Post on 09-Jan-2016
description
transcript
BIOLOGIE MOLECULAR - Metode experimentaleMarius Mihan, Marius tefan, Zenovia Olteanu
Prefa de Gheorghe Benga
Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a RomnieiMIHAN, MARIUS, TEFAN, MARIUS, OLTEANU, ZENOVIA
Biologie molecular: metode experimentale / Marius Mihan,Marius tefan, Zenovia Olteanu; prefa de Gheorghe Benga. Iai:Editura Universitii Al.I. Cuza, 2012Bibliogr.ISBN 978-973-703-816-6
CUPRINS
PREFAdeGHEORGHEBENGA.......................................................................XIINTRODUCERE.................................................................................................1
I.TEHNICIDEBAZUTILIZATENLABORATORULDEBIOLOGIEMOLECULAR..................................................................................................3 I.1Sticlriaiinstrumenteledinmaterialeplastice.....................................................3
Siliconareasticlrieiiainstrumentelordinmaterialeplastice....................................4Splareaiuscareavaselordelaborator......................................................................5
I.2Msurareavolumelor............................................................................................6Msurareavolumelorcuajutorulpipetelor..................................................................7
I.3Msurareamaselor.............................................................................................12Instruciuniprivindutilizareabalaneielectroniceanalitice......................................14
I.4Centrifugarea......................................................................................................15Instruciuniprivindutilizareacentrifugii.....................................................................16
I.5Tehnicidebazfolositepentrumanipulareamicroorganismelor..........................17Msuridebiosecuritate..............................................................................................17Tehnicidesterilizare...................................................................................................21
II.METODEDECULTIVAREABACTERIEIESCHERICHIACOLI.......29II.1Mediiutilizatepentrucultivarea bacterieiEscherichiacoli.................................30
Mediideculturminimale..........................................................................................31Mediideculturcomplexe.........................................................................................33Mediidecultursolide...............................................................................................36
Mediiminimalesolide............................................................................................36Mediideculturcomplexesolide..........................................................................36
Agardeacoperire.......................................................................................................37Agardeconservareprinnepare...............................................................................38Antibioticeutilizatelapreparareamediilordecultur...............................................39
Cuprins VI
II.2CultivareaE.colipemediisolide........................................................................41nsmnarealasuprafaamediilordecultursolide................................................42nsmnareanprofunzimeamediilordecultursolide..........................................44
II.3CultivareaE.colinmediilichide........................................................................47Inoculareaicultivareafolosindvolumemicidemediu.............................................47Inoculareaicultivareafolosindvolumemaridemediu............................................48
II.4MonitorizareacreteriibacterieiE.coli nmediilelichide....................................48Determinareadensitiiopticecuajutorulspectrofotometrului...............................49Determinareadensitiiopticecuajutorulhemocitometrului...................................51DeterminareanumruluidebacteriiprincultivarenplciPetri...............................52
II.5PstrareaculturilordeE.coli.............................................................................54Pstrareaprincongelarela80oC................................................................................55
III.PLASMIDEITULPINIDEESCHERICHIACOLIUTILIZATEFRECVENTNBIOLOGIAMOLECULAR...............................................57III.1Vectoriplasmidialiutilizaifrecventningineriagenetic...................................59
Principalelecaracteristicialevectorilorplasmidialiutilizainingineriagenetic......61VectorulpUC19c....................................................................................................61VectorulpBlueScriptIISK(+/)...............................................................................62VectorulpET21a....................................................................................................62VectorulpMALc5x.................................................................................................62
III.2TulpinideEscherichiacoliutilizatefrecventningineriagenetic.......................63
IV.METODEITEHNICIFOLOSITEPENTRUIZOLAREAIPURIFICAREA ADNULUI...........................................................................73 IV.1IzolareaADNuluiplasmidial.............................................................................75
IzolareaADNuluiplasmidialfolosindmetodalizeialcaline........................................76IzolareaADNuluiplasmidialutilizndmetodalizeiprinfierbere...............................81
IV.2IzolareaADNuluigenomic................................................................................84IzolareaADNuluigenomicdinbacterii......................................................................85IzolareaADNuluigenomicdinplante........................................................................90IzolareaADNuluidinesuturianimale.......................................................................95
IV.3PurificareaADNuluidinsoluiiapoase...........................................................100
Cuprins VII
IV.4IzolareaADNuluidingelurideagaroz...........................................................103IV.5PstrareaADNuluipurificat...........................................................................107
