4. Sinteza de proteineProteinele sunt structuri complexe care trebuie sa indeplineasca diferite functii. Din acest motiv sinteza unei proteine presupune o serie de etape, care fiecare in parte participa la modelarea acestei structuri si care necesita componente specifice.Astfel sinteza unei proteine presupune:

- formarea secventei de aminoacizi care este dictata de codul genetic- impachetarea tridimensionala realizata de “echipamente” specifice numite chaperonii- maturarea proteinelor nou sintetizate prin diverse procese de glicozilare, fosforilare,

farnezilare- daca o etapa esueaza se declanseaza degradarea si reciclarea proteinei.

In tot acest lant de evenimente acizii nucleici intervin in faza initiala care dicteaza structura primara a proteinei. Ei fac acest lucru prin copierea si traducerea informatiei ce specifica proteina in cauza.

4.1 Codul geneticCelulele isi reinnoiesc in mod permanent proteinele, unele avand un turnover foarte rapid. Semnalul care initiaza sinteza unei proteine de care celula are nevoie este dat de transcriptie. In urma transcriptiei informatia genetica pentru sinteza proteinei respective este adusa din nucleu, sub forma ARNm si decodificata cu ajutorul ARNt. ARNt este o molecula “translator”, bi-informationala, care recunoaste doua tipuri de limbaje, limbajul genetic si limbajul proteic, reusind sa faca conexiunea intre ele. Altfel spus ARNt este capabil sa citeasca si sa traduca codul genetic.Limbajul genetic (numit codul genetic) reprezinta modalitatea de scriere a informatiei genetice si el utilizeaza 4 semne de cod: A, U, G, C (adica 4 litere).Limbajul proteic utilizeaza 20 de semne de cod (adica 20 litere) cate unul pentru fiecare aminoacid. Pentru a obtine cele 20 semne de cod ale proteinelor din doar cele 4 semne de cod ale acizilor nucleici, acestea din urma trebuie asociate cate trei. Rezulta astfel unitatea de codare, numita codon care este alcatuita dintr-un grup de 3 nucleotide. Prin aceasta asociere diferita a celor 4 semne, luate cate trei se obtin 64 de semne de cod pentru cei 20 aminoacizi, cu mult peste numarul necesar. Aceasta a dus la constatarea ca unui aminoacid ii pot corespunde unul sau mai multi codoni.

Cei 64 de codoni ce alcatuiesc codul genetic sunt astfel repartizati:- un codon care indica inceperea mesajului (asa cum in scriere litera mare indica inceputul frazei) si

care este AUG. - trei codoni care indica terminarea mesajului numiti codoni Stop sau non-sens: UAG, UGA, UAA- doi codoni care indica fiecare un singur aminoacid: Met si Trp- ceilalti aminoacizi au alocati intre 2 -6 codoni.

Trasaturile codului genetic sunt:- codul genetic este specific nu ambiguu (ambiuitate = lipsa de precizie), ceea ce inseamna ca unui

codon ii corespunde intotdeauna un singur aminoacid

- este degenerat sau redundant: adica ofera informatie suplimenatara prin alocarea mai multor codoni unui singur aminoacid. Este un fenomen asemanator utilizarii sinonimelor.

- este universal: adica este aceleasi la toate speciile (cu foarte putine exceptii, mitocondria eucariota) conservat de-a lungul evolutiei.

- nu are suprapuneri si semne de punctuatie: adica de la un punct de start secventa de nucleotide este citita in grupe de cate trei, pana la sfarsit, in continuare, fara pauze.

Analiza codului genetic arata ca primele doua baze ale codonului sunt “strict” specifice pentru un aminoacid, cea de a treia baza este lipsita de specificitate, putand fi oricare din cele 4 baze fara a determina schimbarea aminoaciduuil specificat. Consecintele alterarii secventei de nucleotide. ADN-ul poate suferi alterari sau lezari care daca devin permanente determina aparitia mutatiilor. Mutatiile pot fi localizate:

a) la nivelul unei singure perechi de nucleotide si sunt numite mutatii punctiformeb) la nivelul unui fragment de nucleotide

a) Mutatiile punctiforme poti cauzate de inlocuirea unei baze cu o alta. In urma inlocuirii pot apare mutatii diferite: silance, missense respectiv non-sense functie de pozitia pe care baza inlocuita o ocupa in codon.

O mutatie silance apare atunci cand este inlocuita de regula ultima nucleotida a codonului cea care prezinta cea mai mica specificitate si prin urmare aminoacidul codificat nu se modifica.O mutatie missense apare atunci cand baza inlocuita ocupa prima sau a doua pozitie in codon si determina codificarea altui aminoacid diferit de cel initialO mutatie nonsense apare atunci cand baza inlocuita determina aparitia codonului stop, care indica oprirea citirii. Aceasta situatie determina aparitia unei proteine mai scurte.

b) Insertia/deletia a una sau doua baze determina si intr-un caz si in celalat modificarea asa-numitului cadru de citire, care este reprezentat de codon. Este alterata astfel citirea pe intreaga secventa determinand sinteza unor proteine eronate incepand cu punctul de insertie/deletie. Daca are loc insertia /deletia unui grup de trei nucleotide care specifica un aminoacid atunci este adaugat respectiv inlaturat un aminoacid.

4.2 Sinteza de proteinePentru realizarea sintezei de proteinelor este nevoie de:

A. toti cei 20 aminoacizi deoarece lipsa unui singur aminoacid duce la stoparea sintezeiB. grupul de ARNt care sa transporte aminoacizii la locul sintezei.

ARNt este o molecula cu functie dubla: de transport a aminoacizilor si de citire a mesajului genetic continut in ARNm.In ceea ce priveste transportul, incarcarea aminoacizilor este catalizata de o familie de enzime numite aminoacil-ARNt transferaze. Fiecare membru al acestei familii [Pamela] recunoaste un anume aminoacid. Prin urmare aceast grup de enzime trebuie sa:

- recunoasca si sa distinga intre diferitii aminoacizi, unii dintre ei avand structuri asemanatoare (Val, Leu)

- identifice aminoacidul si sa faca asocierea cu ARNt corespunzator, actiune esentiala pentru fidelitatea translatiei

- sa recunoasca dar sa si distinga intre ARNt specifici pentru fiecare aminoacid dar nu intre ARNt izoacceptori

Pe langa functiile mai sus enumerate enzimele apartinand acestei familii mai indeplinesc urmatoarele activitati:

- activitate ligazica catalizand atasarea aminoacidului la ARNt corespunzator- activitate hidrolazica prin care este realizata functia de corectare ce asigura fidelitatea transcriptiei.

Aceasta functie intra in actiune in cazul in care asocierea corecta aminoacid –ARNt specific a esuat. In aceasta situatie enzima indeparteaza de pe ARNt aminoacidul incarcat gresit.

Atunci cand ARNt are atasat aminoacidul se spune despre acesta ca este incarcat. Aminoacidul atasat de ARNt este denumit aminoacid activat deoarece legatura formata (esterica) este una macroergica.

In ceea ce priveste citirea mesajului genetic ARNt recunoaste codonii de pe ARNm prin intermediul anticodonului cu care se fixeaza antiparalel si complementaritatii pe codoni.

Un anticodon poate recunoaste mai multi codoni ai aceluiasi aminoacid (acelasi aminoacid poate fi specificat de mai multi codoni). Mecanismul prin care un anticodon poate sa recunoasca mai mult de un singur codon pentru acelasi aminoacid este explicat de asa-numitul efect “wobble” (wobble inseamna oscilare, clatinare). Aceasta inseamna ca prima baza a anticodonului(capatul 5’) si ultima baza a codonului (capatul 3’) nu sunt fixate rigid prin legaturile complementare uzuale. Oscilarea usoara permite formarea unor perechi de baze neconventionale cu baza variabila din ultima pozitie a codonului. Fenomenul “wobble” explica de ce nu este nevoie de 61 ARNt corespunzatori celor 61 de codoni, in realitate existand in jur de 32 ARNt.

C. ARNm care sa contina succesiunea de codoni specifici proteinei ce urmeaza a fi sintetizata. Acesta este recunoscut si fixat la unitatea mica a ribozomilor pentru a putea fi citit de catre ARNt.

D. Ribozomi functionali care reprezinta sediul unde se realizeaza sinteza proteinelor. Ribozomii sunt localizati:

- liberi in citosol sau- asociati reticulului endoplasmatic conferindu-i acestuia un aspect accidentat de unde si numele de

reticul endoplasmatic rugos. Reticulul endoplasmatic este sediul sintezei proteinelor ce urmeaza a fi exportate sau integrate in membrana plasmatica, membranele aparatului Golgi sau incorporate in lizozomi [Pamela].

Din punct de vedere structural ribozomii sunt complexe alcatuite din :- fragmente de ARNr (vezi capitolul structura)- proteine cu rol structural si functional

Ribozomii sunt alcatuiti din doua subunitati, o subunitate mare si o subunitate mica, ale caror marimi sunt indicate de coeficientul de sedimentare S = Svedberg. Deoarece valoarea S este determinata atat de forma cat si de masa moleculara valoarea lor numerica nu este aditiva. (Ex la eucariote in urma asocierii subunitatii mari de 60 S cu subunitatea mica de 40S rezulta ribozomul integral functional care are 80S) .

