UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
”GRIGORE T. POPA” IAȘI
FACULTATEA DE FARMACIE
CERCETǍRI PRIVIND POSIBILITǍŢILE DE VALORIFICARE
A UNOR SCOARŢE DE CONIFERE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Conducător științific,
Prof. Univ. Dr. ANCA MIRON
Doctorand,
Ing. Roxana Laura Amălinei (Mihăilescu)
IAȘI, 2014
Prin decizia Rectorului nr. 838/17.09.2014 a fost numită comisia pentru
susținerea publică a tezei de doctorat intitulată „Cercetări privind
posibilităţile de valorificare a unor scoarţe de conifere”, elaborată de ing.
Roxana Laura Amălinei Mihăilescu, conducător științific Prof. Dr. Anca
Miron, în vederea conferirii titlului de Doctor în Științe Medicale, domeniul
Farmacie.
Comisia de doctorat are următoarea componență:
PREȘEDINTE: Decan Prof. Univ. Dr. Monica Hăncianu
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” Iaşi, Facultatea de
Farmacie
CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC: Prof. Univ. Dr. Anca Miron
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” Iaşi, Facultatea de
Farmacie
REFERENȚI OFICIALI:
Conf. Univ. Dr. Lavinia Tofan
Universitatea Tehnică “Gheorghe Asachi” Iaşi, Facultatea de Management şi
Ingineria mediului
Conf. Univ. Dr. Nela Bibire
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” Iaşi, Facultatea de
Farmacie
Cercetător Științific I, Dr. Elvira Gille
Institutul National de Cercetare Dezvoltare Științe Biologice, Bucureşti/
Centrul de Cercetări Biologice “ Stejarul”, Piatra Neamţ
Teza de doctorat cuprinde:
- 129 pagini,
- 15 tabele,
- 107 figuri,
- 159 referințe bibliografice,
- 4 articole publicate din tematica tezei.
În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru cuprins,
tabele și figuri.
Cuvinte cheie: Pinus sylvestris, Pinus strobus, Abies alba, polifenoli,
proantocianidoli, acțiune antioxidantă, acțiune antiproliferativă, metale grele.
CUPRINS
PARTEA GENERALǍ
CAPITOLUL 1. PINUS SYLVESTRIS L. – GENERALITĂŢI …………. 1
1.1. Încadrare sistematică......................................................................... 1
1.2. Răspândire......................................................................................... 1
1.3. Descriere............................................................................................ 2
1.4. Studii privind compoziţia chimică a scoarţei..................................... 3
1.5. Studii privind potenţialul farmacologic şi posibilele utilizări
ale scoarţei…………………………………………………………..
7
CAPITOLUL 2. PINUS STROBUS L. – GENERALITĂŢI…..…………... 10
2.1. Încadrare sistematică......................................................................... 10
2.2. Răspândire.......................................................................................... 10
2.3. Descriere............................................................................................. 10
2.4. Studii privind compoziţia chimică a scoarţei..................................... 11
2.5. Studii privind potenţialul farmacologic şi posibilele utilizări
ale scoarţei…………………………………………………………..
14
CAPITOLUL 3. ABIES ALBA Mill. …………………………………….. 16
3.1. Încadrare sistematică.......................................................................... 16
3.2. Răspândire.......................................................................................... 16
3.3. Descriere............................................................................................ 17
3.4. Studii privind compoziţia chimică a scoarţei..................................... 18
3.5. Studii privind potenţialul farmacologic şi posibilele utilizări
ale scoarţei………………………………………………………….
19
CAPITOLUL 4. POLUAREA CU METALE GRELE 21
4.1. Aspecte generale............................................................................... 21
4.2. Impactul asupra mediului şi asupra organismului uman…….......... 22
4.3. Metode convenţionale de epurare .................................................... 28
4.4. Metode alternative de epurare............................................................ 29
4.5. Biosorbţia........................................................................................... 30
PARTEA PERSONALĂ
MOTIVAȚIA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI, SCOPUL ŞI
OBIECTIVELE URMĂRITE.........................................................................
42 CAPITOLUL 5. MATERIAL, METODE ŞI TEHNICI DE LUCRU…… 44
5.1. Obţinerea extractelor metanolice 80%............................................... 44
5.2. Studiul chimic..................................................................................... 44
5.2.1. Determinarea cantitativă a polifenolilor totali..................... 44
5.2.2. Analiza HPLC-DAD-ESI-MS....................................... 44
5.3. Studiul capacităţii de scavenger faţă de radicalul DPPH…………... 45
5.4. Studiul acţiunii antiproliferative pe celule HeLa…………………… 46
5.4.1. Evaluarea viabilităţii celulare prin metoda MTT………… 47
5.4.2. Evaluarea efectului asupra viabilităţii celulare şi
apoptozei prin citometrie în flux.........................................
48
5.4.3. Evaluarea efectului asupra ciclului celular prin
metoda NIM-DAPI………………………………………. 49
5.5 Investigarea capacităţii de sorbţie a ionilor de cupru, zinc, cadmiu
şi plumb de către scoarţele de Pinus sylvestris, Pinus strobus şi
Abies alba..........................................................................................
52
5.5.1. Studiul influenţei pH-ului.................................................. 53
5.5.2. Studiul influenţei dozei de sorbent.................................... 53
5.5.3. Studiul influenţei concentraţiei iniţiale de ioni metalici... 54
5.5.4. Studiul influenţei temperaturii........................................... 54
5.5.5. Studiul echilibrului de sorbţie............................................ 54
5.5.6. Studiul influenţei timpului de contact ............................... 54
5.5.7. Determinarea parametrilor cinetici şi termodinamici....... 54
CAPITOLUL 6. STUDIUL SCOARŢEI DE PINUS SYLVESTRIS L... 56
6.1. Obţinerea extractelor metanolice 80%.............................................. 56
6.2. Studiul chimic.............................................................................. ...... 56
6.2.1. Determinarea cantitativă a polifenolilor totali................... 56
6.2.2. Analiza HPLC-DAD-ESI-MS........................................... 56
6.3. Studiul capacităţii de scavenger faţă de radicalul DPPH…………. 64
6.4. Studiul acţiunii antiproliferative pe celule HeLa…………………. 65
6.4.1. Evaluarea viabilităţii celulare prin metoda MTT………. 66
6.4.2. Evaluarea efectului asupra viabilităţii celulare şi
apoptozei prin citometrie în flux.......................................
66
6.4.3. Evaluarea efectului asupra ciclului celular
prin metoda NIM-DAPI………………………………… 67
6.5 Investigarea capacităţii de sorbţie a ionilor de cupru,
zinc şi cadmiu de către scoarţa de Pinus sylvestris..........................
69
6.5.1. Studiul influenţei pH-ului.................................................. 70
6.5.2. Studiul influenţei dozei de sorbent.................................... 71
6.5.3. Studiul influenţei concentraţiei iniţiale de ioni metalici.... 72
6.5.4. Studiul influenţei temperaturii............................................ 72
6.5.5. Studiul echilibrului de sorbţie............................................. 76
6.5.6. Studiul cineticii sorbţiei ..................................................... 76
6.5.7. Determinarea parametrilor cinetici şi termodinamici........ 77
CAPITOLUL 7. STUDIUL SCOARŢEI DE PINUS STROBUS L. 80
7.1. Obţinerea extractelor metanolice 80%.............................................. 80
7.2. Studiul chimic................................................................................. .. 80
7.2.1. Determinarea cantitativă a polifenolilor totali.................. 80
7.2.2. Analiza HPLC-DAD-ESI-MS.......................................... 80
7.3. Studiul capacităţii de scavenger faţă de radicalul DPPH………… 83
7.4. Studiul acţiunii antiproliferative pe celule HeLa………………… 84
7.5 Investigarea capacităţii de sorbţie a ionilor de plumb de
către scoarţa de Pinus strobus .........................................................
84
7.5.1. Studiul influenţei pH-ului................................................. 84
7.5.2. Studiul influenţei dozei de sorbent................................... 85
7.5.3. Studiul influenţei concentraţiei iniţiale de ioni metalici.. 86
7.5.4. Studiul echilibrului de sorbţie............................................ 86
7.5.6. Studiul cineticii sorbţiei .................................................... 88
7.5.7. Determinarea parametrilor cinetici şi termodinamici........ 89
CAPITOLUL 8. STUDIUL SCOARŢEI DE ABIES ALBA Mill. 92
8.1. Obţinerea extractelor metanolice 80%............................................... 92
8.2. Studiul chimic.................................................................................... 92
8.2.1. Determinarea cantitativă a polifenolilor totali.................... 92
8.2.2. Analiza HPLC-DAD-ESI-MS...................................... 92
8.3. Studiul capacităţii de scavenger faţă de radicalul DPPH…….…….. 100
8.4. Studiul acţiunii antiproliferative pe celule HeLa……………...…… 100
8.4.1. Evaluarea viabilităţii celulare prin metoda MTT……..… 100
8.4.2. Evaluarea efectului asupra viabilităţii celulare şi
apoptozei prin citometrie în flux........................................ 101
8.4.3. Evaluarea efectului asupra ciclului celular prin
metoda NIM-DAPI............................................................ 101
8.5 Investigarea capacităţii de sorbţie a ionilor de cupru, zinc şi cadmiu
de către scoarţa de Abies alba.............................................. 102
8.5.1. Studiul influenţei pH-ului................................................... 102
8.5.2. Studiul influenţei dozei de sorbent..................................... 104
8.5.3. Studiul influenţei concentraţiei iniţiale de ioni metalici... 104
8.5.4. Studiul echilibrului de sorbţie............................................ 105
8.5.5. Studiul cineticii sorbţiei..................................................... 109
8.5.6. Determinarea parametrilor cinetici şi termodinamici....... 113
CAPITOLUL 9. CONCLUZII GENERALE.
CONTRIBUȚII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE...........
117
9.1. Concluzii generale............................................................... 117
9.2. Contribuţii originale............................................................ 118
9.3. Perspective de cercetare...................................................... 119
BIBLIOGRAFIE............................................................................................... 120
LISTA DE LUCRĂRI PUBLICATE DIN TEMATICA TEZEI.................. 128
MOTIVAŢIA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI, SCOPUL ŞI
OBIECTIVELE URMĂRITE
În România, Pinus sylvestris L. (pinul roşu), Pinus strobus L. (pinul
moale) şi Abies alba Mill. (bradul) sunt specii lemnoase de interes în industria
prelucrării lemnului. Lemnul acestor specii este utilizat pentru producţia de
cherestea, mobilier, hârtie şi ambalaje.
Scoarţele reprezintă principalul deşeu de la valorificarea industrială a
lemnului acestor specii. În prezent, în România, scoarţele, alături de alte
reziduuri provenite din exploatarea forestieră (rădăcini, alte resturi vegetale,
rumeguş), sunt valorificate numai ca materie primă pentru producerea de
energie.
Acest studiu şi-a propus identificarea altor posibilităţi de valorificare a
scoarţelor unor specii de conifere: în primul rând, o valorificare în terapeutică,
prin utilizarea scoarţelor ca materie primă pentru obţinerea unor extracte cu
proprietăţi antioxidante şi antiproliferative şi în al doilea rând, o valorificare în
epurarea apelor uzate, prin utilizarea scoarţelor ca agenţi chelatanţi pentru ionii
metalici.
Scoarţele de conifere reprezintă o sursă importantă de polifenoli
simpli şi condensaţi, cu diferite efecte biologice: antioxidante,
antiinflamatoare, vasodilatatoare, vasoprotectoare, antimicrobiene,
antitumorale (85-90).
Cel mai elocvent exemplu de valorificare a scoarțelor de conifere
în terapeutică este Pycnogenol®-ul (Horphag Research, Geneva,
Elveţia). Cercetătorul francez Jacques Masquelier a identificat procianidoli
în scoarţa de Pinus pinaster sin. Pinus maritima (Mill) şi a elaborat metoda de
obţinere a Pycnogenol®-ului (91). Pycnogenol
®-ul este un extract apos
purificat care conţine 65%-75% procianidoli, în principal oligomeri,
alături de compuşi fenolici simpli (acizi fenolici şi taxifolină) şi
glicozidele lor. Pycnogenol®-ul inactivează specii reactive ale
oxigenului (radicalii anion, superoxid şi hidroxil), reduce peroxidarea
lipidică, creşte nivelul intracelular de glutation, stimulează activitatea
sistemelor enzimatice antioxidante ( glutation-reductaza, glutation-
peroxidaza, superoxid-dismutaza, catalaza) (92). Pycnogenol®-ul inhibă
activitatea unor enzime care joacă un rol important în producerea de
specii reactive ale oxigenului şi azotului (lipoxigenaza, xantin-oxidază,
NO, sintetază-inductibilă) (93, 94). Pycnogenol®
-ul reduce nivelul de
citokine proinflamatoare şi imunosupresoare (IL-6, IL-10) şi creşte
producţia de cytokine imunostimulatoare (IL-1, IL-5, IL-10, INFα). La
nivelul aparatului cardiovascular, Pycnogenol®-ul acţionează
vasodilatator prin mai multe mecanisme (inactivarea radicalului anion
superoxid, stimularea sintezei de NO la nivelul endoteliului vascular,
scăderea influxului de ioni de calciu). De asemenea, reduce agregarea
plachetară şi inhibă activitatea enzimei de conversie a angiotensinei. În
linia celulară de melanom B16, Pycnogenol®-ul inhibă activitatea
tirozinazei şi în consecinţă, melanogeneza. În plus, normalizează
raportul glutation redus/glutation oxidat şi reduce nivelul unor specii
reactive ale oxigenului şi azotului (radicalul anion superoxid, NO,
anionul peroxinitrit) (95). Pycnogenol®-ul activează caspaza-3 şi ca
urmare, induce apoptoza în celulele leucemice umane HL-60, U-937şi
K562, ceea ce sugerează o posibilă utilizare în prevenirea sau
tratamentul adjuvant al unor forme de leucemie (96). Pycnogenol®-ul
este comercializat ca supliment nutritiv în multe țări europene şi în
SUA. Numeroase studii pe subiecţi umani au demonstrat eficacitatea
sa, ca tratament unic sau adjuvant, în insuficienţă venoasă cronică,
hipertensiune arterială, astm bronşic, diabet zaharat de tip 2,
microangiopatie diabetică, osteoartrită, migrenă, disfuncţie erectilă,
menopauză, lupus eritematos sistemic (97).
Eficacitatea materialelor naturale sau a deşeurilor rezultate din
activităţi agricole şi industriale, ca mediu de adsorbţie sau de schimb
ionic pentru ionii metalelor grele, este deja cunoscută. Produsele şi
deşeurile forestiere constituie una dintre cele mai disponibile resurse
regenerabile în întreaga lume. Dintre acestea, scoarţele reprezintă o
parte însemnată din deşeurile generate la recoltarea şi prelucrarea
lemnului. Numeroase studii au evidenţiat faptul că scoarţele multor
specii de Pinus, ca atare sau modificate (prin extracţie cu alcalii), au
capacitatea de a reţine ioni metalici. Scoarţa de Pinus brutia Ten. a
demonstrat capacitate maximă de sorbţie a Pb(II) de 78 mg/g cu o
eficienţă a desorbţiei de 90,7% (104). Fragmente de scoarţă au fost
testate şi pentru adsorbţia fierului (98).
Scoarţă de Pinus nigra L. modificată chimic a fost testată pentru
reţinerea ionilor de Cd(II), Ni(II), Pb(II), Cu(II) din apele uzate şi
concluzia a fost că tratarea cu NaOH creşte capacitatea de sorbţie de la
2 la 20 mg/L (99).
Pe scoarţa de Pinus radiata D. Don modificată, prin tratarea cu
alcalii, s-au făcut cele mai multe studii şi s-a testat capacitatea de
chelatare a celui mai mare număr de ioni metalici, respectiv: V(V),
Re(III), Mo(VI), Ge(IV), As(V), Cd(II), Hg(II), Al(III), Pb(II), Fe(II),
Fe(III), Cu(II). Ionii de Cu(II), Fe(III) şi Cd(II) au fost îndepărtaţi în
proporţie de 46,9%, 83,7% şi respectiv 33%, prin utilizarea a unui gram
de scoarţă de pin modificată (100).
Totodată studiile efectuate pe scoarţe de conifere au demonstrat
abilitatea acestora de a îndepărta şi unii compuşi organici toxici cum
sunt pesticidele organo-clorurate (lindan, heptaclor), pentaclorfenolul şi
hidrocarburile aromatice policiclice (101).
Concluzia general desprinsă din studiile menţionate este că
utilizarea scoarţelor de conifere în proceselor de sorbţie pentru
îndepărtarea ionilor metalici din ape uzate, poate prezenta numeroase
avantaje, cum sunt costul scăzut al sorbenţilor, disponibilitatea mare a
sorbenţilor, posibilitatea de reutilizare a sorbentului după regenerare,
capacitatea de reţinere a ionilor metalici într-un domeniu larg de pH,
eficienţă ridicată, posibilitatea de a îndepărta specii complexe ale ionilor
metalici, când acest lucru nu este posibil prin utilizarea altor metode de
epurare a apelor uzate.
Scopul cercetării întreprinse a fost identificarea unor direcţii de
valorificare a scoarţelor de conifere, deşeu rezultat din industria
prelucrării lemnului, în prezent insuficient valorificate în România.
Cercetările experimentale au urmărit caracterizarea complexului
polifenolic din scoarţele de Pinus sylvestris, Pinus strobus şi Abies alba,
evaluarea efectelor antioxidante şi antitumorale ale acestora, precum şi
testarea posibilităţilor de utilizare a scoarţelor pentru chelatarea unor
metale grele din apele uzate.
Principalele obiective ale cercetărilor întreprinse în teza de
doctorat au fost:
obţinerea unor extracte polifenolice din scoarţele celor trei
specii de conifere;
caracterizarea spectrului polifenolic al extractelor;
evaluarea potenţialului antioxidant al extractelor;
evaluarea potenţialului antitumoral al extractelor faţă de linia
celulară HeLa şi investigarea posibilelor mecanisme de acţiune
(inducerea apoptozei, blocarea ciclului celular);
evaluarea capacităţii de chelatare a ionilor de Cu(II), Zn(II),
Cd(II) şi Pb(II) de către cele trei specii de conifere studiate;
modelarea echilibrului de sorbţie, cinetica şi termodinamica
procesului pentru adsorbţia ionilor de Cu(II), Zn(II), Cd(II)
şi Pb(II).
PARTEA PERSONALĂ
CAPITOLUL 6.
STUDIUL SCOARŢEI DE PINUS SYLVESTRIS L.
Studiile efectuate de Karonen et al. privitoare la proprietăţile
antiinflamatoare ale fracţiunilor polifenolice (conţinând 28 de compuşi
fenolici) izolate din scoarţa de Pinus sylvestris, au demonstrat
capacitatea de inhibare a doi mediatori proinflamatori, şi anume: NO şi
prostaglandina E2 (10). Aceste rezultate, precum si cele obţinute de
Masquelier, care a studiat efectul de scavenger de radicali liberi al unui
extract bogat în procianidoli, obţinut din altă specie de pin (Pinus
maritima), justifică interesul pentru studiul scoarţei speciei Pinus
sylvestris, atât din punct de vedere al compoziţiei chimice, cât şi din
punct de vedere al evaluării posibilităţilor de valorificare ale acesteia.
6.1. Obţinerea extractului hidrometanolic brut EP1
Studiul a vizat obţinerea unui extract polifenolic total care să
conţină atât structuri fenolice simple, cât şi condensate
(proantocianidoli). Ca urmare, materialul vegetal a fost extras cu
metanol 80% (v/v), obţinându-se extractul brut EP1 (26,03 g,
randament de obţinere 17,35%).
6.2. Studiul chimic
Studiul chimic a urmărit determinarea conţinutului în polifenoli
totali şi analiza spectrului polifenolic al extractului hidrometanolic prin
RP- şi NP-HPLC-DAD-ESI-MS.
6.2.1. Determinarea cantitativă a polifenolilor totali
Conţinutul în polifenoli totali, determinat prin metoda Folin-
Ciocâlteu, a fost calculat din ecuaţia dreptei de calibrare (y = 0,1219x +
0,0091) şi exprimat în g polifenoli/100g extract (fig.6.1).
În extractul brut EP1 a fost determinat un conţinut polifenolic de
48,16%.
Fig. 6.1. Dreapta de calibrare pentru determinarea cantitativă a polifenolilor totali
6.2.2. Analiza RP- şi NP-HPLC-DAD-ESI-MS
Scoarţele speciilor de pin reprezintă o sursă importantă de
polifenoli, atât polifenoli simpli, cât şi condensaţi (procianidoli). Din
acest motiv, pentru identificarea şi caracterizarea polifenolilor din
extractul EP1 a fost utilizată metoda HPLC pe fază inversă (RP-HPLC)
şi pe fază normală ( NP-HPLC) (fig. 6.2, 6.3.) (15, 21, 27).
y = 0.1219x + 0.0091
R2 = 0.9995
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 2 4 6
Acid galic (microg/mL)
Ab
so
rban
ta (
765 n
m)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
1
2
3
4
5
6
7
8
31233
2
2polimeri
1
hexozida taxifolinei
taxifolina
Ab
so
rba
nta
(2
80
nm
)
Timp de retentie (min.)
Fig. 6.2. Analiza RP-HPLC-DAD (280 nm) a extractului EP1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
0
2
4
6
8
10
43
21
taxifolina
hexozida taxifolinei
polimeri
Ab
so
rba
nta
(2
80
nm
)
Timp de retentie (min.)
Fig. 6.3. Analiza NP-HPLC-DAD (280 nm) a extractului EP1
(1-monomeri procianidolici; 2 –dimeri procianidolici)
Principalii polifenoli din extractul EP1 (taxifolină, o O-hexozidă a
taxifolinei, monomeri, dimeri şi trimeri procianidolici) au fost
identificaţi pe baza ionilor moleculari [M-H]- şi [2M-H]
- şi a fragmen-
telor ionice caracteristice (117).
Spectrul de masă al taxifolinei prezintă ionul molecular [M-H]- la
m/z 302,9 alături de un fragment ionic generat prin pierderea unei
molecule de apă [M-H2O]-, la m/z 284,8 (fig. 6.4).
Spectrul de masă al O-hexozidei taxifolinei prezintă ionul
molecular [M-H]- la m/z 465,2 precum şi două fragmente ionice, un
fragment ionic corespunzător agliconului [A]- la m/z 302,8 şi un alt
fragment ionic format din aglicon prin eliminarea unei molecule de apă
[A-H2O]- la m/z 284,9 (fig. 6.5). În spectrul de masă se mai observă un
ion la m/z 437,4 aparţinând unui compus care co-eluează cu O-hexozida
taxifolinei.
200 400 600 800 1000 1200
0,0
2,0x105
4,0x105
6,0x105
8,0x105
1,0x106
1,2x106
1,4x106
1,6x106
302,9
284,8
Inte
nsita
te (
cp
s)
m/z (uma)
Fig. 6.4. Spectrul de masă al taxifolinei
200 400 600 800 1000 1200
0,0
2,0x105
4,0x105
6,0x105
8,0x105
1,0x106
1,2x106
1,4x106
437,4
302,8284,9
465,4
Inte
nsita
te (
cps)
m/z (uma)
Fig. 6.5. Spectrul de masă al O-hexozidei taxifolinei
În extractul EP1 au fost identificaţi şi oligomeri procianidolici,
constituiţi din unităţi de catehină/epicatehină.
Ionizarea prin electrospray (mod negativ) a monomerilor şi
oligomerilor procianidolici inferiori (dimeri, trimeri, tetrameri)
generează ionii moleculari [M-H]- alături de fragmente ionice
caracteristice.
Spectrul de masă al monomerilor procianidolici (catehina,
epicatehina) prezintă ionii moleculari [M-H]- la m/z 289,0 şi [2M-H]
- la
m/z 579,4, alături de un fragment ionic la m/z 245,1 (fig, 6.6.A şi 6.7).
200 400 600 800 1000 1200
0,0
2,0x105
4,0x105
6,0x105
8,0x105
1,0x106
1,2x106
A.
579.4
245.1
289.0
Inte
nsi
tate
(cp
s)
m/z (uma)
Fig. 6.6.A. Spectrul de masă al monomerilor procianidolici
Spectrul de masă al dimerilor procianidolici prezintă ionii
moleculari
[M-H]- la m/z 577,3 şi [2M-H]
- la m/z 1155,5 alături de o serie de
fragmente ionice formate prin scindarea legăturii interflavonoidice (m/z
286,9 şi m/z 289,0), fragmentarea de tip retro-Diels-Alder (m/z 425,3),
eliminarea unei molecule de apă din fragmentul ionic la m/z 425,3 (m/z
407,4) şi fisiunea inelului heterociclic (m/z 451,1) (fig.6.8.B ).
200 400 600 800 1000 1200
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
7x105
8x105B.
286.9
289.0
407.4
425.3
451.1
577.3
1155.5
Inte
nsita
te (
cp
s)
m/z (uma)
Fig. 6.8.B. Spectrul de masă al dimerilor procianidolici
Spectrul de masă al trimerilor procianidolici prezintă ionii
moleculari [M-H]- la m/z 865,3 şi fragmente ionice formate prin
scindarea legăturilor interflavonoidice (m/z 286,8 şi m/z 577,2),
fragmentarea de tip retro-Diels-Alder (m/z 713,6), fisiunea inelului
heterociclic (m/z 739,4) şi scindarea ulterioară a fragmentului ionic la
m/z 577,2 prin mecanism de tip retro-Diels-Alder (m/z 425,3), (fig.
6.9.C )
Spectrul de masă al tetramerilor procianidolici se caracterizează
prin prezenţa ionului molecular [M-H]- la m/z 1153,6 şi a mai multor
fragmente ionice generate prin scindarea legăturilor interflavonoidice
(m/z 289,1, m/z 575,5, m/z 577,5 şi m/z 865,3), fragmentarea de tip
retro-Diels-Alder (m/z 713,6), fisiunea inelului heterociclic (m/z 739,4)
şi scindarea fragmentului ionic la m/z 577,5 prin mecanism de tip retro-
Diels-Alder (m/z 407,3) (fig. 6.10.).
200 400 600 800 1000 1200
0,0
5,0x104
1,0x105
1,5x105
2,0x105
2,5x105
3,0x105
C.
