Biologie Moleculară

BIOLOGIE MOLECULAR - Metode experimentaleMarius Mihan, Marius tefan, Zenovia Olteanu

Prefa de Gheorghe Benga

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a RomnieiMIHAN, MARIUS, TEFAN, MARIUS, OLTEANU, ZENOVIA

Biologie molecular: metode experimentale / Marius Mihan,Marius tefan, Zenovia Olteanu; prefa de Gheorghe Benga. Iai:Editura Universitii Al.I. Cuza, 2012Bibliogr.ISBN 978-973-703-816-6

CUPRINS

PREFAdeGHEORGHEBENGA.......................................................................XIINTRODUCERE.................................................................................................1

I.TEHNICIDEBAZUTILIZATENLABORATORULDEBIOLOGIEMOLECULAR..................................................................................................3 I.1Sticlriaiinstrumenteledinmaterialeplastice.....................................................3

Siliconareasticlrieiiainstrumentelordinmaterialeplastice....................................4Splareaiuscareavaselordelaborator......................................................................5

I.2Msurareavolumelor............................................................................................6Msurareavolumelorcuajutorulpipetelor..................................................................7

I.3Msurareamaselor.............................................................................................12Instruciuniprivindutilizareabalaneielectroniceanalitice......................................14

I.4Centrifugarea......................................................................................................15Instruciuniprivindutilizareacentrifugii.....................................................................16

I.5Tehnicidebazfolositepentrumanipulareamicroorganismelor..........................17Msuridebiosecuritate..............................................................................................17Tehnicidesterilizare...................................................................................................21

II.METODEDECULTIVAREABACTERIEIESCHERICHIACOLI.......29II.1Mediiutilizatepentrucultivarea bacterieiEscherichiacoli.................................30

Mediideculturminimale..........................................................................................31Mediideculturcomplexe.........................................................................................33Mediidecultursolide...............................................................................................36

Mediiminimalesolide............................................................................................36Mediideculturcomplexesolide..........................................................................36

Agardeacoperire.......................................................................................................37Agardeconservareprinnepare...............................................................................38Antibioticeutilizatelapreparareamediilordecultur...............................................39

Cuprins VI

II.2CultivareaE.colipemediisolide........................................................................41nsmnarealasuprafaamediilordecultursolide................................................42nsmnareanprofunzimeamediilordecultursolide..........................................44

II.3CultivareaE.colinmediilichide........................................................................47Inoculareaicultivareafolosindvolumemicidemediu.............................................47Inoculareaicultivareafolosindvolumemaridemediu............................................48

II.4MonitorizareacreteriibacterieiE.coli nmediilelichide....................................48Determinareadensitiiopticecuajutorulspectrofotometrului...............................49Determinareadensitiiopticecuajutorulhemocitometrului...................................51DeterminareanumruluidebacteriiprincultivarenplciPetri...............................52

II.5PstrareaculturilordeE.coli.............................................................................54Pstrareaprincongelarela80oC................................................................................55

III.PLASMIDEITULPINIDEESCHERICHIACOLIUTILIZATEFRECVENTNBIOLOGIAMOLECULAR...............................................57III.1Vectoriplasmidialiutilizaifrecventningineriagenetic...................................59

Principalelecaracteristicialevectorilorplasmidialiutilizainingineriagenetic......61VectorulpUC19c....................................................................................................61VectorulpBlueScriptIISK(+/)...............................................................................62VectorulpET21a....................................................................................................62VectorulpMALc5x.................................................................................................62

III.2TulpinideEscherichiacoliutilizatefrecventningineriagenetic.......................63

IV.METODEITEHNICIFOLOSITEPENTRUIZOLAREAIPURIFICAREA ADNULUI...........................................................................73 IV.1IzolareaADNuluiplasmidial.............................................................................75

IzolareaADNuluiplasmidialfolosindmetodalizeialcaline........................................76IzolareaADNuluiplasmidialutilizndmetodalizeiprinfierbere...............................81

IV.2IzolareaADNuluigenomic................................................................................84IzolareaADNuluigenomicdinbacterii......................................................................85IzolareaADNuluigenomicdinplante........................................................................90IzolareaADNuluidinesuturianimale.......................................................................95

IV.3PurificareaADNuluidinsoluiiapoase...........................................................100

