Curs Proteine Structura Proteomica

7/25/2019 Curs Proteine Structura Proteomica

1/96

1

TIPURI DE PROTEINE, CLASIFICARE STRUCTURASTRUCTURA PROTEINELORPROTEINELOR TEHNICI UTILIZATETEHNICI UTILIZATE N ANALIZAN ANALIZA

PROTEINELORPROTEINELOR --PROTEOMICPROTEOMICAnaliza prin tehnici cromatograficeAnaliza prin tehnici cromatograficeAnaliza prin tehnici electroforeticeAnaliza prin tehnici electroforetice

SECVENSECVENIALIZAREA PROTEINELORIALIZAREA PROTEINELOR

PROTEINEPROTEINE


2/96

2

PROTIDEPROTIDE

PEPTIDE (2PEPTIDE (2--20 AA)20 AA)

PROTEINEPROTEINE propriupropriu--zisezise

holoproteineholoproteine -- alctuitealctuite

numainumai dindin aminoaciziaminoaciziheteroproteineheteroproteine conconin oin ocomponent proteiccomponent proteic (AA)(AA) iio component prostetico component prostetic


3/96

3

FFuncunciiii::-- rolrol structuralstructural (colagenul, keratina, elastina)(colagenul, keratina, elastina)-- rol derol de transporttransport (hemoglobina, albumina)(hemoglobina, albumina)-- rolrol contractilcontractil (actina, miozina)(actina, miozina)

-- rolrol de aprarede aprare a organismului (imunoglobulinelea organismului (imunoglobulineleserice, factorii de coagulare ai sngeluiserice, factorii de coagulare ai sngelui trombinatrombina iifibrinogenul)fibrinogenul)-- rolrol hormonalhormonal (hormonii(hormonii cu structur derivat de lacu structur derivat de laaminoacizi, hormonii peptidiciaminoacizi, hormonii peptidici i cei polipeptidici)i cei polipeptidici)-- biocatalizatoribiocatalizatori enzimeenzime


4/96

4

HoloproteineglobulareAlbumine

Globuline Histone

Protamine

Prolamine Gluteline

Holoproteinefibrilare

Keratinele

Colagenul

Elastina

Fibrinogenul Miozina si actina

Fibroina


5/96

5

Albumine - precipita in prezenta sarurilor

concentrate si coaguleaza la temperaturi ridicate serumalbumine (serul sanguin)

proteina monomerica cu masa moleculara ~ 66.500 kDa- are rolul de a transporta molecule cu solubilitate scazuta

(acizi grasi liberi, anumiti hormoni, bilirubina, etc.)- rol in mentinerea presiunii osmotice a sangelui

lactalbumina (din lapte) proteina sintetizata de glanda mamara (sub controlul

prolactinei)- masa moleculara ~ 13.500 kDa- componenta a sistemului enzimatic lactaz-sintetaza

mioalbumina (din muchi) ovalbumina (albuul de ou)


6/96

6

Globuline

- proteine prezente in serul sanguin- in functie de mobilitatea electroforetica

(1 si 2),

si

globuline- globulinele

si

sunt sintetizate in ficat

- globulinelesunt sintetizate de catre limfocite


7/96

7

1 globuline:

- 1 - antitripsina- reprezinta aproximativ 70 %

- 1 - antichimotripsina

- - lipoproteine

- 1 - glicoproteina acida

- proteina de legare a tiroxinei

2 globuline:

-2 - macroglobulina - reprezinta 30 - 50 %

- haptoglobina - reprezinta 30 %

- ceruloplasmina- alte enzime


8/96

8

-globuline:

- transferina - 60 %

- chemotripsina - 30 %

- fractiuni ale sistemului complement

-fibrinogen- beta lipoproteine

- beta 2 - microglobulina

- transcobalamina

-proteina C reactiva

Gamaglobulinele

- sunt reprezentate de imunoglobuline, produse deplasmocite, care au rol de

anticorpi: imunoglobulinele A, G, M, D, E.


9/96

9

Histone-proteine bazice (aprox. 30% din totalul deaminoacizi = arginina si lizina)-mase moleculare - 11.000 si 21.000 kDa-sunt prezente in cromatina celulelor eucariote informa asociata cu AND

-5 tipuri diferite> H1, H2A, H2B, H3 si H4


10/96

10

Proteine fibrilare

Keratine-proteine majore din par, unghii, coarne, copite, etc.-formate din unitati numiteprotofibrile (diametrul 20)prin asocierea a 8 protofibrile se formeazamicrofibrile

(diametrul 80) care prin asociere formeazamacrofibrile (diametrul 2000)-stabilitatea si rigiditatea structurii este data de legaturiledisulfidice S-S- formate intre resturi de cisteina


11/96

11

Colagen-proteina cea mai abundenta 25% din totalulproteinelor din organism-componenta majora a matricei extracelulare-prezent in piele, oase, tendoane, cartilagii, artere,mischi, etc.-in forma cristalina apare in cornee-contine 35% glicocol, 11% alanina, 21% prolina si

hidroxiprolina-La nivelul oaselor apare in asociere cu hidroxiapatitaCa5(PO4)3OH


12/96

12

Elastina-proteina prezenta in peretii vaselor sanguine, in plamani,ligamente, piele, etc.-masa moleculara ~ 64.000 66.000 kDa-contine glicocol 33% si proportii mai ridicate de alanina, valina,

prolina-poate fi hidrolizata sub actiunea elastazei, enzima produsa deneutrofile

Miozina si actina-Miozina = proteina majora din muschii striati ( M= 200 kDa)-Actina = proteina majora din filamentele subtiri-Asociere actina - miozina


13/96

13

HETEROPROTEIDEHETEROPROTEIDE

ClasificareClasificare inin functiefunctie dede naturanatura chimicachimica aagrupariigruparii prosteticeprostetice::

metaloproteidemetaloproteide

fosfoproteidefosfoproteide

glicoproteideglicoproteide

lipoproteidelipoproteide

cromoproteidecromoproteide

nucleoproteidenucleoproteide


14/96

14

Cu rol de transport

Transferina transporta Fe

Ceruloplasmina transporta Cu

Calmodulina Ca Hemoglobina Oxigen, CO2, Fe

MetaloproteideMetaloproteide

CaCa2+2+, Mg, Mg2+2+, Fe, Fe2+/3+2+/3+, Cu, Cu1+/2+1+/2+, Zn, Zn2+2+, Mn, Mn2+2+

Cu rol de rezerva

Feritina depozit de Fe 3+ ficat si splina

Hemosiderina ficat

Ovotransferina rezerva de Fe 3+ in ou

Lactotransferina - rezerva de Fe 3+ in lapte

Cu rol functional metaloenzime


15/96

15

FosfoproteideFosfoproteidecomponentacomponenta prosteticaprostetica constaconsta inin resturiresturi fosfatfosfatlegatelegate estericesteric lala ggruparirupari OHOH (din(dinSerSer sausau TreTre))

CazeineleCazeinele

80 % din80 % din proteineleproteinele dindin laptelapte-- Proteine completeProteine complete -- ccononinin totitoti AAAA esenesenialiiali

-- NUNU coaguleazcoaguleaz lalancnclzirelzire

-- precipitprecipitnn mediumediu acidacid -- paracazeinatparacazeinat de Cade Ca OvovitelineleOvovitelinele

FosfovitelineleFosfovitelinele gglbenulbenuulul dede ouou


16/96

16

NH

C

O

CH

P O-

O-

O

O

CH2

Ca2+

Phosphate group esterified at a serine residue


17/96

17

GlicoproteideGlicoproteideGrupareGrupare prosteticaprostetica restrest glucidicglucidic,, maimai frecventfrecventoo oligoglucidaoligoglucida, O, O sausau NN--glicozidicglicozidic

Cu rol structural: Intra in alcatuirea matricii extracelulare si tesutului

conjunctiv: proteoglicanii sau mucoproteinele, sialoproteinele

Glicophorina (eritrocite) Avidina din albuul de ou leag biotina Peptidoglicanii peretelui celulelor bacteriene mureina

Cu rol de aparare (anticorpi): imunoglobulinele G, A, M, D, E


18/96

18

OO

H2OHC

O

OH

-D-N-acetylgalactosamine linked to a threonine residue by O-glycosidic linkage

NH C CH3

O

CH CH

CH3 CO

NH

Polypeptide chain


19/96

19

LipoproteideLipoproteide

asociaasociaiiii complexecomplexe dede proteineproteine cucu lipidelipidesimple,simple, complexecomplexe,, colesterolcolesterol liberliberiicolesterolcolesterol esterificatesterificat

Lipoproteine de transport:Chilomicroni (Volum , densitate )vLDL (Very Low Density Lipoproteins)

LDLHDL

Lipoproteine de membran - Biomembrane


20/96

20

Lipo-

protein

Dimension

(nm)

Type of

apo-lipo-

protein

Prote-

in

(% )

Phospho

lipids

(% )

Choleste-

rol

(% )

Triacyl-

glycerols

(% )

Chylo-

microns100-1000

AI, B,

CI, CII,

CIII, E

1 4 6 90

VLDL 30-70

AI, B,

CI, CII,

CIII, E

10 19 19 50

LDL 15-25 B 20 24 45 10

HDL 7,5-10AI, AII,

D, E50 30 18 5


21/96

21


22/96

22

CromoproteideCromoproteide CarotenoproteineCarotenoproteine ((carotenoidecarotenoide))

crustacyanin

astaxanthine

linckiacyanin


23/96

23

RodopsinaRodopsina (11(11--ciscis--retinal)retinal)


24/96

24

HemoproteineHemoproteine


25/96

25

STRUCTURAPROTEINELOR


26/96

26

Structura primara a proteinelor

= catena polipeptidica a proteinelor

Numrul aminoacizilor Tipul aminoacizilor Proporia aminoacizilor Secvena (ordinea) aminoacizilor Poziia legturilor disulfidice

NH

R1

C

O

CH

NH

R3

C

O

CHNH

CH

R2

C

O

NH

CH

R4

C

O

Capat amino-terminal

Capat carboxiterminal


27/96

27

Structura secundara proteinelor

structurastructura de tipde tip --helixhelix

foaiefoaie pliatapliata paralala si antiparalelaparalala si antiparalelaO

N C

N C

R

R

N C

N C

R

R

H

O

H

O

O

H

N C

N C

R

R

N C

N C

R

RH

O O

H H

O

H

O

NC

NC

R

R

NC

NC

R

RH

OO

O

H

H

O

O

H

OH H

N C

N C

R

R

N C

N C

R

RH

O

O


28/96

28


29/96

29

Modelul de tip colagenModelul de tip colagen


30/96

30

Structura teriar

Descrie modul n care catenele polipeptidicecaracterizate prin structura secundara interacioneazprin resturile R ale AA, pentru a da o structurtridimensional

Catena polipeptidic sufer plieri i nfurri spontane Interactiuni hidrofobe si Van der Waals: Leu, Ileu, Ala, Val, Tri Legaturi de hidrogen: Tir-His, Ser-Asp sau Glu Legaturi ionice: Glu-Arg sau Lis


31/96

31

Structura cuaternar

Consta n asocierea a doua sau mai multe catenepolipeptidice, numite monomeri (protomeri) Monomerii pot fi identici sau diferii In funcie de numarul de monomeri: dimeri,

trimeri, tetrameri, etc. Intre monomeri se stabilesc diferite tipuri de

interaciuni chimice

Structura cuaternara hemoglobinei


32/96

32

1. Extracia proteinelor din materiale biologice

2. Determinarea concentraiei proteinelor

3. Tehnici de separare i purificare a proteinelor:- Cromatografie-Electroforez

4. Determinarea structurii proteinelor purificate


33/96

33

EXTRACEXTRACIA PROTEINELORIA PROTEINELOR

DIN MATERIALE BIOLOGICEDIN MATERIALE BIOLOGICE-- cantitatea decantitatea de esut disponibilesut disponibil-- cantitatea de proteine prezentecantitatea de proteine prezentenn esutesut

-- solubilitatea proteinelorsolubilitatea proteinelor-- prezenprezena unor electrolia unor electroliii-- prezenprezena unor solvena unor solveni organicii organici-- pHpH--ulul

--localizarea intracelular a proteinelorlocalizarea intracelular a proteinelor-- stabilitatea proteinelor extrasestabilitatea proteinelor extrase


34/96

34

localizarea intracelular a proteinelorlocalizarea intracelular a proteinelor

citoplasmacitoplasma

-- CeluleCelule animaleanimale -- suspendarea celulelorsuspendarea celulelor ntrntr--oosolusoluie hipotonicie hipotonic liz osmoticliz osmotic-- CeluleCelule vegetalevegetale LIZOZIMELIZOZIME -- enzimeenzime carecare

degradeaz chimic membranele celularedegradeaz chimic membranele celulare

componente ale formacomponente ale formaiunilor subcelulareiunilor subcelulare(membrane sau mitocondrii)(membrane sau mitocondrii) CENTRIFUGARECENTRIFUGARE

DIFERENDIFERENIATIAT


35/96

35

Celulele suspendate sunt centCelulele suspendate sunt centrrifugate la viteze potrivite, aleseifugate la viteze potrivite, alese

astfelastfelnct s putem separa unct s putem separa uor componentele mai denseor componentele mai dense


36/96

36

stabil itatea proteinelor extrasestabil itatea proteinelor extrase

PROTEAZEPROTEAZE--pH ales astfelpH ales astfel nct s inactiveze enzima dar snct s inactiveze enzima dar s

nu produc degradri ale proteinei de interesnu produc degradri ale proteinei de interes-- util izarea unor inhibitori enzimatici specif iciutil izarea unor inhibitori enzimatici specif ici

(anumi(anumii ageni ageni chimici)i chimici)care s nu interaccare s nu interacionezeionezei cu proteina analizati cu proteina analizat


37/96

37

metode fotometricemetode fotometriceDeterminarea absorbDeterminarea absorbiei la 280nmiei la 280nmMetoda biuretuluiMetoda biuretuluiMetoda LowryMetoda LowryMetoda Blue CoomassieMetoda Blue Coomassie

metode / teste imunochimicemetode / teste imunochimice

DETERMINAREADETERMINAREA

CONCENTRACONCENTRAIEI PROTEINELORIEI PROTEINELOR


38/96

38

Determinarea absorbDeterminarea absorbiei la 280nmiei la 280nm

ttriptofanulriptofanul

tirozinatirozina

ffenilalaninaenilalanina

cisteinacisteina-- absorbabsorbiaia de numrul moleculelor de triptofande numrul moleculelor de triptofan..-- o soluo soluie ce conie ce conine 1 mg de proteine / mline 1 mg de proteine / ml absorbtieabsorbtie 0,50,5 i 2,0i 2,0

AvantajeAvantaje::

--o bun sensibilitateo bun sensibilitate (50(50 100 micrograme)100 micrograme)--este o metod simpleste o metod simpl i ui uor de realizator de realizat-- nu este o metod distructivnu este o metod distructiv

Dezavantaje:- contaminai acizii nucleici ( 254 nm)

1941 - Warburg i Christian - determinarea absorbiei la doulung de und diferite 280nm pentru proteine i 260 nm pentruacizii nucleici

mg proteine / ml = 1,55 x A280 0,76 x A260- contaminai sol.tampon i detergenii utilizarea probei n alb


39/96

39


40/96

40

Metoda biuretuluiMetoda biuretului Cornall - 1949

N

C

C

C N

C

O

Cu

C

N C

C

C

NHR

O

HR O

H R

O

H R2 Na+

max = 560 nm

DezaDezavantajevantaje::--sensibil la prezensensibil la prezena unor contaminana unor contaminani cum sunt peptidele,i cum sunt peptidele,glicerol sau tampon TRISglicerol sau tampon TRIS

AvantajeAvantaje::--este o metod simpleste o metod simpl ii rapidrapid

-- sensibilitatesensibilitate

mediemedie

( 1( 1

2020

mg)mg)


41/96

41

Metoda LowryMetoda Lowry 1951 combinaie ntre reacia biuretului i reac. Folin-Ciocltu se bazeaz pe proprietatara tirozinei i a triptofanului de areactiona cu fodsfomolibdatul i fosfotungstat cu formareaunui complex colorat n albastru

Dezavantaje:sensibil la numeroase substane interferente cum ar fianumite peptide i aminoacizi, zaharoza, glicerol, derivai

de mercaptan, EDTA i numeroi detergeni.


