anual em 115
torno de 20 a 30 m3 ha-1 ano-1, e no estado de Minas Gerais são encontrados plantios de 12 116
anos de idade com 20 m de fuste e 40 cm de diâmetro à altura do peito (KALIL FILHO; 117
WENDLING, 2012). 118
O cedro australiano possui amplo potencial para a silvicultura comercial (ARES e 119
FOWNES, 2000), nesse sentido, a implantação de plantios dessa espécie é economicamente 120
viável e proporciona um investimento lucrativo ao produtor (SOUZA et al., 2010). 121
Cultivado com o objetivo de fornecer madeira de qualidade para serrarias e indústrias 122
moveleiras, pode ser utilizado para fabricação de compensados, aglomerado, móveis, 123
esculturas, entalhes em portas e janelas, na construção de navios e aviões, fabricação de 124
lápis e instrumentos musicais. A sua madeira é marrom-avermelhada, de boa durabilidade, 125
fácil secagem e desdobro, macia e de textura grossa, com densidade aproximada de 0,33 a 126
0,60 g cm-3 (CIFLORESTAS, 2019). 127
A propagação do cedro australiano era até pouco tempo exclusivamente por sementes 128
(LORENZI et al. 2003; PINHEIRO et al. 2003), assim, o cultivo ficava restringido, uma vez 129
que a coleta anual de sementes é dificultada devido ao porte das árvores, a posição 130
desfavorável e rápida dispersão dos frutos (SOUZA et al., 2010). Porém, alguns avanços têm 131
surgido atualmente, no desenvolvimento de protocolos para a propagação vegetativa, como 132
por exemplo, os estudos de Souza et al. (2009), Benatti et al. (2012) e Silva et al. (2012). 133
Em termos de produção de mudas, a espécie possui exigências específicas. As 134
matrizes clonais do cedro australiano possuem alta exigência nutricional e do tipo de 135
substrato para que as mesmas alcançassem padrões aceitáveis de qualidade morfológica 136
(BENATTI et al., 2012). 137
6
1.2 Micorrízicas Arbusculares (MA) 138
1.2.1 Aspectos gerais 139
Micorrizas são associações simbióticas formadas por plantas e fungos de solo. 140
Estima-se que 80 a 90% das plantas terrestres, ou seja, cerca de 250.000 espécies, são 141
capazes de formar micorriza arbuscular (MA). A MA é a associação entre fungos do Filo 142
Glomeromycota (SCHŰΒLER et al., 2001) e raízes de Briófitas, Pteridófitas, 143
Gimnospermas e Angiospermas. 144
De acordo com a classificação atual, os FMA são divididos em 13 famílias, 19 145
gêneros e 214 espécies (Tabela 1). 146
147
Tabela1- Classificação dos fungos micorrízicos arbusculares. 148
Filo Glomeromycota Classe Glomeromycetes
Ordem Família Gênero Nº de espécies Glomerales Glomeraceae Glomus 105
Diversisporales Gigasporaceae Gigaspora 9 Scutellosporaceae Scutellospora 10
Racocetraceae Racocetra 9 Cetraspora 5
Dentiscutataceae Dentiscutata 7 Fuscutata 4 Quatunica 1
Acaulosporaceae Acaulospora 34 Kuklospora 2
Entrophosporaceae Entrophospora 2 Pacisporaceae Pacispora 7
Diversisporaceae Diversispora 4 Otospora 1
Paraglomerales Paraglomeraceae Paraglomus 3 Archaeosporales Geosiphonaceae Geosiphon 1
Ambisporaceae Ambispora 8 Archaeosporaceae Archaeospora 1
Intraspora 1 Total 13 19 214 Fonte: http:/ www.AMF-phylogeny.com. Data de acesso: 18 de maio de 2019. 149
150
Os FMA são biotróficos obrigatórios, assim, só se propagam quando associado a 151
uma planta viva. A simbiose é iniciada antes mesmo do contato físico entre fungo e a planta, 152
uma vez que primeiramente ocorre uma troca de sinais que provocam a liberação de 153
7
exsudados radiculares que estimulam a ramificação das hifas e germinação dos esporos 154
(BUEÉ et al., 2000; KIRIACHEK et al., 2009). Em seguida, os fungos penetram nas células 155
do córtex, dando origem ao micélio interno, vesículas e arbúsculos (HABT, 2000). 156
Estes micro-organismos não apresentam especificidade hospedeira, assim uma 157
espécie de planta pode ser colonizada por qualquer espécie de FMA, porém os efeitos da 158
simbiose diferem-se conforme a combinação hospedeiro-fungo (BRITO et al., 2017). 159
Também não há evidências de alterações morfológicas macroscópicas nas raízes colonizadas 160
(MOREIRA e SIQUEIRA, 2006), neste sentido, as MA se distinguem das demais micorrizas 161
por apresentarem crescimento intercelular no córtex das raízes e por formarem estruturas 162
específicas como arbúsculos na maior parte das famílias de plantas superiores (SMITH; 163
READ, 2008). 164
O estabelecimento das MA resulta, portanto, de uma sequência de eventos 165
coordenados pelo fungo e pela planta e suas interações, culminando em uma relação 166
mutualística caracterizada pela perfeita integração morfológica, bioquímica e funcional da 167
associação (SMITH e READ, 2008). A planta fornece fotoassimilados como lipídios e 168
carboidratos ao fungo e em troca este fornece água, compostos nitrogenados e fosfatados à 169
planta, configurando os principais benefícios desta simbiose. 170
Acredita-se que a micorriza é uma das mais bem-sucedidas estratégias de 171
bioproteção, tanto para a planta quanto para o fungo (GIANINAZZI–PEARSON, 1996). No 172
solo, as hifas dos FMA atuam como uma extensão do sistema radicular da planta, 173
aumentando a área de superfície de contato com o solo e, portanto, melhor acesso a regiões 174
da rizosfera. Desta maneira, há um aumento na absorção de nutrientes como o P (FREITAS 175
et al, 2006), N, K (GOVINDARAJULU et al., 2005), Ca e Mg (SCHIAVO et al., 2009) da 176
solução do solo e o aproveitamento de água (SMITH e READ, 2008). 177
Além destes benefícios, os FMA promovem redução na incidência de ataques 178
patogênicos nas, aumentam a resistência ao déficit hídrico (MORATELLI et al., 2007) e a 179
tolerância das plantas a condições de estresses (SANNAZZARO et al., 2006). Plantas 180
micorrizadas apresentam maior atividade fotossintética, maiores atividade enzimática e 181
produção de substâncias reguladoras de crescimento, tudo isso possibilitar às elas melhor 182
adaptação ao ecossistema, bem como a maior capacidade de adaptação de mudas 183
transplantadas (FILHO e NOGUEIRA, 2007). 184
Os FMA contribuem também para o aumento da biomassa microbiana em solos 185
(OLSSON e WILHELMSSON, 2000), favorecendo a formação e estabilidade de agregados, 186
8
pela ação física do micélio fúngico e através da ação da glicoproteína glomalina, que é 187
secretada por esses fungos (RILLIG e MUMMEY, 2006). 188
A exploração da simbiose mutualística estabelecida pelos FMA e raízes das plantas, 189
em ambientes naturais e agronômicos é de alto valor ambiental e econômico (BONFANTE e 190
ANCA, 2009). No entanto, alguns fatores influenciam o processo de estabelecimento e 191
regulação desta relação, como por exemplo, a disponibilidade de P, que inibe o processo 192
simbiótico (MOREIRA e SIQUEIRA 2006, MOREIRA et al., 2018) e a microbiota do solo, 193
que interfere na simbiose por atuar na translocação de nutrientes, competindo por eles, 194
especialmente fosfatos ou, contrariamente, atuando sinergicamente com os FMA por meio 195
de efeitos combinados sobre o crescimento da planta (MOREIRA e SIQUEIRA, 2006; 196
SMITH e READ, 2008). 197
198
1.2.2 FMA em mudas de cedro 199
A simbiose de fungos e espécies florestais é fundamental para desenvolvimento das 200
plantas (CARNEIRO et al., 2004). Alguns trabalhos relacionam a nutrição de diversas 201
espécies florestais à presença das MA, que podem diminuir as deficiências nutricionais 202
decorrentes dos solos de baixa fertilidade natural (LACERDA et al., 2011). Desta maneira, 203
torna-se essencial o conhecimento das relações ecológicas e as exigências nutricionais das 204
espécies, auxiliando o desenvolvimento de tecnologias para se obter mudas vigorosas 205
destinadas aos plantios comerciais com diversos fins, bem como aos programas de 206
revegetação. 207
A inoculação de FMA em mudas de espécies florestais favorece o seu crescimento 208
inicial na fase de viveiro e, posteriormente, o seu estabelecimento no campo, com 209
consequente incremento de vigor (ZANGARO e ANDRADE 2002), uma vez que, nessa 210
associação as plantas são beneficiadas pelo aumento de absorção de água e nutrientes, 211
principalmente de P (MOREIRA e SIQUEIRA, 2006). Além disto, a associação micorrízica 212