Cuprins VII

IV.4IzolareaADNuluidingelurideagaroz...........................................................103IV.5PstrareaADNuluipurificat...........................................................................107

V.AMPLIFICAREAENZIMATICINVITROAACIZILORNUCLEICI..................................................................................111 V.1AmplificareaenzimaticinvitroaADNului sau PCR .........................................113

AmplificareaenzimaticinvitroafragmentelordeADNdepnla4kb................116V.2Criteriipentrualegereaoligonucleotideloramors(primer)..............................126

VI.DETERMINAREACONCENTRAIEIACIZILORNUCLEICINSOLUIE........................................................................................................133 V.1DeterminareaconcentraieiacizilornucleiciprinspectroscopieUVVIS.............133

DeterminareaconcentraieiacizilornucleiciprinspectroscopieUV........................134V.2.Determinareaconcentraieiacizilornucleiciprinfluorimetrie..........................138

Determinareaconcentraieiacizilornucleicifolosindbromuradeetidiu.................139Determinareaconcentraieiacizilornucleici folosindmetodacufoliedinplastic....141DeterminareacantitiideADNpegelurideagaroz..............................................143

VII.SEPARAREAELECTROFORETICAADNULUI.........................147VII.1Electroforezaclasicngelurideagaroz.......................................................150VII.2.SeparareaADNprinelectroforezngeldepoliacrilamidcugradientdeagentdenaturant............................................................................................................157VII.3DeteciaADNuluingelurideagaroz...........................................................168

DeteciaADNuluifolosindbromuradeetidiu.........................................................169DeteciaADNuluingelurideagarozfolosindcoloranidetipSYBR.....................171DeteciaADNuluingelurideagarozfolosindalbastruldemetilen......................173

VIII.PURIFICAREAPROTEINELORPRINCROMATOGRAFIEDEAFINITATEFADEMETALE.................................................................177 VIII.1Strategiideclonareagenelornvectorideexpresie......................................181VIII.2Identificareacondiiiloroptimedesupraexpresieaproteinelorrecombinate.186

Cuprins VIII

VIII.3Purificareaprin IMACaproteinelorrecombinatencondiiinative................192VIII.4Purificareaprin IMACaproteinelorrecombinatencondiiidenaturante.......198VIII.5Determinareamaselormolecularenativeutilizndcromatografiadefiltrarepringel(GF)..................................................................................................................200

Determinareamaselormolecularenativeutilizndcromatografiadefiltrarepringel..................................................................................................................................206CalibrareacoloaneideGFicalculareamaselormolare..........................................208

IX.DETERMINAREACONCENTRAIEIPROTEINELOR..................215IX.1DeterminareaconcentraieiproteinelorprinspectroscopieUV........................216IX.2Metodecolorimetricededeterminareaconcentraieiproteinelor...................219

MetodaLowry...........................................................................................................219MetodaBradford ......................................................................................................224

MicrometodaBradforddedozareaconcentraieiproteinelor............................227Metodacuacidbicinchoninic(BCA).........................................................................229

MicrometodaBCAdedozareaproteinelor.........................................................231Macrometoda BCAdedozareaproteinelor........................................................232

IX.3Realizareacurbelordeetalonareiprelucrareadatelor...................................234

X.SEPARAREAELECTROFORETICAPROTEINELOR...................241X.1Electroforezanativaproteinelornsistemdiscontinuu...................................243X.2Electroforezaproteinelorncondiiidenaturante(SDSPAGE)...........................253X.3Deteciaproteinelorseparateprinelectroforezapegeluridepoliacrilamid.....257

Colorareagelurilordepoliacrilamidnvedereaevidenieriiproteinelor................257ColorareacuComassieBrilliantBlueR250.........................................................259Colorareacuargintagelurilordepoliacrilamid.................................................261

X.4Fotografiereagelurilorianalizaimaginilor.Stabilireamaseimolecularerelative.............................................................................................................................264

XI.EVIDENIEREAIMUNOLOGICAPROTEINELORTEHNICAWESTERNBLOT.........................................................................................273 XI.1Obinereaanticorpilorpoliclonali.Tehnicideimunizare..................................273

Cuprins IX

ObinereaanticorpilorpoliclonalifolosindadjuvantulFreund.................................275XI.2Imunoblotingul..............................................................................................278

Electrotransferulproteinelorpemembranensistemsemiuscat..........................279Imunodeteciaproteinelortransferatepemembranedenitroceluloz...................282