42/96

42

Metoda Blue CoomassieMetoda Blue Coomassie

19761976 BradfortBradfort proprietatea colorantului Blue Coomassie de a se absoarbe laproprietatea colorantului Blue Coomassie de a se absoarbe lasuprafasuprafaa proteinelor,a proteinelor, ntrntr--un mediu acidun mediu acid sese modificamodifica culoareaculoareade lade la maromaro lala albastrualbastru

AvantajeAvantaje::--o bun sensibilitateo bun sensibilitate ((22 55 gg))--este o metod simpleste o metod simpl i ui uor de realizator de realizat

-- rezistent la prezenrezistent la prezena contaminana contaminanilorilor


43/96

43

teste imunochimiceteste imunochimice

tehnica ELISA


44/96

44

1.1. Cromatografia pe coloanCromatografia pe coloan::

--prin schimb de ioniprin schimb de ioni--gelgel--filtrare (excluzifiltrare (excluziune molecularune molecular))--de afinitatede afinitate

2. Cromatografia pe hrtie2. Cromatografia pe hrtie

TEHNICI CROMATOGRAFICETEHNICI CROMATOGRAFICEUTILIZATEUTILIZATEN ANALIZA PROTEINELORN ANALIZA PROTEINELOR


45/96

45

CROMATOGRAFIA PRINCROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB DE IONISCHIMB DE IONI

DEAE cellulose [dimethylaminoethyl cellulose] (+)

CM-cellulose [carboxymethyl cellulose] (-)


46/96

46

Denumirea fazei Natura chimic Gruparea ionizatDowex 1 Polistiren bazic -CH2-N

+(CH3)3

Dowex 50 Polistiren acid - SO3H

DEAE celuloza Bazic Dietilaminoetil

ECTEOLA celuloza Bazic Amine

CM celuloza Acid Carboximetil

DEAE Sephadex Dextran gel bazic Dietilaminoetil

CM Sephadex Dextran gel acid Carboximetil


47/96

47

CROMATOGRAFIA PRIN EXCLUZIUNECROMATOGRAFIA PRIN EXCLUZIUNE

MOLECULARMOLECULAR (GEL(GEL--FILTRARE)FILTRARE)


48/96

48

NUME TIPDIMENSIUNE

(kD)

Sephadex G-10

Sephadex G-25

Sephadex G-50

Sephadex G-100

Dextran

Dextran

Dextran

Dextran

0,05-0,7

1-5

1-30

4-150

Bio-Gel P-2

Bio-Gel P-10

Bio-Gel P-100

Bio-Gel P-300

Poliacrilamid

Poliacrilamid

Poliacrilamid

Poliacrilamid

0,1-1,8

1,5-20

5-100

60-400

Sepharose B6

Sepharose B2

Agaroz

Agaroz

10-4000

70-40000


49/96

49

DIALIZA


50/96

50

CROMATOGRAFIA DE AFINITATE


51/96

51


52/96

CROMATOGRAFIA PE HRTIECROMATOGRAFIA PE HRTIE

The paper is suspended in acontainer with a shallow

layer of a suitable solvent ormixture of solvents in it. Itis important that the solventlevel is below the line with

the spots on it.

As the solvent slowly travelsup the paper, the different

components of the inkmixtures travel at differentrates and the mixtures are

separated into differentcoloured spots.


53/96

53

The distance travelled relative to thesolvent is called the Rfvalue. For each

compound it can be worked out using theformula:


