Hemoglobina (Hb) - Generalități• Max Perutz, John Kendrew 1959 – 1962, Premiul Nobel pentru Chimie

• Este pigmentul roșu, respirator al vertebratelor

• Reprezintă 1/3 din masa celulară eritrocitară

ERITROCITE = HEMATII = GLOBULE ROȘII

Eritrocitele sunt suspensii de hemoglobină

70 kg → volumul sângelui ≈ 5 litri → 800 – 900 g Hb

• Producția medie zilnică: 6,3 g/zi

• Concentrații fiziologice: - bărbați 14-16 g% → 45% hematocrit

- femei 11,5 – 14,5 g% → 41g%

- copii 11% - 13,5g%

- nou născuți 15g%-21g%

• Are funcție de transportor de gaze (oxigen si CO2)

• Este implicată în menținerea echilibrului acido-bazic al sângelui•Plasticitate deosebită – suferă „in vivo” deformări masive în timpul cât străbat cele mai mici capilare• Mișcarea deosebită - „ca tancul pe șenile”• Deci → Adaptare funcțională la transportul gazelor 1

• Eritrocitele: sunt celule anucleate, fără mitocondrii, fără microzomi,specializate in transportul gazelor sangvine

- Deci nu sunt celule adevărate („formă remanentă”)– Durata de viaţă 120 – 130 zile ( apoi - fagocitate)– Au o bună rezistenţă la agresiuni osmotice, chimice,

oxidative– Valorile constante ale eritrocitelor circulante sunt asigurate

de echilibrul între eritropoieză şi eritroliză

• Număr eritrocite: ≈ 4.500.000/mm3 femei

5.000.000/mm3 bărbațiVariații importante în condiții fiziologice:Creșteri: - transpirații profunde

- poliurii abundente- diminuarea presiunii sangvine- creșterea temperaturii mediului- efortul fizic moderat- digestia (10 – 15%)- activitatea intelectuală- stresul

Scăderi: - efortul fizic excesiv

2

Etapele procesului de eritropoieză:

Proliferarea și diferențierea celulelorcare vor deveni eritrocite mature serealizează la nivelul măduveihematoformatoare, și este stimulată deeritropoietină (hormon secretat la nivelrenal)

Reticulocitele = eritrocite imatureSectorul sangvin circulant conține:- Reticulocite (0,1%)- Eritrocite tinere, diferite vârste- Eritrocite ajunse la limita supraviețuiriiERITROPOIEZA (HEMATOPOIEZA) =

totalitatea proceselor citologice și de metabolism ce asigură formarea, regenerarea globulelor roșii –ERITROPOIETINA

3

Eritrocitele sunt specializate în • Absorbția• Transportul• Eliberarea• Unei cantități maxime de O2 și a altor gaze: CO2 și CO.

Formă de disc biconcav4

• Hemoglobina este o heteroproteină (proteină conjugată)

• Cromoproteină – HEMUL care reprezintă partea neproteică estecolorată

• CARACTERISTICI:

- partea proteică – globina ≈ 95-96% din moleculă

- partea neproteică – hemul ≈ 4%

- fierul ≈ 0,34% fier porfirinic

HEMUL – structură tetrapirolică:

- 4 nuclee pirolice I, II, III, și IV, coplanare, legate prin punțimetin notate α, β, ɣ, δ

- substituenții: - CH3 în pozițiile 1,3,5,8

- CH=CH2 (vinil) în pozițiile 2,4

- CH2-CH2-COOH (propionil) în pozițiile 6,7

- Fierul în stare de valență +2

HEXACOORDINAT: 4 legături de azotul pirolic:

-1 legătură directă cu His din globină

- 1 legătură cu His din globină prin intermediul H2O sau O2

STRUCTURA HEMOGLOBINEI

5

LEGĂTURA HEMULUI CU CATENELE POLIPEPTIDICE ALE GLOBINEI

-Se leagă de catenele de tip α ale globinei- Se realizează prin intermediul histidinelor din poziția 58 și 87- FIERUL –hexacoordinat- este legat diferit:

CH = CH2

N

CH3

N

CH3

CH = CH2

N

CH3

CH3

N Fe2+

COOH

COOH

IV HEM

I

II

III

1 2

3

4

56

7

8

CH2

CH2

CH2

CH2

Globinã

His (87 sau 93)

His (58 sau 63)Globinã

O2 (H2O)

1. DIRECT cu o histidină (legătură proximală)

2. Indirect cu altă histidină (legătură distală)

Cu ajutorul unei legături de hidrogen, prin intremediul unei molecule de apă

sau oxigen molecular

6

HEM = Protoporfirina + Fe bivalent, hexacoordinat

Legarea oxigenului poziționează atomul de Fe în interiorul planului hemului

Planul hemului

Histidină proximală87 α sau 93 β

7

GLOBINA – Caracteristici structurale

• Proteină bazică- subclasa HISTONE – predomină aminoacizi cu caracter bazic (histidina, arginina)

• Globina funcțională are o structură cuaternară: 4 lanțuri polipeptidice (TETRAMER)

• 574 aminoacizi : 141 aminoacizi în 2 lanțuri de tip α și 146 de aminoacizi în 2 lanțuri de tip β (2 monomeri α și 2 monomeri β)

• Lanţurile polipeptidice au un grad ridicat de spiralare

• La nivelul tetramerilor, legaturile între monomerii α și β sunt maiputernice decât cele între monomerii de același tip

• Structura spațială a catenelor polipeptidice permite înglobarea îninteriorul moleculei a 4 structuri heminice; fiecare catenă formează ocavitate hidrofobă în care este inclusă o moleculă de hem

• Fiecare protomer are structură primară, secundară, terțiară(globulară)

• Lanțurile polipeptidice sunt legate între ele prin legături labile (punțide hidrogen, forțe Van der Vaals)

8

Oxihemoglobină DeoxihemoglobinăHem

Structura spațială a catenelor polipeptidice permite înglobarea în interiorulmoleculei a 4 structuri heminice; fiecare catenă formează o cavitate hidrofobă în

care este inclusă o moleculă de hem

9

GLOBINA – Caracteristici structurale

• Există mai multe tipuri de protomeri:

• Hemoglobina normală: 2 monomeri identici - 2 câte 2: α1α2β1β2

2 tipuri de legăturiLegăturile dintre protomeri

Legăturile dintre protomeri și HEM

10141 aa

141 aa

146 aa146 aa

METHEMOGLOBINÃ HEMOGLOBINÃ

methemoglobinreductaza II

methemoglobinreductaza I

NADH + H+

glutation reductaza

GSH GSSG

NADP+ NADPH + H+

NAD+

(Fe2+)(Fe3+)

REGENERAREA Fe3+ → Fe2+

ROLUL GLUTATIONULUI ÎN

PROTECŢIA ANTIHEMOLITICĂ

11

glucozo -6-P

Glucozã

6 - fosfogluconat

NADP

NADPH

Hb-Fe2+

Met - Hb-Fe3+

G-6-P-DH Met - Hb reductaza I

Suntul

pentozo

fosfatilor

Glicolizã

lactat

piruvat

NAD

NADH

Hb-Fe2+

Met - Hb-Fe3+

LDH Met - Hb reductaza II

SISTEMELE ENZIMATICE CARE INTERVIN ÎN REGENERAREA Fe3+ → Fe2+

+

+

12

• Deficiența genetică de glucozo-6 –fosfatdehidrogenază și stresul oxidativ

• Toxicitate crescută a anumitor medicamente, pesticide, anumite alimente

• Rezistența la malarie datorată stresului oxidativ mărit din eritrocite

13

FUNCȚIILE HEMOGLOBINEI

1. Se combină reversibil cu O2

Hb + O2 HbO2 + O2 Hb(O2)2 Hb(O2)3 Hb(O2)4

+O2 +O2

Fe NN

N

NH2O

Globinã

His

Fe NN

N

NO2

His

Globinã

Globinã

His

+ O2 + H2O

His

Globinã

DEOXIHEMOGLOBINĂ OXIHEMOGLOBINĂ

Proteină allosterică! (allos = spaţiu)

14

15

FACTORI : 1) Presiunea parțială a O2

2) pH –ul3) Prezența 2,3-difosfogliceratului

1) La pO2 mai mare de 100mm Hg, în alveolele pulmonare, echilibrul este deplasat spre dreapta; la pO2 mai mică de 35 mm Hg în capilare, echilibruleste deplasat spre stânga;

2) La pH acid (în capilare) Hb are afinitate mai mică pentru oxigen pe care îl cedează usor; la pH alcalin afinitatea Hb pentru oxigen este mai mare;

3) cantităţi crescute de acid 2,3 difosfogliceric deplasează echilibrul sprestânga.