XII.METODECOMPUTAIONALEDESTUDIUAPROTEINELOR.285XII.1FiiereFASTAioperaiisimplecusecvene....................................................286XII.2Bazededatecuinformaiidespreproteine.....................................................290

Bazededatecusecveneproteice...........................................................................291Bazededatecustructuriproteice............................................................................294

XII.3IdentificareafuncieiproteinelornecunoscutecuajutorulprogramuluiBLAST 295XII.4Modelareacomputaionalastructuriitridimensionaleaproteinelor............308

Programe,servereimetaservere............................................................................311Aplicaiialemetodelordemodelareastructurilortridimensionaleaproteinelor..316

XII.5Modelareacomputaionalacomplecilorliganziproteine............................316Problematicaandocriimoleculare..........................................................................317Evaluarearezultatelorobinuteprinandocaremolecularcomputerizat..............324Aplicaiialeandocriimoleculare.............................................................................324

ANEX...........................................................................................................335

.

PREFA

Biologia molecular poate fi definit cel mai simplu ca fiind un concept de studiere a materiei vii prin prisma relaiei structur-funcie la nivel molecular. Este un concept ce a revoluionat tiinele biologice i medicale ncepnd cu a doua jumtate a secolului XX. Dar pe lng noile cunotine teoretice, revoluia produs de biologia molecular a fost posibil i datorit introducerii de noi metode i tehnici de laborator. Toate lucrrile experimentale de biologie molecular implic utilizarea unor astfel de metode i tehnici. De aici rezult i necesitatea unor cri care s-i ajute pe cercettori n munca zilnic la masa de laborator (bench). n Romnia nu cunosc s se fi scris o asemenea carte, care s descrie toate metodele i tehnicile de biologie molecular la modul practic de lucru.

Efortul tinerilor colegi Marius Mihan, Marius tefan i Zenovia Olteanu de a redacta o astfel de carte mi se pare de aceea deosebit de ludabil i rezultatul este o lucrare de mare valoare.

Merit subliniat c sunt descrise pe de o parte unele tehnici de baz n laboratorul de biologie molecular (dar i n laboratoarele de analize biomedicale, de biochimie i chimie clinic, de microbiologie, de biofizic etc), precum: pregtirea sticlriei i a vaselor de laborator, msurarea volumelor, a maselor, centrifugarea, tehnicile de baz folosite pentru manipularea microorganismelor, metodele de determinare a proteinelor, separarea electroforetic a proteinelor, tehnici de imunologie (obinerea de anticorpi policlonali, imunodetecia proteinelor transferate pe membrane de nitroceluloz) etc. Pe de alt parte sunt descrise metode specifice biologiei moleculare: plasmide i tulpini de Escherichia coli folosite frecvent n biologia molecular, izolarea ADN-ului, purificarea proteinelor prin cromatografie de afinitate, metode computaionale de studiu a proteinelor.

Descrierea metodelor i a tehnicilor este foarte bine fcut, de la principiile teoretice, avantajele i limitele, pn la descrierea concret a materialelor necesare i a modului de lucru.

n acest fel cartea este un valoros ghid pentru lucrul n laborator, att pentru nceptori (studeni, masteranzi, doctoranzi), ct i pentru avansai (cercettori postdoctorali, cadre didactice din nvmntul

Prefa XII

superior, tehnicieni de laborator cu experien) i trebuie s se afle pe masa de lucru din laborator (ori aproape de masa de lucru).

Fiind eu nsumi autor al unei cri pentru laboratoarele clinice (Ion Manta, Mircea Cucuianu, Gheorghe Benga, Adriana Hodrnu, Metode biochimice n laboratorul clinic, Editura Dacia, Cluj-Napoca, 1975) i al unui ndrumtor pentru lucrrile practice cu studenii (Gh. Benga -Ed.- ndrumtor pentru lucrrile practice de biologie celular i molecular, Editura Carpatica, Cluj-Napoca, 1997) mi dau bine seama de dificultatea scrierii unei astfel de cri i apreciez efortul foarte mare depus de autori.

Recomand clduros lucrarea scris de cei trei autori tuturor categoriile de cititori (i utilizatori) menionai mai sus, dar i celor care nu aplic sau nu vor aplica niciodat metodele i tehnicile de laborator ale biologiei moleculare, dar care vor s se orienteze n metodele i tehnicile laborator de biologie molecular, spre a nelege mai bine aplicaiile acesteia n tiinele medicale i biologice.

