A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Caracterizarea nanoparticulelor de ZnO

in vederea evaluarii riscurilor asupra

mediului si calitatii vietii

A.Bragaru, M. Kusko, E. Vasile*, M. Simion, M. Danila, T. Ignat, I. Mihalache, R. Pascu, F. Craciunoiu

Diana Savu**

Laboratorul de Nanobiotehnologii, IMT Bucuresti, Romania

e-mail: adina.bragaru@imt.ro* UPB Bucuresti

** IFIN-HH Magurele

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Primul pas: o analiza mai in detaliu pentru fiecare tip de NPs, in functie de aplicatia dorita (Fubini et al.Nanotoxicology 4, (2010) 347-363) :

- dimensiunea/forma (distributia de dimensiune);- aria suprafetei;- cristalinitatea;- proprietatile electrice;- compozitia chimica – reactivitatea suprafetei, grupele functionale de la suprafata, gradul de stabilitate;- solubilitatea si gradul de aglomerare;

FP7 Engineered Nanoparticles Risk Assesment (ENPRA) (2009-2012) (www.enpra.eu) :

Evaluarea riscului NPs presupune expunerea si identificarea pericolelor, hazardului !Principalele componente ale evaluarii riscului:

- identificarea pericolului (hazardului) (hazard identification)- evaluarea raspunsului in functie de doza (dose-response assesment)- expunerea riscului (risk exposure)- evaluarea si managementul riscului (risk and management assesment)

Urmatorul pas: evaluarea riscurilor expunerii NPs prin efectuarea testelor de toxicologie in vitro(S. Arora et al., Toxicology and Applied Pharacology 258 (2012) 151-165)

- studiu pulmonar, renal, hepatic, cardio-vascular, urmarindu-se:- stresul oxidativ;- genotoxicitatea;- apoptoza;- hemoliza;- etc;

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Studii privind evaluarea gradului de toxicitate al ZnO-NPs s-au efectuat pe diferite

dimensiuni, DAR exista inca probleme nerezolvate referitoare la influenta dimensiunilor mici

de NP (5-10 nm) asupra toxicitatii (Lin et al., J Nanopart Res 11 (2009)25–39 )

Scopul acestui studiu – de a caracteriza proprietatile fizico-chimice ale

ZnO-NPs cu dimensiuni < 10 nm, si de a studia gradul de stabilitate

al dispersiilor formate din aceste NPs, primele etape pentru

viitoarele studii de toxicologie (Jiang et al., J Nanopart Res 11 (2009)77–89)

ZnO-NPs – denumirea comerciala Zincox™, de la Nanogate AG, companie partenera

in proiectul FP7 Project NanoSustain (2010-2013)

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Caracterizarea nanoparticulelor

a(a)

Determinarea structurii cristaline - XRDDeterminarea proprietatilor optice -spectroscopia UV-Vis

Dimensiunea medie: 8.5-10 nm

Caracterizare morfologica

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

105

106

(220)(214)

(205)

(006)

(302)

(213)

(204)

(300)

(105)(212)

(114)

(211)

(210)

DHW = 8.9nm

εWPPF = 0.16%DWPPF = 8.6nm

(203)

(104)

(202)

(004)

(201)

(112)

(200)

(103)

(110)

(102)

(002) (101)

I [co

unts

]

2θ [o]

ZnO NP(100)

200 300 400 500 600

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Abso

rban

ce (a

.u.)

Wavelength (nm)

100 µg/mL ZnO aq. sol. 50 µg/mL ZnO aq. sol. 25 µg/mL ZnO aq. sol.

λpeak~ 365 nm

λcut-off ~ 396 nm

Corelare buna a rezultatelor masuratorilor :

- spectroscopie UV-Vis - 7.8 nm

-SEM - 8.5-10.0 nm

-TEM - 6-14 nm

- XRD - 8.6-9.5 nm

D Scherer eq=9.5 nm

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Evaluarea gradului de stabilitate a dispersiilor de ZnO-NPs

Dispersii apoase de ZnO-NPs

Diametrul hidrodinamic (dh ) si potentialul zeta (ζ ) – prima etapa in evaluarea efectelor asupra mediului sisanatatii umane – inaintea studiilor in vitro si in vivo (Murdock et al. 2008)