V.AMPLIFICAREAENZIMATICINVITROAACIZILORNUCLEICI..................................................................................111 V.1AmplificareaenzimaticinvitroaADNului sau PCR .........................................113
AmplificareaenzimaticinvitroafragmentelordeADNdepnla4kb................116V.2Criteriipentrualegereaoligonucleotideloramors(primer)..............................126
VI.DETERMINAREACONCENTRAIEIACIZILORNUCLEICINSOLUIE........................................................................................................133 V.1DeterminareaconcentraieiacizilornucleiciprinspectroscopieUVVIS.............133
DeterminareaconcentraieiacizilornucleiciprinspectroscopieUV........................134V.2.Determinareaconcentraieiacizilornucleiciprinfluorimetrie..........................138
Determinareaconcentraieiacizilornucleicifolosindbromuradeetidiu.................139Determinareaconcentraieiacizilornucleici folosindmetodacufoliedinplastic....141DeterminareacantitiideADNpegelurideagaroz..............................................143
VII.SEPARAREAELECTROFORETICAADNULUI.........................147VII.1Electroforezaclasicngelurideagaroz.......................................................150VII.2.SeparareaADNprinelectroforezngeldepoliacrilamidcugradientdeagentdenaturant............................................................................................................157VII.3DeteciaADNuluingelurideagaroz...........................................................168
DeteciaADNuluifolosindbromuradeetidiu.........................................................169DeteciaADNuluingelurideagarozfolosindcoloranidetipSYBR.....................171DeteciaADNuluingelurideagarozfolosindalbastruldemetilen......................173
VIII.PURIFICAREAPROTEINELORPRINCROMATOGRAFIEDEAFINITATEFADEMETALE.................................................................177 VIII.1Strategiideclonareagenelornvectorideexpresie......................................181VIII.2Identificareacondiiiloroptimedesupraexpresieaproteinelorrecombinate.186
Cuprins VIII
VIII.3Purificareaprin IMACaproteinelorrecombinatencondiiinative................192VIII.4Purificareaprin IMACaproteinelorrecombinatencondiiidenaturante.......198VIII.5Determinareamaselormolecularenativeutilizndcromatografiadefiltrarepringel(GF)..................................................................................................................200
Determinareamaselormolecularenativeutilizndcromatografiadefiltrarepringel..................................................................................................................................206CalibrareacoloaneideGFicalculareamaselormolare..........................................208
IX.DETERMINAREACONCENTRAIEIPROTEINELOR..................215IX.1DeterminareaconcentraieiproteinelorprinspectroscopieUV........................216IX.2Metodecolorimetricededeterminareaconcentraieiproteinelor...................219
MetodaLowry...........................................................................................................219MetodaBradford ......................................................................................................224
MicrometodaBradforddedozareaconcentraieiproteinelor............................227Metodacuacidbicinchoninic(BCA).........................................................................229
MicrometodaBCAdedozareaproteinelor.........................................................231Macrometoda BCAdedozareaproteinelor........................................................232
IX.3Realizareacurbelordeetalonareiprelucrareadatelor...................................234
X.SEPARAREAELECTROFORETICAPROTEINELOR...................241X.1Electroforezanativaproteinelornsistemdiscontinuu...................................243X.2Electroforezaproteinelorncondiiidenaturante(SDSPAGE)...........................253X.3Deteciaproteinelorseparateprinelectroforezapegeluridepoliacrilamid.....257
Colorareagelurilordepoliacrilamidnvedereaevidenieriiproteinelor................257ColorareacuComassieBrilliantBlueR250.........................................................259Colorareacuargintagelurilordepoliacrilamid.................................................261
X.4Fotografiereagelurilorianalizaimaginilor.Stabilireamaseimolecularerelative.............................................................................................................................264
XI.EVIDENIEREAIMUNOLOGICAPROTEINELORTEHNICAWESTERNBLOT.........................................................................................273 XI.1Obinereaanticorpilorpoliclonali.Tehnicideimunizare..................................273
Cuprins IX
ObinereaanticorpilorpoliclonalifolosindadjuvantulFreund.................................275XI.2Imunoblotingul..............................................................................................278
Electrotransferulproteinelorpemembranensistemsemiuscat..........................279Imunodeteciaproteinelortransferatepemembranedenitroceluloz...................282
XII.METODECOMPUTAIONALEDESTUDIUAPROTEINELOR.285XII.1FiiereFASTAioperaiisimplecusecvene....................................................286XII.2Bazededatecuinformaiidespreproteine.....................................................290
Bazededatecusecveneproteice...........................................................................291Bazededatecustructuriproteice............................................................................294
XII.3IdentificareafuncieiproteinelornecunoscutecuajutorulprogramuluiBLAST 295XII.4Modelareacomputaionalastructuriitridimensionaleaproteinelor............308
Programe,servereimetaservere............................................................................311Aplicaiialemetodelordemodelareastructurilortridimensionaleaproteinelor..316
XII.5Modelareacomputaionalacomplecilorliganziproteine............................316Problematicaandocriimoleculare..........................................................................317Evaluarearezultatelorobinuteprinandocaremolecularcomputerizat..............324Aplicaiialeandocriimoleculare.............................................................................324
ANEX...........................................................................................................335
.
PREFA
Biologia molecular poate fi definit cel mai simplu ca fiind un concept de studiere a materiei vii prin prisma relaiei structur-funcie la nivel molecular. Este un concept ce a revoluionat tiinele biologice i medicale ncepnd cu a doua jumtate a secolului XX. Dar pe lng noile cunotine teoretice, revoluia produs de biologia molecular a fost posibil i datorit introducerii de noi metode i tehnici de laborator. Toate lucrrile experimentale de biologie molecular implic utilizarea unor astfel de metode i tehnici. De aici rezult i necesitatea unor cri care s-i ajute pe cercettori n munca zilnic la masa de laborator (bench). n Romnia nu cunosc s se fi scris o asemenea carte, care s descrie toate metodele i tehnicile de biologie molecular la modul practic de lucru.
Efortul tinerilor colegi Marius Mihan, Marius tefan i Zenovia Olteanu de a redacta o astfel de carte mi se pare de aceea deosebit de ludabil i rezultatul este o lucrare de mare valoare.
Merit subliniat c sunt descrise pe de o parte unele tehnici de baz n laboratorul de biologie molecular (dar i n laboratoarele de analize biomedicale, de biochimie i chimie clinic, de microbiologie, de biofizic etc), precum: pregtirea sticlriei i a vaselor de laborator, msurarea volumelor, a maselor, centrifugarea, tehnicile de baz folosite pentru manipularea microorganismelor, metodele de determinare a proteinelor, separarea electroforetic a proteinelor, tehnici de imunologie (obinerea de anticorpi policlonali, imunodetecia proteinelor transferate pe membrane de nitroceluloz) etc. Pe de alt parte sunt descrise metode specifice biologiei moleculare: plasmide i tulpini de Escherichia coli folosite frecvent n biologia molecular, izolarea ADN-ului, purificarea proteinelor prin cromatografie de afinitate, metode computaionale de studiu a proteinelor.
Descrierea metodelor i a tehnicilor este foarte bine fcut, de la principiile teoretice, avantajele i limitele, pn la descrierea concret a materialelor necesare i a modului de lucru.
n acest fel cartea este un valoros ghid pentru lucrul n laborator, att pentru nceptori (studeni, masteranzi, doctoranzi), ct i pentru avansai (cercettori postdoctorali, cadre didactice din nvmntul
Prefa XII
superior, tehnicieni de laborator cu experien) i trebuie s se afle pe masa de lucru din laborator (ori aproape de masa de lucru).
Fiind eu nsumi autor al unei cri pentru laboratoarele clinice (Ion Manta, Mircea Cucuianu, Gheorghe Benga, Adriana Hodrnu, Metode biochimice n laboratorul clinic, Editura Dacia, Cluj-Napoca, 1975) i al unui ndrumtor pentru lucrrile practice cu studenii (Gh. Benga -Ed.- ndrumtor pentru lucrrile practice de biologie celular i molecular, Editura Carpatica, Cluj-Napoca, 1997) mi dau bine seama de dificultatea scrierii unei astfel de cri i apreciez efortul foarte mare depus de autori.
Recomand clduros lucrarea scris de cei trei autori tuturor categoriile de cititori (i utilizatori) menionai mai sus, dar i celor care nu aplic sau nu vor aplica niciodat metodele i tehnicile de laborator ale biologiei moleculare, dar care vor s se orienteze n metodele i tehnicile laborator de biologie molecular, spre a nelege mai bine aplicaiile acesteia n tiinele medicale i biologice.