Cluj-Napoca, 12 noiembrie 2012

Prof. Univ. Dr. Dhc. Gheorghe Benga Membru corespondent al Academiei Romne

Membru Titular al Academiei de tiine Medicale din Romnia Medic specialist de Laborator Clinic, Chimist,

Medic primar de Genetic Medical, Laboratorul de Explorri Genetice I al Spitalului Clinic Judeean de Urgen Cluj-Napoca

Profesor Univ. Asociat, Disciplina de Biologie Celular i Molecular, Universitatea de Vest Vasile Goldi din Arad

Preedinte al Filialei Cluj a C.R.I.F.S.T. (Comitetul Romn pentru Istoria i Filosofia Stiinei i Tehnicii) al Academiei Romne

Honorary Associate, School of Molecular Biosciences, University of Sydney, Australia

Past-President, Societatea Romn de Medicin de Laborator Past-President, Balkan Federation of Clinical Laboratory

E-mail: [email protected]

INTRODUCERE

Dac biologia clasic s-a dezvoltat i a atins nivelul de cunoatere de astzi prin folosirea cu precdere a studiilor observaionale, biologia modern se bazeaz n mod fundamental pe noiunea de experiment i pe procesul de experimentare n scopul dobndirii de noi informaii i cunotine. Experimentul are rolul de a verifica validitatea unei ipoteze formulate n prealabil utiliznd pentru aceasta un ansamblu de tehnici i metode. Reuita unui experiment, adic formularea fr echivoc a unei concluzii legate de ipoteza de testat, depinde n mare msur de capacitatea cercettorului de a concepe un model de studiu, de a alege i de a utiliza n mod corect una sau mai multe metode de investigaie. Majoritatea lucrrilor de profil din ultima decad, care descriu metode i tehnici de laborator utilizate n biochimie, enzimologie, biologie celular i molecular, au fost realizate cu precdere n scopuri didactice, fiind utilizate ca suport pentru prelegerile teoretice. Metodele experimentale sunt reduse frecvent la un set de indicaii simple i clare pe care studenii s le poat urma cu uurin. Lipsa unor informaii generale despre principiile teoretice i aplicabilitatea metodelor dau ns o fals impresie de imuabilitate a protocoalelor experimentale, ceea ce face ca experimentatorul s fie pus deseori n dificultate atunci cnd trebuie s adapteze metoda n mod specific. n acest context, lucrarea de fa se dorete a fi un ghid detaliat al unor metode-cheie, utilizate frecvent n biologia molecular, concentrn-du-se nu numai pe simpla formulare a unor protocoale experimentale, ci i pe explicarea principiilor din spatele fiecrei metode n scopul precizrii spectrului de aplicabilitate i a rezultatelor scontate. Fiecare din metodele prezentate au fost testate i utilizate de ctre autori n cadrul Laboratorului de Biochimie i Biologie Molecular al Facultii de Biologie, Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Iai. Modul de prezentare este adaptat specificului fiecrei metode n parte, cuprinznd n general cinci seciuni distincte: 1. principiul metodei ofer informaii legate de bazele teoretice ale

metodei utilizate; 2. avantaje furnizeaz informaii legate de domeniul de aplica-

bilitate al metodei, rezultatele ateptate corelate cu date legate de sensibilitate, randament etc.;

Biologie molecular. Metode experimentale 2

3. limitri prezint condiiile n care metoda nu poate fi aplicat, dezavantajele sau inconvenientele sale n comparaie cu metode similare;

4. materiale necesare conine lista complet a reactivilor, materia-lelor, instrumentelor i aparaturii necesare, alturi de instruciuni legate de prepararea reactivilor i indicaii privind potenialele pericole care pot s apar n laborator;

5. mod de lucru ofer indicaii simple i precise privind suita de operaii care trebuie efectuate pentru obinerea rezultatelor finale.

Prin coninut i structur lucrarea se adreseaz cu precdere studenilor care frecventeaz studiile masterale i de doctorat, cercet-torilor post-doctorat, cadrelor didactice care coordoneaz lucrrile de disertaie i doctorat, tinerilor angajai n activitatea de cercetare, care fac primii pai n domeniul tiinelor vieii, precum i specialitilor din domenii conexe. Prin aspectele teoretice abordate, prezenta lucrare poate fi util i cercettorilor i tehnicienilor cu experien care au deprins i utilizeaz aceste protocoale de ani buni, dar care nu au acordat suficient importan cunotinelor teoretice care fundamenteaz metodele respective. Puini vor fi cei care vor parcurge aceast lucrare de la un capt la altul, dar sperm c o vom regsi pe masa de lucru a ct mai multor cercettori, funcionnd ca un ghid pentru selecia, dezvoltarea i adaptarea protocoalelor experimenta e la nevoile specifice ale experimentatorului.

Mesajul final pe care aceast lucrare dorete s l transmit este c reproducerea n detaliu a fiecrei etape a unui protocol nu este suficient pentru utilizarea cu succes a acestuia. Este mai important poate de cunoscut cum funcioneaz, n ce condiii se poate utiliza, ce informaii poate i ce informaii nu poate s ofere o anumit metod, precum i care sunt parametrii critici de care trebuie s se in cont la utilizarea unei tehnici experimentale.

Mulumim anticipat celor care vor transmite sugestii, observaii i recomandri care s conduc la completarea acestei lucrri n scopul mbuntiri unei viitoare ediii.

Autorii

l

Textul complet este disponibil in format electronic gratuit. Nu ezitati sa macontactati in aceasta directie prin e-mail la adresa:

[email protected]

ANEX

TABEL A1. Multipli i submultipli ai unitilor de msur Prefix Factor de multiplicare Abreviere

Atto 10-18 a Femto 10-15 f Pico 10-12 p Nano 10-9 n Micro 10-6 Mili 10-3 m Centi 10-2 c Deci 10-1 d Deca 10 da Hecto 102 h Kilo 103 k Myria 104 my Mega 106 M Giga 109 G Tera 1012 T Peta 1015 P Exa 1018 E


TABEL A2. Tabel de conversie a celor mai utilizate uniti de volum Pentru a converti: n: se multiplic cu: Centimetri cubi (cm3) Microlitri (l) 103 Mililitri (ml) 1 Litri (l) 10-3 Galoane (US) 2.641 x 10-4 Metri cubi (m3) 10-6 Picioare cubice (cubic feet,

ft3) 3,531 x 10-5

Inchi cubici (cubic inches (in.3)

6,102 x 10-2

Litri (L) Microlitri (l) 106 Mililitri (ml) 103 Galoane (US) 0,2642 Centimetri cubi (cm3) 103 Metri cubi (m3) 10-3 Picioare cubice (engl.cubic

feet, ft3) 3,531 x 10-2

Inchi cubici (engl.cubic inches (in.3)

61.02

Mililitri (ml) Litri (l) 10-3 Microlitri (l) 103 Microlitri (l) Mililitri (ml) 10-3 Litri (l) 10-6

Anex

337

TABEL A3. Tabel de conversie a celor mai utilizate uniti de msur Pentru a converti din: n: se multiplic cu: Concentraia Miligrame per litru (mg/l) Pri pe milion (ppm) 1 Distana Centimetri (cm) Picioare (engl. feet, ft) 3,281 x 10-2 Inchi (in.) 0,39 Metri (m) 10-2 Milimetri (mm) 10 Yarzi (yd) 1,094 x 10-2 Inchi (in) Centimetri (cm) 2,54 Picioare (engl. feet, ft) 8,333 x 10-2 Metri (m) 2,540 x 10-2 Milimetri (mm) 25,4 Yarzi (yd) 2,778 x 10-2 Milimetri (mm) Centimetri (cm) 0,1 Picioare (engl. feet, ft) 3,281 x 10-3 Inchi (in.) 3,937 x 10-2 Metri (m) 10-3 Angstromi () Nanometri (nm) 0,1

Metri (m) 10-10 Picometri (pm) 100 Curentul i sarcina electric

Amperi pe centimetru ptrat (A/cm2)

Amperi pe inci ptrai (A/in2)

6,45

Amperi pe metru patrat (A/m2)

104


Pentru a converti din: n: se multiplic cu: Amperi pe inci ptrai (A/in2)

Amperi pe centimetru ptrat (A/cm2)

0,16

Amperi pe metru patrat (A/m2)