Factorii care influențează capacitatea hemoglobinei de a lega oxigenul

16

Hb + O2 HbO2 + O2 Hb(O2)2 Hb(O2)3 Hb(O2)4

+O2 +O2

Forma R (Relaxed) -în capilarele pulmonare adiacente

alveolelor

Forma T (Taut sau tense)-la nivelul țesuturilor

Legarea și eliberarea oxigenului de hemoglobină

Crește

PO2

Crește

PCO2

2,3-DPG

DeoxihemoglobinăOxihemoglobină

17

Capacitatea de legare a O2 de către Hb crește odată cu saturarea în oxigen a moleculei. Legarea primei molecule de O2 va influența în mod favorabil forma situsurilor de legare a următoarelor molecule de oxigen, astfel încât crește afinitatea pentru O2 => EFECT COOPERANT (situsurile de legare “cooperează” între ele).

18

2. Se combină reversibil cu CO2

Prin intermediul grupării –NH2 libere a globinei => carbaminohemoglobină

FUNCȚIILE HEMOGLOBINEIcontinuare

Hb – NH2 + CO2 Hb – NH – COO- + H+

4. Se combină ireversibil cu CO => carboxihemoglobină

Hb + CO HbCO afinitate > 300 ori

3. Oxidarea Fe2+ - e- Fe3+ methemoglobină (maxim 6%)

5. Sulfhemoglobina

19

Situații patologice

Biosinteza hemoglobinei

20

BIOSINTEZA HEMOGLOBINEI

Etapele: I. Biosinteza HEMULUI

II. Biosinteza GLOBINEI

III. Cuplarea hemului cu globina

David SHEMIN, David RITTENBERG – 1945

I. Biosinteza HEMULUI. Faze:

1. Sinteza acidului delta – aminolevulinic

2. Biosinteza PORFOBILINOGENULUI

3. Biosinteza PROTOPORFIRINEI – IX

4. Biosinteza HEMULUI

Precursori: - Succinil ~ SCoA

- Glicocol activat cu PLP

Autoexperiment cu 15N-glicină

•Hemoglobinogeneză•Eritropoieză

21

N

CH2

CH

OH

CH3

O PO3H

2

N CH2

COOHCOOH

CH2

CH2O

~SCoA

COOH

CH2

CH2

O

NH2

COOH

CO2

COOH

CH2

CH2

O

CH2

NH2

+

C

Glicocol activat cu PLP Succinil~SCoA

H2O PLP(se reface)

- ALAS

( - aminolevulinatsintetaza)

C

Acid - amino, - cetoadipic

HC

- ALAS C

Acid - aminolevulinic

( - ALA)

1) Sinteza acidului delta aminolevulinic (δ – ALA)

HSCoA

22

1. Biosinteza acidului delta aminolevulinic

• Reprezintă prima etapă din biosinteza hemului

• Presupune reacţia între succinil CoA şi glicocol sub acţiunea δ aminolevulinat-sintazei (ligază carbon-carbon)

• Este obligatorie prezenţa PLP care activează glicocolul

• Aceasta etapă se desfasoară INTRAMITOCONDRIAL, iar δ ALA trece în citoplasmă

• Enzima δ ALA sintaza este enzima determinantă de viteză a întreguluiproces; hemul acţionează ca inhibitor al activităţii enzimei

• Plumbul inhibă δ ALA sintaza

23

COOH

CH2

CH2

O

H2C

NH2

COOH

CH2

CH2

O

CH2

NH2

CH2

COOH

N

CH2

CH2

NH2

CH2

COOH

CH2

COOH

CH2

NH2

CH2

N

CH2

COOH

CH2

C

C+

2 H2O

C C

C

PORFOBILINOGEN

(PBG)

izomeraza

( - aminolevulinatdehidrataza

H

Acid -

aminolevulinic

( - ALA)

2) Biosinteza PORFOBILINOGENULUI

porfobilinogensintetaza

24

• Se realizează prin condensarea a 2 molecule de δ ALA sub acţiunea enzimei δ aminolevulinat dehidrataza(sau porfobilinogen sintetaza)

• Porfobilinogenul conţine nucleul pirolic

• Această etapă se desfăşoară în CITOPLASMĂ

• Enzima conţine zinc şi este foarte sensibilă la acţiuneainhibitorie a metalelor grele, mai ales a plumbului

2. Biosinteza porfobilinogenului (PBG)

25

3) Biosinteza PROTOPORFIRINEI – IX

COOH

CH2

NH

CH2

NH2

CH2

CH2

COOH

NH

AP

NH

A

P

NH

A P

NH

NH

AP

NH

A

P

NH

A P

NH

- CH2 - COOH

- CH2 - CH

2 - COOH

PORFOBILINOGEN(4 PBG)

porfobilinogendezaminaza

A

P

H2C

H2C CH2

CH2

I

II

III

IV

A

P

UROPORFIRINOGEN izomer - I

H2C

H2C CH2

CH2

IV

UROPORFIRINOGEN izomer - III

izomeraza

A

P

A

P

4 NH3

- acetil

- propionil

4 molecule

26

3. Biosinteza protoporfirinei IX

Transformarea porfobilinogenului (PBG) în protoporfirina IX are loc în CITOPLASMĂ

• PBG este transformat iniţial în uroporfirinogen, sub acţiunea a 2 enzime:

– Porfobilinogen deaminaza (sau uroporfobilinogen sintetaza) care determină formarea unor punţi metilenice între inelelepirolice => CICLUL TETRAPIROLIC

– Are loc izomerizarea ciclului IV (se schimbă radicalul propionilcu acetil)

– Uroporfirinogenul este transformat în coproporfirinogen sub acţiunea uroporfirinogen decarboxilazei

27

CH3

NH

P

NH

CH3

P

NH

CH3

P

NH

CH3- CH

2 - COOH

- CH2 - CH

2 - COOH

CH3

NH

P

NH

CH3

CH = CH2

NH

CH3

CH = CH2

NH

CH3

CH3

N

P

NH

CH3

CH = CH2

N

CH3

CH = CH2

NH

CH3

O2

H2C

H2C CH2

CH2

IV

COPROPORFIRINOGEN izomer - III

P

A

P

UROPORFIRINOGEN - III

uroporfirinogendecarboxilaza

4 CO2

I

II

III

coproporfirinogen oxidaza

H2C

H2C CH2

CH2

IV

PROTOPORFIRINOGEN izomer - IX

P

I

II

III

HC

HC CH

CH

IV

PROTOPORFIRINÃizomer- IX

P

I

II

III

protoporfirinogen oxidaza

6 H

ferochelataza

2 H2O

2 CO2

28

Fe2+

CH = CH2

N

CH3

N

CH3

CH = CH2

N

CH3

CH3

N Fe2+

COOH

COOH

PROTOPORFIRINÃizomer- IX

ferochelataza

4.) Biosinteza HEMULUIIII. Cuplarea hemului cu globina

IV HEM

I

II

III

1 2

3

4

56

7

8

CH2

CH2

CH2

CH2

Globinã

His (87 sau 93)

His (58 sau 63)Globinã

Globinã

O2 (H2O)

2H

29

- Fierul este transportat de transferină la nivelul reticulocitelor (eritrocite imature)

-Chelatarea fierului de cătreprotoporfirina IX se

desfășoară intramitocondrial

-Enzima ferochelataza

este sensibilă la acţiunea

inhibitoare a metalelor grele

(mai ales a plumbului)

-În paralel, la nivelul

ribozomilor are lor sintezaglobinei, care se va lega de

hem prin intermediul

resturilor de Hys din poziţiile

58 si 87, pentru a forma hemoglobina

Biosinteza hemului – localizarea intracelulară a diferitelor etape

30

REGLAREA BIOSINTEZEI HEMULUI 8 GLICINÃ + 8 SUCCINIL~SCoA

- aminolevulinatsintetaza

8 ACID - AMINOLEVULINIC

porfobilinogensintetaza

4 - PORFOBILINOGEN

uroporfirinogenI sintetaza

UROPORFIRINOGEN III

uroporfirinogendecarboxilaza

COPROPORFIRINOGEN III

coproporfirinogenoxidaza

PROTOPORFIRINOGEN IX

protoporfirinogenoxidaza

PROTOPORFIRINÃ IX

ferochelataza

HEMAPOREPRESOR

8 HS-CoA + 8 CO2

8 H2O

4 NH3

Izomerizarea ciclului IV

4 CO2

2 CO2 + 4 H

6 H

Fe2+

Fe3+

feedback (-)