Cluj-Napoca, 12 noiembrie 2012
Prof. Univ. Dr. Dhc. Gheorghe Benga Membru corespondent al Academiei Romne
Membru Titular al Academiei de tiine Medicale din Romnia Medic specialist de Laborator Clinic, Chimist,
Medic primar de Genetic Medical, Laboratorul de Explorri Genetice I al Spitalului Clinic Judeean de Urgen Cluj-Napoca
Profesor Univ. Asociat, Disciplina de Biologie Celular i Molecular, Universitatea de Vest Vasile Goldi din Arad
Preedinte al Filialei Cluj a C.R.I.F.S.T. (Comitetul Romn pentru Istoria i Filosofia Stiinei i Tehnicii) al Academiei Romne
Honorary Associate, School of Molecular Biosciences, University of Sydney, Australia
Past-President, Societatea Romn de Medicin de Laborator Past-President, Balkan Federation of Clinical Laboratory
E-mail: gbgbenga@gmail.com
INTRODUCERE
Dac biologia clasic s-a dezvoltat i a atins nivelul de cunoatere de astzi prin folosirea cu precdere a studiilor observaionale, biologia modern se bazeaz n mod fundamental pe noiunea de experiment i pe procesul de experimentare n scopul dobndirii de noi informaii i cunotine. Experimentul are rolul de a verifica validitatea unei ipoteze formulate n prealabil utiliznd pentru aceasta un ansamblu de tehnici i metode. Reuita unui experiment, adic formularea fr echivoc a unei concluzii legate de ipoteza de testat, depinde n mare msur de capacitatea cercettorului de a concepe un model de studiu, de a alege i de a utiliza n mod corect una sau mai multe metode de investigaie. Majoritatea lucrrilor de profil din ultima decad, care descriu metode i tehnici de laborator utilizate n biochimie, enzimologie, biologie celular i molecular, au fost realizate cu precdere n scopuri didactice, fiind utilizate ca suport pentru prelegerile teoretice. Metodele experimentale sunt reduse frecvent la un set de indicaii simple i clare pe care studenii s le poat urma cu uurin. Lipsa unor informaii generale despre principiile teoretice i aplicabilitatea metodelor dau ns o fals impresie de imuabilitate a protocoalelor experimentale, ceea ce face ca experimentatorul s fie pus deseori n dificultate atunci cnd trebuie s adapteze metoda n mod specific. n acest context, lucrarea de fa se dorete a fi un ghid detaliat al unor metode-cheie, utilizate frecvent n biologia molecular, concentrn-du-se nu numai pe simpla formulare a unor protocoale experimentale, ci i pe explicarea principiilor din spatele fiecrei metode n scopul precizrii spectrului de aplicabilitate i a rezultatelor scontate. Fiecare din metodele prezentate au fost testate i utilizate de ctre autori n cadrul Laboratorului de Biochimie i Biologie Molecular al Facultii de Biologie, Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Iai. Modul de prezentare este adaptat specificului fiecrei metode n parte, cuprinznd n general cinci seciuni distincte: 1. principiul metodei ofer informaii legate de bazele teoretice ale
metodei utilizate; 2. avantaje furnizeaz informaii legate de domeniul de aplica-
bilitate al metodei, rezultatele ateptate corelate cu date legate de sensibilitate, randament etc.;
Biologie molecular. Metode experimentale 2
3. limitri prezint condiiile n care metoda nu poate fi aplicat, dezavantajele sau inconvenientele sale n comparaie cu metode similare;
4. materiale necesare conine lista complet a reactivilor, materia-lelor, instrumentelor i aparaturii necesare, alturi de instruciuni legate de prepararea reactivilor i indicaii privind potenialele pericole care pot s apar n laborator;
5. mod de lucru ofer indicaii simple i precise privind suita de operaii care trebuie efectuate pentru obinerea rezultatelor finale.
Prin coninut i structur lucrarea se adreseaz cu precdere studenilor care frecventeaz studiile masterale i de doctorat, cercet-torilor post-doctorat, cadrelor didactice care coordoneaz lucrrile de disertaie i doctorat, tinerilor angajai n activitatea de cercetare, care fac primii pai n domeniul tiinelor vieii, precum i specialitilor din domenii conexe. Prin aspectele teoretice abordate, prezenta lucrare poate fi util i cercettorilor i tehnicienilor cu experien care au deprins i utilizeaz aceste protocoale de ani buni, dar care nu au acordat suficient importan cunotinelor teoretice care fundamenteaz metodele respective. Puini vor fi cei care vor parcurge aceast lucrare de la un capt la altul, dar sperm c o vom regsi pe masa de lucru a ct mai multor cercettori, funcionnd ca un ghid pentru selecia, dezvoltarea i adaptarea protocoalelor experimenta e la nevoile specifice ale experimentatorului.
Mesajul final pe care aceast lucrare dorete s l transmit este c reproducerea n detaliu a fiecrei etape a unui protocol nu este suficient pentru utilizarea cu succes a acestuia. Este mai important poate de cunoscut cum funcioneaz, n ce condiii se poate utiliza, ce informaii poate i ce informaii nu poate s ofere o anumit metod, precum i care sunt parametrii critici de care trebuie s se in cont la utilizarea unei tehnici experimentale.
Mulumim anticipat celor care vor transmite sugestii, observaii i recomandri care s conduc la completarea acestei lucrri n scopul mbuntiri unei viitoare ediii.
Autorii
l
Textul complet este disponibil in format electronic gratuit. Nu ezitati sa macontactati in aceasta directie prin e-mail la adresa:
marius.mihasan@uaic.ro
ANEX
TABEL A1. Multipli i submultipli ai unitilor de msur Prefix Factor de multiplicare Abreviere
Atto 10-18 a Femto 10-15 f Pico 10-12 p Nano 10-9 n Micro 10-6 Mili 10-3 m Centi 10-2 c Deci 10-1 d Deca 10 da Hecto 102 h Kilo 103 k Myria 104 my Mega 106 M Giga 109 G Tera 1012 T Peta 1015 P Exa 1018 E
Biologie molecular. Metode experimentale 336
TABEL A2. Tabel de conversie a celor mai utilizate uniti de volum Pentru a converti: n: se multiplic cu: Centimetri cubi (cm3) Microlitri (l) 103 Mililitri (ml) 1 Litri (l) 10-3 Galoane (US) 2.641 x 10-4 Metri cubi (m3) 10-6 Picioare cubice (cubic feet,
ft3) 3,531 x 10-5
Inchi cubici (cubic inches (in.3)
6,102 x 10-2
Litri (L) Microlitri (l) 106 Mililitri (ml) 103 Galoane (US) 0,2642 Centimetri cubi (cm3) 103 Metri cubi (m3) 10-3 Picioare cubice (engl.cubic
feet, ft3) 3,531 x 10-2
Inchi cubici (engl.cubic inches (in.3)
61.02
Mililitri (ml) Litri (l) 10-3 Microlitri (l) 103 Microlitri (l) Mililitri (ml) 10-3 Litri (l) 10-6
Anex
337
TABEL A3. Tabel de conversie a celor mai utilizate uniti de msur Pentru a converti din: n: se multiplic cu: Concentraia Miligrame per litru (mg/l) Pri pe milion (ppm) 1 Distana Centimetri (cm) Picioare (engl. feet, ft) 3,281 x 10-2 Inchi (in.) 0,39 Metri (m) 10-2 Milimetri (mm) 10 Yarzi (yd) 1,094 x 10-2 Inchi (in) Centimetri (cm) 2,54 Picioare (engl. feet, ft) 8,333 x 10-2 Metri (m) 2,540 x 10-2 Milimetri (mm) 25,4 Yarzi (yd) 2,778 x 10-2 Milimetri (mm) Centimetri (cm) 0,1 Picioare (engl. feet, ft) 3,281 x 10-3 Inchi (in.) 3,937 x 10-2 Metri (m) 10-3 Angstromi () Nanometri (nm) 0,1
Metri (m) 10-10 Picometri (pm) 100 Curentul i sarcina electric
Amperi pe centimetru ptrat (A/cm2)
Amperi pe inci ptrai (A/in2)
6,45
Amperi pe metru patrat (A/m2)
104
Biologie molecular. Metode experimentale 338
Pentru a converti din: n: se multiplic cu: Amperi pe inci ptrai (A/in2)
Amperi pe centimetru ptrat (A/cm2)
0,16
Amperi pe metru patrat (A/m2)
1,55 x 103
Amperi or (A-hr) Coulombi (C) 3,6 x 103 Faraday (F) 3,731 x 10-2 Coulombi (C) Faraday (F) 1,036 x 10-5 Coulombi pe centimetru ptrat (C/cm2)
Coulombi pe inci ptrat (C/in2)
64,52
Coulombi pe metru patrat (C/m2)
104
Coulombi pe inci ptrat (C/in2)
pe centimetru ptrat (C/cm2)
0,16
pe metru patrat (C/m2)
1,55 x 103
Faraday (F) Amperi-or (A-hr) 26.,8 (C) 9,649 x 10-4 Presiunea Atmosfere (atm) Bari 1,01 Milimetri coloana de Hg
(mmHg) sau torri 760
Bari (bar) Atmosfere (atm) 0,99 Kilograme pe metru
ptrat (kg/m2) 1,020 x 104
psi 14,5 Milimetri coloana de Hg (mmHg) sau torri
Atmosfere (atm) 1,316 x 10-3
Kilograme pe metru ptrat (kg/m2)
136
Coulombi
Coulombi
Coulombi
Anex
339
Pentru a converti din: n: se multiplic cu: Pascali (P) Newtoni pe metru ptrat
(N/m2) 1
Rezistena electric Ohmi () Megaohmi (M) 106 Microhmi () 10-6 Timp Zile Ore (hr) 24 Minute (min) 1,44 x 103 Secunde (sec) 8,64 x 104 Temperatura Grade Kelvin (K) Grade Celsius (oC) K-273,13 Grade Fahrenheit (oF) [(K 273,13)
95] + 32 Grade Celsius (oC) Grade Kelvin (oK) OC + 273,13 Grade Fahrenheit (oF) 1,8 x oC + 32 Grade Fahrenheit (oF) Grade Celsius (oC) (F -32)/1,8
Viteza Centimetri pe secund (cm/s)
Picioare pe minut (ft/min)
1,2
Picioare pe secund (ft/sec)
3,281 x 10-2
Kilometri pe or (km/hr) 3,6 x 10-2 Metri pe minut (m/min) 0,6 Mile pe ora (miles/hr) 2,237 x 10-2 Mile pe minut
(miles/min) 3,728 x 10-4
Biologie molecular. Metode experimentale 340
TABEL A4. Date generale privind concentraia aproximativ a diverilor constitueni intracelulari dup Ausubel et al., 2002 (1)
Macromolecule (proteine, acizi nucleici, poliglucide) 22% (w/w) Molecule mici Ap 70% (w/w) Monoglucide 3% (w/w) Lipide 2% (w/w) Aminoacizi liberi 0,4% (w/w) Nucleotide 0,4% (w/w) Ioni anorganici 1% (w/w) Na+ 5-15 mM K+ 140 mM Mg2+ 30 mM Ca2+ 1-2 mM Cl- 4 mM pH 7,4
Anex
341
TABEL A5. Factori de conversie utilizai frecvent n studiul proteinelor i acizilor nucleici
Masa molar medie a unei perechi de baze = 649 Da 1 kb de ADN codifica 333 amino-acizi, adic 36.000 Da 1 fragment de 1 kB este echivalentul a 6,5 x 105 Da ADN dublu catenar, 3,3 x 105 Da ADN mono catenar sau 3,4 x 105 Da ARN monocatenar 1 g/ml ADN conine 3,08 M fosfat 1 g/ml ADN cu dimensiunea de 1 kb conine 3,08 nM capete 5 1mol pBR322 (4363 bp) este echivalent a 2,83 g Masa molar medie a unui aminoacid = 110 Da 10 kDa dintr-o protein conine 91 aminoacizi i este codificat de 273 nucleotide
Biologie molecular. Metode experimentale 342
TABEL A6. Modul de notare prescurtat a nucleotidelor Prescurtare NucleotidA Adenin C Citozin G Guanin T Timin U Uracil M Adenin sau Citozin R Adenin sau Guanin S Citozin sau Guanin Y Citozin sau Timin K Guanin sau Timin V Adenin, Citozin sau Guanin (oricare, exceptnd
Timina) H Adenin, Citozin sau Timin (oricare, exceptnd
Guanina) D Adenin, Guanin sau Timin (oricare, exceptnd
Citozina) B Citozin, Guanin sau Timin (oricare, exceptnd
Adenina) N Oricare din cele cinci nucleotide
TABE
L A7.
Princ
ipalel
e pro
priet
i fiz
ico-ch
imice
ale a
mino
acizi
lor
Am
inoa
cid
Pres
curt
area
cu
trei
lite
re
Pres
curt
area
cu
o lit
er
Mas
mol
ar
(g/m
ol)
Ari
a su
praf
eei
acce
sibi
lea
Hid
ro-
fobi
cita
teb
Mut
abili
tate
re
lativ
c
Ala
nin
Ala
A
89
.1
115
-0.4
10
0 A
rgin
in
Arg
R
17
4.2
225
-0.5
9 65
A
spar
agin
Asn
N
13
2.1
160
-0.9
2 13
4 A
cid
aspa
rtic
Asp
D
13
3.1
150
-1.3
1 10
6 C
iste
in
Cys
C
12
1.2
135
0.17
20
G
luta
mat
G
lu
E 14
7.1
190
-1.2
2 10
2 G
luta
min
Gln
Q
14
6.2
180
-0.9
1 93
G
licin
Gly
G
75
.1
75
-0.6
7 49
H
istid
in
His
H
15
5.2
195
-0.6
4 66
Is
oleu
cin
Ile
I 13
1.2
175
1.25
96
Le
ucin
Leu
L 13
1.2
170
1.22
40
Li
zin
Lys
K
146.
2 20
0 -0
.67
56
Met
ioni
n M
et
M
149.
2 18
5 1.
02
94
Anex 343
Am
inoa
cid
Pres
curt
area
cu
trei
lite
re
Pres
curt
area
cu
o lit
er
Mas
mol
ar
(g/m
ol)
Ari
a su
praf
eei
acce
sibi
lea
Hid
ro-
fobi
cita
teb
Mut
abili
tate
re
lativ
c
Feni
lala
nin
Phe
F 16
5.2
210
1.92
41
Pr
olin
Pro
P 11
5.1
145
-0.4
9 56
Se
rin
Ser
S 10
5.1
115
-0.5
5 12
0 Tr
eoni
n Th
r T
119.