7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

Hyd

rodi

nam

ic d

iam

eter

(nm

)

pH

25 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml

7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0

-40

-20

0

20

40

60

80

Zeta

pot

entia

l (m

V)

pH

25 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml

IEP=8.9

IEP=9.1

IEP=9.3

Valorile max ale dh – in apropierea IEP, unde apar aglomerari

Cresterea concentratiei Cresterea dh

!Concentratie

(µg/ml)PDI

25 0.46550 0.483100 0.580

pH 7-9, ζ valori pozitivepH 9.5-11.5, ζ valori negative

( )+OHZn( )−

4OHZn ( ) −24OHZnsi

pH ≠ IEP dh - scade ζ - creste

cresterea [ZnO] ζ scade

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Evaluarea efectului cresterii tariei ionice asupra stabilitatii dispersiilor

Influenta concentratiei si pH-ului asupra dh si ζ in momentul cresterii tariei ionice (IS) (5×10-4, 10-3, 10-2 si 10-1 M NaCl)

7 8 9 10 11 12

500

750

1000

1250

1500

1750

5x10-4 M

10-5 M

10-3 M

10-2 M

Hyd

rodi

nam

ic d

iam

eter

(nm

)

pH

10-1 M

7 8 9 10 11 12-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

10-1 M

10-2 M

10-3 M

5x10-4 M

Zeta

pot

entia

l (m

V)

pH

10-5 M

1E-5 1E -4 1E-3 0.01 0.18.7

8.8

8.9

9.0

9.1

9.2

9.3

Isoe

lect

ric p

oint

Ion ic strength (M)

IEP

1E-5 1E-4 1E-3 0.01 0.1400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800 Hydrodynamic diameter Zeta potential

Ionic strength (M)

Hyd

rodi

nam

ic d

iam

eter

(nm

)

5

10

15

20

25

30

35

Zeta potential (mV

)

Ionic strength (M)

Hydrodinamic diameter Zeta potential

(mV)dh

(nm)PDI Average

error %10-5 751.6 0.165 0.3 31.01

5×10-4 519.6 0.254 5.5 30.9310-3 1239.3 0.320 1.8 16.4210-2 1475.3 0.335 4.1 13.8310-1 1638.4 0.450 2.5 7.62

Variata dh si ζ cu IS la pH 8 si 50 µg/ml ZnO-NPs

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Procesul de agregare – intre ZnO-NPs dispersate in sol NaCl

Forma se schimba, ZnO-NPs – forma poliedrica !

Investigarea morfologica privind efectul cresterii tariei ionice asupra stabilitatii dispersiilor

10-3 M NaCl 10-1 M NaCl

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

!Concluzii

Analiza rezultatelor privind ZnO-NPs sub forma de pulbere si dispersie – diametrele

hidrodinamice masurate pentru fiecare concentratie preparata - sunt de 10 ori mai mari decat cele ale pulberilor

Explicatia: formarea de specii instabile Zn(OH)2 si ( )−3OHZn ( ) −2

4OHZn

Rezultatele indica influenta puternica pe care o exercita mediul de dispersie/taria

ionica asupra gradului de stabilitate al ZnO-NPs, analiza cat mai completa a acestora

putand asigura un control privind dozajul in timpul testelor de bio-toxicitate!

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Studii de toxicitate asupra efectelor biologice induse de ZnO-NPs

Prepararea probelor pentru experimentele in vitro: pulberea ZnO – suspendata in ser fiziologic (2 mg/ml); sol stoc – 30 mindispersare in baie de apa cu ultrasunete si 15 min autoclavate la 121°C; [ZnO] = 200-0.5 µg/ml in MEM, αMEM,DMEM cu 10 si20% FCS

2 linii celulare: fibroblaste de soarece (L929) si celule melanoma de soarece (B16)Medii de cultura: (i) L929 - αMEM cu 2 mM Glutamina+20%FCS si MEM cu 2 mM Glutamina+10%FCS (ii) B16 - DMEM + 10%FCS.In toate mediile de cultura folosite s-a adaugat streptomicina 100µg/ml si penicilina 100 unitati/ml.

Testul MTS (determinarea viabilitatii celulare) si testul de supravietuire clonogenica

- modificari morfologice si inhibarea viabilitatii, relatie doza-efect de tip logaritmic; - Concentratia medie letala (IC50 ) calculata pentru ZnO-NPs - 10.1 µg/ml pentru L929 crescute in MEM cu 10%FCS si 30.2 µg/ml pentru celulele crescute in alphaMEM cu 20%FCS

Suplimentarea mediului de cultura cu un procent mai mare de ser fetal are un efect de protectie impotriva efectului citotoxic indus de nanoparticule.