UROPORFIRINOGEN Iuroporfirinogen

III sintetaza

31

BIOSINTEZA HEMOGLOBINEI - COMENTARII –

=> PRECURSORI : COMPUȘI FOARTE SIMPLI - GLICOCOL

- SUCCINIL~SCOA

- PIRIDOXAL FOSFAT (PLP)

=> Legătura cu CICLUL KREBS prin Succinil ~SCoA

(ciclul KREBS – SHEMIN)

=> Prima enzimă = δ – aminolevulinat sintetaza – este enzimă limitantă de viteză

→ etapă reglatoare a procesului

=> ERITROPOIETINA = hormon ce modulează procesul de biosinteză

=> Proces foarte complex ce se petrece în reticulocit pe toată durata dezvoltării

sale, din stadiul timpuriu de proeritroblast la cea de reticulocit, în măduva osoasă

=> Are loc la nivelul tuturor organitelor subcelulare:

- formarea protoporfirinei IX → MITOCONDRIE

- încorporarea Fe2+ → MITOCONDRIE

- biosinteza globinei → RIBOZOMI

- cuplarea globinei cu hem → CITOPLASMĂ32

Catabolismul hemoglobinei

33

• Eritrocitele au o durată medie de viaţă de 120 de zile; celulele îmbătrânite sunt

recunoscute datorită modificarilor ce au loc la nivel membranar şi sunt fagocitate

de către ţesutul reticuloendotelial extravascular (din splină, ficat și ganglioni

limfatici). La un om adult se degradează zilnic în jur de 6 grame Hb.

• Are loc denaturarea globinei şi eliberarea hemului în citoplasmă. Globina este

degradată cu eliberarea aminoacizilor ce vor intra în fondul metabolic al

organismului.

• Hemul este degradat prin intervenţia sistemului enzimatic microzomal; enzima

hem-oxigenaza care scindează ciclul tetrapirolic este dependentă de fier şi de

NADPH; această enzimă rupe una din punţile α metinice care leagă două inele

pirolice, iar C este convertit în CO, aceasta fiind singura sursă endogenă de CO.

Această oxidare se realizează în prezenţa oxigenului molecular.

Catabolismul hemoglobinei

34

• În urma acţiunii hemoxigenazei se formează biliverdina care se va

transforma în bilirubină sub acţiunea biliverdin reductazei.

• Bilirubina rezultă atât din degradarea eritrocitelor îmbătrânite

precum şi din catabolismul celorlalte proteine heminice.

• Bilirubina este puţin solubilă în mediu apos la pH-ul fiziologic; ea este

transportată în plasmă legată de albumină.

• În această formă bilirubina este denumită bilirubină totală/

neconjugată/ indirectă, şi nu poate fi determinată (ca marker

biochimic) prin reacţia cu acidul diazobenzensulfonic (reacția Van

den Berg).

Catabolismul hemoglobinei

35

V

N

M

N

MP

V

N

M

M

N

P

Fe2+

O2

NADPH2

V

N

M

N

MP

V

N

M

M

N

P

OH

Fe3+

O2 CO

Fe3+

V

NH

M

NH

MP

O

V

ONH

M

M

P

N

HEM

Globinã

Globinã

hem oxigenazã

H2O

Globinã

Globinã

I

II

- HIDROXIHEMINÃ

VERDOGLOBINÃ

Globinã

Cit P450

I

II

BILIVERDINÃ

NADP+

III

IV

CATABOLISMUL HEMOGLOBINEI

36

Compus aciclic oxidat, legat de globină

aminoacizi

Compus aciclic oxidat, liber

V

NH

M

NH

MP

O

V

ONH

M

M

P

N

NADPH2

NH

M V

O NH

CH

2

M P

NH

P M

NH

M V

O

I

II

BILIVERDINÃ

III

IV

biliverdin reductazã

NADP+

IIIIIIIV

BILIRUBINÃ

37

NH

M V

O NH

CH

2

M

NH

P M

NH

M V

O

COOH

COOH

NH

M V

O NH

CH

2

M

NH

M

NH

M V

O

COOH

IIIIIIIV

BILIRUBINÃ

O

OOC

(CH2)2

O

O CO

(CH2)2

IIIIIIIV

O

O CO

(CH2)2

1 1

Bilirubinã - monoglucuronid Bilirubinã - diglucuronid

UDP-GLUCURONILtransferaza

UDP-GLUCURONAT 2 UDP-GLUCURONAT

La FICAT:

Bilirubina glucuronoconjugată = bilirubina directă38

• Bilirubina este transportată la ficat unde este separată de albumine, şi

suferă o reacţie de conjugare cu acidul glucuronic, la nivelul grupărilor

carboxilice de la resturile propionice ce substituie inele pirolice;

• Conjugarea are loc în prezenţa enzimei bilirubin: UDP -glucuronil

transferaza.

• Bilirubina glucuronoconjugată (bilirubina directă) este hidrosolubilă,

ceea ce permite excreţia sa la nivel biliar. Bilirubina glucuronoconjugată

nu este absorbită in intestinul subţire; la nivelul intestinului gros, sub

acţiunea hidrolazelor bacteriene, se realizează hidroliza esterilor cu

acidul glucuronic şi eliberarea resturilor propionice. Bilirubina eliberată

astfel este redusă la un compus tetrapirolic liniar, numit urobilinogen

(punţile metinice devin metilenice iar inelele tetrapirolice au duble

legături paralele).

39

Urobilinogenul poate urma mai multe căi:

- o parte este oxidat la urobilină, sau redus la stercobilinogen, compuşi

care se elimină prin fecale

- o parte este reabsorbit la nivel intestinal, revine la nivel hepatic şi este

din nou excretat prin bilă (circuitul enterohepatic)

- o cantitate mică de urobilinogen se elimină ca atare prin urină

- urobilina si stercobilina dau culoarea caracteristică scaunelor

- Bilirubina liberă și cea glucuronoconjugată sunt denumite în laboratorul

clinic „pigmenți biliari”

40

Catabolismul

hemoglobinei și circuitul

enterohepatic al

urobilinogenului

HEMOGLOBINA

VERDOGLOBINA

BILIVERDINA

BILIRUBINA

BILIRUBINA LEGATÃ DE ALBUMINE

INDIRECTÃ

PRIMARÃ (NECONJUGATÃ)

BILIRUBINA DIRECTÃ

CONJUGATÃ (DIGLUCURONID)

BILÃ(colecist)

INTESTIN

Reduceri

BILIRUBINÃ

MEZOBILIRUBINÃ

UROBILINOGEN

STERCOBILINOGEN

Reducere

Oxidare

Oxidare

UROBILINÃ

STERCOBILINÃ

FECALE

PLASMÃ

RINICHI

URINÃurobilinogenstercobilinogen

urobilinogenstercobilinogen

FICAT

MÃDUVÃ OSOASÃ

SPLINÃ

CELULE RETICULO-ENDOTELIALE

EXTRAHEPATICE

ruperea puntii

- metinice

Fe2+

globinã

Reduceri

PLASMÃ

{

FICAT

{

{

41

Circuitul enterohepatic al urobilinogenului

42

Aspecte patologice legate de catabolismul hemoglobinei

- Creşterile nivelelor de bilirubină conjugată în plasmă sunt în general

asociate cu perturbări ale funcţionării hepatice şi/ sau biliare.

- Deficitul enzimei bilirubin UDP glucuronil transferaza se manifestă prin

nivele plasmatice crescute ale bilirubinei neconjugate, ceea ce se traduce

prin icter (simptom caraterizat prin coloraţia galbenă a pielii, a sclerei şi a

altor ţesuturi), mai ales la nou născuți.

- Bilirubina indirectă (neconjugată) are o afinitate mărită pentru lipidele

membranare (la concentraţii mari, de 25mg/dL); aceasta va produce o

tulburare a funcţiilor membranare, mai ales de la nivelul SNC, ce

determină icterul nuclear (depunerea de bilirubină în ganglionii bazali şi în

nucleii trunchiului cerebral).

43