1,55 x 103

Amperi or (A-hr) Coulombi (C) 3,6 x 103 Faraday (F) 3,731 x 10-2 Coulombi (C) Faraday (F) 1,036 x 10-5 Coulombi pe centimetru ptrat (C/cm2)

Coulombi pe inci ptrat (C/in2)

64,52

Coulombi pe metru patrat (C/m2)

104

Coulombi pe inci ptrat (C/in2)

pe centimetru ptrat (C/cm2)

0,16

pe metru patrat (C/m2)

1,55 x 103

Faraday (F) Amperi-or (A-hr) 26.,8 (C) 9,649 x 10-4 Presiunea Atmosfere (atm) Bari 1,01 Milimetri coloana de Hg

(mmHg) sau torri 760

Bari (bar) Atmosfere (atm) 0,99 Kilograme pe metru

ptrat (kg/m2) 1,020 x 104

psi 14,5 Milimetri coloana de Hg (mmHg) sau torri

Atmosfere (atm) 1,316 x 10-3

Kilograme pe metru ptrat (kg/m2)

136

Coulombi

Coulombi

Coulombi

Anex

339

Pentru a converti din: n: se multiplic cu: Pascali (P) Newtoni pe metru ptrat

(N/m2) 1

Rezistena electric Ohmi () Megaohmi (M) 106 Microhmi () 10-6 Timp Zile Ore (hr) 24 Minute (min) 1,44 x 103 Secunde (sec) 8,64 x 104 Temperatura Grade Kelvin (K) Grade Celsius (oC) K-273,13 Grade Fahrenheit (oF) [(K 273,13)

95] + 32 Grade Celsius (oC) Grade Kelvin (oK) OC + 273,13 Grade Fahrenheit (oF) 1,8 x oC + 32 Grade Fahrenheit (oF) Grade Celsius (oC) (F -32)/1,8

Viteza Centimetri pe secund (cm/s)

Picioare pe minut (ft/min)

1,2

Picioare pe secund (ft/sec)

3,281 x 10-2

Kilometri pe or (km/hr) 3,6 x 10-2 Metri pe minut (m/min) 0,6 Mile pe ora (miles/hr) 2,237 x 10-2 Mile pe minut

(miles/min) 3,728 x 10-4


TABEL A4. Date generale privind concentraia aproximativ a diverilor constitueni intracelulari dup Ausubel et al., 2002 (1)

Macromolecule (proteine, acizi nucleici, poliglucide) 22% (w/w) Molecule mici Ap 70% (w/w) Monoglucide 3% (w/w) Lipide 2% (w/w) Aminoacizi liberi 0,4% (w/w) Nucleotide 0,4% (w/w) Ioni anorganici 1% (w/w) Na+ 5-15 mM K+ 140 mM Mg2+ 30 mM Ca2+ 1-2 mM Cl- 4 mM pH 7,4

Anex

341

TABEL A5. Factori de conversie utilizai frecvent n studiul proteinelor i acizilor nucleici

Masa molar medie a unei perechi de baze = 649 Da 1 kb de ADN codifica 333 amino-acizi, adic 36.000 Da 1 fragment de 1 kB este echivalentul a 6,5 x 105 Da ADN dublu catenar, 3,3 x 105 Da ADN mono catenar sau 3,4 x 105 Da ARN monocatenar 1 g/ml ADN conine 3,08 M fosfat 1 g/ml ADN cu dimensiunea de 1 kb conine 3,08 nM capete 5 1mol pBR322 (4363 bp) este echivalent a 2,83 g Masa molar medie a unui aminoacid = 110 Da 10 kDa dintr-o protein conine 91 aminoacizi i este codificat de 273 nucleotide


TABEL A6. Modul de notare prescurtat a nucleotidelor Prescurtare NucleotidA Adenin C Citozin G Guanin T Timin U Uracil M Adenin sau Citozin R Adenin sau Guanin S Citozin sau Guanin Y Citozin sau Timin K Guanin sau Timin V Adenin, Citozin sau Guanin (oricare, exceptnd

Timina) H Adenin, Citozin sau Timin (oricare, exceptnd

Guanina) D Adenin, Guanin sau Timin (oricare, exceptnd

Citozina) B Citozin, Guanin sau Timin (oricare, exceptnd

Adenina) N Oricare din cele cinci nucleotide

TABE

L A7.