Ribozomul functional format prin asocierea celor doua subunitati prezinta trei situsuri de legare specifice care se extind pe ambele subunitati. Aceste situsuri acopera ca lungime secventa a trei codoni vecini si sunt notate:

- A (provine de la aminiacid) este situsul unde se fixeaza ARTt~aminoacid-ul ce urmeaza a fi atasat la lantul in crestere

- P (provine de la peptid) este situsul ocupat de ARNt-ul incarcat cu lantul polipeptidic deja sintetizat si care este in crestere

- E (provine de la loc gol=empty) este situsul ocupat de ARNt ramas fara aminoacid in urma descarcarii acestuia

E. Factori de natura proteica necesari si specifici pentru fiecare etapa: factori de initiere, de elongare, de terminare, cu rol structural in asamblarea si stabilizarea ribozomului functional sau cu actiune catalitica. Acesti factori sunt notati functie de etapa la care particpa:

- IF = initiation factor, pentru eucariote = eIF- EF = elongation factors, pentru eucariote eEF- RF = release factors, pentru eucariote eRF

6. Energie sub forma de ATP si GTP:- doi ATP (in ractia de incarcare a ARTt - doi GTP: unul ptr fixarea aminoacil-ARNt la situsul A si al doilea pentru translocarea peptidil-

ARNt in locatia AAlte molecule ATP si GTP sunt consumate pentru initierea si terminarea sintezei.

Etapele sintezei Sinteza proteinelor numita si translatie inseamna traducerea limbajului genetic reprezentat de nucleotidele codonului in limbajul proteic reprezentat de fiecare aminoacid din secventa lantului polipeptidic.ARNm este tradus in directia 5’->3’ generandu-se proteine de la capatul NH2 terminal la cel COOH terminal.Un ARNm va “produce” prin procesul de translatie un singur lant polipeptidic, motiv pentru care se spune ca ARNm este monocistronic.A. InitiereaAre loc in doua etape:- asamblarea subunitatii mici 40S cu ARNm si cu ARNti –Met (ARNti provine de la ARNt de initiere)- dupa asamblarea elementelor de mai sus este atasata subunitatea mare 60S Aceste asamblari precum si recunosaterea capatului 5’ a ARNm, a semnalului de initiere AUG si a ARNti este sunt realizate cu ajutorul eIF si au loc cu consum de GTP.In urma asamblarii:E = golP = ARNti-MetA = gol

In urma asamblarii:E = golP = ARNti-MetA = gol

B. Elongarea

In cadrul procesului de elongare pot fi identificate 4 etape: a. Fixare ARNt-aa1 (in desen Phe) la pozitia A, cu consum de GTP si prin intermediul eEF, pe baza complementaritatii cerute de ARNm. In urma fixarii :

E = golP = ARNti-MetA = ARNT-aa1(in desen Phe)

b. Formarea legaturii peptidice dintre Met si primul aminoacid atasat este realizata de peptidil-transferaza fara consum de GTP. Peptidil-transferaza nu este o proteina ci este ARNr 28S localizat in subunitatea mare. Peptidil-transferaza este o enzima care are ARN ca centru catalitic si se numeste ribozim. Realizarea legaturii peptidice duce la transferarea Met (sau lantului in formare) de la pozitia P la A.In urma formarii legaturii peptidice se obtine:

E = golP = ARNtiA = ARNT-aa1-Met

c. Traslocarea. Dupa formarea legaturii peptidice ribozomul avanseaza pe ARNm pe o distanta de trei nucleotide in directia 5’->3’, proces ce necesita consum de GTP si o serie de alti eEF. In urma translocarii lantul polipeptidic in formare va ocupa situsul P deplasand ARNt descarcat pe situsul E.

E = ARNtiP = ARNT-aa1-MetA = gol

d. In prezenta factorilor elongarii ARNt descarcat se disociaza de pe ribozom eliberand pozitia E permitand continuarea elongarii prin reluarea etapelor a,b,c.Elongarea are loc pana cand la situsul A apare un codon STOP (nonsens) .

C. TerminareaApare atunci cand unul din cei trei codoni STOP intra in situsul A. Acesta este recunoscut de un factor specific eRF, care hidrolizeaza legatura esterica dintre ultimul aminoacid si ARNt, eliberandu-l pe acesta din urma. Fixarea codonilor STOP determina detasarea lantului nou sintetizat de pe ribozomul functional, a ARNm cat si disocierea celor doua subunitati aleribozomului care pot participa la initierea altei sinteze.

Dupa sinteza lanturile polipeptidice nou sintetizate sufera modificari ulterioare care presupun, atasarea unor grupari functionale sau a unor fragmente specifice care au ca scop marcarea lor pentru o anumita locatie (spatiu extracelular, nucleu) sau pentru o anumita functie (activare realizata prin fosforilare) .

Administrara antibioticelor isi bazeaza efectul terapeutic pe inhibarea translatiei la bacterii:- cloramfenicol = inhiba peptidil-transferaza- eritromicin si toxina difterica = se fixeaza pe translocaza- puromicina = inlocuieste un ARNt-Tyr si blocheaza sinteza- streptomicina, tetraciclina = se leaga la subunitatea mare a procariotelor distorsionand structura

acestuia sau impiedicand fixarea ARNt-aan.