Post on 17-Oct-2019
transcript
OANA GÂZA, TIBERIU B.SAVA, CORINA A.SIMION, CĂTĂLIN S.TUȚĂ
1
Datarea cu radiocarbon a aminoacizilor individuali separaţi prin metoda HPLC, din materialul osteologic
de la Curtea Domnească din Târgoviște
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
Radioizotop – Carbon 14
2
12Carbon, 98.89%
6 protoni, 6 neutroni
13Carbon, 1.11% 6 protoni, 7 neutroni
14Carbon, <10-12% 6 protoni, 8 neutroni
T1/2 = 5730 ani
Izotopii Carbonului: instabil,radioactiv stabili
Radionuclid cosmogenic
Principala sursa naturala de C-14 pe pamant este reactia nucleara dintre neutronii din razele cosmice si azotul din atmosfera.
Organism viu 1mol 12C = 1mol 14C Organism mort
1mol 12C ˃1mol 14C
Ciclul 14C în natură
Radiția cosmică Neutron
14Azot
14Carbon Proton
Plantele adsorb CO2 și încorporează astfel 14C
Oamenii și animalele ingerează plante și astfel introduc în organism 14C
Electron
Descompunere beta
14Azot 14Carbon
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
Datare radiocarbon material osteologic
Os1
~20% Organic Matrice
Celule ~80% Anorganic
Hidroxiapatita
~85-90% Colagen tip I
Aminoacizi
Materialul osteolgic este datat de obicei, prin masurarea radiocarbon a colagenului extras1.
Curatarea probei Spalare proba os cu apa Milli-Q; uscare la 60°C; mojarare
Demineralizarea 10 mL HCl 0.5 M ; centrifugare / aducere la pH = 7
Gelatinizarea 20 mL HCl 0.2M; agitare 15-24 h,80°C, 400 rpm
Filtrarea colagenului Centrifugare; Filtru Amicon Ultra
Liofilizarea - 45°C, 0.040mbar, 18 h
Extragerea colagenului2
1F. Brock, V. Geoghegan, B. Thomas, K. Jurkschat, T.F.G. Higham, ANALYSIS OF BONE “COLLAGEN” EXTRACTION PRODUCTS FOR RADIOCARBON DATING, RADIOCARBON, Vol 55, Nr 2–3, 2013, p 445–463 2R. Longin, new method of collagen extraction for radiocarbon dating, Nature, 1971, Nr. 230, pp. 241-242
3
“Procesul uzual de datare”
Pretratarea si tratarea probei fizic si fizico – chimic
extractia colagenului
Grafitizarea colagenului obtinerea grafitului
Presarea grafitului intr-un sistem special de inchidere
obtinerea catodului (sub forma unui con)
Incarcarea catodului in sursa sputtering cu ioni Cs si masurarea
C14 prin metoda AMS la acceleratorul tandetron 1MV
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
Zeolitul este un mineral
microporos, aluminosilicat
4
Colagen Grafit
Captarea dioxidului de carbon in trapa de zeolit Eliberarea acestuia prin expansiune termica (450°C) Reducerea dioxidului de carbon la grafit pe
catalizator de Fe (500°C) in atmosfera de Hidrogen Amestec omogen: grafit:fier = 1:5 (mg)
Instalatia de Grafitizare Automata (AGE3)*
*L. Wacker, N. Nemec, J. Bourquin, A revolutionary system; Fully automated, compact and simple, Nuclear Methods in Physics Research B, vol. 268, 2010, p. 931-934. *N. Nemec, L. Wacker, H. Gaggeler, Optimization of the graphitization process at AGE-I, Radiocarbon, vol. 52, Nr. 2-3, 2010, p. 1380-1393.
Elementar* 3 coloane: 1.Coloana de combustie (900°C) - combustia totala a probelor organice in prezenta de oxigen; 2.Coloana de reducere (550°C) - reducerea gazelor formate anterior 3. Coloana de uscare umpluta cu Sicapent – retine apa Separarea CO2 din amestecul de gaze rezultat - transportul CO2 in AGE se face folosind Heliu – gaz purtator
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
5
Accelerator Tandetron 1 MV Cockcroft-Walton
Grafit Varsta Radiocarbon
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
Rezultatul analizei este raportat in ani radiocarbon inainte de prezent.