1 14
0 -0
.28
97
Trip
tofa
n Tr
p W
20
4.2
255
0.5
18
Tiro
zin
Tyr
Y
181.
2 23
0 1.
67
41
Valin
Va
l V
11
7.1
155
0.91
74
a A
ria su
praf
eei a
cces
ibile
est
e ex
prim
at n
2 i
est
e ca
lcul
at p
entru
fiec
are
amin
oaci
d ca
par
te a
unu
i sch
elet
pol
ipep
tidic
(2)
b H
idro
fobi
cita
tea
este
exp
rimat n
uni
ti a
rbitr
are
folo
sind
scal
a O
MH
des
cris
a de
Sw
eet i
Eis
enbe
rg (1
983)
(3)
c Mut
abili
tate
a re
lativ
est
e ex
prim
at n
unit
i arb
itrar
e (al
anin
a fiin
d al
eas
ca re
ferin
) i
repr
ezin
t pro
babi
litat
ea c
a un
am
inoa
cid
s su
fere
o m
utai
e n
tr-un
tim
p da
t (4)
Biologie molecular. Metode experimentale 344
TABE
L A8.
Comp
atibil
itate
chim
ic a d
iverse
lor tip
uri d
e mate
riale
plasti
ce ut
ilizate
n la
bora
tor:
A
BS
Ace
tal
CPV
C
LD
PEPC
PE
EK
PP
PT
FE
PVC
PV
DF
Slov
eni o
rgan
ici
Ace
ton
D
A
D
B
D
A
A
A
D
D
Acr
iloni
tril
D
N/A
A
A
D
A
A
A
B
A
Ben
zen
D
A
D
C
D
A
D
A
C
A
Clo
rofo
rm
D
A
D
C
D
A
C
A
D
A
Dic
lorb
enze
n D
N
/A
D
N/A
D
A
C
A
D
A
Hex
an
D
A
B
D
D
A
B
A
B
A
Nitr
oben
zen
D
C
D
C
D
A
B
A
D
A
Feno
l D
D
B
D
D
D
B
A
D
A
Tolu
en
D
C
D
C
D
A
C
A
D
A
Dic
lore
tan
D
A
D
C
D
A
D
A
D
A
Alc
ooli
Alc
ool a
mili
c A
A
A
B
B
A
B
A
A
D
Alc
ool b
enzi
lic
D
A
A
D
N/A
A
A
A
D
A
Alc
ool i
zopr
opilc
N
/A
A
C
A
A
A
A
A
A
N/A
Etan
ol
B
A
B
B
B
A
A
A
C
N/A
Met
anol
D
A
A
A
B
A
A
A
A
A
Anex 345
A
BS
Ace
tal
CPV
C
LD
PEPC
PE
EK
PP
PT
FE
PVC
PV
DF
Aci
zi
Aci
d ac
etic
gla
cial
D
D
B
A
B
A
B
A
D
C
Aqu
a R
egia
(HC
l 80%
, HN
O3
20%
)D
D
C
B
D
D
B
A
C
A
Aci
d ci
tric
D
B
B
D
A
A
A
A
B
A
Aci
d fo
rmic
D
A
A
D
A
C
A
A
A
A
HF
pn
la 7
5%
C
D
C
C
D
D
C
A
C
A
HC
l 37%
A
C
A
B
D
A
C
A
B
A
H2S
O4 1
0-75
%
B
D
A
A
B
D
A
A
A
A
H2S
O4 9
8%
N/A
N
/A
C
C
N/A
D
A
A
D
A
Aci
d tri
clor
acet
ic, T
CA
N
/A
N/A
N
/A
A
D
N/A
A
A
B
B
HN
O3 p
n la
50%
C
D
B
B
B
D
B
A
B
A
HN
O3
D
D
D
C
C
D
D
A
B
A
H3P
O4 m
ai c
once
ntra
t de
40%
) D
D
A
B
A
A
A
A
B
B
Baze
Am
onia
c D
D
A
B
D
A
A
A
A
A
Mg(
OH
) 2 B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
KO
H
A
A
A
A
D
A
A
A
A
A
Biologie molecular. Metode experimentale 346
A
BS
Ace
tal
CPV
C
LD
PEPC
PE
EK
PP
PT
FE
PVC
PV
DF
NaO
H p
n la
80%
A
D
A
D
D
A
A
A
A
A
Alte
le
Ace
tald
ehid
D
A
D
C
C
A
A
A
D
D
Det
erge
ni
B
A
A
D
A
A
A
A
A
A
Form
alde
hid
B
A
A
B
A
A
C
A
A
A
H2O
2 A
D
A
C
A
A
B
A
A
A
Iod
D
D
D
A
N/A
C
C
A
A
A
AgN
O3
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Ure
e B
A
A
A
D
A
A
A
D
A
NaO
Cl p
n la
20%
A
D
A
A
C
B
A
A
A
A
A =
com
patib
ilita
te e
xcel
ent,
B =
com
patib
ilita
te b
un, e
fect
e m
ici
o uoa
r de
colo
rare
sau
coro
ziun
e, C
= c
ompa
tibili
tate
rela
tiv
bun,
efe
cte
mai
pro
nuna
te, n
u se
reco
man
d pe
ntru
util
izar
ea c
ontin
u; p
ot a
prea
feno
men
e de
nm
uier
e sa
u um
flare
, D =
efe
cte
seve
re, n
u se
reco
man
d ut
iliza
rea,
N/A
= n
u ex
ist i
nfor
maii
des
pre
com
patib
ilita
te
Anex 347
Biologie molecular. Metode experimentale 348
FIGURA A1. Nomogram pentru conversia forei centrifuge (g) n vitez de rotaie (rpm).