425.3739.4
286.8
713.6
577.2
865.3
Inte
nsita
te (
cp
s)
m/z (uma)
Fig. 6.9.C. Spectrul de masă al trimerilor procianidolici
200 400 600 800 1000 1200
0
1x104
2x104
3x104
4x104
5x104
6x104
7x104
8x104
9x104
D.
407.3577.5
289.1 575.5
865.3
1153.6
Inte
nsi
tate
(cp
s)
m/z (uma)
Fig. 6.10. Spectrul de masă al tetramerilor procianidolici
În cazul procianidolilor cu grad de policondensare mai mare decât
patru, ionizarea prin electrospray (mod negativ) generează ioni cu
sarcini multiple de tipul [M-2H]2-
şi [M-3H]3-
.
Eventuala prezenţă a oligomerilor superiori de la pentameri la
decameri a fost investigată prin identificarea ionilor caracteristici [M-
H]- şi/sau [M-2H]
2- din cromatograma ionică totală. Au fost detectate
semnale slabe corespunzătoare pentamerilor (fig. 6.11), hexamerilor
(fig. 6.12) şi heptamerilor (fig. 6.13). Picul corespunzător polimerilor
procianidolici (TR=50,06 min.) este mai vizibil în cromatograma pe
fază staţionară normală (fig. 6.11).
0 10 20 30 40 50 60
0,0
2,0x104
4,0x104
6,0x104
8,0x104
1,0x105
14,40
Inte
nsi
tate
(cp
s)
Timp de retentie (min.)
Fig. 6.11. Cromatograma corespunzătoare ionului [M-2H]
2- la m/z 720,7
(caracteristic pentru pentamerii procianidolici)
0 10 20 30 40 50 60
0,0
2,0x104
4,0x104
6,0x104
8,0x104
14,82
Inte
nsita
te (
cp
s.)
Timp de retentie (min.)
Fig. 6.12. Cromatograma corespunzătoare ionului [M-2H]2-
la m/z 864,7
(caracteristic pentru hexamerii procianidolici)
0 10 20 30 40 50 60
0
1x104
2x104
3x104
4x104
5x104
6x104
16,55
Inte
nsitate
(cp
s)
Timp de retentie (min.)
Fig. 6.13. Cromatograma corespunzătoare ionului [M-2H]2-
la m/z 1009,0
(caracteristic pentru heptamerii procianidolici)
6.3. Studiul capacităţii de scavenger faţă de radicalul DPPH
Metoda de determinare a capacităţii de scavenger faţă de radicalul
DPPH este utilizată pentru evaluarea capacităţii antioxidante.
Activitatea de scavenger faţă de radicalul DPPH a extractului EP1
a crescut de la 23,24 ±0,56% la 5,20 µg/mL, la 80,63 ±0,22% la 83,33
µg/mL. În acest domeniu de concentraţie activitatea de scavenger a
cvercetolului a crescut de la 74,37 ±1,4% la 95,59 ±1,22% (fig.6.14).
Fig. 6.14. Activitatea de scavenger a extractului EP1 faţă de radicalul DPPH
Valoarea CE50, redusă, de 15,73±0,31 µg/mL, determinată pentru
extractul EP1 dovedeşte o bună activitate de scavenger faţă de radicalul
DPPH. (tab. 6.1)
Tab. 6.1. Valorile CE50 în testul pentru determinarea capacităţii de scavenger
faţă de radicalul DPPH
Extract/Martor pozitiv CE50 (µg/mL)
EP1 15,73 ± 0,31
Cvercetol 3,36 ± 0,05
6.4. Studiul acţiunii antiproliferative pe celule HeLa
6.4.1. Studiul influenţei extractului EP1 asupra viabilităţii
celulare (metoda MTT)
Extractul EP1 a prezentat un efect de reducere a viabilităţii
celulelor HeLa dependent de doză. La concentraţia de 25 µg/mL efectul
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100
% A
ctiv
itat
e d
e sc
aven
ger
Concentratie (µg/mL)
EP1
Cvercetol
citotoxic al extractului a fost nesemnificativ, pentru ca la 100 µg/mL, să
atingă valoarea de 61,99±1,40%. La 200 µg/mL extractul a prezentat o
citotoxicitate de 82,10±1,95%, apropiată ca valoare de citotoxicitatea
etopozidei (87,16 ±2,72%), evaluată la aceaşi concentraţie ( 200 µg/mL)
(fig.6.15).
Fig. 6.15. Viabilitatea şi citotoxicitatea celulelor HeLa după 48 ore de tratament
(EP1 = extract din scoarţă; M = martor; E =etopozidă)
6.4.2. Studiul influenţei extractului EP1 asupra viabilităţii
celulare şi apoptozei (citometrie în flux)
Citometria în flux a evidenţiat un efect pro-apoptotic semnificativ
pentru extractul EP1. Astfel, la 100 µg/mL, extractul EP1 a crescut
procentul de celule apoptotice la 70,17±8,11%. La 200 µg/mL efectul a
fost similar (71,97±0,96%). Trebuie remarcat faptul ca la 200 µg/mL,
etopozida a crescut numărul de celule apoptotice la numai
41,00±3,02%.
La 200 µg/mL, extractul EP1 a determinat şi o creştere importantă
a numărului de celule moarte (23,29±1,29%). Este evident efectul pro-
apoptotic semificativ al extractului EP1, însoţit, la concentraţia de 200
µg/mL, şi de alte mecanisme de inducere a morţii celulare (posibil
necroză) (fig.6.16).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
M EP1 25 EP1 50 EP1 100 EP1 200 E
Citotoxicitate
Viabilitate
Fig. 6.16. Distribuţia procentuală a celulelor vii, moarte, apoptotice şi preapoptotice
după tratamentul cu extractul EP1 (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)
6.4.3. Studiul influenţei extractului EP1 asupra ciclului
celular
(metoda NIM-DAPI)
Distribuţia procentuală a celulelor HeLa în fiecare fază a ciclului
celular, după 48 de ore de tratament cu extractul EP1 (100 şi 200
µg/mL) şi etopozidă (200 µg/mL) este prezentată în fig.6.17.
Fig. 6.17. Analiza ciclului celular în celulele HeLa tratate cu extractul EP1
(*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)
În cazul extractului EP1 se remarcă o creştere semnificativă a
celulelor aflate în faza subG1 (celule apoptotice), pentru ambele
concentraţii testate
**
0
20
40
60
80
100
Celule viabile Celule moarte Celule apoptotice Celulepreapoptotice
% C
elu
le
Martor
EP1 100
EP1 200
Etop 200
**
***
***
**
***
***
*
***
0
20
40
60
80
G0/G1 S G2/M sub-G1
% C
elu
le Martor
EP1 100
EP1 200
Etop 200
(61,38±1,77% pentru concentraţia de 100 µg/mL; 67,69±0,64% pentru
concentraţia de 200 µg/mL). Martorul folosit, etopozida, a determinat o
creştere a numărului de celule din faza sub G1 la 48,72±5,64%.
Metoda NIM-DAPI de analiză a ciclului celular a confirmat
rezultatele obţinute prin citometrie în flux, mai precis efectul pro-
apoptotic semnificativ al extractului EP1, superior etopozidei.
6.5. Investigarea capacităţii de sorbţie a ionilor Cu(II), Zn(II)
şi Cd(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris L.
6.5.1. Studiul influenţei pH-ului
Fig. 6.18. reprezintă grafic efectul pH-ului soluţiei iniţiale asupra
sorbţiei ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris.
Se poate constata că sorbţia celor trei ioni metalici studiaţi scade odată
cu reducerea pH-ului iniţial.
Fig. 6.18. Influenţa pH-ului asupra adsorbţiei ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd (II)
pe scoarţa de Pinus sylvestris
Pentru ionii de Cu(II) s-a înregistrat o adsorbţie maximă de 6,98
mg/g la un pH de 4,5-5, care a scăzut progresiv atingând valoarea de 4
mg/g la pH 3 şi de 0,68 mg/g la pH 1.
Capacitatea de adsorbţie pentru ionii de Zn(II) atinge valoarea
maximă de 6,24 mg/g la pH 4,5-5 şi scade la 3,3 mg/g la pH 3 şi la 0,54
mg/g la pH 1.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 3 4 5 6 7
q (
mg/
g)
pH
60 mg Zn(II)/L
72 mg Cu(II)/L
60 mg Cd(II)/L
Pentru ionii de Cd(II), capacitatea de adsorbţie maximă este de
6,63 mg/g la pH 5 şi scade progresiv la 4,32 mg/g la pH 3 şi la 0,28
mg/g la pH 1.
Scăderea sorbţiei ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) la valori mici
ale pH-ului poate fi atribuită încărcării pozitive a scoarţei de pin si
totodată competiţiei dintre ionii de hidrogen şi ionii metalelor grele
pentru poziţiile active de la suprafaţa scoarţei. Acest comportament
poate fi folosit pentru recuperarea ionilor metalici prin desorbţia lor de
pe scoarţa de Pinus sylvestris cu acizi minerali. Pe de altă parte,
creşterea sorbţiei la valori mari ale pH-ului se poate datora ionizării
grupelor funcţionale şi creșterii densităţii încărcăturii negative la
suprafaţa scoarţei, ceea ce îmbunătățește semnificativ atracţia cationilor
testaţi.
Capacitatea de adsorbţie a ionilor de Cd(II) este mai mare decât
cea a ionilor de Cu(II) şi Zn(II) ceea ce sugerează că grupele funcţionale
prezente în scoarţa de pin au afinitatea cea mai mare pentru ionii de
Cd(II).
6.5.2. Studiul influenţei dozei de sorbent
Influenţa cantităţii de scoarţă asupra sorbţiei ionilor de Cu(II),
Zn(II) şi Cd(II) din soluţiile apoase este redată în fig. 6.19.
Determinările s-au efectuat la pH= 4,5-5, timp de contact de 8 ore şi
temperatură de 20oC.
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
R (
%)
Cantitate sorbent (g/L)
60 mg Zn(II)/L
72 mg Cu(II)/L
60 mg Cd(II)/L
Fig. 6.19. Variaţia procentului de retenţie a ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II)
în funcţie de cantitatea de sorbent
Îndepărtarea cationilor testaţi a sporit semnificativ odată cu
creşterea cantităţii de scoarţă de pin. Astfel, procentul de eliminare a
ionilor de Cu(II) dintr-o soluţie de concentraţie 72 mg/L a variat de la
45% la 81% prin creşterea cantităţii de scoarţă de la 4 la 40 g/L. În
acelaşi timp, sorbţia ionilor de Zn(II) din soluţiile apoase de
concentraţie C0=60 mg/L a crescut de la 43% la 77% în condiţiile unei
creşteri a cantităţii de scoarţă de la 4 la 40 g/L, iar sorbţia ionilor de
Cd(II) din soluţiile apoase de concentraţie C0=60 mg/L a înregistrat cea
mai mare creştere, de la 46% la 90% în condiţiile unei creşteri a
cantităţii de scoarţă de la 4 la 40 g/L. Acest comportament poate fi
atribuit creşterii suprafeţei de contact datorată creşterii masei
sorbentului, ceea ce determină o creştere a numărului de poziţii active
de sorbţie.
Cantitatea de cationi reţinută pe unitatea de masă de scoarţa a
scăzut la creşterea cantităţii de sorbent. De aceea, în soluţii de
concentraţie C0=72 mg/L, cantitatea de Cu(II) reţinut a scăzut de la
18,21 mg/g la 2,79 mg/g, la o creştere a cantităţii de scoarţă de pin de la
4 la 40 g/L. Cantitatea de ioni de Zn(II) reţinuţi pe scoarţă a atins o
valoare de 14,2 mg/g şi respectiv, de 1,70 mg/g pentru cantităţi de
scoarţă de 4 şi respectiv 40 g/L, iar cantitatea de ioni de
Cd(II) reţinuţi pe scoarţa a atins o valoare de 18,2 mg/g si respectiv de
1,23 mg/g pentru doze de scoarţă de 4 şi respectiv 40 g/L. Această
scădere poate fi corelată cu scăderea atât a suprafeţei de contact, cât si a
raportului sorbat/sorbent.
6.5.3. Studiul influenţei concentraţiei iniţiale de ioni metalici
Influenţa concentraţiei iniţiale a soluţiilor asupra procesului de
sorbţie a ionilor Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris
este redată în tab.6.2. Determinările s-au efectuat pentru cantităţi de
scoarţă de 4g/L, pH= 4,5-5. timp de contact de 8 ore, la temperatura de
20oC. Aşa după cum reiese din tab. 6.2, creşterea concentraţiei iniţiale a
ionilor metalici determină creşterea gradului de sorbţie al acestora pe
scoarţă. Acest comportament se poate explica prin creşterea forţei
motrice a gradientului de concentraţie produs de creşterea concentraţiei
iniţiale a ionilor a Cu(II), Zn(II) şi Cd(II). Pe de altă parte, procentul de
adsorbţie a celor trei ioni scade odată cu creşterea concentraţiei iniţiale a
ionilor metalici.
Tab. 6.2. Influenţa concentraţiilor iniţiale ale soluţiilor de Cu(II, Zn(II) şi Cd(II)
asupra procesului de adsorbţie pe scoarţa de Pinus sylvestris
C0 (mg/L) q (mg/g) R (%)
Cu(II) Zn(II) Cd(II) Cu(II) Zn(II) Cd(II) Cu(II) Zn(II) Cd(II)
24 20 20 3,14 2,62 3,00 86 83 87
48 40 40 5,03 4,20 5,01 79 74 80
72 60 60 6,98 6,24 8,25 70 67 78
96 80 80 9,20 8,76 10,30 66 60 68
120 100 100 10,40 9,80 11,20 60 52 60
144 120 120 11,30 10,75 12,00 55 49 55
168 140 140 13,50 12,00 13,01 50 47 47
192 160 160 14,70 13,01 14,00 47 45 43
q (mg/g) reprezintă cantitatea de ion metalic reţinut pe unitatea de masă
de sorbent iar R( %) reprezintă procentul de ion metalic reţinut.
Această constatare este în concordanţă cu datele din literatură
referitoare la sorbţia ionilor de Cu(II) şi Zn(II) pe o biomasă de conuri
de Pinus sylvestris L. şi se poate datora fie creşterii numărului de ioni
care intră în competiţie pentru situsurile de legare libere din scoarţa de
pin, fie lipsei situsurilor de legare necesare pentru complexarea ionilor
de Cu(II) şi Zn(II) la nivele mai ridicate ale concentraţiilor (119). În
acest context, este evident faptul că scoarţa de pin ar putea fi folosită cu
succes la îndepărtarea metalelor grele din apele reziduale al căror
conţinut în Cu(II) , Zn(II) şi Cd(II) este scăzut.
6.5.4 Studiul echilibrului de sorbţie
Fig. 6.20, 6.21 şi 6.22 ilustrează prin izotermele Langmuir
dependenţele funcţionale între concentraţiile la echilibru ale Cu(II),
Zn(II) şi Cd(II) în faza solidă şi soluţie, la diferite temperaturi, q = f(c).
Determinările s-au efectuat la pH=4,5-5; cantitatea de sorbent = 6 g/L;
timp de sorbţie 6 ore. Din izotermele Langmuir se constată că
temperatura influenţează favorabil procesul de adsorbţie a celor trei ioni
metalici studiaţi.
Fig. 6.20. Izotermele Langmuir pentru sorbţia ionilor de Cu(II)
pe scoarţa de Pinus sylvestris
Fig. 6.21. Izotermele Langmuir pentru sorbţia ionilor de Zn(II)
pe scoarţa de Pinus sylvestris
Fig. 6.22. Izotermele Langmuir pentru sorbţia ionilor de Cd(II)
pe scoarţa de Pinus sylvestris
Constantele izotermelor de sorbţie ale ionilor de Cu(II), Zn(II) şi
Cd(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris au fost calculate din intersecţiile şi
0
5
10
15
0 10 20 30 40 50 60 70
q (
mg/
L)
Ce (mg/L)
4 °C
20 °C
60 °C
0
5
10
15
0 20 40 60 80 100 120
q (
mg/
L)
Ce (mg/L)
4 °C
20 °C
60 °C
0
5
10
15
0 20 40 60 80 100 120
q (
mg/
L)
Ce (mg/L)
4 °C
20 °C
60 °C
pantele reprezentărilor grafice în coordonate log q vs. log C (fig. 6.23-
6.25) şi respectiv C/q vs. C (fig. 6.26-6.28). Valorile coeficienţilor lor
de corelaţie (R2) sunt prezentate în tab. 6.3.
Fig. 6.23. Modelarea datelor experimentale după izoterma Freundlich
pentru sorbţia ionilor de Cu(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris
Fig. 6.24. Modelarea datelor experimentale după izoterma Freundlich
pentru sorbţia ionilor de Zn(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris
Fig.6.25. Modelarea datelor experimentale după izoterma Freundlich
pentru sorbţia ionilor de Cd(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris
y = 0.5917x - 0.1032 R² = 0.9989 y = 0.4567x + 0.2679
R² = 0.9958
y = 0.3747x + 0.5172 R² = 0.9992
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.5 1 1.5 2
Lg q
Lg C
4 °C20 °C60 °C
y = 0.8401x - 0.784 R² = 0.9746 y = 0.7007x - 0.3108
R² = 0.9651
y = 0.5166x + 0.1331 R² = 0.9947
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Lg q
Lg C
4 °C20 °C60 °C
y = 0.7485x - 0.5585 R² = 0.9758
y = 0.7172x - 0.3023 R² = 0.9884
y = 0.5307x + 0.1514 R² = 0.9991
0
0.5
1
1.5
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Lg q
Lg C
4 °C20 °C60 °C
Fig. 6.26. Modelarea datelor experimentale după izoterma Langmuir
pentru sorbţia ionilor de Cu(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris
Fig. 6.27. Modelarea datelor experimentale după izoterma Langmuir
pentru sorbţia ionilor de Zn(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris
Fig. 6.28. Modelarea datelor experimentale după izoterma Langmuir
pentru sorbţia ionilor de Cd(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris
Valorile empirice ale constantelor Freundlich pentru sistemele
statice de adsorbţie Cu(II)-scoarţă , Zn(II)-scoarţă şi Cd(II)-scoarţă sunt
redate în tab. 6.3 şi evidenţiază încă o dată faptul că procesul de
adsorbţie depinde puternic de natura ionilor metalici.
Valorile „n” sunt supraunitare, demonstrând o adsorbţie favorabilă
a cationilor testaţi pe scoarţa de pin la toate temperaturile de lucru.
y = 0.0784x + 2.4713 R² = 0.9765
y = 0.0754x + 1.0142 R² = 0.9803
y = 0.0683x + 0.4812 R² = 0.9808
0
2
4
6
8
0 10 20 30 40 50 60 70
C/q
C (mg/L)
4 °C
20 °C
60 °C
y = 0.0501x + 8.6063 R² = 0.8132
y = 0.0568x + 3.6124 R² = 0.9651 y = 0.063x + 1.6172
R² = 0.988 0
5
10
15
20
0 20 40 60 80 100 120
C/q
C (mg/L)
4 °C20 °C60 °C
y = 0.0592x + 6.425 R² = 0.9434 y = 0.0446x + 3.662
R² = 0.9953
y = 0.0517x + 1.6923 R² = 0.9665 0
2
4
6
8
10
12
14
0 20 40 60 80 100 120
C/q
C (mg/L)
4 °C
20 °C
60 °C
Valorile Kf determinate în urma acestui studiu sunt mult mai mari
comparativ cu cele prezentate în alte studii ceea ce dovedeşte faptul că
scoarţa de pin poate fi utilizată pentru îndepărtarea ionilor de Cu(II),
Zn(II) şi Cd(II) din medii apoase. Ar trebui realizate studii suplimentare
pe ape uzate pentru a evalua capacitatea de sorbţie a scoarţei de pin
pentru aceste metale în prezenţa altor metale şi a materiilor organice.
Pentru a compara modelele izotermelor Langmuir şi Freundlich, datele
experimentale au fost procesate statistic prin regresie lineară.
Tab. 6.3. Parametrii caracteristici sorbţiei ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II)
pe scoarţa de Pinus sylvestris
Ion
metalic
T
(K)
Izoterma Langmuir Izoterma Freundlich
R2
q0
(mmol/g)
KL
(L/mol) R
2 Kf n
Cu(II)
277 0,9832 0,2099 1892 0,9873 0,7680 1,640
293 0,9967 0,2750 3591 0,9967 1,8900 2,210
333 0,9899 0,3450 4543 0,9974 3,4100 2,700
Zn(II)
277 0,9922 0,2057 649 0,9799 0,1688 1,200
293 0,9948 0,2420 1319 0,968 0,5290 1,470
333 0,9870 0,2570 2320 0,9957 1,3900 1,954
Cd(II)
277 0.9898 0.1230 709 0.9964 0.3244 1.376
293 0.9940 0.1450 1210 0.9975 1.0650 2.102
333 0.9948 0.1510 1550 0.9998 2.0540 2.313
6.5.5. Studiul influenţei timpului de contact
Efectul timpului de contact asupra procesului de reţinere a ionilor
de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris a fost investigat
folosind soluţii apoase cu pH-ul iniţial 5 şi diferite concentraţii în ioni
metalici.
Rezultatele prezentate în fig. 6.29 - 6.31 evidenţiază faptul că
reţinerea ionilor metalici testaţi este extrem de rapidă în primele 20
minute, iar apoi scade în mod semnificativ, echilibrul fiind considerat
atins după 2 ore.
Fig. 6.29. Influenţa timpului de contact asupra adsorbţiei Cu(II)
Fig. 6.30. Influenţa timpului de contact asupra adsorbţiei Zn(II)
Fig. 6.31 Influenţa timpului de contact asupra adsorbţiei Cd(II)
Studiul termodinamicii procesului de sorbţie
Parametri termodinamici calculaţi sunt prezentaţi în tab. 6.4.
Valorile negative ale variaţiei energiei libere (∆G) la toate
temperaturile de lucru arată că procesul de sorbţie a ionilor de Cu(II),
Zn(II) şi Cd(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris este spontan şi că gradul
de spontaneitate al reacţiei creşte odată cu creşterea temperaturii.
Valorile pozitive ale variaţiei entalpiei (∆H) sunt caracteristice
proceselor endoterme, favorizate de creşterea temperaturii.
Valorile pozitive ale variaţiei entropiei (∆S) sugerează
redistribuirea energiei între ionii metalelor grele şi scoarţă.
Tabelul 6.4. Parametrii termodinamici ai procesului de sorbţie
0
5
10
15
0 50 100 150 200 250 300 350 400
q (
mg/
g)
Timp (min)
72 mg Cu(II)/L
96 mg Cu(II)/L
0
2
4
6
8
10
0 50 100 150 200 250 300 350 400
q (
mg/
g)
Timp (min)
60 mg Zn(II)/L
100 mg Zn(II)/L
0
5
10
0 50 100 150 200 250 300 350 400
q (
mg/
g)
Timp (min)
60 mg Cd(II)/L
a ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) pe scoarţa de Pinus sylvestris
Ion T ΔG ΔH ΔS
metalic (K) (KJ/mol) (KJ/mol) (J/mol K)
Cu(II)
277 -17,350 10,54 0,102
293 -19,780 0,104
333 -23,300 0,101
Zn(II)
277 -15,031 8,48 0,084
293 -17,362 0,088
333 -21,418 0,089
Cd(II)
277 -15.100
0.090
293 -17.280 10.07 0.093
333 -20.310 0.091
Concluzii
Din scoarţa de Pinus sylvestris fost obţinut un extract
hidroalcoolic cu un conţinut polifenolic de 48,16 ± 0,29%.
Analiza HPLC-DAD-ESI-MS a evidenţiat prezenţa în extractul
EP1 a următorilor compuşi polifenolici: taxifolină, o O-hexozidă a
taxifolinei şi procianidoli (monomeri, dimeri, trimeri şi tetrameri).
Extractul EP1 a prezentat o capacitate ridicată de scavenger faţă
de radicalul DPPH (CE50= 3,36 ± 0,05 µg/mL) şi a indus apoptoza în
celulele de adenocarcinom cervical HeLa. La concentraţiile de 100 şi
200 µg/mL efectul proapoptotic a fost mai intens decât cel al etopozidei
de 200 µg/mL (70,17±8,11% şi 71,97±0,96% vs 41,00±3,02%). Efectul
proapoptotic a fost confirmat şi prin analiza ciclului celular, extractul
EP1 determinând o acumulare semnificativă a celulelor în faza subG1
(61,38±1,77% la 100 µg/mL, 67,69±0,64% la 200 µg/mL) superioare
celei induse de etopozidă
(48,72±5,64% la 200 µg/mL). Extractul EP1 nu a influenţat alte faze ale
ciclului celular.
În ceea ce priveşte scoarța de Pinus sylvestris, aceasta s-a
dovedit a fi un sorbent eficient pentru îndepărtarea ionilor de Cu(II),
Zn(II) şi Cd(II) din soluţii apoase. Experimentele de stabilire a
parametrilor adsorbţiei au evidenţiat următoarele:
- la o variaţie a pH-ului de la 1 la 5, capacitatea de adsorbţie a
scoarţei de pin scade odată cu diminuarea pH-ului iniţial; ionii de Cu(II)
, cât şi ionii de Zn(II) şi Cd(II) prezintă maxime de adsorbţie de 6,98
mg/g şi respectiv, 6,24 mg/g şi 8,53 mg/g, la pH 4,5-5 respectiv la 5-5,5
pentru ionii de Cd(II);
- procentul de sorbţie al ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) creşte
odată cu creşterea cantităţii de sorbent; la doza maximă de 64 g/L,
valoarea procentului de retenţie depăşeşte 99%;
- cinetica de sorbţie a ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) din
soluţii apoase cu pH iniţial de 5-5,5 este bine descrisă prin modelul de
ordin pseudo-doi;
- cantitatea de ioni de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) reţinută pe scoarţă
creşte odată cu creşterea concentraţiei ionilor metalici, dar procentul
reţinut scade;
- izotermele de sorbţie indică, că reţinerea ionilor de Cu(II),
Zn(II) şi Cd(II) pe scoarţa de pin satisface atât ipotezele modelului
Langmuir, cât şi pe cele ale modelului Freundlich;
- valorile calculate ale parametrilor termodinamici evidenţiază
faptul că sorbţia ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) pe scoarţa de pin este
un proces spontan de natură endotermă şi chimică.
CAPITOLUL 9 . CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII
ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE
9.1. Concluzii generale
În urma studiului întreprins asupra scoarţelor provenite de la
speciile Pinus sylvestris L. (Pinaceae, pin roşu), Pinus strobus L.
(Pinaceae, pin strob, pin moale) şi Abies alba Mill. (Pinaceae, brad), se
desprind următoarele concluzii:
♦ prin extracţia scoarţelor celor trei specii de conifere cu metanol
80%, s-au obţinut extractele brute EP1, EP2 şi respectiv, EA
randamentele de obţinere fiind de 17,35%, 22,35%, şi 11,62%;
♦ studiul chimic cantitativ a evidenţiat faptul că extractul EP1 are
conţinutul cel mai ridicat în polifenoli totali (48,16±0,29%), fiind urmat
de extractele EP2 (36,56±0,55%) şi EA (29,86±1,07%);
♦ analiza RP- şi NP-HPLC-DAD-ESI-MS a evidenţiat
componentele polifenolice majore în fiecare extract :
- taxifolina, o O-hexozidă a taxifolinei, catehina, procianidoli
oligomeri
(trei dimeri, trei trimeri, tetrameri, pentameri, hexameri) şi polimeri în
extractul EP1;
- taxifolina, o O-hexozidă a taxifolinei, derivaţi de stilben,
catehina, procianidoli oligomeri (doi dimeri, un trimer) şi polimeri în
extractul EP2;
- galocatehină/epigalocatehină şi prodelfinidoli (un monomer, un
dimer, trei trimeri, polimeri) în extractul EA.
♦ Capacitatea de scavenger de radicali liberi a fost evaluată faţă de
radicalul DPPH. Faţă de acest radical, extractul EP2 a fost cel mai activ
(CE50=10,8±0,3 µg/mL), fiind urmat de extractul EA (CE50=12,4±0,11
µg/mL) şi extractul EP1 (CE50=15,73±0,31 µg/mL). Valorile reduse ale
CE50 dovedesc o activitate antioxidantă bună pentru toate cele trei
extracte testate.
♦ Evaluarea potenţialului antitumoral al extractelor a constat în
studiul efectelor acestora asupra viabilităţii, apoptozei şi ciclului celular
în culturi de celule HeLa. În screening-ul preliminar de testare a
efectelor asupra viabilităţii celulelor HeLa prin metoda MTT, la
concentraţia de 200 µg/mL, cel mai activ s-a dovedit extractul EP1
(82,10±1,95% citotoxicitate), urmat de extractul EA (53,20±2,72%
citotoxicitate); extractul EP2 a prezentat o activitate citotoxică redusă
(36,65±0,57% citotoxicitate). Activitatea extractului EP1 a fost
asemănătoare cu cea a etopozidei (87,16±2,72% citotoxicitate), la 200
µg/mL.
Extractul EP1 (100 şi 200 µg/mL) a indus un efect pro-apoptotic mai
intens decât al etopozidei (200 µg/mL) în celulele HeLa, după o
incubare de 48 de ore (70,17±8,11% şi 71,97±0,96% vs 41,00±3,02%
celule apoptotice. Extractul EA, la 200 µg/mL, a fost mai slab activ
determinând o creştere a procentului de celule apoptotice la
34,77±2,80%. Analiza ciclului celular după 48 de ore de incubare, a
confirmat efectele pro-apoptotice ale extractului EA, superioare
etopozidei, la 100 şi 200 µg/mL, extractul EP1 a determinat creşteri
semnificative ale procentului de celule din faza sub G1 (apoptotică),
superioare celei induse de etopozidă (200 µg/mL), (61,38±1,77% şi
67,69±0,64% vs 48,72±5,64%). Extractul EP2 a fost mai slab activ; la
200 µg/mL, a determinat o creştere a procentului de celule din faza sub
G1 la numai 15,28±1,28%. Nici unul dintre extracte nu a influenţat
semnificativ celelalte faze ale ciclului celular. Efectul pro-apoptotic
intens al extractului EP1, justifică continuarea studiilor privind
potenţialul antitumoral al acestuia. În ceea ce priveşte extractul EA,
efectul de reducere a viabilităţii celulelor HeLa este datorat altor
mecanisme decât inducerea apoptozei sau blocarea ciclului celular.
♦ Scoarţele speciilor Pinus sylvestris L, Pinus strobus L. şi Abies
alba Mill., pot reprezintă sorbenţi ieftini şi eco-prietenoşi pentru
îndepărtarea ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) şi Pb(II) din soluţii
apoase;
♦ eficienţa procesului de adsorbţie este influenţată de pH-ul iniţial
al soluţiei apoase, unul dintre mecanismele procesului fiind dat de
interacţiunile electrostatice dintre sarcinile negative ale grupărilor
funcţionale de pe suprafaţa sorbentului şi ionii metalici încărcaţi pozitiv.
La o variaţie a pH-ului de la 1 la 5, capacitatea de adsorbţie a scoarţei de
Pinus sylvestris şi a scoarţei de Abies alba, scade odată cu diminuarea
pH-ului iniţial; capacitatea maxima de adsorbţie se înregistrează la un
pH de 4,5-5, pentru scoarţa de Pinus sylvestris capacitatea de adsorbţie
scăzând în ordinea Cd(II)>Cu(II)>Zn(II) iar pentru scoarţa de Abies
alba scăderea fiind în ordinea Cd(II)>Zn(II)>Cu(II). La pH 5 se
constată că, capacitatea de adsorbţie a scoarţei de Pinus sylvestris este
superioară celei de Abies alba. La o variaţie a pH-ului de la 2 la 7,
capacitatea de adsorbţie a scoarței de Pinus strobus pentru ionii de
Pb(II) a înregistrat valoarea maximă la pH 5-5.5. Valorile pH-lui optim
de 4,5-5 arată că reacţiile de complexare au de asemenea un rol
important în procesul de adsorbţie;
♦ procentul de adsorbţie al ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) a
crescut odată cu creşterea cantităţii de sorbent, tendinţa de creştere fiind
mai accentuată la Abies alba decât la Pinus sylvestris. Acest
comportament justificabil prin creşterea suprafeţei de contact, datorată
creşterii masei sorbentului este reflectat prin creşterea a numărului de
poziţii active de adsorbţie;
♦ cinetica de adsorbţie a ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) din
soluţii apoase cu pH iniţial de 4,5-5 pe scoarţele de Pinus sylvestris şi
Abies alba şi a ionilor de Pb(II) din soluţii apoase cu pH iniţial de 5-5,5
pe scoarţa de Pinus strobus este bine descrisă prin modelul de ordin
pseudo-doi;
♦ cantitatea totală de ioni reţinuţi pe scoarţele testate a crescut odată
cu creşterea concentraţiei ionilor metalici, dar procentul de retenţie a
acestora a scăzut; Pinus sylvestris demonstrează abilităţi de chelatare a
ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) superioare faţă de Abies alba;
izotermele de adsorbţie au indicat clar că reţinerea ionilor de
Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) pe scoarţele testate satisface atât ipotezele
modelului Langmuir, cât şi pe cele ale modelului Freundlich; la fel se
constată şi pentru reţinerea ionilor de Pb(II);
valorile calculate ale parametrilor termodinamici evidenţiază
faptul că adsorbţia ionilor de Cu(II), Zn(II) şi Cd(II) pe scoarţele de
conifere este un proces spontan de natură endotermă şi chimică.
9.2. Gradul de originalitate
Originalitatea tezei de doctorat constă în :
studiul spectrului polifenolic din scoarţele de Pinus sylvestris L,
Pinus strobus L. şi Abies alba Mill. prin RP- şi NP-HPLC-DAD-ESI-
MS;
evaluarea capacităţii extractelor hidrometanolice, obţinute din
scoarţă, de a inactiva radicalii liberi;
evaluarea capacităţii extractelor hidrometanolice de a reduce
viabilitatea celulelor HeLa şi investigarea mecanismelor de acţiune
(inducerea apoptozei, blocarea ciclului celular);
stabilirea experimentală a parametrilor (concentraţia de ioni
metalici în soluţia apoasă, cantitatea de scoarţă, pH-ul inițial, timpul și
temperatura), procesului de adsorbţie a ionilor de Cu(II), Zn(II), Cd(II)
şi Pb(II), pe scoarţele de Pinus sylvestris L, Pinus strobus L. şi Abies
alba Mill.;
prelucrarea datelor experimentale pentru stabilirea timpului
necesar atingerii echilibrului, determinarea concentrațiilor de echilibru,
pentru stabilirea izotermelor (regresie liniară și neliniară) modelelor
cinetice și pentru calcularea parametrilor termodinamici.