“Prezent”= 1950 AD
Conservarea probelor
Influenta mediului inconjurator / contaminanti Osul / coalgenul
degradare > 90%
Nr de probe de oase poate fi redus considerabil
DATAREA AMINOACIZILOR - HPLC
In colagenul de tip I aminoacizi abundenti
o Glicina (Gly) – 33%
o Prolina (Pro) – 12%
o Hidroxiprolina (Hyp) – 10%
o Alanina (Ala) – 10%
o Acidul glutamic (Glu) – 7%
o Treonina (Thr) – 7%
6
Metoda noua: Datarea cu radiocarbon a aminoacizilor individuali separati prin metoda HPLC
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
COLAGEN HIDROLIZA
SEPARAREA AMINOACIZILOR
HPLC
GRAFITIZAREA AMINOACIZILOR
MASURARE AMS
ANALIZAREA DATELOR
*James S O McCullagh, Anat Marom, Robert E M Hedges, Radiocarbon Dating of Individual Amino Acids from Archaeological Bone Collagen, Proceedings of the 20th International Radiocarbon Conference, edited by A J T Jull, RADIOCARBON, Vol 52, Nr 2–3, 2010, p 620–634
Protocol de lucru pentru datarea aminoacizilor din colagen*
Etapele protocolului de separare a aminoacizilor din colagen
Schema de datare a aminoacizilor din colagen
7
HIDROLIZA
• 50 mg colagen HCl 6N, 110°C, 24h
• HCl este indepartat folosind evaporator rotativ (Genevac EZ-2)
• Se obtine un amestec de aminoacizi in stare vascoasa
COLECTAREA FRACTIILOR DE AMINOACIZI
EVAPORAREA FRACTIILOR COLECTATE
OBTINEREA INDIVIDUALA A AMINOCAIZILOR
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
Metoda AA_apa_6mL(150 min) Debit: 6mL/min Faza mobila: Milli-Q apa
1-
Hid
roxi
pro
lina
2 –
Aci
d G
luta
mic
3 -
Tre
on
ina
+ G
licin
a
4 -
Pro
lina
5 -
Ala
nin
a
Mix standarde aminoacizi
*James S O McCullagh, Anat Marom, Robert E M Hedges, Radiocarbon Dating of Individual Amino Acids from Archaeological Bone Collagen, Proceedings of the 20th International Radiocarbon Conference, edited by A J T Jull, RADIOCARBON, Vol 52, Nr 2–3, 2010, p 620–634 8
Separarea aminoacizilor prin HPLC
Hydrolyzed collagen Colagen hidrolizat
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
Standardele de aminoacizi au fost utilizate pentru a determina ordinea de elutie si timpii de retentie pentru aminoacid*
Contaminare controlata Probe*
Pentru contaminarea controlata s-a utilizat ulei
de mir, de diferite vechimi, de la Manastirea Hurezi
acest proces de contaminare s-a facut conform unor
idei originale din laborator si urmarind cateva idei
din literatura de specialitate, pornind de la
experienta manuscriselor de la Marea Moarta.
Probe
Eficienta separarii prin sistemul
HPLC
Contaminare controlata
Rezultatele obtinute pentru o parte din probele
necontaminate si contaminate, sunt prezentate in
slide-urile urmatoare.
*Anat Marom, James S O McCullagh, Thomas F G Higham, Robert E M Hedges, HYDROXYPROLINE DATING:EXPERIMENTS ON THE 14C ANALYSIS OF CONTAMINATED AND LOW-COLLAGEN BONES, Proceedings of the 21st International Radiocarbon Conference edited by A J T Jull & C Hatté RADIOCARBON, Vol 55, Nr 2–3, 2013, p 698–708
9
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
Rezultate RoAMS vs HEKAL
10
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
Proba Varsta radiocarbon (BP)
Interval calendaristic (cal AD)
Probabilitatea (%)
Colagen 189.50 (necontaminat)
614 ± 33 1293 – 1404 95.4
Alanina* 677 ± 18 1276-1306 1363- 1385
66.3 29.1
Prolina* 603 ± 18 1300 – 1369 1381 – 1404
74.7 20.7
Colagen 189.50 (contaminat)
479 ± 30 1408 – 1453 95.4
CAZUL M4 Pb. 189.50 Mormant descoperit in interiorul altarului bisericii paraclis de la Curtea Domneasca din Targoviste
Notatia * indica faptul ca proba a fost analizata la HEKAL
Rezultate RoAMS vs HEKAL
11
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS
Proba Varsta radiocarbon (BP)
Interval calendaristic (cal AD)
Probabilitatea (%)
Colagen 191.50 (necontaminat)
709 ± 38 1224 – 1235 1242 – 1315 1356 – 1389
1.6 76.3 17.4
Hidroxiprolina* 713 ± 19 1264 – 1295 95.4
Colagen 191.50 (contaminat)
655 ± 31 1278 – 1325 1344 – 1394
45.5 49.9
Prolina* (contaminata)
704 ± 18 1267 – 1299 95.4
CAZUL M2 Pb. 191.50 Mormant descoperita la proximitatea mormantului M4, dar care suprapune fundatia absidei altarului Bisericii paraclis
Notatia * indica faptul ca proba a fost analizata la HEKAL
12
Izolarea si analiza aminoacizilor singulari din proteine pot oferi informatii suplimentare si date radiocarbon mai precise prin eliminarea contaminarii (in cazul de fata cu ulei de mir) si imbunatatirea preciziei de masurare;
Intervalele obtinute la calibrarea varstelor pot deveni compatibile cu plajele de valori estimate
de arheologi daca nu intervin efecte de dieta sau off-seturi care pot induce imbatraniri aparente ale varstei radiocarbon
Metoda de separare prin HPLC s-a dovedit a fi un instrument puternic care poate ajuta la rezolvarea problemelor arheologice prin datele suplimentare care pot diferentia off-seturile aduse de contaminanti de cele aduse prin alte mecanisme; in cazul celor doua probe de la Targoviste este valabil al doilea scenariu;
Cu toate acestea, separarea individuala, purificarea si datarea aminoacizilor din probele de
colagen (os) a fost / este un proces dificil.
CONCLUZII
Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS