40 DE ANI DE EXPERIENTAIN SANATATEA ANIMALELOR

INFLUENTA AGENTILOR MICROBIENI IMUNOSUPRESORI (PRRS, CIRCOVIRUS, MYCOPLASMA, ETC.) ASUPRA EFICIENTEI PROGRAMELOR DE IMUNOPROFILAXIE APLICATE IN UNITATILE DE CRESTERE A PORCILOR

Există agenti patogeni, recunoscuti a avea activitate imunosupresoare, inpopulatiile de porcine. Acestia pot determina slabirea capacitatii de aparare aorganismului ducând la cresterea riscurilor de aparitie si evolutie grava a unor boli.

Unii patogeni, prezenti pe plan mondial, sunt cunoscuti a modula negativsistemul imun, interferând semnificativ cu eficacitatea oricarui protocol devaccinare. Astfel:• Circovirusul porcin de tip 2 (PCV-2) este agentul cauzal major al sindromuluimultisistemic cahectizant de dupa intarcare (PMWS).• Virusul PRRS este agenul etiologic al Sindromului Respirator si ReproductivPorcin• Mycoplasma hyopneumoniae este agentul cauzal al Pneumoniei EnzooticePorcine (PEP).

INTRODUCERE

Semnele clinice ale infectiei cu germenii amintiti  sunt variate, fiind dependente de statusul  imun al organismului, conditiile de igiena din 

ferma si prezenta altor agenti patogeni.

Obtinerea de date, privind influenta imunosupresoare a unor germeni patogeni PRRS,Circovirusul porcin, Mycoplasma, etc, asupra . eficientei programelor de imunoprofilaxie, aplicate in unitatile de

crestere a porcilor.Realizarea si aplicarea unor metode de imunoprofilaxie eficiente care

sa limiteze pierderile economice si să ducă la cresterea calitatii si sigurantei alimentare.

SCOPUL LUCRARII

MATERIALE SI METODAMaterial biologic:

• 778 probe ser obtinut din sange recoltat din confluentul jugular recoltat de la porci

518 animale de varste diferite, din care:- 428 - Tineret (1,5 – 4 luni)- 53 - Scroafe in asteptare- 38 - Porci grasi (6 luni – 1 an)

• Probe din organe (pulmoni, limfonoduli, ficat, splina, intestin) si avortoni

METODE DE LUCRU

Pentru identificarea germenilor imunosupresori studiati s-au efectuat:

• 1. Teste serologice (tehnica ELISA)- pentru punerea in evidenta a anticorpilor specifici fata de virusul PRRS, PCV2, Mycoplasma hyopneumoniae, Erisipelothrix rhusiopathie.

• 2. Teste de biologie moleculara – RT-PCR pentru a pune in evidenta genomul viral si bacterial.

• 3. Examene virusologice si IFD pentru izolarea si punerea in evidenta a virusurilor PRRS si Circovirus tip 2 pe culturi celulare specifice

• 4. Izolarea bacteriei M. hyopneumoniae din organe si noduli traehobronhici pe medii speciale.

•HerdCheck-PRRS X3 IDEXX Laboratories, SUA

•Porcine Circovirus (PCV2) ELISA test Kit, Green Spring, Shenzhen Lvshiyuan Biotechnology Co

•HERD CHECK*M hyo, IDEXX Laboratories, SUA

•Erysipelothrix rhusiopathiae SE/MR, Cypress Diagnostics

Cititor de placi ELISA – Idexx Laboratories ‐ Sunrise Tecan

1.TESTE SEROLOGICE

Tehnica ELISA – metoda de detectie serologica a anticorpilor specifici din serurile prelevate.Kituri de diagnostic ELISA:

• S-a efectuat detectia anticorpilor specifici pentru PRRS, Circovirus tip 2, Mycoplasma hyopneumoniae prin utilizarea kiturilor de diagnostic ELISA amintite, la porci de diferite categorii de varsta din ferme intensive si din gospodariile populatiei

• S-a procedat la detectia anticorpilor de rujet in urma programului de vaccinare pentru a stabili posibila influenta a germenilor amintiti asupra raspunsului imun postvaccinal.