-pentru melanoma B16, curba doza-efect se situeaza in acelasi domeniu devalori ca si L929, cu IC50 de 22.2 µg/ml.- in conditiile experimentale folosite inacest studiu, nu putem trage o concluzierelativa la sensibilitatea semnificativdiferita a celulelor canceroase incomparatie cu celulele normale atuncicand sunt expuse la ZnO-NPs.

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Testul de supravietuire si proliferare colonogenica

- abilitatea unei singure celule de a se divide si a produce o colonie

Pentru celulele L929 - deteriorare semnificativa a integritatii reproductive a celulelor odata cu cresterea

dozei de ZnO-NPs dupa 8 zile

Efectul expunerii la ZnO-NPs asupra integritatii reproductive (formare de colonii) a celulelor L929; Punctele reprezinta numarul de colonii

gasite dupa 8 zile de expunere la ZnO

Doza de 6 µg/ml - pierderea totala a capacitatii reproductive a celulelor dupa 8 zile de incubare cu ZnO-NPs

Celule apoptotice L929 in MEM induse dupa 20 de ore de incubare in prezenta

de ZnO-NPs

- in domeniul de doze < 10 µg/ml nivelul de celule apoptotice indus este neglijabil, apoptoza astfel pare sa nu

fie unul dintre mecanismele de inducere a toxicitatii- Pentru concentratii mai mari de ZnO nu s-a mai putut pune in

evidenta apoptoza cu metoda folosita in experiment

celulele L929 marcate si analizate prin microscopie de fluorescenta s-au dovedit a fi viabile

Masurarea gradului de apoptoza indus de incubarea celulelor cu nanoparticule

Celulele – incubate 24h (37ºC, 5%CO2), inainte de

a fi expuse ZnP-NPs pentru 20 h. Dupa

incubarea de 24 de ore, mediul de cultura a fost

extras si inlocuit cu 200 µl sol ZnO-NPs diferite

concentratii; Drept control s-a folosit celule incubate doar in mediu de cultura,

fara nanoparticule

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Evaluarea genotoxicitatii induse de nanoparticulele de ZnO

- Genotoxicitatea indusa de ZnO-NPs asupra celulelor L929 a fost testata prin metodele cometei alcaline si formarea de micronuclei;- ZnO-NPs nu induc o alterare semnificativa a ADN-ului prin cresterea nivelului de micronuclei formati, neexistand o dependenta anumarului acestora de timp, in domeniul 0.5 – 20 µg/ml;

Determinarea genotoxicitatii prin masurarea nivelului de micronuclei la celule L929 si B16 incubate 20h cu ZnO-NPs

In cazul testului cometei - rezultatele - un efect de inducere a deteriorarii ADN-ului intr-o maniera dependenta atat de concentratia ZnO-NPs cat si de timpul de incubare in prezenta acestora. Diferente semnificative apar

la 40 de ore de expunere

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Sunt necesare experimente suplimentare pentru o adaptare mai buna

a metodologiilor folosite in acest studiu la caracteristicile dispersiilor

de nanoparticule pentru care se urmareste raspunsul toxic

Concluzii

- Monitorizarea viabilitatii a doua tipuri de celule (L929 si B16) prin testul MTS indica un efect citotoxic

dependent atat de doza cat si de timpul de expunere la ZnO-NPs

!

!- toxicitatea nanoparticulelor studiate pare sa nu fie indusa prin apoptoza

- parametrul supravietuire clonogenica evidentiaza un efect puternic de scadere a capacitatii proliferative cu dozade expunere

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Acknowledgement

Aceste studii au fost realizate cu sprijinul proiectului finantat de Uniunea Europeana FP7/2001-2013NanoSustain - Development of sustainable solutions for nanotechnology based products based on hazardcharacterization and LCA

Multumiri Dr. Adrian Dinescu pentru caracterizarea SEM

Va multumesc!adina.bragaru@imt.ro

A. Bragaru, M. Kusko, E. Vasile, M. Simion, M. Danila, T. Ignat ,I. Mihalache, R. Pascu, F. Craciunoiu, Analytical characterization ofengineered ZnO nanoparticles relevant for hazard assessment, J Nanopart Res (2013) 15:1352, DOI 10.1007/s11051-012-1352-0