Genul Staphylococcus

Caractere generale (minidefiniţie)

• coci sferici gram-pozitivi (0,5-1,5µm Ø), dispuşi izolat, in diplo, ocazional in scurte lanţuri şi caracteristic în grămezi neregulate;

• imobili, nepretenţioşi nutritiv, aerobi-facultativ anaerobi, catalazo-pozitivi şi oxidazo-negativi;

• cultivă pe medii cu concentraţii crescute de NaCl (7,5-

10%);

• testul coagulazei îi clasifică în: - coagulazo-pozitivi: S.aureus;

- coagulazo-negativi: mai multe specii izolate de la om, dintre care S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus, S. warneri, S. hominis, S. lugdunensis.

Testul catalazei

• Pozitiv pentru stafilococi

• Negativ pentru streptococi

• Tulpina de testat, împreună cu peroxidul de hodrogen 3% - eliberarea de oxigen (efervescen.ţă) – test pozitiv

Staphylococcus aureusImportanţa medicală

• determină infecţii comunitare sau nosocomiale care se remarcă prin frecvenţă şi diversitate, unele cu evoluţie deosebit de gravă (bacteriemii cu localizări secundare, şoc septic, şoc toxic stafilococic);

• s-a dovedit capabil să dezvolte rezistenţă la toate antibioti-cele folosite în terapie.

Habitat• 20-70% purtători nazali (procente mai mari la personalul

din spitale);

• prezenţă tranzitorie la nivelul tegumentului;

• contaminează mediul extern prin mâini, scuame, secreţii, excrete.

Caractere morfo-tinctoriale• sunt cele caracteristice genului;

• în unele produse patologice poate predomina dispoziţia in diplo, fiind dificilă diferenţierea de S. pyogenes;

• Gram-variabili în frotiul din puroi provenit din colecţii închise sau din culturi vechi.

Caractere de cultură• colonii mari, S, de consistenţă untoasă, pigmentate în

galben-portocaliu sau nepigmentate ( alb-cenuşii) pe geloză nutritivă;

• pe geloză-sânge coloniile pot fi hemolitice;

• dezvoltă colonii manito-pozitive pe mediul Chapman (mediu hiperclorurat cu manită şi roşu fenol).

Frotiu din produs patologic

• In culturi vechi, unele bacterii pierd caracterul Gram (+), devenind Gram (-)

• Bacterie nepretenţioasă nutritiv (creşte şi pe medii simple)

• Colonii beta-hemolitice

• Colonii S, nehemolitice (hemoliza este un caracter inconstant ca şi pigmentogeneza)

• Colonii manito-pozitive pe mediul Chapman (dreapta)

Rezistenţa la factori de mediu

• rezistent la condiţii de desicaţie;

• rezistent la acţiunea lizozimului şi a acizilor graşi de la nivelul tegumentului;

• sensibil la acţiunea unor antiseptice şi dezinfec-tante: alcool etilic 700 (după 60 min), alcool iodat, hexaclorofen etc;

• distrus în 30 min la temperatura de 600C şi după 15 minute la 121C.

Factori de patogenitate

Virulenţa acestei specii este rezultatul efectului combinat al mai multor factori de patogenitate

• Factori asociaţi bacteriei

• Capsulă• Proteina A• Adezine:

- proteina de legare a fibronectinei;

- proteina de legare a colagenului.

.

Produşi extracelulari

• Enterotoxine

• Toxina epidermolitică

• Toxina sindromului şocului toxic (TSSS - 1)

• Hemolizine

• Leucocindine

• Stafilochinază

1. Structuri parietale• peptidoglicanul manifestă proprietăţi endotoxină-like;

(asigură stabilitatea osmotică; stimulează produ-cerea endogenului pirogen; este chemoatractant pentru leucocite; inhibă fagocitoza şi chemotaxia).

• acidul ribitol teichoic, cu specificitate de specie, are proprietăţi adezive la receptorii celulari şi determină reacţii de sensibilizare după infecţii repetate;

• proteina A leagă IgG prin fragmentul Fc şi impiedică opsonizarea şi fagocitoza; anticorpii anti proteină -A sunt prezenţi la persoanele cu infecţii severe;

• adezine la proteine ale gazde: fibrinogen/fibrină (coagulaza legată), fibronectină, colagen;

• microcapsula polizaharidică cu efect antifagocitar.

2. Exoenzime• coagulaza liberă

- se leagă de protombină şi determină conversia fibrinogenului în fibrină;

- înglobează cocii în trama de fibrină, protejându-i de fagocite;

- formează trombi, implicaţi în patogenia tromboflebitelor septice;

• stafilokinaza (fibrinolizina)

- activează plasminogenul, determinând disoluţia cheagurilor de fibrină; prin liza trombilor septici intravenoşi ar putea realiza diseminarea infecţiei cu apariţia septicopioemiei.

• hialuronidaza

- hidrolizează matricea intercelulară;

• lipaze

- active pe lipidele din plasmă şi sebum, explicând tropismul pentru unitatea pilo-sebacee.

3. Exotoxine

• citotoxine - hemolizine α, β, γ şi δ, active pe eritrocite provenite de

la diferite specii animale; cel mai bine caracterizată este hemolizina α, incriminată în manifestări ale şocului septic;

- leucocidina care are efect leucolitic, prezentă în special la tulpini izolate din leziuni dermonecrotice;

• toxine exfoliative (A şi B)

- au activitate proteazică, determinănd ruperea desmo-zomilor de la nivelul stratului granulos, cu formare de bule epidermice;

- implicate în sindromul pielii opărite (boala Ritter la copil sau Lyell la adolescent şi adult);

Sindromul Lylle

3. Exotoxine • toxina 1 a sindromului şocului toxic (TSST-1)

- funcţionează ca superantigen, (1 celulă din 5 este activată prin cooperare cu MHC de clasă II, iar un antigen poate activa 1 celulă din 10.000) stimulând nespecific limfocitele T, cu eliberare de citokine în cantitate mare;

- determină febră, erupţie eritematoasă cu descuamare, hipotensiune şi insuficienţe funcţionale multiorgan;

- manifestările au fost asociate cu utilizarea tampoanelor hiperabsorbante intravaginale, dar şi cu infecţii extrageni-tale;

• enterotoxine- mai multe tipuri antigenice (A – G);

- funcţionează de asemena ca superantigene;

- termorezistente;

- determină toxiinfecţii alimentare; enterotoxinele B şi C pot determina şi manifestări sistemice (şoc toxic stafilo-cocic).

lactamazele

lactamazele, în număr de patru (A, B, C, D), explică rezistenţa stafilococilor la penicilină şi antibiotice penicilin-like.

• Producerea acestor enzime, de peste 90% dintre tulpinile de S. aureus, poate fi inductibilă (rezistenţa ce apare numai în prezenţa antibioticelor lactam)

• Genele care codifică sinteza acestor enzime sunt de tip plasmidic (pentru A, C si D) sau cromozomal (pentru B), ele fiind şi carrier-ul rezistenţei pentru alte antibiotice, cum ar fi eritromicina sau tetraciclinele.

Superantigens and the non-specific stimulation of T cells. Superantigens bind directly to MHC calss II of antigen-presenting cells outside the normal antigen-binding groove. Up to one in five T cells may be activated. Cytokines are released in large amounts, causing the symptoms of TS

Manifestări clinice ale infecţiilor stafilococice supurative• infecţii cutanate şi ale glandelor anexe: foliculite,

impetigo, furuncul, carbuncul, hidrosadenite, panariţii etc;

• infecţii ale mucoaselor: otite, sinusite;

• infecţii ale părţilor moi: abcese, flegmoane;

• infecţii profunde: osteomielite, osteoartrite, pneumonii, abcese hepatice, cerebrale, meningite, endocardite;

• bacteriemii cu sepsis sever sau şoc septic.

Imunitatea antistafilococică• fagocitoza este mecanismul major de apărare;

• cu excepţia Ac antileucocidină, nu există o corelaţie între receptivitatea la infecţie şi titrul Ac.

Diagnosticul de laborator al infecţiilor supurative

• se bazează pe examen bacteriologic;

• produsul patologic variază în raport cu localizarea infecţiei;

• examenul microscopic are în special valoare în cazul produselor provenite din zone normal sterile;

• izolarea S. aureus o realizăm prin însămânţare pe geloză-sânge iar în cazul produselor contaminate pe mediul selectiv Chapman;

• identificarea se bazează pe caracterele de cultivare, microscopice, testul catalazei şi coagulazei;

• în investigaţii epidemiologice (izbucniri epidemice) se poate recurge la lizotipare sau tipare moleculară.

Principii de terapie a infecţiilor stafilococice

• în infecţii cutanate ca şi în colecţii purulente profunde, drenajul chirurgical este esenţial;

• antibioterapia infecţiilor sistemice este ghidată de rezultatele antibiogramei.

• Tulpini neproducătoare de peniciilnază: penicilina• Tulpini producătoare de penicilinază (90%):

meticilina sau izoxazolilpeniciline: oxacilina, cloxacilina;

• Alte antibiotice utile: eritromicina, lincomicina (infecţii osoase), pristinamicina, fucidina, vancomicina;

• De păstrat antibiotice “de rezervă”: vancomicina, lincomicina.

Fenotipuri de rezistenţă• antibiotice beta-lactamice

- rezistenţă la peniciline prin producere de penicilinază;

- rezistenţă omogenă sau heterogenă la oxacilină prin prezenţa unei PLP 2a suplimentară, care se extinde la toate antibioticele beta-lactamice (tulpini meticilino-rezistente - SARM);

• macrolide şi lincosamide

- rezistenţa inductibilă la eritomicină antrenează rezistenţă la macrolide cu 14 şi 15 atomi de C;

- pot fi înregistrate eşecuri terapeutice şi la clindamicină;

Fenotipuri de rezistenţă (continuare)

• aminoglicozide- testare curentă la kanamicină, tobramicină şi gentamicină;

- rezistenţa enzimatică la kanamicină se extinde la amikacină;

- rezistenţa la kanamicină, tobramicină şi gentamicină este predictivă pentru rezistenţa la amikacină şi netilmicină;

• fluorochinolone

- rezistenţa frecvent prezentă la tulpinile meticilino-rezistente;

- utilizarea în monoterapie favorizează emergenţa rezistenţei;

• noi fenotipuri de rezisenţă- recent raportate tulpini cu rezistenţă intermediară sau

înaltă la glicopeptide (ex. vancomicina);

- necesită confirmarea prin teste cantitative şi trimiterea tulpinii la un centru de referinţă.

S. aureus

Penicillin

[1950s]

Penicillin-resistant

S. aureus

Evolution of Drug ResistanS. aureus

Methicillin

[1970s]

Methicillin-resistant

S. aureus (MRSA)

Vancomycin-resistant

enterococci (VRE)

Vancomycin

[1990s]

[1997]

Vancomycin

intermediate-resistantS. aureus (VISA)

Vancomycin-

resistantS. aureus

• Pentru slide/urile 33 – 51 informatii facultative (an VI).

• Pana in prezent CDC a raportat 8 tulpini de VRSA documentate bacteriologic si genetic:

• 1. tulpina Michigan 1 izolata de la un pacient cu diabet zaharat, boala vasculara periferica si insuficienta renala cronica, care din aprilie 2001 a primit numeroase scheme de antibiotice pentru o infectie cutanata cronica (picior diabetic), inclusiv vancomicina.

• In aprilie 2002 s-a semnalat bacteriemie cu MRSA dupa amputatia halucelui, pacientul primind vancomicina si rifampicina.

• In iunie 2002 se diagnosticheaza infectie de cateter cu o tulpina de stafilococ rezistenta atat la oxacilina, cat si la vancomicina (CMI oxacilina peste 16 mg/l, CMI vancomicina peste 128 mg/l).

• Concomitent, s-au izolat VRSA si VRE de la nivelul piciorului

Sievert DM, Boulton ML, Stoltman G et al - Staphylococcus aureus Resistant to Vancomycin - United States, 2002. MMWR, 2002; 51: 565-567

• “tulpina 2”: Pensylvania a fost izolata in octombrie 2002 de la un pacient cu ulcer cronic al piciorului si posibila osteomielita.

• Metoda difuzimetrica utilizata a aratat o zona de inhibitie de 12 mm, iar pe mediu BHI agar cu adaos de vancomicina s-a semnalat cresterea stafilococului.

• Determinarea sensibilitatii la vancomicina a continuat prin efectuare de E-test (CMI, 64 mg/l), precum si prin metoda microdilutiilor in bulion (CMI, 32 mg/l).

Miller D et al- Public Health Dispatch: Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus - Pennsylvania, 2002. MMWR, 2002; 51: 902

• 3 tulpina New York a fost raportata in aprilie 2004, fiind izolata din urocultura la un pacient asistat intrun azil.

• Desi la testarea prin MicroScan, CMI la vancomicina fusese de 4 mg/l, efectuarea unui E-test a indicat CMI/ peste 256 mg/l.

• Metoda microdilutiilor in bulion a confirmat tulpina drept VRSA (CMI, 64 mg/l).

Kacica M, McDonald LM - Brief Report: Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus - New York, 2004 MMWR, 2004; 53: 322-3

• 4. tulpina Michigan 2 a fost raportata in februarie 2005 la un barbat diabetic, 78 ani, care primise timp de 9 saptamani tratament cu vancomicina dupa protezare de valva aortica.