pode prolongar a vida da raiz e proteger a planta de patógenos (ABBOTT; ROBSON, 1991). 213
Portanto, os FMA são de grande interesse ecológico e econômico, principalmente 214
porque, em geral, a produção de madeira ocorre em solos de baixa fertilidade (SIQUEIRA, 215
1994). Nestas condições, os FMA podem atuar como alternativa à utilização de grandes 216
quantidades de fertilizantes químicos (SAGGIN JÚNIOR; SIQUEIRA, 1996), que implicam 217
no alto custo de produção e impactos ambientais. 218
9
Para se avaliar a resposta de uma planta à colonização micorrízica, diferentes 219
espécies de FMA devem ser testadas, sob as mesmas condições ambientais, para selecionar 220
os mais eficientes quanto à capacidade de proporcionar o crescimento de seu hospedeiro 221
(SAGGIN JÚNIOR e SIQUEIRA, 1995) e conferir à planta maior tolerância a estresses 222
ambientais de natureza biótica e abiótica (MOREIRA e SIQUEIRA, 2006), como ocorre no 223
transplantio de mudas para o campo (VANDRESEN et al., 2007). 224
Muitas essências florestais nativas como C. fissilis formam MA, podendo esta chegar 225
a 70 % colonização (SILVA et al., 2009). Mudas de cedro (Cedrella fissilis Vell.) 226
apresentaram elevada dependência micorrízica na fase de viveiro (ROCHA et al., 2006). No 227
estudo os autores anteriores observaram que entre os quatro FMA estudados, Glomus clarum 228
foi o mais eficiente em aumentar o crescimento e nutrição fosfatada das mudas, 229
principalmente quando os níveis de P disponível eram em torno de 12 mg dm-3. Este 230
benefício da inoculação em C. fissilis pode ser explicado pela alta dependência aos FMA 231
(PASQUALINI et al., 2007). Este mesmo autor e colaboradores observaram que entre 232
quatro espécies arbóreas nativas do Brasil, da Floresta Ombrófila Densa, a espécie C. fissilis 233
apresentou dependência micorrízica de 93 % e Cytharexylum myriantum (tucaneira) de 94 234
%. 235
Em solos de baixa fertilidade, a inoculação de FMA em mudas seminais de cedro 236
australiano aumentou a altura, diâmetro e estabelecimento das mudas no campo em relação 237
às plantas não inoculadas quando plantadas (FERREIRA et al., 2010). Os autores 238
observaram que a dose de P que proporcionou maiores benefícios da inoculação dos FMA 239
em relação às plantas não inoculadas foi de 25 mg kg-1 de P e que este efeito desapareceu 240
em doses de 250 mg kg-1. Em condições de aplicação de altas doses de P ao solo, os FMA 241
podem ser desnecessários à planta e a representar um gasto fotossintético (SIQUEIRA E 242
COLOZZI FILHO, 1986; BOLDT et al., 2011 e ADOLFSSON et al., 2015). 243
A produção de mudas de cedro australiano em bloco prensado, inoculadas com o 244
FMA Rhizophagus clarum de forma isolada e combinada com Gigaspora margarita, exibiu 245
resultados satisfatórios. Estes fungos, em ambas as condições de inoculação, apresentaram 246
maior eficiência em promover o crescimento das mudas, com incrementos de 165 e 155% na 247
altura e 54 e 46% para o diâmetro, respectivamente, em relação ao tratamento não inoculado 248
(CARMO et al., 2016). 249
Em outro estudo, mudas seminais de cedro australiano na ausência de adubação 250
fosfatada, quando inoculadas com os inóculos de FMA combinados G. margarita + G. 251
etunicatum, G. clarum + G. etunicatum e G. margarita + G. clarum + G. etunicatum, 252
10
apresentaram altura e diâmetro significativamente iguais às testemunhas contendo 50 e 100 253
mg dm-3 de P no solo, sem a presença de FMA. E ainda, quando comparadas às testemunhas 254
sem FMA com 50 mg dm-3 de P, o tratamento contendo a mistura de todas as espécies de 255
FMA, resultou no incremento superior de até 62 % no conteúdo de P. Em adição, todos os 256
todos os tratamentos contendo inóculo misto foram iguais ao tratamento sem FMA com 50 257
mg dm-3 de P em relação aos conteúdos de K (LIMA et al., 2015). 258
Plantas de cedro australiano inoculadas com inóculo misto de FMA Entrophospora 259
colombiana + Acaulospora morrowiae, 20 dias pós transplantio, nas doses 0,5 e 1,0 kg ha-1 260
de P, apresentaram os maiores conteúdos relativos de P na parte aérea, sendo estes 20,8 % e 261
20,4 %, respectivamente, e estes não diferenciaram dos tratamentos com E. colombiana e A. 262
morrowiae de forma isolada. Por outro lado, as plantas do tratamento sem fungo 263
apresentaram os menores conteúdos relativos de P nas três doses (0, 0,5 e 1 kg ha-1) de P, 264
sendo estes 8 %, 5 % e 7,4 %, respectivamente (CASARA, 2016). 265
266
1.2.3 Inoculantes 267
O tipo de inoculante a ser usado é essencial para o sucesso de um programa de 268
inoculação de mudas (BRUNDRETT et al., 1996). As características que o inoculante deve 269
apresentar são: ser adequado para armazenamento e transporte, ter aplicação fácil e uniforme 270
e ser compatível com a espécie hospedeira. O inoculante também deve ter boa qualidade 271
microbiológica, ausência de patógenos e de micro-organismos indesejáveis (BRUNDRETT 272
et al., 1996). 273
Apesar dos benefícios da inoculação, a oferta de inoculantes no mercado nacional é 274
limitada, e a importação destes implica na elevação dos custos de produção de mudas. A 275
inoculação de FMA apresenta limitações, principalmente devido à dificuldade de cultivo dos 276
FMA em condições axênicas. Uma vez que estes são biotróficos obrigatórios, os FMA não 277
são cultiváveis em meios artificiais (SILVEIRA, 1992), impossibilitando a produção de 278
inóculo e seu estudo separado da planta hospedeira (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). 279
Outro fator limitante trata-se da falta de tecnologia adequada para produção de 280
inoculantes de FMA, bem como a falta de interesse comercial pela sua produção e 281
distribuição, restringindo o seu uso na agricultura (SAGGIN JÚNIOR; LOVATO, 1999). E 282
ainda, deve-se considerar a compatibilidade entre os FMA e o uso de fertilizantes químicos, 283
que ainda são utilizados em larga escala tanto na produção de mudas quanto em campo, 284
11
causando redução da germinação de esporos e afetando a população de FMA no solo 285
(SILVEIRA, 1992). 286
No entanto, recentemente surgiu a perspectiva de mudanças neste cenário de 287
produção de inoculantes no Brasil. A empresa NovaTero anunciou a criação do primeiro 288
inoculante comercial à base de FMA com registro no Ministério da Agricultura, Pecuária e 289
Abastecimento- MAPA, o Rootella BR®. Testes de eficácia no milho e na soja foram 290
realizados em vários locais em todo o Brasil, sob condições climáticas variadas e em vários 291
tipos de solo. 292
O desempenho do Rootella BR® foi excepcionalmente bom, aumentando as colheitas 293
em mais de 11% para cada e qualquer tratamento, tanto para soja, quanto para o milho sob 294
todos os regimes de fertilização e em todos os locais (Groundwork BioAg, 2019). A maioria 295
das melhorias na colheita foi estatisticamente significativa e o impacto do Rootella BR® foi 296
geralmente maior sob taxas reduzidas de fósforo (Groundwork BioAg, 2019). 297
298
2 MATERIAL E MÉTODOS 299
2.1 Local do experimento 300
O estudo foi realizado no período de abril a outubro de 2018 no viveiro comercial de 301
mudas da empresa Bela Vista Florestal, localizado no município de Campo Belo, região 302
sudoeste de Minas Gerais, com sede nas coordenadas geográficas 20º 53’ 30’’S e 45º 16’ 303
15’’ W e altitude média de 945 m. Segundo a classificação climática de Köppen, o clima da 304
região é classificado como Cwa: subtropical, chuvoso e mesotérmico. A temperatura média 305
anual do município é de 23,5 ºC, a máxima 30 ºC e a mínima 10 ºC e a precipitação média 306
anual de 1250 mm (INMET, 2019). 307
308
2.2 Delineamento experimental 309
O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado e os 310
tratamentos dispostos em esquema fatorial 2x4, sendo: mudas dos clones BV1120 e BV1321 311
de cedro australiano não inoculadas (Controle), inoculadas com inoculante comercial 312
Rootella BR® e inoculadas com a mistura de inoculantes dos FMA Claroideoglomus 313
etunicatum e Acaulospora morrowiae (MIX) e crescidas em substrato com redução da 314
adubação fosfatada; mais o controle não inoculado e crescidas sem redução da adubação 315
12
fosfatada (Comercial). Os tratamentos possuíam cinco repetições e parcela experimental foi 316
composta por 10 mudas. 317
318
2.3 Inoculantes micorrízicos 319
O inoculante comercial Rootella BR® foi cedido pela empresa NovaTero. Os 320
inoculantes de Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora morrowiae foram produzidos 321
pelo Laboratório de Microbiologia do Solo da Universidade Federal de Lavras- UFLA sob 322
cultivo de Brachiaria decumbes inoculada e crescida por 90 dias em mistura de areia e solo 323
esterilizado (SILVA, 2000). Estes inoculantes foram compostos de uma mistura de solo, 324
areia, esporos, hifas e raízes colonizadas. Para caracterização dos inoculantes amostras 325
foram obtidas e submetidas ao peneiramento úmido em peneiras sequenciais de 710, 250, 53 326
e 38 mm de abertura de malha, seguida de centrifugação em água, por três minutos a 3000 327
rpm, e em sacarose 50% durante dois minutos a 2000 rpm (JENKINS, 1964), e 328
posteriormente, efetuada a contagem do número de esporos em microscópio estereoscópico 329
. O número de esporos observado foi de 144 esporos mL-1 para C. etunicatum com 144 e 47 330
esporos mL-1 para A. morrowiae com. 331
332
2.4 Substrato de produção das mudas, fertilização e inoculação 333
O substrato de produção de mudas foi uma mistura 6:1:1 (por volume) de casca de 334
pinus, vermiculita fina e casca de arroz carbonizada. Para a produção das mudas do 335
Comercial, a adubação do substrato foi aquela utilizada na rotina do viveiro da empresa Bela 336
Vista Florestal, sendo: 357 mg dm-3 de P (Super Simples com 18 % de P2O5); 95 mg dm-3 de 337
N e 104 mg dm-3 de S (sulfato de amônio - (NH4)2 SO4 com 21 % N e 23 % S); 238 mg dm-3 338
de K (cloreto de potássio - HCl com 52 % K). Para os tratamentos inoculados e o Controle a 339
dose de P aplicada na forma de Super Simples foi reduzida em dez vezes. Esta redução foi 340
feita visando evitar a inibição de formação de micorrizas arbusculares. 341
Após a homogeneização e adição de fertilizantes, o substrato foi umedecido com 10 342
% do seu volume em água e em seguida o inoculante foi adicionado nos tratamentos 343
correspondentes. O primeiro tratamento recebeu 100 g do inoculante Rootella BR® e o 344
segundo uma mistura dos inóculos de FMA contendo 22 g do inóculo Claroideoglomus 345
etunicatum + 65 g de Acaulospora morrowiae. Ao substrato do Controle foram adicionados 346
87 mL de uma suspensão obtida pela mistura do inoculante contendo C. etunicatum + A. 347
13
morrowiae em água na proporção 1:2 para simular a adição dos inoculantes nos tratamentos 348
inoculados, porém sem adicionar os fungos micorrízicos. O tratamento Comercial não 349
recebeu qualquer tipo de inoculante. 350
O substrato foi acondicionado em tubetes de 55 cm3, previamente lavados em água 351
corrente e desinfetados por imersão em água a 85 oC por 10 segundos. Como o enchimento 352
dos tubetes foi com auxílio de máquina vibratória, cada um recebeu aproximadamente 77 353
cm3 de substrato, e, portanto, cada muda do tratamento Comercial recebeu 27,5 mg de P e as 354
mudas os demais tratamentos receberam 2,75 mg de P. 355
356
2.5 Plantio de miniestacas e condução do experimento 357
As miniestacas dos clones BV1120 e BV1321 coletadas do minijardim clonal com 6 358
a 8 cm de comprimento e com dois pares de folhas foram colocadas nos substratos com os 359
tratamentos. Estes clones foram escolhidos por apresentarem maior importância comercial 360
para a empresa, uma vez que se adaptam bem em diversas regiões. Ambos apresentam 361
densidade média de madeira de 400 kg m-3 para plantas com 15 anos. 362
As mudas foram acondicionadas em casa de vegetação, com irrigação por 363
microaspersão com lâmina de água 1 mm e turno de rega de 30 minutos nos primeiros 20 364
dias e de 50 minutos do 20º ao 30º dia. Ainda na casa de vegetação, as mudas receberam 365
fertirrigação semanalmente, aplicada com pulverizador costal na proporção de 1 mL L-1 do 366
formulado ProAqua® (produzido por PRODUQUIMICA AGRO), contendo 12 g kg-1 de N, 367
40 g kg-1 de P2O5, 12 g kg-1 de K2O, 0,03 g kg-1 de B, 0,05 g kg-1 de Cu, 0,1 g kg-1 de Mn, 368
0,02 g kg-1 de Mo e 0,1 g kg-1 de Zn. Após 30 dias, as mudas foram transferidas para casa 369
de sombra, onde permaneceram por 15 dias, e receberam semanalmente a mesma 370
fertirrigação descrita acima. 371
Quarenta e cinco dias após o estaqueamento, as mudas foram realocadas da casa de 372
sombra para o canteiro a pleno sol, onde permaneceram até o 181º dia. No viveiro as mudas 373
receberam em média seis irrigações diárias de 8 minutos, e a nutrição foi feita com 374
fertirrigação de rustificação a pleno sol. 375
376
2.6 Avaliações e colheita do experimento 377
A sobrevivência, altura da parte aérea e diâmetro do coleto das mudas foram 378
avaliados aos 90 e 180 dias após o estaqueamento. No 181º dia, os teores de clorofila A e B 379
14
foram mensurados, utilizando o medidor eletrônico de teor de clorofila clorofiLOG – 380
CFL1030 em uma folha escolhida aleatoriamente do terço médio, sendo expressos em índice 381
de clorofila Falker (ICF). Em seguida, as mudas foram cortadas rente ao tubete, separando a 382
parte aérea das raízes. Os torrões, raízes mais substrato foram removidos do tubete e 383
atribuídas notas de 1 a 3 à sua formação (Figura 3). Em seguida, as raízes foram lavadas em 384
água corrente para a remoção do substrato e obtenção de uma sub-amostra de raízes das 10 385
mudas da parcela experimental, que compuseram uma amostra de raízes composta da 386
parcela experimental. Estas amostras de raízes foram armazenadas em solução de álcool 387
etílico para posterior determinação da porcentagem colonização por FMA 388
(GIOVANNETTI; MOSSE, 1980). O restante das raízes e a parte aérea foram 389
acondicionados em sacos de papel e secos até peso constante em estufa de circulação de ar 390
forçada a 65 ºC, para determinação da massa seca da parte aérea (MSPA), massa seca de 391
raízes (MSR), cálculo da massa seca total (MST), da razão raiz/parte aérea (R/PA) e do 392
Índice de Qualidade de Dickson (IQD) (DICKSON; LEAF; HOSNER, 1960). O IQD foi 393
calculado pela fórmula: IQD=(MST)/[(H/D)+(MSPA/MSR)]. 394
395
396
Figura 3. Características dos torrões das raízes das mudas de cedro australiano correspondentes às notas: 397
a) Nota 3 – torrão firme e bem enraizado; b) Nota 2 – torrão moderadamente firme e parcialmente 398
enraizado; c) Nota 1 – torrão fraco e mal enraizado. 399
400
401
402
403
A CB
15
2.7 Análise nutricional das mudas 404
Após pesagem, a massa seca da parte aérea foi moída em moinho tipo Willey com 405
peneira de 40 mesh (0,42 mm de abertura). As amostras foram digeridas em solução 406
sulfúrica para determinação do N pelo método micro Kjeldahl (destilação) e submetidas à 407
digestão nítrica (HNO3) em sistema fechado em forno micro-ondas, para determinação dos 408
teores de P, K, Ca, Mg, Fe, Zn, Mn na parte aérea das mudas (OBARA et al, 2009). O teor 409
de P foi determinado por colorimetria; K por fotometria de chama; Ca, Mg, Fe, Zn e Mn por 410
espectrofotometria de absorção atômica (MALAVOLTA et al., 1997). 411
412
2.8 Porcentagem de colonização micorrízica 413
As amostras de raízes armazenadas em álcool etílico 50% foram despigmentadas em 414
solução de KOH 10% por uma hora e solução de HCl 1% por 5 minutos (KOSKE e 415
GEMMA, 1989). Em seguida, as estruturas fúngicas coradas em solução de azul de tripano 416
em lactoglicerol 0,05% (PHILLIPS; HAYMAN, 1970) por 2 minutos em banho-maria à 70 417
ºC. A porcentagem do comprimento radicular colonizado foi determinada pelo método de 418
interseção em placas reticuladas (GIOVANNETTI; MOSSE, 1980). 419
420
2.9 Atividade de enzimas nas folhas 421
2.9.1 Obtenção dos extratos enzimáticos 422
Para a determinação da atividade das enzimas Catalase (CAT) e Superóxido 423
Dismutase (SOD) foram utilizados extratos enzimáticos obtidos através da homogeneização 424
de 80 mg de amostra foliar fresca macerada em cadinho, em nitrogênio líquido. Em seguida, 425
foram adicionados 5 mL de solução de extração composta por uma solução tampão de 426
fosfato de potássio 100 mM (17,41 g L-1 de fosfato de potássio dibásico + 16,60 g L-1 de 427
fosfato de potássio monobásico) com pH 7,5, adicionada de 0,372 g L-1 de EDTA (Ácido 428
Etilenodiamino Tetra-acético), 0,462 g L-1 de ditiotreitol e 0,3 g L-1 de polivinil-poli-429
pirrolidona. Após homogeneização o extrato foi centrifugado por 20 minutos a 8.000 rpm a 430
4 ºC. O sobrenadante foi armazenado em Eppendorf e utilizado no mesmo dia nas avaliações 431
enzimáticas, mantido em banho de gelo. Toda vidraria utilizada na manipulação do extrato 432
16
foi deixada anteriormente em freezer a -18 ºC, por pelo menos 4 horas para evitar atividade 433
das enzimas. 434
435
2.9.2 Catalase (CAT) 436
Para determinar a atividade da CAT, em 150 μL do extrato enzimático bruto foram 437
adicionados 1.950 μL de solução tampão de fosfato 100 mM TKF a pH 7,5, 750 μL de meio 438
de reação, constituído de peróxido de hidrogênio 50 mM (H2O2) e 150 μL de solução 439
tampão de extração (descrita no item anterior). A atividade da enzima foi determinada pelo 440
monitoramento do decréscimo da absorbância a 240 nm, no intervalo de 40 segundos após o 441
início da reação, por 2 minutos (HAVIR e McHALE, 1987). A atividade enzimática (A) foi 442
calculada conforme a Equação (1), utilizando o coeficiente de extinção do peróxido de 443
hidrogênio 39,4 mM min-1 (LIMA e MONTEIRO, 2017). 444
(ΔAbs.Vcubeta. Vextrato)
(εH2O2. Vctf. t. Mf) 445
Em que: 446
A= Atividade Enzimática; 447
ΔAbs = Absorbância final – Absorbância inicial; 448
εH2O2 = coeficiente de extinção molar para o H2O2 (39,4 mM cm -1); 449
Vcubeta = Volume da cubeta utilizada (3 mL); 450
VExtrato = Volume de extrato enzimático utilizado na reação; 451
Vctf = Volume após centrifugação; 452
t = tempo de reação em minutos; 453
Mf = Massa fresca (g) 454
Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima 455
que converte 1 μmol de H2O2 em seu radical cátion por minuto, por gramas de massa fresca. 456
457
2.9.3 Superóxido Dismutase (SOD) 458
Para determinação da atividade da SOD, em 50 μL do extrato enzimático foram 459
adicionados 2.000 μL de solução de tampão (TKF 100 mM, pH 7,5), 250 μL da solução de 460
A (U/Mf) = (1)
17
Cloreto de Azul Nitrotetrazólio (8,1 mg em 25 mL de água), 200 μL de solução 3,684 g L-1 461
de EDTA, 250 μL de solução 7,4 mg L-1de Riboflavina e 250 μL de solução 0,2238 g L-1 de 462
Metionina. 463
O cálculo da atividade de SOD foi determinado a partir do incremento da 464
absorbância na leitura da amostra a 560 nm (Equação 2), da porcentagem de inibição 465
(Equação 3) e a Unidade de SOD (Equação 4). 466
467
LA = LA– LBA 468
469
470
471
472
473
474
475
Em que; 476
LA = Leitura da amostra 477
LBA = Leitura do branco da amostra 478
LBS = Leitura do branco da solução 479
Uma unidade da SOD foi definida como a quantidade de enzima necessária para 480
inibir em 50% a fotorredução do NBT (BEAUCHAMP & FRIDOVICH, 1971). 481
482
2.10 Análises estatísticas 483
Os dados referentes à formação do torrão, avaliados por notas, foram submetidos a 484
uma análise de frequência. A porcentagem do comprimento radicular colonizado e 485
sobrevivência foram transformadas usando ln (x+2), por não seguirem distribuição normal 486
e/ou por serem inferiores a 30 %. Os demais dados foram submetidos à análise de variância 487
e quando significativas, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5 % de 488
significância. Os efeitos dos clones foram comparados pelo teste F a 5 % de significância. 489
490
3 RESULTADOS 491
3.1 Sobrevivência, crescimento e colonização das raízes 492
LBS - LA LBS
% inibição 0,5
(3)
U = (4)
% inibição =
(2)
18
A sobrevivência, diâmetro do coleto, massa seca de raízes (MSR), razão raiz parte 493
aérea (R/PA) e Índice de Qualidade de Dickson (IQD) foram influenciadas apenas pelos 494
clones (P < 0,05) (Tabela 2). A massa seca da parte aérea (MSPA) e massa seca total (MST) 495
foram influenciadas pela inoculação com redução das doses de P no substrato e pelos clones 496
(P < 0,05), porém não foi observada interação entre os efeitos de inoculação e redução da 497
adubação versus clone (P > 0,05) (Tabela 2). As demais características avaliadas não foram 498
influenciadas (P > 0,05) pelos tratamentos, sendo em média de 13,9 cm para altura da parte 499
aérea e de 36,8 para clorofila total. A percentagem de colonização foi influenciada apenas 500
pela inoculação e redução das doses de P no substrato (P < 0,05) (Tabela 2). 501
As estacas do clone BV1120 sobreviveram 10,3 % mais que aquelas do clone 502
BV1321, mas em geral este último cresceu mais que o primeiro, sendo o diâmetro do coleto 503
24,3 % maior, a MSPA 25 % maior, a MST 31 % maior, a MSR 38,6 % maior, R/PA 18,3 % 504
e o IQD 45,7% maior (tabela 2). 505
A frequência de nota máxima (3) para formação do torrão das raízes foi sempre 506
maior do que a frequência de torrões moderadamente firmes e parcialmente enraizados (2) e 507
de fracos e mal enraizados (1) para ambos os clones e em todas as condições de inoculação e 508
adubação (Figura 4). No clone BV1321, a soma da frequência de torrões firmes e bem 509
enraizados e firme e parcialmente enraizados (notas 3 e 2) foi maior nas mudas inoculadas e 510
na seguinte ordem: inoculadas com MIX (92 %) > inoculadas com Rootella BR (86 %) > 511
Comercial (84 %) > Controle (76 %), ou seja, a frequência de torrões fracos e mal 512
enraizados foi menor nas mudas inoculadas (Figura 4). No BV1120, a frequência de notas 3 513
nas mudas inoculadas com MIX e Rootella BR foram maiores que as do Controle e 514
próximas das do Comercial (Figura 4). A soma da frequência de torrões firmes e bem 515
enraizados (notas 3) e firme e parcialmente enraizados (notas 2) foi na seguinte ordem do 516
maior para o menor: Comercial (88 %) > inoculadas com MIX (86%) > inoculadas com 517
Rootella BR (80 %) > Controle (76 %). 518
A inoculação com Rootella BR® aumentou a MSPA e MST dos dois clones, sendo na 519
média destes, a MSPA 37,1 % maior que as do Controle e 33,4 % maior do que as do 520
Comercial e a MST 32,8 % maior que as do Controle e 31 % maior do que as do Comercial 521
(Tabela 2). Nas plantas inoculadas com a mistura do inoculante de C. etunicatum e A. 522
morrowiae a MSPA e MST não diferiu das demais condições de inoculação. A MSPA e 523
MST das mudas do BV1321 foram 25 % e 31 %, respectivamente, maiores do que as do 524
BV1120 (Tabela 2). 525
19
O IQD foi influenciado apenas pelos clones (p < 0,05), sendo maior nas mudas do 526
BV1321 que no BV1120 e igual entre as mudas com diferentes condições de inoculação e 527
adubação (Tabela 2). Na média entre os dois clones, esta variável apresentou tendência de 528
aumento nas mudas inoculadas com Rootella BR®, seguindo a ordem decrescente: Rootella 529
BR®, MIX, Comercial e Controle (Tabela 2). 530
A maior porcentagem de colonização micorrízica foi observada nas mudas 531
inoculadas com a mistura C. etunicatum e A. morrowiae, sendo esta 29,3 % maior que a 532
observada para Rootella BR®, 62,1 % maior que o Controle e 69,4 % maior que o Comercial 533
(Tabela 2). 534
535
Tabela 2 – Sobrevivência, diâmetro do coleto, massa seca de raízes (MSR), massa seca de parte 536
aérea (MSPA), massa seca total (MST), razão raiz/parte (R/PA), porcentagem de colonização e 537
Índice de Qualidade de Dickson (IQD) das mudas dos clones BV1120 e BV1321 de cedro 538
australiano não inoculadas (Controle), inoculadas com inoculante comercial Rootella BR® e 539
inoculadas com a mistura de inoculantes dos FMA Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora 540
morrowiae (MIX) e crescidas em substrato com redução da adubação fosfatada; mais o 541
controle não inoculado e crescidas sem redução da adubação fosfatada (Comercial). 542
Clones Clones Tratamentos BV1120 BV1321 Média BV1120 BV1321 Média
--------- Sobrevivência, % --------- --- Diâmetro do coleto, mm --- Comercial 68,0 60,0 64,0 2,9 3,8 3,4 Controle 58,0 54,0 56,0 2,9 3,6 3,3 MIX 64,0 58,0 61,0 2,9 3,8 3,4 Rootella BR 62,0 54,0 58,0 2,9 4,0 3,4 Média 63,0 a1/ 56,6 b 59,7 2,9 b 3,8 a 3,4
-------- MSR, mg planta-1--------- -------- MSPA, mg planta-1 -------- Comercial 530 824 677 899 A 981 B 941 Controle 571 797 684 832 A 947 B 889 MIX 612 1011 811 927 A 1209 AB 1068 Rootella BR 646 1211 928 1036 A 1790 A 1413 Média 590 b 960 a 775 923 b 1232 a 1078
-------- MST, mg planta-1 -------- -------- R/PA, mg planta-1 -------- Comercial 1429 A 1805 B 1617 0,67 0,85 0,77 Controle 1402 A 1744 B 1573 0,73 0,85 0,79 MIX 1538 A 2219 AB 1879 0,65 0,84 0,75 Rootella BR 1683 A 3001 A 2342 0,63 0,73 0,68 Média 1513 b 2192 a 1852 0,67 b 0,82 a 0,74
-------- Colonização, % -------- -------- IQD -------- Comercial 8,4 10,6 9,5 C 0,19 0,28 0,24 Controle 10,9 12,7 11,8 C 0,18 0,28 0,23 MIX 30,5 31,8 31,1 A 0,19 0,38 0,29 Rootella BR 22,2 21,8 22,0 B 0,21 0,43 0,32 Média 18,0 19,21 18,6 0,19 b 0,35 a 0,27
1/ Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5 % 543
de probabilidade e médias seguidas de mesma letra minúscula na linha não diferem entre si pelo teste 544
F ao nível de 5 % de significância. 545
20
Comercial Controle MIX Rootella BR
Freq
uênc
ia d
e no
tas à
form
ação
de
torr
ão, %
0
10
20
30
40
50
60
70
Fraco e mal enraizado (1)Firme e parcialmente enraizado (2)
Firme e bem enraizado (3)
Comercial Controle MIX Rootella BR
BV1321BV1120
546
547
Figura 4 - Frequência das notas atribuídas à formação das raízes das mudas dos clones BV1120 e 548
BV1321 de cedro australiano não inoculadas (Controle), inoculadas com inoculante comercial Rootella 549
BR® e inoculadas com a mistura de inoculantes dos FMA Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora 550
morrowiae (MIX) e crescidas em substrato com redução da adubação fosfatada; mais o controle não 551
inoculado e crescidas sem redução da adubação fosfatada (Comercial). As frequências médias foram 552
obtidas de 40 parcelas com 10 plantas cada. 553
554
555
556
3.2 Teores de nutrientes 557
As plantas, em todas as condições de inoculação, independente dos clones, 558
visualmente não apresentaram sintomas de deficiência nutricional (Figura 5). 559
560
Figura 5- das mudas dos clones BV1120 e BV1321 de cedro australiano não inoculadas 561
(Controle), inoculadas com inoculante comercial Rootella BR® e inoculadas com a mistura 562
de inoculantes dos FMA Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora morrowiae (MIX) e 563
crescidas em substrato com redução da adubação fosfatada; mais o controle não inoculado e 564
crescidas sem redução da adubação fosfatada (Comercial). 565
21
566
Os teores de P e N foram influenciados (p ≤ 0,05) pela condição de inoculação, e 567
esse efeito foi dependente dos clones, os teores de K, Fe, Mn e Zn foram influenciados (p ≤ 568
0,05) pelos clones e os teores de Mn apenas pela condição de inoculação (Tabela 3). Os 569
teores de Ca e Mg não foram influenciados (p > 0,05) pelas condições de produção de 570
mudas e clones (Tabela 3), sendo em média 10,3 g kg-1 e 2,4 g kg-1, respectivamente. 571
Nos dois clones, os teores de P foram maiores nas mudas inoculadas do que as do 572
Controle, não inoculadas com redução da adubação fosfatada no substrato de produção das 573
mudas (Tabela 3). Esse aumento foi semelhante independente do inoculante ou do clone e 574
foi em média de 21,2 %. Ainda assim, nas mudas do Comercial, os teores de P foram 575
maiores do que nas mudas inoculadas, sendo em média essa diferença de 24 % no clone 576
BV1120 e de 7 % no BV1321 (Tabela 3). 577
No clone BV1120, a inoculação com Rootella BR® diminuiu os teores de N nas 578
plantas em relação às demais condições de inoculação que não diferiram entre si (Tabela). 579
Nas mudas do BV1321, os teores de N das mudas do Comercial foram 25,3 % maiores do 580
que as do Controle, porém ambas não diferiram das mudas inoculadas (Tabela 3). 581
Os teores de K, Fe e Zn na parte aérea das mudas foram em média maiores no clone 582
BV1120 do que no BV132, sendo essa diferença de 25 % para o K, 19 % para o Fe e 12 % 583
para o Zn (tabela 3). Os teores de Mn foram maiores nas mudas do tratamento Comercial do 584
que das do Controle, independente do clone, e estes não diferiram dos tratamentos 585
inoculados (Tabela 3). 586
587
588
589
590
591
592
593
594
595
596
597
22
Tabela 3 – Teores de P, N, Fe, K, Zn e Mn na parte aérea das mudas dos clones BV1120 e 598
BV1321 de cedro australiano não inoculadas (Controle), inoculadas com inoculante 599
comercial Rootella BR® e inoculadas com a mistura de inoculantes dos FMA 600
Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora morrowiae (MIX) e crescidas em substrato com 601
redução da adubação fosfatada; mais o controle não inoculado e crescidas sem redução da 602
adubação fosfatada (Comercial). 603
Clones Clones Tratamentos BV1120 BV1321 Média BV1120 BV1321 Média
----------------- P, g kg-1 -------------- -------------- N, g kg-1 -------------- Comercial 1,32 Aa1/ 1,10 Ab 1,21 26,3 Aa 27,7 Aa 27,0 Controle 0,72 Cb 0,88 Ca 0,80 25,7 Aa 20,7 Bb 23,2 MIX 0,98 Ba 1,03 Ba 1,01 25,9 Ab 25,3 ABb 25,6 Rootella BR® 1,03 Ba 1,02 Ba 1,03 19,4 Bb 24,9 ABa 22,1 Média 1,02 1,01 1,01 24,32 24,65 24,48
-------------- Fe, mg kg-1-------------- -------------- K, g kg-1-------------- Comercial 166 138 152 29,8 23,6 26,7 Controle 141 128 135 27,6 20,6 24,1 MIX 158 128 143 28,6 21,3 24,9 Rootella BR® 185 133 159 26,2 18,8 22,5 Média 163 a 132 b 147 28,1 a 21,1 b 24,6
-------------- Zn, mg kg-1-------------- -------------- Mn, mg kg-1-------------- Comercial 31,3 29,4 30,4 23,8 25,7 24,8 A Controle 30,5 27,7 29,1 22,4 23,8 23,1 AB MIX 29,9 26,7 28,3 21,3 20,2 20,7 AB Rootella BR® 32,6 25,6 29,1 22,6 18,4 20,5 B Média 31,1 a 27,48 b 29,24 22,5 22,0 22,3 1/ Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5 % 604
de probabilidade e médias seguidas de mesma letra minúscula na linha não diferem entre si pelo teste 605
F ao nível de 5 % de significância. 606
607
3.3 Atividade enzimática 608
As atividades das enzimas CAT e SOD foram influenciadas (p ≤ 0,05) pelas 609
condições de inoculação das mudas independente dos clones (Figura 6 A e B). Nos dois 610
clones, a atividade da CAT foi maior nas mudas inoculadas e com redução da adubação 611
fosfatada no substrato de crescimento das mudas do que as mudas do Comercial, no entanto 612
foram iguais as das mudas do Controle (Figura 6 A). A inoculação das mudas com MIX ou 613
Rootella BR® em substrato com menor dose de fertilizante fosfatado aumentou em média a 614
atividade da CAT em 51 % em relação às mudas do Comercial. (Figura 5 A). 615
A atividade de SOD nas mudas inoculadas com MIX foi, média dos clones, 33 % 616
maior do que as do Controle e 64 % maior do que as do Comercial (Figura 6B). Já nas 617
mudas inoculadas com Rootella BR® a atividade de SOD foi, média dos clones, 56 % maior 618
do que nas mudas do Comercial e não diferiu das mudas do Controle. 619
23
Comercial Controle MIX Rootella BR
Cat
alas
e, U
ngM
f -1
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
AB
B
A A
Comercial Controle MIX Rootella BR
Supe
róxi
do d
ism
utas
e, U
gM
f -1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
B
C
AB
A
620
621
622
Figura 6- Atividades de Catalase (CAT) (A) e Superóxido dismutase (SOD) (B) médias das 623
mudas dos clones BV1120 e BV1321 de cedro australiano não inoculadas (Controle), 624
inoculadas com inoculante comercial Rootella BR® e inoculadas com a mistura de 625
inoculantes dos FMA Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora morrowiae (MIX) e 626
crescidas em substrato com redução da adubação fosfatada; mais o controle não inoculado e 627
crescidas sem redução da adubação fosfatada (Comercial). 628
629
630
4 DISCUSSÃO 631
A promoção do crescimento (tabela 2) e nutrição (tabela 3) de mudas de cedro 632
australiano pelo uso de inoculantes de FMA observada no presente trabalho também foi 633
observada por Lima et al., (2015), Carmo et al., (2016) e Silva et al., (2017). No presente 634
trabalho o efeito benéfico da inoculação de FMA foi, em geral, dependente do clone e 635