Pentru a identifica pe nomogram o valoare necunoscut se traseaz o dreapt descris de dou puncte de pe celelalte dou coloane. Valoarea dorit se citete la intersecia dreptei cu coloana de interes. Pentru centrifugri la viteze mai mari se folosete nomograma din figura A2. Pentru valori precise, se utilizeaz ecuaia prezentat n subcapitolul dedicat centrifugarii, pagina 15.
Anex
349
FIGURA A2. Nomogram pentru conversia forei centrifuge (g) n vitez de rotaie (rpm).
Pentru a identifica o valoare necunoscut folosind nomograma reprezentat n figura se traseaz o dreapt descris de dou puncte de pe celelalte dou coloane. Valoarea dorit se citete la intersecia dreptei cu coloana de interes. Pentru valori precise, se utilizeaz ecuaia prezentat n n subcapitolul dedicat centrifugarii, pagina 15
Biologie molecular. Metode experimentale 350
FIGURA A3. Harta situs-urilor de restricie a plasmidului pUC19c A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; lacZ fragmentul Nterminal al genei ce codific galactozidaza din calea metabolic a lactozei; Ori originea de replicare provenind din plasmidul pMB1; bla(AmpR) confer rezisten la ampicilin) B. Secvena n zona MCS
B
A
Anex
351
FIGURA A4. Harta situs-urilor de restricie a plasmidului pBluescript II SK A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; f1 ori originea de replicare provenind din fag; lacZ fragmentul Nterminal al genei ce codific galactozidaza din calea de metabolic a lactozei; Plac promotorul sub controlul cruia este pus gena clonat; pUC ori originea de replicare provenind de la plasmidul pUC; bla(ApmR) gena ce confer rezisten la ampicilin) B. Secvena n zona MCS.
.
B
A
Biologie molecular. Metode experimentale 352
FIGURA A5. Harta situs-urilor de restricie a plasmidelor pET21a; A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; f1 ori originea de replicare provenind din fag lacZ fragmentul Nterminal al genei ce codific galactozidaza din calea metabolic a lactozei; face posibil selecia alb/albastr prin complementare alfa pe plci cu Xgal; ori originea de replicare provenind de la plasmidul pUC; lacI represorul din operonul lac cu rol n controlul expresiei genei clonate; bla(ApmR) gena ce confer rezisten la ampicilin) B. Secvena n zona MCS.
B
A
Anex
353
FIGURA A6. Harta situs-urilor de restricie a plasmidului pMAL-c5X A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; bla(ApmR) gena ce confer rezisten la ampicilin; ori originea de replicare provenind de la plasmidul pBlueScript; lacIq represorul din operonul lac cu rol n controlul expresiei genei clonate; P tac promotorul sub controlul cruia este pus gena clonat; malE maltose binding protein, proteina cu afinitate pentru maltoz din E.coli, rrnBT1T2 zona de semnalizare a sfritului transcripiei B. Secvena n zona MCS.
B
A
Bibliografie pentru Anexa
Bibliography
1. Ausubel, M. F., Brent, R., Kingston, E. R., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, A. J., Struhl, K.(2002) Short Protocols in Molecular Biology, p A2-1,. John Wiley & Sons Inc.
2. Chothia, C. (1976) The nature of the accessible and buried surfaces in proteins, Journal ofMolecular Biology, 105, 1-12.
3. Sweet, R. M., Eisenberg, D. (1983) Correlation of sequence hydrophobicities measuressimilarity in three-dimensional protein structure, Journal of Molecular Biology , 171, 479-88.
4. Dayhoff, M., Schwartz, R., Orcutt, B. (1978) A model of evolutionary change in proteins, Atlasof Protein Sequence and Structure, 5, 345-352.