• Ulterior a avut o infectie de parti moi de unde s-a izolat VRSA cu CMI-256 mg/l (microdilutii si E-test); concomitent, s-a descoperit VRE din coprocultura.

• De mentionat ca Vitek2 a incadrat tulpina de stafilococ in mod eronat ca VSSA (CMI sub 1 mg/l).

CDC Atlanta/ www.cdc.gov/ncidod/hip/vanco.htm

• 5. tulpina Michigan 3 a fost raportata in noiembrie 2005 la o pacienta care prezenta infectie de parti moi dupa o paniculectomie pentru obezitate.

• Pacienta avusese initial infectie cu MRSA pentru care a primit cel putin 2 luni de vancomicina. Ulterior, s-a izolat VRE si apoi VRSA (CMI, 512 mg/l) de la nivelul zonei infectate.

J. Rudrick – www.michigan.gov/mdchlab

• 3 tulpina New York a fost raportata in aprilie 2004, fiind izolata din urocultura la un pacient asistat intrun azil.

• Desi la testarea prin MicroScan, CMI la vancomicina fusese de 4 mg/l, efectuarea unui E-test a indicat CMI/ peste 256 mg/l.

• Metoda microdilutiilor in bulion a confirmat tulpina drept VRSA (CMI, 64 mg/l).

Kacica M, McDonald LM - Brief Report: Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus - New York, 2004 MMWR, 2004; 53: 322-3

• 4. tulpina Michigan 2 a fost raportata in februarie 2005 la un barbat diabetic, 78 ani, care primise timp de 9 saptamani tratament cu vancomicina dupa protezare de valva aortica.

• Ulterior a avut o infectie de parti moi de unde s-a izolat VRSA cu CMI-256 mg/l (microdilutii si E-test); concomitent, s-a descoperit VRE din coprocultura.

• De mentionat ca Vitek2 a incadrat tulpina de stafilococ in mod eronat ca VSSA (CMI sub 1 mg/l).

CDC Atlanta/ www.cdc.gov/ncidod/hip/vanco.htm

• 5. tulpina Michigan 3 a fost raportata in noiembrie 2005 la o pacienta care prezenta infectie de parti moi dupa o paniculectomie pentru obezitate.

• Pacienta avusese initial infectie cu MRSA pentru care a primit cel putin 2 luni de vancomicina. Ulterior, s-a izolat VRE si apoi VRSA (CMI, 512 mg/l) de la nivelul zonei infectate.

J. Rudrick – www.michigan.gov/mdchlab

• Aparent, VRSA nu se coreleaza cu administrarea de vancomicina pentru al doilea si al treilea caz (Tenover)

Testarea sensibilitatii – criterii CLSI

• Conditii de testare• Agar Mueller-Hinton• Inoculum – suspensie de colonii, echivalent al

standardului 0.5 McFarland• Incubare: 35ºC - 16-18 ore (24 ore pentru: oxa-,

meticilina, nafcilin, vancomicina).• Testarea la peste 35ºC – poate sa nu deceleze tulpinile

de stafilococi rezistenti la oxacilina (atât S aureus ,cât şi SCN).

Consideratii generale

• SARM, sau SRM , rămân denumirile cele mai frecvente pentru S aureus rezistent la meticilină sau stafilococi rezistenti la meticilina, deşi meticilina nu este antibioticul utilizat în terapiei sau/şi testare

• In multe articole se utilizează denumirile din engleza (MRSA, MRS), toate cu aceeaşi semnificatie a rezistentei la oxacilina/meticilină.

Consideratii generale

• Pentru tulpinilie de S aureus si de stafilococi coagulaza negativi (SCN) sensibile la oxacilina, rezultatele pentru cefamicine orale sau parenterale, asocierea β-lactamice – inhibitori de β-lactamaze, carbapeneme, trebuie raportate conform criteriilor interpre-tative.

• Pentru SARM si SRM ca şi pentru stafilococi rezistenţi şi la alţi agenţi antimicrobieni (e.g. peniciline, β-lactamice – inhibitori de β-lactamaze, cefamicine, carbapeneme), rezulta-tele in vitro pot indica “sensibilitate”, iar anti-bioticele să nu fie active in vivo.

Detectarea rezistentei la oxacilina

• Testarea rezistentei la oxa prin:

- gena mecA;

- evidenţierea produsului genei mecA (PLP2a).

* Sunt testele cele mai utile pentru confirmarea rezultatelor obţinute prin metoda difuzimetrică în cazul infecţiilor severe stafilococice.

• Nu se testeaza de rutină tulpinile de S saprophyticus izolate din infectii urinare deoarece infecţiile de acest tip răspund bine la concentraţiile urinare atinse de antibiotice (in cazul infectiilor fără complicaţii).

• E.g: nitrofurantoin, cotrimoxazol, fluorochi-nolone

• Stafilococii sensibili la penicilina sunt S si la alte peniciline, asocierea β-lactamice – inhibitori de β-lactamaze, carbapeneme (aprobate de catre FDA pentru tratamentul infectiilor severe).

• Tulpinile R la P şi S la oxacilină, sunt R la penicilinele inactivate de către penicilinaze şi S la alte peniciline stabile la penicilinaze, asocierea β-lactamice – inhibitori de β-lactamaze şi carbapene-me.

Comentarii*

• Dacă pentru S aureus obţinem pentru oxacilină, un rezultat intermediar, recurgem la teste suplimentare:

- evidienţierea genei mecA sau PLP2a;- testul cu discul de cefoxitin;- determinarea CMI a oxacilinei;- testarea pe mediu cu oxa/sare.

• Se raporteaza rezultatele la testele alternative şi nu rezultatul “IR”!

• Sensititre® Automated System Accurately Detects VRSA

• • TREK Diagnostic Systems supplies Sensititre automated

AST/ID instrumentation to clinical diagnostic laboratories throughout the world.

• Sensititre susceptibility plates can be read automatically using the ARIS® 2X or AutoReader instruments.

• Recently, the Sensititre automated system accurately detected four Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VRSA) strains at the Centers for Disease Control (CDC).* A brief summary is presented here, full details can be obtained from Trek Diagnostics.

Epidemiologie

În infecţii nosocomiale se urmăresc • rezervorul

- bolnavi,

- pacienţi sau personal de spital colonizaţi;

• transmiterea

- direct, prin picături Flugge ;

- indirect, vehiculare prin obiecte, alimente sau mâini contaminate.

Profilaxie- măsuri riguroase de asepsie şi antisepsie;

- sterilizarea purtătorilor nazali prin aplicaţii topice de unguente cu antibiotice antistafilococice (mupirocin);

- în experiment un vaccin antistafilococic (StaphVAX).

Stafilococii coagulazo-negativi

• constituienţi ai florei bacteriene rezidente de la nivelul tegumentului şi mucoaselor colonizate;

• pot determina infecţii legate de prezenţa unor implante protetice şi catetere, grave în special la imunodepresaţi;

• sinteza unor exopolizaharide favorizează ataşarea la suprafaţa acestor dispozitive;

• cea mi frecventă specie implicată este S.epidermidis:

- infecţii de cateter, infecţii de pace-maker, infecţii ale grefei vasculare, endocardită subacută a valvelor protezate;

- patogen primar în infecţii asociate cu şunturile LCR, protezele articulare, dispozitivele ortopedice sau la cei cu dializă peritoneală cronică ambulatorie (infecţii ale tractusului urinar – cistită, uretrită, pielonefrită).

Stafilococii coagulazo-negativi• S. saprophyticus ocupă o nişă specială, fiind cauza

unor infecţii ale tractusului urinar in special la femeia tânără; sensibil la majoritatea antibioticelor, inclusiv benzil-penicilină (rezistenţă naturală la novobiocină);

• S. haemolyticus: endocardite subacute (chiar în absenţa protezelor valvulare), septicemii, peritonite, infecţii ale tractusului urinar, ale plăgilor chirurgicale, ale oaselor sau articulare;

• S. lugdunensis: endocardite subacute pe valve protetice sau native, infecţii de cateter, septicemii, abcese cerebrale, infecţii profunde, osteite, etc.

• S. shleiferi: empiem cerebral, infecţii ale plăgilor, bacteriemii, osteite ale rahisului şi infecţii de cateter;

Stafilococii coagulazo-negativi

• diagnosticul bacteriologic impune criterii care să stabilească semnificaţia clinică a izolatului, eliminând o posibilă contami-nare;

• se impune izolarea repetată dacă există unui “teren” deficitar (ex. diabet, imunos-upresaţi, vârste extreme);

• stafilococii coagulazo-negativi sunt frecvent meticilino-rezistenţi;

Coci gram-pozitivi

facultativ anaerobi

+

catalaza

Staphylococcus

−Streptococcus

coagulaza

+ −S.aureus Stafilococi coagulazo-negativi

sensibilitate la novobiocină

R S

S. saprophyticus alţi stafilococi coagulazo-negativi