caracterizado pela maior MSPA e MST das mudas do clone BV1321 inoculadas com 636
Rootella BR em relação às mudas do Controle e do Comercial (tabela 2), pela menor 637
frequência de torrões fracos e mal enraizados nas mudas dos dois clones e com os dois 638
inoculantes (figura 4), pelos maiores teores de P nos dois clones inoculados em relação às 639
mudas do Controle (tabela 3), pelo aumento das atividades das enzimas SOD e CAT e pela 640
tendência de aumento do IQD. Em cedro australiano inoculado com A. colombiana + A. 641
morrowiae foi observado aumento de 13,3 % na MSPA (CASARA, 2016) e, portanto menor 642
do que os 28,3 % observado neste trabalho (tabela 2). Porém, os aumentos de 36,8 % 643
observado para MSPA e 33,2 % para MST nas mudas do BV1321 inoculadas em relação as 644
do Controle são inferiores aos aumentos de 494 % na MSPA e de 339 % na MST 645
observados em mudas inoculadas com G. clarum (CARMO et al.,2016) e aos aumentos na 646
MSPA de 2248 % em mudas inoculadas com Claroideoglomus etunicatum e de 1190 % 647
A B
24
naquelas inoculadas com Acaulospora colombiana (SILVA et al., 2017). Algumas 648
diferenças nas condições experimentais no presente estudo podem justificar este menor 649
benefício. Nos estudos citados anteriormente as mudas foram produzidas em tubetes ou 650
vasos com volume de substrato de 3 a 54 vezes maior que o utilizado neste estudo, em 651
tubetes de 55 cm3. Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação, cujas 652
condições de temperatura e umidade são facilmente controláveis, e neste as mudas ficaram 653
acondicionadas a maior parte do tempo em canteiro a pleno sol, e, apesar da redução da 654
adubação fosfatada estas mudas recebiam irrigações e fertirrigações com P frequentes. 655
O bom desenvolvimento da parte aérea e radicular, consequentemente a total, 656
comprova a eficiência dos inoculantes de FMA no aumento do vigor das mudas, que, 657
quando transplantadas em campo poderão apresentar maior sobrevivência, crescimento, 658
produtividade e tolerância a condições de estresse bióticos e abióticos. O aumento na MSPA 659
e MST promovido pelo uso do inoculante comercial Rootella BR apenas no clone BV1321 660
indica que os clones de cedro australiano diferem quanto à resposta à inoculação de FMA e 661
com isto poderia permitir a seleção de clones mais responsivos as MA e menos dependentes 662
da adubação fosfatada. 663
A porcentagem do comprimento radicular colonizado observada nas mudas 664
inoculadas, entre 21,8 e 31,8 % (Tabela 2), está dentro da faixa de 4,0 a 68,0 % observada 665
também em cedro australiano inoculado com 10 FMA (FOGAÇA, 2010) e da faixa de 20,0 a 666
39,0 % observada em plântulas de C. fissillis (cedro), Guarea kunthiana (figo-do-mato), 667
Trichilia casaretti C. DC. (catiguá-vermelho) e Trichilia claussenii (catiguá), todas 668
pertencentes também à família Meliaceae (ZANGARO et al., 2002). Porém, essa 669
colonização observada nas mudas inoculadas foi menor do que os 72,5 % observados em 670
mudas de cedro australiano inoculadas com A. morrowiae e 72,7% naquelas inoculadas com 671
E. colombiana + A. morrowiae (CASARA, 2016). As maiores porcentagens de colonização 672
observadas por Casara, (2016) em relação às do presente estudo podem ser devido à 673
ausência total de adubação fosfatada à qual as mudas foram submetidas, ao volume e 674
qualidade melhores de substrato usado, uma vez que as mudas foram produzidas em tubetes 675
de 175 cm3, com Nitossolo Háplico distrófico, e neste estudo foram produzidas em tubetes 676
de 55 cm3 com substrato inerte, e ainda pode ser devido ao uso de inóculos frescos de FMA, 677
cuja mistura de solos e raízes colonizadas foram extraída no momento de implantação do 678
experimento, sem prejuízo de perda da viabilidade, enquanto no presente trabalho, os 679
inoculantes ficaram acondicionados precedendo o uso, por dias em geladeira. 680
25
Em condição de viveiro comercial, o comprimento radicular colonizado de 62 % 681
observada nas mudas inoculadas com C. etunicatum e de A. morrowiae e de 46 % nas mudas 682
inoculadas com Rootella BR® (Tabela 2) pode ser considerado satisfatório para a promoção 683
de benefícios às plantas. No entanto, neste caso de produção maciça de mudas é mais 684
recomendável o uso do inoculante Rootella BR® do que a mistura dos inoculantes de C. 685
etunicatum e de A. morrowiae, já que, embora tenha exibido menor porcentagem de 686
colonização foi o que melhor promoveu o crescimento (Tabela 2) e os teores de P nas mudas 687
(Tabela 3). Este inoculante é o primeiro á base de FMA disponível no mercado brasileiro e 688
deve-se considerar a possibilidade de seus desenvolvedores melhorarem ainda mais a sua 689
capacidade de colonização, seja aumentado o número de propágulos de fungos, usando 690
outras espécies ou misturas de FMA, ou melhorando a composição geral do produto. Além 691
disto, a produção dos inoculantes de C. etunicatum e de A. morrowiae em laboratório é 692
relativamente pequena e dispendiosa, dificultando ainda seu uso em larga escala. 693
A percentagem de comprimento radicular colonizado por FMA semelhante entre os 694
clones de cedro australiano observada no presente trabalho também foi observada em clones 695
de Eucalyptus (LIMA e SOUZA, 2014), e em mudas seminais de Calophyllum brasiliense 696
Camb. (SILVA et al., 2018) e Schizolobium amazonicum (BRITO et al., 2017) e reforça a 697
ideia de que os FMA não possuem especificidade (TRAPPE, 1987; MOREIRA e 698
SIQUEIRA, 2006). 699
A presença de colonização nas mudas dos tratamentos Comercial e Controle não 700
inoculadas (Tabela 2) pode ter sido resultado da proximidade das mudas com o solo, ou 701
ainda devido ao fato de, neste trabalho, o substrato de produção de mudas utilizado não ter 702
sido esterilizado e a água de irrigação utilizada sem pré-tratamento, condições estas 703
diferentes da maioria dos trabalhos com FMA em que os experimentos foram desenvolvidos 704
em casas de vegetação e recebiam água deionizada ou destilada (LIMA et al.,2015; 705
CASARA, 2016; SILVA et al., 2017), o que pode justificar a presença de colonização 706
mesmo nos tratamentos não inoculados. 707
A colonização semelhante entre as mudas dos tratamentos Controle e Comercial 708
(tabela 2) demostra que a redução do adubo fosfatado não foi suficiente para estimular a 709
colonização natural ou, mais provavelmente, que os fungos que ocorrem naturalmente na 710
condição de viveiro estudada estão adaptados às altas doses de P. Pois é sabido que altas 711
doses de P inibem a colonização dos FMA nas raízes das plantas (MOREIRA e SIQUEIRA 712
2006; SMITH e READ, 2008). 713
26
A tendência de aumento do IQD nas mudas inoculadas com MIX (0,29) e Rootella 714
BR® (0,32) em relação aos controles não inoculados (Tabela 2), também foi observada em 715
mudas de cedro australiano inoculadas com diferentes FMA, cujos valores variaram de 0,26 716
a 0,39 (CARMO, 2016), aproximando dos exibidos no presente estudo. O IQD é 717
mencionado como uma medida morfológica integrada (JOHNSON, 1991) e como bom 718
indicador da qualidade de mudas, que considera no cálculo a robustez e o equilíbrio da 719
distribuição da biomassa, sendo ponderadas várias variáveis importantes (FONSECA, 2000) 720
tais como altura, diâmetro, MSPA, MSR e MST. Quanto maior o índice, melhor a qualidade 721
da muda avaliada (GOMES, 2001). Contudo, a colonização micorrízica não é levada em 722
consideração, caso contrário, promoveria valores de IQD maiores e comprovaria ainda mais 723
a qualidade das mudas inoculadas. 724
De maneira geral, no caso de produção de mudas de espécie arbórea que serão 725
transplantadas a campo, onde estarão expostas a condições de estresse, a qualidade do 726
torrão, produção de MSPA, MSR e MST, bem como o IQD pode indicar a capacidade das 727
mudas de sobreviverem em campo, devendo, deste modo, ser considerada a inoculação de 728
fungos que aumentam essas variáveis. O uso dos FMA permite o uso de solos marginais e 729
aumento na produtividade dos plantios florestais destinados à produção de madeira, bem 730
como aos programas de reflorestamento, cujos solos, em sua maioria são de baixa 731
fertilidade, e representam ainda uma alternativa para a sustentabilidade do setor florestal, 732
uma vez que possibilita a redução do uso de fertilizantes fosfatados, que além de serem 733
recursos finitos, com risco potencial de escassez, seu uso e produção colocam o meio 734
ambiente em risco de contaminação e envolve elevado gasto de derivados de petróleo na 735
produção. 736
Além do clone BV1321 ter demonstrado ser mais responsivo à inoculação por FMA, 737
este também teve maior diâmetro do coleto, MSPA, MSR, MST, R/PA e IQD do que o 738
BV1120. Este resultado reforça a necessidade do trabalho realizado pela Bela Vista Florestal 739
na busca de melhores clones de cedro australiano, porém a resposta diferenciada à 740
inoculação indica a necessidade da busca de clones mais responsivos à inoculação de FMA, 741
para a obtenção no futuro de povoamentos mais sustentáveis e menos dependentes da 742
fertilização fosfatada. Para isto a seleção dos clones deverá ser realizada em mudas 743
inoculadas em viveiro. Assim, a disponibilidade de inoculante comercial no mercado é 744
essencial para que essa biotecnologia possa ser usada nos povoamentos florestais. Esse 745
comportamento diferenciado entre clones de cedro australiano à inoculação por FMA não é 746
27
encontrada na literatura, mas há registro deste comportamento entre clones de Eucalyptus 747
em relação às ectomicorrizas (COSTA et al., 2019). 748
As plantas no presente trabalho, independente das condições de inoculação e redução 749
de P e dos clones, não apresentaram sintomas de deficiência visualmente. Quando 750
comparados os teores médios dos nutrientes observados no presente estudo (Tabela 2), N e 751
K (24,5 g kg-1, 24,6 g kg-1) foram maiores e P, Ca, Mg e Zn foram menores (1,01 g kg-1, 10,3 752
g kg-1, 2,4 g kg-1 e 29,2 mg kg-1) que os observados em mudas de cedro australiano crescidas 753
com fornecimento adequado de N, P, K, S, B, Cu, Zn e aplicação de calcário (N: 18,8 g kg-1, 754
K: 14,2 g kg-1, P: 1,4 g kg-1, Ca: 10,5 g kg-1, Mg: 2,5 g kg-1 e Zn: 39,9 mg kg-1 - MORETTI, 755
et al., 2011). 756
Os menores teores de N observados nas mudas inoculadas com Rootella BR® (22,1 g 757
kg-1) em relação ao Controle (23,2 g kg-1) (Tabela 3) podem ter sido um efeito de diluição 758
promovido pelo maior crescimento das mudas inoculadas em relação ao controle. Os 759
maiores teores de N nas mudas do Comercial (27,0 g kg-1) em relação ao Controle (23,2 g 760
kg-1), podem ser devido ao maior enraizamento das mudas do primeiro, ou ainda pode ter 761
havido efeito sinérgico dos nutrientes, já que nesta condição, a adubação de P foi elevada e 762
de N igual para todas. 763
A inoculação favoreceu o aumento dos teores de P em relação ao controle não 764
inoculado e com redução da adubação fosfatada, e este resultado explica a maior MSPA, 765
MST, teores de P e atividades de Catalase e Superóxido dismutase nas mudas inoculadas 766
(Tabelas 2 e 3). Em dose baixa de P (25 mg dm-3), mudas de cedro australiano inoculadas 767
com Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora colombiana apresentaram teor médio de P 768
3300% maior que as do controle, em relação a dose elevada de P (250 mg dm-3) (SILVA et 769
al., 2017); mudas inoculadas com inóculo misto de G. clarum e G. margarita produzidas em 770
bloco prensado apresentaram um incremento de 47,7% no teor de P em relação ao 771
tratamento não inoculado (CARMO et al., 2015) e mudas ainda da mesma espécie 772
inoculadas com a mistura de E. colombiana + A. morrowiae na menor dose de NKP (0 kg 773
ha-1) obtiveram incremento de 45 % no teor de P, em relação ao controle não inoculado 774
(CASARA, 2016) . Esses resultados evidenciam a importância dos FMA em promover a 775
maior absorção de P em relação às não inoculadas, o que resulta num dos principais 776
benefícios da associação (SMITH e READ, 1997). O efeito do P é fundamental na produção 777
de mudas de boa qualidade, pois melhora características muito importantes da planta, como 778
a capacidade fotossintética e de absorção de água e nutrientes (LIMA et al., 2011). Também 779
se confirma a importância da inoculação de FMA em mudas na fase de viveiro, pois estes 780
28
podem tornar as plantas menos dependentes de fertilizantes fosfatados, tornando a produção 781
menos onerosa e mais sustentável. 782
O aumento nas atividades de CAT e SOD observado nas plantas inoculadas é 783
importante porque pode aumentar da tolerância destas plantas á situações de estresse, já que 784
as enzimas atuam na conversão de espécies reativas de oxigênio e na destoxificação do seu 785
excesso, evitando danificações celulares no vegetal. Registros indicam que a exposição das 786
plantas aos vários tipos de estresses pode intensificar a produção de espécies reativas de 787
oxigênio, especialmente ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxila, 788
resultando no aumento de oxidações danosas dos componentes celulares (FOYER et al., 789
1997; SCANDALIOS, 2002) e reações em cadeia com várias moléculas orgânicas, levando 790
à peroxidação lipídica e à degradação de ácidos nucléicos (LAMB e DIXON, 1997). 791
O aumento da tolerância aos estresses pode estar fortemente relacionado ao aumento 792
da atividade de sistemas antioxidantes das plantas, com elevação no nível da expressão de 793
enzimas como catalase, superóxido dismutase e peroxidase (PRASAD, 1996). A imposição 794
de estresse hídrico induziu o aumento da atividade das enzimas CAT, SOD e Peroxidase nos 795
genótipos BRS Aracé, BR 17 Gurgueia e BRS Marataoã de feijão Vigna, com acentuada 796
atividade nas menores lâminas de irrigação e a ação destas enzimas foi diminuída 797
consideravelmente quando ocorreu o aumento na reposição de água no solo (SILVA, 2014). 798
A superóxido dismutase é a primeira enzima de defesa contra danos provocados 799
pelas espécies reativas de oxigênio nas células, ela transforma o ânion superóxido (O2•-) em 800
O2 e peróxido de hidrogênio (H2O2), utilizando 2H+ (ALSCHER et al., 2002). Em sequência, 801
o H2O2 pode ser eliminado pela atuação da catalase, que o transforma em O2 e H2O 802
(RIEDLE-BAUER, 2000). Portanto, uma atividade aumentada destas enzimas, sugere maior 803
proteção e eficiência. 804
Os papéis da MA nessas enzimas ainda não estão bem elucidados. Em plantas com 805
MA, o acúmulo de H2O2 tem sido observado nas proximidades da membrana periarbuscular, 806
especialmente em células contendo arbúsculos agrupados ou menos ramificados 807
(SALZER et al., 1999). Esses dados sugerem que uma explosão oxidativa pode ocorrer 808
durante o desenvolvimento intracelular do FMA. Este acúmulo de espécies reativas de 809
oxigênio (EROs), por sua vez, na presença da MA pode ser estritamente controlado por 810
enzimas antioxidativas, especialmente CAT e SOD. Diante disto, pode-se inferir que, o 811
incremento da atividade de CAT e SOD observado nos tratamentos inoculados com FMA 812
neste estudo, provavelmente está associado com o aumento de EROs provocados pela 813
colonização micorrízica, com consequente ativação do sistema de defesa da planta. Desta 814
29
maneira, plantas com maiores atividades destas enzimas, provocadas pela colonização 815
micorrízica, quando forem expostas às condições de estresse, principalmente no momento 816
do transplantio, estarão mais aptas a suportá-las e, consequentemente maior será sua 817
sobrevivência. 818
Isoformas SOD específicas foram induzidas em raízes de Trifolium 819
pratense colonizadas por Glomus mosseae, provavelmente devido ao aumento da 820
concentração de O2•- nas raízes (PALMA et al., 1993; ARINES et al., 1994) e em tabaco 821
colonizado por Glomus mosseae, a indução transitória de CAT e ascorbato-peroxidase 822
(APX) foi observada durante a formação de apressórios, indicando uma resposta de defesa 823
da planta durante os estágios iniciais do estabelecimento da simbiose (BLILOU et al., 824
2000a). Estes resultados reforçam os observados neste estudo, onde as maiores atividades 825