9.3. Perspective de cercetare
Rezultatele obţinute justifică continuarea studiilor în următoarele
direcţii:
evaluarea in vivo a acţiunii antioxidante a celor trei extracte;
studiul acţiunii antiproliferative (pro-apoptotice) a extractului
din scoarţa de Pinus sylvestris ( EP1), faţă de alte linii celulare
tumorale umane;
evaluarea capacităţii extractului EP1 de a potenţa acţiunea unor
citostatice, faţă de celulele HeLa şi alte linii celulare tumorale
umane;
studiul potenţialului citostatic al extractului EP1 faţă de linii
celulare normale, umane;
evaluarea in vivo a acţiunii antitumorale a extractului EP1;
investigarea posibilelor efecte biologice ale extractelor obţinute
din scoarţele altor specii de conifere, utilizate în industria
lemnului;
investigarea parametrilor pentru desorbţia ionilor metalici
adsorbiţi pe scoarţe;
investigarea potenţialului de adsorbţie/desorbţie a altor ioni
metalici, pe scoarţele de conifere, în sisteme apoase
monocomponent sau poli-component;
studiu privind modificarea scoarţelor pentru creşterea
potenţialului adsorbant;
studii pe ape uzate pentru investigarea comportamentului de
adsorbţie al scoarţei de conifere în co-prezenţa altor metale şi a
unor materii organice;
studiu capacităţii de chelatare a metalelor de către fracţiunile
solubile extractibile din scoarţele de conifere şi de către
reziduul lignocelulozic;
investigarea potenţialului de obţinere a unor compuşi Me-
fracţiune polifenolică, în care Me sunt metale cu potenţial
farmacologic şi investigarea acţiunii acestora;
evaluarea potenţialului de utilizare ca agent de fertilizare a
solurilor, a compostului obţinut după chelatarea zincului şi
cuprului pe scoarţele de conifere.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Sârbu I Ştefan N, Oprea A. Plante vasculare din România. 2013; 48-49: 50-
51.
2. Horeanu C, Barbu I. Dendrologie. Editura Universităţii Suceava 2005; 47-51,
58-59, 23-27.
3. Pârvu C. Universul plantelor, ed. a IV-a. Bucureşti: Ed. ASAB, 2006.
4. Ciocârlan V. Flora ilustrată a României. Pteridophyta et Spermatophyta, ed.
a II-a. Bucureşti: Ed. Ceres, 2000.
5. Pan H, Lundgren LN. Phenolics from inner bark of Pinus sylvestris.
Phytochemistry 1996;42 (4): 1185-1189.
6. Karonen M, Hämäläinen M, Nieminen R, Klika KD, Loponen J, Ovcharenko
VV, Moilanen E, Pihlaja K. Phenolic Extractives from the bark of Pinus
sylvestris L. and their effects on inflammatory mediators nitric oxide and
prostaglandin E2. J Agric Food Chem 2004; 52: 7532-7540.
7. Sinkkonen J, Liimatainen J, Karonen M, Pihlaja K. A new dihydroflavonol
from Pinus sylvestris L. Magn Reson Chem 2005; 43: 348-349.
8. Sinkkonen J, Liimatainen J, Karonen M, Wiinamäki K, Eklund P, Sjöholm
R, Pihlaja K. A sesquineolignan with a spirodienone structure from Pinus
sylvestris L. Angew Chem Int Ed 2007; 46: 4148-4150.
9. Sinkkonen J, Karonen M, Liimatainen J, Pihlaja K. Lignans from the bark
extract of Pinus sylvestris L. Magn Reson Chem 2006; 44: 633-636.
10. Karonen M, Loponen J, Ossipov V, Pihlaja K. Analysis of procyanidins in
pine bark with reversed-phase and normal-phase high-performance liquid
chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chim Acta
2004; 522: 105-112.
11. Östlund L, Ahlberg L, Zackrisson O, Bergman I, Arno S. Bark-peeling,
food stress and tree spirits – the use of pine inner bark for food in
Scandinavia and North America. J Ethnobiol 2009; 29(1): 94-112.
12. Saleem A, Kivelä H, Pihlaja K. Antioxidant activity of pine bark
constituents. Z Naturforsch 2003; 58c: 351-354.
13. Kähkönen MP, Hopia AI, Vuorela HJ, Rauha J-P, Pihlaja K, Kujala TS,
Heinonen M. Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic
compounds. J Agric Food Chem 1999; 47 (10): 3954-3962.
14. Rauha J-P, Remes S, Heinonen M, Hopia A, Kähkönen M, Kujala T,
Pihlaja K, Vuorela H, Vuorela P. Antimicrobial effects of Finnish plant
extracts containing flavonoids and other phenolic compounds. Int J Food
Microbiol 2000; 56: 3-12.
15. Laitinen LA, Tammela PSM, Galkin A, Vuorela HJ, Marvola MLA, Vuorela
PM. Effects of extracts of commonly consumed food supplements and food
fractions on the permeability of drugs across Caco-2 cell monolayers. Pharm
Res 2004; 21 (10): 1904-1916.
16. Vuorela S, Kreander K, Karonen M, Nieminen R, Hämäläinen M, Galkin A,
Laitinen L, Salminen J-P, Moilanen E, Pihlaja K, Vuorela H, Vuorela P,
Heinonen M. Preclinical evaluation of rapeseed, raspberry and pine bark
phenolics for health related effects. J Agric Food Chem 2005; 53: 5922-
5931.
17. Lindstedt G. Constituents of Pine Heartwood. XX. Separation of Phenolic
Heartwood Constituents by Paper Partition Chromatography.Acta Chemica
Scandinavica 1950; 448-455.
18. Pietarinen S.P, Willför S, Ahotupa M, Hemming J, Holmbom B, Knotwood
and bark extracts: strong antioxidants from waste materials J Wood Sci 2006;
52:436–444.
19. Carvalho M , Carvalho Cranchi D, Carvalho A, Chemical constituients from
Pinus strobus var. Chiapensis J Braz Chem Soc 1996; 7:3: 187-191.
20. Zinkel D F, Evans B B. Terpenoids of Pinus strobus cortex tissue.
Phytochemistry1972; 11: 3387-338.
21. Durzan D J. Arginine, scurvy and Cartier's "tree of life". Journal of
Ethnobiology and Ethnomedicine 2009; 5:5.
22. Grieve M. A Modern Herbal. Brace &Company 1931; 637.
23. Legault J, Lalancette K J, Dufour D, Pichette A. Antioxidant Potential of
Bark Extracts from Boreal Forest Conifers Antioxidants 2013; 2, 77-89.
24. Jancinova V, Perecko
T, Nosal
R, Harmatha J, Smidrkal
J, Drabikova
K. The
natural stilbenoid pinosylvin and activated neutrophils: effects on oxidative
burst, protein kinase C, apoptosis and efficiency in adjuvant arthritis Acta
Pharmacologica Sinica 2012; 33: 1285–1292.
25. Lee SK, Lee HJ, Min HY, Park EJ, Lee KM, Ahn YH, Cho YJ, Pyee JH.
Antibacterial and antifungal activity of pinosylvin, a constituent of pine
Fitoterapia. 2005; 76(2) : 258-60.
26. Koskela A, Reinisalo M, Hyttinen JM, Kaarniranta K, Karjalainen RO,
Pinosylvin-mediated protection against oxidative stress in human retinal
pigment epithelial cells Mol Vis. 2014; 2;20:760-769
27. Tavcar Benkovi E, Grohar T, Zigon D, Svajger U, Jane D, Kreft S, Strukelj
B. Chemical composition of the silver fir (Abies alba) bark extract Abigenol®
and its antioxidant activity Industrial Crops and Products 2014 ; 52: 23– 28.
28. O’Neill J A, Gallegher O P, Devine K J, Jones P W, Maquire A R. Journal of
Natural products 2005; 68(1): 125-128.
ARTICOLE PUBLICATE DIN TEMATICA TEZEI
În extenso:
Mihăilescu Amălinei R. L., Miron A., Volf I., Pădurau C.,
Tofan L. Investigations on the feasibility of Romanian pine bark wastes
conversion into a value-added sorbent for Cu(II) and Zn(II) ions.
BioResources 2012; 7 (1), 148-160 (FI = 1,549/2013).
Tofan L., Păduraru C., Robu B., Miron A., Mihăilescu
Amălinei R. L. Removal of Cd(II) ions from aqueous solution by
retention on pine bark. Environmental Engineering and Management
Journal 2012; 11 (1), 199-205 (FI = 1,258/2013).
Amălinei R. L., Trifan A., Cioanca O., Miron S. D., Mihai C.
T., Rotinberg P., Miron A. Polyphenol-rich extract from Pinus sylvestris
L. bark – chemical and antitumor studies. Revista Medico-Chirurgicală
a Societăţii de Medici şi Naturalişti din Iaşi 2014; 118 (2), 551-557.
În rezumat:
Mihăilescu Amălinei R. L., Mitroi G., Iacob E., Miron A.,
Păduraru C., Tofan L., Volf I. Studii privind posibilitatea utilizării
scoarţei de Pinus strobus L. pentru eliminarea ionilor de Pb(II) din ape
reziduale. 50 de ani de Invatamant Universitar Farmaceutic la Iasi 5-7
octombrie 2011, Iasi