54/96

54

CROMATOGRAFIA PE HRTIECROMATOGRAFIA PE HRTIEBIDIMENSIONALBIDIMENSIONAL


55/96

55

ELECTROFOREZAELECTROFOREZA

electroforezn mediu libermigrarea liber a speciilor ionicentr-o soluietampon de pH corespunztor. electroforezn mediu stabilizant - medii suport inerte (hrtia de filtru,acetatul de celuloz,Sephadexul, etc)

active, care interacioneaz cu particulelencrcate (gelul de agar, de amidon sau depoliacrilamid)

monodimensional - sistem orizontal sau verticalbidimensional


56/96

56

ELECTROFOREZA PE HRTIE


57/96

57

ELECTROFOREZA PE GEL DE POLIACRILAMID

CH

H2C O

NH2

N

H3C (CH2)2

N

CH3

CH3 CH3

Acrilamida Tetrametilenetilendiamina (TEME

N N

O

H H

O

N,N-metilen-bis-acrilamida


58/96

58


59/96

59

Electroforez nedenaturant (PAGE)- se separ proteinele nativen funcie de raportul ntre sarcinaelectric i masa lor molecular-proteinele i pstreaz integritatea

Electroforez denaturant (SDS-PAGE)- detergent ionic (ncrcat negativ) SDS sodiu dodecil sulfat- Probele de analizat - SDS i 2-mercaptoetanol. Detergentuldetermin ruperea legturilorntre diferite proteine iinteraciunile lipide-proteine i se leag la moleculele de

proteine. Sub aciunea 2-mercaptoetanolului are loc ruperealegturilor disulfifice inter- i intramoleculare din structuraproteinelor, separndu-se astfel subunitile oligoproteinelor.


60/96

60


61/96

61


62/96

62


63/96

63


64/96

64


65/96

65

Coloratia cu Blue Coomassie

Coloratia cu argint


66/96

Focalizarea izoelectric

Dac un amestec de proteine este supus electroforezei ntr-o matrice careare un gradient de pH si creste ncet pH de la anod la catod, fiecareprotein va migra pn la punctul n care pH-ul este egal cu punctulizoelectric:


67/96

Electroforez bidimensionala (electroforez 2D)


68/96


69/96

69

ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE


70/96

70

ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICEPE GEL DE AGAROZ

DBA2/J C57BL/6 C3H/He PRM/Alf


71/96

71

lapte degresat Dozareproteine

Bradford

NanoDrop

separare benzi

hidroliza cu tripsina

Baza de date

RP - HPLC

700.0 1260.2 1820.4 2380.6 2940.8 3501.0

Mass (m/z)

2.8E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%I

ntensity

Voyager Spec #1 MC[BP = 842.5, 27761]

Ech 2 - 02/03/06

842.5089

1798.8404

1769.8639

832.3306

1045.5722

876.3139

892.2810 1814.82731243.5654 2205.0472703.9699 906.5003 1785.8511700.2688 883.0575 1259.5615 1802.8537 2212.1087709.4210 2808.26611057.5994879.5673 1400.7700 1 60 9. 82 08 2 00 8. 95 54

spectrometrie de masa

SDS-PAGE

SDS-PAGE

gel 17 cm

mini gel

B6 J8


72/96

72

lapte degresat

+ solut ie de clarifiere(0.3% DTT, uree 8M)

lapte degresat

+ solut ie de clarefiere

(3% DTT, uree 8M)

B6 J8

B6 J8


73/96

73

1 2 3 4 5 6 7

6.5

16.5

25

32.5

47.5

62

83

175

234

5

7

61

Score M (Da) / pIobservs

M (Da)thorique

Protin

2 123 20062.1/4.84 17700 K caseine

3 1.44e+009

285

76724.3/6.94

1437.0/4.83 12442

Serotransferrin

WAP

4 6.23e+016

9.96e+007

68693.0/5.7535602.5/5.88

65892

34042

Serum albumine

s1 casein

5 1.16e+003 21100.7/6.20 19446 casein

7 195e+004 25337.5/5.82 23779

caseine

? 15300 caseine

? 13999

lactalbumine


74/96

74

PWK

1

2 4

56

7

8

3

K

WAP

s1

STSA

PRM

234

5

7

61

1 2 3 4 5 6 7

6.5

16.5

25

32.5

47.5

62

83

175

K

ST, WAP

SA, s1

K

WAP

s1

STSA

B6

B6


75/96

75


76/96


77/96

N1 M14 M15N4M13M11 N2 M12 N3 6

ProfilulProfilul proteicproteic alal lapteluilaptelui normalnormal sisi mamiticmamitic


78/96

N1 M3 M4M1M1N2 N3 N4 N5 St

Lactoferina

BSA

Ig

-caz

-caz

-caz

-lac

-lac

A

B

ProfilulProfilul proteicproteic alal lapteluilaptelui normalnormal sisi mamiticmamitic


79/96

N

120

M

750

M

1000

N

150

M

750

M

500

N

200

M

1000

N

125

NCS x 10-3

bac d


80/96

Gel lactoser - mamiticpH = 3 pH = 10

BSA

Imunoglobuline cu caten lung

-cazeina +

s1-cazeina

-cazeina

-lactalbumina

-lactoglobulina

s2-cazeine

Imunoglobuline cu caten scurt


81/96

pH = 3 pH = 10

BSA

-cazeina +s1-cazeina

-cazeina

-lactalbumina

-lactoglobulina

s2-cazeine

Imunoglobuline cu caten scurt

Gel lactoser - normal

Imunoglobuline cu caten lung


82/96

Gel lactoser - mamitic Gel lactoser - normal

AA

B B

C1

C2

C1

C2


83/96

83

Determinarea structuriiDeterminarea structuriiproteinelorproteinelor determinarea secvendeterminarea secvenei de aminoacizi ce alctuiescei de aminoacizi ce alctuiesc

catena polipeptidiccatena polipeptidic

determinarea conformadeterminarea conformaiei pe care o adaptiei pe care o adaptproteina precumproteina precum i interaci interaciunile acesteia cuiunile acesteia cu

molecule nonmolecule non--proteiceproteice


84/96

84

SECVENSECVENIALIZAREAIALIZAREA

PROTEINELORPROTEINELOR Determinarea compoziiei generale n

aminoacizi

Analiza aminoacidului N-terminalAnaliza aminoacidului C-terminal

Determinarea secvenei de aminoacizi

- prin degradarea Edman- prin spectrometrie de mas


85/96

85

Determinarea compoziDeterminarea compoziieiieigeneralegeneralen aminoacizin aminoacizi

hidroliza total a unei cantithidroliza total a unei cantiti cunoscute dei cunoscute de

proteinprotein Hidroliz chimicHidroliz chimic -- HCl 6M, 100HCl 6M, 100--110110C, 24 deC, 24 de

oreore

separarea aminoacizilor rezultasepararea aminoacizilor rezultai prin hidrolizi prin hidroliz cromatografie prin schimb de ioni sau decromatografie prin schimb de ioni sau de

absorbabsorbieie


86/96

86

O

OH

OH

O

O

O

OH

H

O

O

OH

H

O

OH

OH

O

R

CHH2N

COOH

+ +

R

C O

H

CO2+ NH3Ninhidrina

Ninhidrina

+ NH3

C

O

O

C

O

OH

N

H

Compus colorat ( max = 570nm)

determinarea cantitativ a aminoacizilor separadeterminarea cantitativ a aminoacizilor separaii

fotometric, prin reacfotometric, prin reacia cu ninhidrinaia cu ninhidrina


87/96

87

Analiza aminoacidului

N-terminalEtape de analizEtape de analiz:: reacreacia proteinei cu un reactiv ce prezintia proteinei cu un reactiv ce prezint

selectivitate faselectivitate fa de aminoacidul N de aminoacidul N--terminalterminalreactivul Sanger (2,4reactivul Sanger (2,4--dinitrofluorobenzenul)dinitrofluorobenzenul)

clorura de dansylclorura de dansyl

hidroliza proteineihidroliza proteinei

determinarea produsului specific de reacdeterminarea produsului specific de reacieieprin cromatografieprin cromatografie i comparare cu standardei comparare cu standarde


88/96

88

reactivul Sanger (2,4reactivul Sanger (2,4--dinitrofluorobenzenul)dinitrofluorobenzenul)

dezavantaj - reacia cu anumite grupri amino din structuraaminoacizilor aflai in catena polipeptidic

NO2

FO2N H2NC

C

R1

O

NH

H peptida

fluorodinitrobenzen

- HF

peptida

NO 2

NHO2NCH

R1

C

O

hidroliza acida

Derivat colorat al aminoaciduluice poate fi separat si identificat

cromatografic


89/96

89

reacreacia cu clorura de dansylia cu clorura de dansyl

- HCl

Derivat fluorescent al aminoacidulce poate fi separat si

identificat cromatografic

Hidroliza acida

N(CH3)2

SO2Cl

Clorura de dansyl

H2NC

C

R1

O

NH

H peptida

N(CH3)2

SO2

C

C

R1

O

NH

H peptidaNH


90/96

90

Analiza aminoacidului CAnaliza aminoacidului C--terminalterminal hhidroliza sub acidroliza sub aciunea carboxipeptidazeloriunea carboxipeptidazeloranaliza produanaliza produilor de hidroliz la intervale regulate de timpilor de hidroliz la intervale regulate de timp

1 2 3Timp de hidroliz

Cantitateade AA

Catenapolipeptidic GliGli SerSer LeuLeu


91/96

91

Determinarea secvenDeterminarea secvenei deei de

aminoacizi prin degradare a Edmanaminoacizi prin degradare a Edman scindarea legturilor disulfidice formate la nivelul catenelorscindarea legturilor disulfidice formate la nivelul catenelor separareasepararea i purificarea catenelor individualei purificarea catenelor individuale

determinarea compozideterminarea compoziiei generaleiei generalen AA pentru fiecare catenn AA pentru fiecare catenpurificatpurificat determinarea capetelor Cdeterminarea capetelor C i N terminale pentru fiecare cateni N terminale pentru fiecare caten hidroliza catenelorhidroliza catenelorn fragmente mai mici ( maxim 50 AA)n fragmente mai mici ( maxim 50 AA) determinarea secvendeterminarea secvenei specifice fiecrui fragmentei specifice fiecrui fragment

reconstituirea proteinei plecnd de la fiecare fragmentreconstituirea proteinei plecnd de la fiecare fragmentsecvensecvenializatializat


92/96

92

MecanismulMecanismul

N C S

Fenil-izotiocianat

O

H2NC

R1

H CNH

C

R2

H

O

C

capat N-terminal

etapa 1

C

R

H C

NH

CR2

H

O

C

N C

NH

H S

Fenil-tiocarbamoil derivat

O1


93/96

93

+ 2H+

etapa 3H

+

Fenil-tiocarbamoil derivat

etapa 2

N C

N

H

S

CH

C O

R1

C

R2

H C

O

H3N+

+

Catena polipeptidica mai scurta cu un aminoa

N C

N

S

R1

C

CHO

H

derivat fenil-tiohidantoin-aminoacid


94/96

94


95/96

95

Dezavantaje:Dezavantaje:--se lucreaz pe catene polipeptidice micise lucreaz pe catene polipeptidice mici-- randament de 98% este obrandament de 98% este obinut pentru peptideinut pentru peptidede maxim 30 aminoacizide maxim 30 aminoacizi

Avantaje:Avantaje:--se lucreaz pe cantitse lucreaz pe cantiti foarte mici de peptidei foarte mici de peptide

( 10( 10 -- 100 picomoli)100 picomoli)-- procesul poate fi complet automatizatprocesul poate fi complet automatizat


96/96

Determinarea secvenDeterminarea secvenei proteinelorei proteinelor

prin spectrometrie de masprin spectrometrie de mas digestia proteinelor sub acdigestia proteinelor sub aciunea unor endopeptidazeiunea unor endopeptidaze separarea produsepararea produilor de hidroliz prin cromatografieilor de hidroliz prin cromatografiededenalt performannalt performan (HPLC)(HPLC) cuplat la spectrometriecuplat la spectrometrie

de masde mas spectrul obspectrul obinut pentru fiecare fragment polipeptidicinut pentru fiecare fragment polipeptidicseparat este analizat de un computerseparat este analizat de un computer i identificat prini identificat princomparacomparaie cu spectre de peptide reuniteie cu spectre de peptide reunitentrntr--o bazo baz

de datede date Procesul se repet apoiProcesul se repet apoi, cu alte enzime digestive, cu alte enzime digestive(peptidaze) rezultatele ob(peptidaze) rezultatele obinute corelateinute corelate secvensecveneieifinalefinale

Date post:	25-Feb-2018
Category:	Documents
Upload:	ioana-bandila
View:	230 times
Download:	0 times

Curs Proteine Structura Proteomica

Documents