enzimáticas tanto para CAT quanto pra SOD foram observadas nas mudas de cedro 826
australiano com maior porcentagem de colonização. 827
Outro motivo para o aumento da atividade das enzimas CAT e SOD nos tratamentos 828
fúngicos neste estudo pode ainda estar relacionado à diminuição da adubação fosfatada, à 829
qual estes tratamentos foram submetidos. Ainda que esta condição não possa ser considerada 830
de estresse, já que nela foram observados aumentos de crescimento e estado nutricional das 831
mudas, ela pode ter resultado no acumulo de EROs e iniciado o estresse oxidativo, 832
sinalizando uma resposta da planta á condição de restrição nutricional, o que, por 833
consequência, aumentou as atividades enzimáticas para atenuar os efeitos desta restrição. 834
Em condições de baixa adubação fosfatada (20 mg kg-1), as atividades específicas de 835
SOD foram significativamente maiores (63 %) em raízes de Phaseolus vulgaris L. 836
colonizadas por Glomus clarum, do que em controles não-micorrízicos, 10 semanas após o 837
plantio. Ainda nestas condições, as atividades de CAT foram 79, 65 e 150 % maiores do que 838
no controle não-micorrízico, 4, 6 e 10 semanas após plantio, respectivamente. Além disso, 839
atividades de CAT foram suprimidas em raízes micorrízicas e não micorrízicas em 840
condições de alto P (150 mg kg-1), em comparação com condições baixo P (20 mg kg-1) 841
(LAMBAIS et al., 2003). 842
Tudo isto sugere que, embora as plantas tenham sido expostas à restrição de 843
adubação fosfatada nos tratamentos inoculados com FMA e estes tenham implicado em um 844
provável aumento nas espécies reativas de oxigênio, a condição de restrição foi compensada 845
pelo estabelecimento da simbiose, que estimulou o aumento da atividade das enzimas 846
antioxidativas. 847
848
30
849
5 CONCLUSÕES 850
A inoculação com fungos micorrízicos arbusculares aumenta o crescimento da parte 851
aérea, os teores de P e a atividade das enzimas CAT e SOD de mudas de cedro australiano 852
(Toona ciliata) em viveiro comercial, mas este efeito é dependente do clone. 853
O inoculante comercial Rootella BR® pode ser recomendado para produção de 854
mudas clonais de cedro australiano em condição de viveiro comercial. 855
A inoculação de FMA reduz a demanda de fertilizantes fosfatados na produção de 856
mudas de cedro australiano. 857
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1212
1213
1214
39
1215
ANEXOS 1216
1217
Tabela 1A- Quadrado médio e sua significância, obtidos na análise de variância dos dados 1218
coletados nas avaliações de sobrevivência, diâmetro do coleto, altura da parte aérea, 1219
clorofila total, matéria seca de raízes, massa seca da parte aérea, massa seca total, relação 1220
raiz/parte aérea, Índice de Qualidade de Dickson, porcentagem de colonização, teores de 1221
nutrientes e atividades de Catalase e Superóxido dismutase, avaliados aos 180 dias. 1222
1223
Fontes de variação Variáveis Tratamento (T) Clone (C) T x C CV (%) QMR Sobrevivência ns ** ns 11,38 46,25 Diâmetro do coleto ns ** ns 10,37 0,1213 Altura da parte aérea ns ns ns 19,92 7.6345 Clorofila total ns ns ns 7,82 8.2922 Massa seca de raízes ns ** ns 32.53 63559.8759 Massa seca da parte aérea * * ns 35.94 149991.2897 Massa seca total * ** ns 31.4 338334.4106 Relação raiz/parte aérea ns * ns 27.33 0.0417 Índice de qualidade de Dickson ns ** ns 40.93 0.012213 Colonização ** ns ns 20,07 13.9586 Teores de N * ns * 13.85 11.503125 Teores de P * ns * 7.45 0.005725 Teores de K ns ** ns 14.49 12.69241 Teores de Ca ns ns ns 11.76 1.469751 Teores de Mg ns ns ns 11.61 0.080488 Teores de Fe ns ** ns 17,60 670.639561 Teores de Mn * ns ns 14,93 11.05537 Teores de Zn ns ** ns 11,96 12.234636 Atividade CAT ** ns ns 34.85 1.52E-19 Atividade SOD ** ns ns 21.16 0.111131 ns: não significativo; * e ** significativo a 5 e 1% pelo teste F, respectivamente. CV: coeficiente de 1224
variação; QMR: quadrado médio do resíduo. 1225
1226
1227
1228
1229
1230
1231
1232
1233
1234
40
Tabela 2A – Altura da parte aérea e índice de clorofila Falker (IFC) das mudas dos 1235
clones BV1120 e BV1321 de cedro australiano não inoculadas (Controle), inoculadas 1236
com inoculante comercial Rootella BR® e inoculadas com a mistura de inoculantes 1237
dos FMA Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora morrowiae (MIX) e crescidas 1238
em substrato com redução da adubação fosfatada; mais o controle não inoculado e 1239
crescidas sem redução da adubação fosfatada (Comercial) aos 180 dias de 1240
crescimento. 1241
Clones Clones Tratamentos BV1120 BV1321 Média BV1120 BV1321 Média
-------- Altura, cm --------- ------- IFC ------- Comercial 14,1 14,7 14,4 36,4 35,8 36,1 Controle 12,6 12,1 12,3 36,3 38,6 37,4 MIX 15,1 12,5 13,8 37,0 38,2 37,6 Rootella BR 14,5 15,4 14,9 36,3 36,1 36,2 Média 14,1 13,7 13,9 3,5 37,2 36,2 1242
1243
Tabela 3A – Teores de Ca e Mg das mudas dos clones BV1120 e BV1321 de cedro 1244
australiano não inoculadas (Controle), inoculadas com inoculante comercial Rootella 1245
BR® e inoculadas com a mistura de inoculantes dos FMA Claroideoglomus 1246
etunicatum e Acaulospora morrowiae (MIX) e crescidas em substrato com redução 1247
da adubação fosfatada; mais o controle não inoculado e crescidas sem redução da 1248
adubação fosfatada (Comercial). 1249
Clones Clones
Tratamentos BV1120 BV1321 Média BV1120 BV1321 Média
------- Ca, g kg-1 ------- ------- Mg, mg kg-1 ------- Comercial 10,42 10,15 10,29 2,42 2,51 2,46
Controle 10,09 9,50 9,79 2,41 2,08 2,25
MIX 10,42 11,13 10,77 2,43 2,59 2,5
Rootella BR 10,11 10,65 10,38 2,45 2,65 2,5
Média 10,26 10,35 10,31 2,43 2,46 2,44 1250
1251
1252
1253
1254
1255
1256
1257
1258
1259
1260
41
1261
Tabela 4A - Atividades de Catalase (CAT) e Superóxido dismutase (SOD) na parte 1262
aérea das mudas dos clones BV1120 e BV1321 de cedro australiano não inoculadas 1263
(Controle), inoculadas com inoculante comercial Rootella BR® e inoculadas com a 1264
mistura de inoculantes dos FMA Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora 1265
morrowiae (MIX) e crescidas em substrato com redução da adubação fosfatada; mais 1266
o controle não inoculado e crescidas sem redução da adubação fosfatada 1267
(Comercial). 1268
1269
Clones Clones Tratamentos BV1120 BV1321 Média BV1120 BV1321 Média
---------- CAT, U ngMf-1 ------------ -------- SOD, U gMf-1 -------- Comercial 0,64 0,71 0,67 B1/ 0,73 0,85 0,79 C Controle 1,06 1,03 1,04 AB 1,39 1,57 1,48 B MIX 1,44 1,28 1,36 A 2,35 2,04 2,20 A Rootella BR 1,39 1,37 1,38 A 1,85 1,77 1,81AB Média 1,13 1,10 1,11 1,58 1,56 1,57 1/ Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste 1270
Tukey a 5 % de probabilidade e médias seguidas de mesma letra minúscula na linha não 1271
diferem entre si pelo teste t ao nível de 5 % de significância. 1272
1273
Tabela 5A – Sobrevivência, diâmetro e altura da parte aérea das mudas dos clones 1274
BV1120 e BV1321 de cedro australiano não inoculadas (Controle), inoculadas 1275
com inoculante comercial Rootella BR® e inoculadas com a mistura de 1276
inoculantes dos FMA Claroideoglomus etunicatum e Acaulospora morrowiae 1277
(MIX) e crescidas em substrato com redução da adubação fosfatada; mais o 1278
controle não inoculado e crescidas sem redução da adubação fosfatada 1279
(Comercial) aos 90 dias de crescimento. 1280
Clones Clones Tratamentos BV1120 BV1321 Média BV1120 BV1321 Média
------- Sobrevivencia,% -------- -------- Diâmetro, mm -------- Comercial 76,0 62,0 69,0 6,7 6,3 5,5 Controle 64,0 58,0 61,0 5,3 5,9 5,6 MIX 68,0 64,0 66,0 6,3 5,7 5,9 Rootella BR 70,0 56,0 69.0 5,7 5,8 5,7 Média 69,5 a1/ 60,0 b 66,2 6,0 5,9 5,7
--------- Altura, cm --------- Comercial 1,8 2,5 2,2 Controle 1,7 2,6 2,1 MIX 1,8 2,5 2,2 Rootella BR 1,9 2,6 2,3 Média 1,8 b 2,6 a 2,2
1/ Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste 1281
Tukey a 5 % de probabilidade e médias seguidas de mesma letra minúscula na linha não 1282
diferem entre si pelo teste t ao nível de 5 % de significância 1283
1284
![Nuno Ricardo Soares [ARCH]Portfolio](https://static.documente.net/doc/80x56/579074ce1a28ab6874b19e0b/nuno-ricardo-soares-archportfolio.jpg)