• S-a luat ca referinta influenta germenilor amintiti, asupra raspunsului imun antirujetic deoarece aceasta vaccinare este o actiune prevazuta si executata in tehnologia actuala aplicata in fermele de porcine

Seroprevalenta germenilor imunosupresori in populatiile de porcine domestice si mistreti

• S-au prelevat 778 probe de sange de la porci de diferite varste, inainte si dupa vaccinarea antirujetica, din 8 locatii diferite de crestere a porcinelor: 5 ferme de crestere intensiva (A, B, C, D, E) si 3 microferme din gospodariile populatiei

- Ferma A: 329 probe testate- Ferma B: 170 probe testate- Ferma C: 99 probe testate- Ferma D: 23 probe testate- Ferma E: 27 probe testate- Gospodariile populatiei: 130 probe testate

Suine din complexe de crestere industriala si din gospodariile populatiei

REZULTATE FERMA A (Picovit)

0

10

20

30

40

50

60

FERMA A

57,1%

3,6%

16,4%

PRRS

M.hyo

PCV2

Probe pozitive si suspecte

• PRRS: 188 pozitive (329 testate)• M. hyopneumoniae: 8 pozitive, 4

suspecte (329)• PCV2: 46 supecte / 279

REZULTATE FERMA B (Peris)

Probe pozitive si suspecte

• PRRS: 161 pozitive (170)• M. hyopneumoniae: 39 pozitive,

18 suspecte (170)• PCV2: 16 pozitive, 67 suspecte

(170) 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

FERMA B

94,7%

33,5%

48,8%PRRS

M.hyo

PCV2

REZULTATE FERMA C (PigCom)

Probe pozitive si suspecte

• PRRS: 41 pozitive (99)• M. hyopneumoniae: 23 pozitive,

2 suspecte (99)• PCV2: 2 pozitive, 23 suspecte

(99) 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

FERMA C

49,4%

25,2% 25,2%PRRS

M.hyo

PCV2

REZULTATE FERMA D (Floroaica)

Probe pozitive si suspecte

• PRRS: 1 pozitiv (23)• M. hyopneumoniae: 0 (23)• PCV2: 0 (23)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

FERMA D

4,3%

0% 0%

PRRS

M.hyo

PCV2

REZULTATE FERMA E (Cristiana)

Probe pozitive si suspecte

• PRRS: 0 (27)• M. hyopneumoniae: 0 (27)• PCV2: 0 (27)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

FERMA E

0% 0% 0%

PRRS

M.hyo

PCV2

REZULTATE GOSPODARIILE POPULATIEI

Probe pozitive si suspecte

• PRRS: 3 pozitive (130)• M. hyopneumoniae: 0 (90)• PCV2: 2 pozitive, 11 suspecte

(130)0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

GOSPODARII

2,3%

0%

10%

PRRS

M.hyo

PCV2

S-au identificat serologic PRRS, Circovirus, M. hyopneumoniae, in majoritatea fermelor luate in studiu, atat în cele de crestere intensiva (fermele A, B, C si D) cat si în gospodariile populatiei. A existat si o locatie (ferma E) unde nu s-au identificat agentii studiati.

In gospodariile populatiei nu s-a identificat M. hyopneumoniae, iar seroprevalenta PRRS si PCV2 a fost scazuta.

In ferme proportiile agentilor imunosupresori au fost variate.

57,1%

94,7%

49,4%

4,3%0% 2,3%3,6%

33,5%25,2%

0% 0% 0%

16,4%

48,8%

25,2%

0% 0%

10%

Din cele 778 probe analizate, incidenta maxima a prezentat-o virusul PRRS(50.1%), urmat de Circovirus porcin tip II (21%), pe ultimul loc situându-se Mycoplasma hyopneumoniae (12.8%).

51,1%

21,0%12,8%

Incidenta agentilor imunosupresori la suinele domestice

În urma examinarii prin metoda PCR  a probelor de organe suine, s‐au obtinut urmatoarele rezultate: pentru virusul PRRS s‐au identificat 4 probe pozitive, iar Circovirusul porcin tip 2 (PCV2) a fost identificat la un numar total de 5 probe. Nu au fost probe pozitive pentru prezenta  genomului specific Mycoplasmahyopneumoniae.

33%

0%

41,6%

Examenul PCR

2. TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARA: RT–PCR

3. EXAMENE VIRUSOLOGICE PE CULTURI CELULARE SI TESTUL IFD

• S-au realizat suspensii filtrate din probe de organe recoltate de la porci din cadrul PigCom Tulcea. Aceste suspensii au fost repartizate pe monostraturi din liniile celulare VERO (rinichi de maimuta verde africana adulta), MARK (rinichi de maimuta) si PK15 (rinichi de porc adult).

• Placile au fost examinate zilnic in vederea urmaririi aparitiei unor modificari ale monostratului datorate inoculului ( prezenta virusului), cu ajutorul unui microscop ranversat de tip ZEISS, cu obiectiv 16X si ocular 10X.

• Aceste probe au prezentat o modificare a monostratului, cu modificari morfologice ale celulelor ( detritusuri celulare acumulate) si aparitia unor celule refringente si celule sub forma de vezicule cu membrana dubla ceea ce inseamna prezenta efectului citopatic. Pentru confirmarea prezentei sau absentei virusului PRRS probele au etalate pe lame de microscop si colorate cu reagentul FITC-anti PRRS virus(Bio-268).

• Virusul fiind prezent s-a observat la microscopul cu UV o florescenta specifica cu incluzii galben verzui sub forma unor aglomerari de celule.

Efect citopatic aparut pe linia celulara PK15 inoculată cu triturat de pulmoni

IFD coloratie cu FITC‐anti PRRS virus (Bio‐268)

4. EXAMENE BACTERIOLOGICE PENTRU IZOLAREA M. hyopneumoniae

• De la animale din experiment s-au recoltat probe de secretii nazale pe tampoane sterile, imersate in eprubete ce au continut mediu steril de transport.

• S-au recoltat fragmente de tesut pulmonar din zone cu aspect de hepatizatie rosie sau cenusie si ganglioni traheobronhici.

• Ca martor s-a utilizat tulpina de Mycoplasma agalactiae S/94.• Probele recoltate si culturi de 72 de ore de M. agalactiae au fost insamantate

pe controale perechi: tuburi cu mediu selectiv lichid (mediu Goodwin) si placi cu mediu selectiv agarizat si incubate la anaerostat la 37c

• Tuburile inoculate din probe nu au prezentat modificari ale aspectului (turbiditate, virarea culorii), pe mediu solid nu s-a constat dezvoltarea unor colonii specifice.

• In tuburile inoculate cu tulpina martor s-a constat turbiditate, iar pe agar prezenta unor colonii transparente, confirmand specificitatea acestei tulpini.

Mediu Goodwin  stanga ‐ pozitiv (M+, 2 tuburi), dreapta – negativ ( probe suine, 3 tuburi)

Incidenta agentilor imunosupresori la mistretia fost stabilita prin teste imunoenzimatice ELISA, teste PCR, examene virusologice si bacteriologice.Pentru desfasurarea lucrarilor s-au recoltat probe biologice (sange si organe) de la mistreti din 9 judete: Prahova , Bacau, Suceava, Valcea, Brasov, Mures, Covasna, Gorj si Giurgiu.La examenul serologic, din 66 de probe (judeţele Prahova, Mures, Braşov, Giurgiu, Covasna, Suceava, Bacau) , toate au fost negative pentru infecţia cu virusul PRRS şi 11 suspecte pentru Circovirus (16,6%). La infectia cu M. hyopneumoniae 14 probe au fost pozitive (21,2%) şi 2 suspecte (3%).

0%

24,2%

16,6%

In urma examinarii prin metoda PCR a 46 de probe organe suine provenite din mediul silvatic s-au obtinut urmatoarele rezultate: pentru virusul PRRS s-au identificat 3 probe pozitive (6,5%). În cea ce priveşte Circovirusul porcin tip 2 (PCV2), acesta a fost identificat la un număr de 2 probe (4,3%). Detecţia genomului specific M. hyopneumoniae a fost pozitivă pentru un număr total de două probe (4,3%).

6,5%4,3% 4,3%

Examenul PCR

Bacau Valcea Giurgiu Gorj

0

10

20

30

40

50

Repartitia pe judete  a probelor pozitive/suspecte

M. hyo

Circovirus

PRRS

Bacau Valcea Giurgiu GorjPRRS 0 0 0 0Circovirus 0 0 0 11M. hyo 3 10 1 2

Prezenta agentilor microbieni imunosupresori studiati a fost in proportii variate in diferite judete.

02468

101214161820

Repartitia pe judete a probelor pozitiveprin examen PCR (nr. probe)

M. hyo

Circovirus

PRRS

Prahova Giurgiu Covasna Suceava Brasov Bacau MuresPRRS 3 0 0 0 0 0 0

Circovirus 2 0 0 0 0 0 0

M. hyo 2 0 0 0 0 0 0

Comparativ cu mistretii, la porcinele domestice din sistemul de crestere intensiv si din gospodariile populatiei, s-a observat o incidenta crescuta a agentilor imunosupresori, (PRRS 51%, Circovirusul porcin tip II 21%, Mycoplasma hyopneumoniae 12,8%).

51,1%

0%

21,0%16,6%

12,8%

24,2%

Raspunsul imunitar in urma vaccinarii antirujetice

FERMA A PICOVIT (IF) PRRS M.HYO CIRCOVIRUS RujetLot 1  tineret nu 49/50 0/50 21/50 xLot 1 (II) vaccinati 15/15 0/15 8/15 0/15Lot 2  tineret vaccinati (Farmavet) 30/30 0/30 6/30 0/30Lot 3 tineret vaccinati (Farmavet) 20/20 1/20 5/20 0/20Lot 4 tineret vaccinati (Farmavet) 20/20 3/20 1/20 0/30Lot 5 tineret nu 0/20 1/20 0/20 0/20Lot 5 (II) vaccinati (Bioveta) 0/30 5/30 0/30 2/30Lot 5 (III) vaccinati (Bioveta) 6/30 1/30 2/30 5/30Lot 6 tineret nu 0/32 1/32 1/32 0/32Lot 6 (II) vaccinati (Eryromvac) 32/32 0/32 2/32 4/32Lot 7 tineret 16/50 0/50 x x

188/329 12/329 46/279 11/187% 57,1 3,6 16,4 4,6

57,1%

3,6%

16,4%

5,8%

FERMA B PERIS (IF) PRRS M.HYO CIRCOVIRUS RujetLot 1 tineret nu 28/30 5/30 6/30 xLot 1 (II) vaccinati 25/28 0/28 7/28 0/28Lot 2 grasi nu 29/30 10/30 7/30 xLot 2 (II) vaccinati 22/22 9/22 22/22 0/22Lot 3 scroafe asteptare nu 27/30 17/30 26/30 xLot 3 (II) vaccinati 30/30 16/30 15/30 19/30

161/170 57/170 83/170 19/80

94,7%

33,5%

48,8%

23,7%

FERMA C PigCom PRRS M.HYO CIRCOVIRUS Rujet92 zile 0/16 0/16 1/16 0/16109 zile 0/21 0/21 4/21 9/21180 zile 20/20 20/20 9/20 0/2085 zile 17/21 3/21 7/21 0/21scroafe in asteptare 4/21 2/21 4/21 0/21

41/99 25/99 25/99 9/99

49,4%

30,1% 29,9%

9%

GOSPODARII MAINEASCA PRRS M.HYO CIRCOVIRUS RujetLot 1 tineret nu 0/20 0/20 5/20 0/20Lot 1 (II) vaccinati (Eryromvac) 0/20 0/20 3/20 12/20Lot 2  tineret nu 0/20 0/20 5/20 4/20Lot 2 (II) vaccinati (Eryromvac) 0/20 0/20 5/20 11/20Lot 3 grasi nu 0/10 0/10 2/10 5/10GOSPODARII AFUMATI40‐45 kg 1/10 6/10 x60 kg 1/10 3/10 x75‐80 kg 1/10 3/10 x100‐110 kg 0/10 1/10 x

3/130 0/90 13/130 23/40

2,3%0%

10%

57,5%

Seroprevalenta agentilor imunosupresori la porcinele domestice si raspunsul imun dupa vaccinarea antirujetica

Nivelurile titrurilor anticorpilor postvaccinali antirujetici in sistemul de crester industrial au fost influentate negativ de seroprevalenta crescuta a agentilor imunosupresori in efectivele de animale. In schimb, in gospodariile populatiei seroconversia in urma vaccinarii antirujetice a fost crescuta, ca o consecinta a seroprevalentei scazute a germenilor microbieni imunosupresori.

57,1

94,7

49,4

2,33,6

33,525,2

0

16,4

48,8

25,2

105,8

23,7

9

57,5

Insamantarile primare s-au efectuat din organe ce prezentau tipuri variate de leziuni: echimoze, petesii pulmonare, bronho-pneumonie, splină marita, limfoganglioni mariţi si hemoragici, enterită catarala şi cataral-congestiva.

EXAMENE ANATOMOPATOLOGICE SI BACTERIOLOGICE DIN ORGANE CU LEZIUNI:  pulmoni, limfonoduli, ficat, splina, intestin

In urma examenelor bacteriologice efectuate din leziuni de la nivelul diferitelor organe (pulmoni, limfonoduli, ficat, splina, intestin) s-a evidentiat prezenta unor germeni de asociatie, patogeni sau potential patogeni.

Specii bacteriene cu semnificatie patologica, izolate de la suine:

•Mannheimia (Pasteurella) haemolytica - 1 tulpina•Pasteurella multocida – 2 tulpini•Pseudomonas aeruginosa – 2 tulpini •Streptococcus spp. – 3 tulpini•Klebsiella pneumoniae – 1 tulpina•Escherichia coli – 12 tulpini

CONCLUZII• La porcinele domestice s-a observat o incidenta crescuta a virusului PRRS

(51%) si scazuta a PCV2 (21%) si Mycoplasma hyopneumoniae (12,8%).• In sistemul de crestere intensiv, comparativ cu gospodariile populatiei

seroprevalenta agentilor imunosupresori a fost semnificativ crescuta.• La mistreti s-au detectat niveluri scazute de anticorpi anti- PCV2 (16.6%) si

M. hyopneumoniae (24,2%). Nu au fost detectati anticorpi anti- PRRS.• Incidenta agentilor imunosupresori la porcinele domestice a fost net

superioara celei detectate la mistreti.• Examenele bacteriologice din organe cu leziuni au evidentiat prezenta unor

germeni de asociatie, patogeni sau potential patogeni. • Prin testul PCR, au fost analizate 12 probe de la porcinele domestice si au

fost gasite pozitive 33% pentru PRRS si 41,6% pentru PCV2. Mycoplasmahyopneumoniae nu a fost detectata.

• Examinarea prin metoda PCR a 46 de probe organe mistreti provenite din mediul silvatic (judetele Prahova, Mures, Brasov, Giurgiu, Covasna, Suceava, Bacau) s-au identificat probe pozitive pentru PRRS 6,5%, PCV2 4,3% si M. hyopneumoniae 4,3%. Toate probele pozitive au provenit din judetul Prahova.

• Seroprevalenta crescuta a agentilor imunosupresori in efectivele de animale a influentat negativ nivelurile titrurilor anticorpilor postvaccinali antirujetici. In 3 unitati de creştere a porcilor, diferite ca status imun si conditii de crestere, seroconversia in urma vaccinarii antirujetice a fost negativa in proportie ridicata, indiferent de tipul de vaccin folosit, viu sau subunitar.

• Eficienta programelor de imunoprofilaxie specifica aplicate in unitatile de crestere industriala a porcinelor este influentata de prezenta agentilor microbieni imunosupresori studiati (PRRS, Circovirus, Mycoplasma hyopneumoniae ) si a germenilor de asociatie.

VA MULTUMESC!