Princ

ipalel

e pro

priet

i fiz

ico-ch

imice

ale a

mino

acizi

lor

Am

inoa

cid

Pres

curt

area

cu

trei

lite

re

Pres

curt

area

cu

o lit

er

Mas

mol

ar

(g/m

ol)

Ari

a su

praf

eei

acce

sibi

lea

Hid

ro-

fobi

cita

teb

Mut

abili

tate

re

lativ

c

Ala

nin

Ala

A

89

.1

115

-0.4

10

0 A

rgin

in

Arg

R

17

4.2

225

-0.5

9 65

A

spar

agin

Asn

N

13

2.1

160

-0.9

2 13

4 A

cid

aspa

rtic

Asp

D

13

3.1

150

-1.3

1 10

6 C

iste

in

Cys

C

12

1.2

135

0.17

20

G

luta

mat

G

lu

E 14

7.1

190

-1.2

2 10

2 G

luta

min

Gln

Q

14

6.2

180

-0.9

1 93

G

licin

Gly

G

75

.1

75

-0.6

7 49

H

istid

in

His

H

15

5.2

195

-0.6

4 66

Is

oleu

cin

Ile

I 13

1.2

175

1.25

96

Le

ucin

Leu

L 13

1.2

170

1.22

40

Li

zin

Lys

K

146.

2 20

0 -0

.67

56

Met

ioni

n M

et

M

149.

2 18

5 1.

02

94

Anex 343

Am

inoa

cid

Pres

curt

area

cu

trei

lite

re

Pres

curt

area

cu

o lit

er

Mas

mol

ar

(g/m

ol)

Ari

a su

praf

eei

acce

sibi

lea

Hid

ro-

fobi

cita

teb

Mut

abili

tate

re

lativ

c

Feni

lala

nin

Phe

F 16

5.2

210

1.92

41

Pr

olin

Pro

P 11

5.1

145

-0.4

9 56

Se

rin

Ser

S 10

5.1

115

-0.5

5 12

0 Tr

eoni

n Th

r T

119.

1 14

0 -0

.28

97

Trip

tofa

n Tr

p W

20

4.2

255

0.5

18

Tiro

zin

Tyr

Y

181.

2 23

0 1.

67

41

Valin

Va

l V

11

7.1

155

0.91

74

a A

ria su

praf

eei a

cces

ibile

est

e ex

prim

at n

2 i

est

e ca

lcul

at p

entru

fiec

are

amin

oaci

d ca

par

te a

unu

i sch

elet

pol

ipep

tidic

(2)

b H

idro

fobi

cita

tea

este

exp

rimat n

uni

ti a

rbitr

are

folo

sind

scal

a O

MH

des

cris

a de

Sw

eet i

Eis

enbe

rg (1

983)

(3)

c Mut

abili

tate

a re

lativ

est

e ex

prim

at n

unit

i arb

itrar

e (al

anin

a fiin

d al

eas

ca re

ferin

) i

repr

ezin

t pro

babi

litat

ea c

a un

am

inoa

cid

s su

fere

o m

utai

e n

tr-un

tim

p da

t (4)


TABE

L A8.

Comp

atibil

itate

chim

ic a d

iverse

lor tip

uri d

e mate

riale

plasti

ce ut

ilizate

n la

bora

tor:

A

BS

Ace

tal

CPV

C

LD

PEPC

PE

EK

PP

PT

FE

PVC

PV

DF

Slov

eni o

rgan

ici

Ace

ton

D

A

D

B

D

A

A

A

D

D

Acr

iloni

tril

D

N/A

A

A

D

A

A

A

B

A

Ben

zen

D

A

D

C

D

A

D

A

C

A

Clo

rofo

rm

D

A

D

C

D

A

C

A

D

A

Dic

lorb

enze

n D

N

/A

D

N/A

D

A

C

A

D

A

Hex

an

D

A

B

D

D

A

B

A

B

A

Nitr

oben

zen

D

C

D

C

D

A

B

A

D

A

Feno

l D

D

B

D

D

D

B

A

D

A

Tolu

en

D

C

D

C

D

A

C

A

D

A

Dic

lore

tan

D

A

D

C

D

A

D

A

D

A

Alc

ooli

Alc

ool a

mili

c A

A

A

B

B

A

B

A

A

D

Alc

ool b

enzi

lic

D

A

A

D

N/A

A

A

A

D

A

Alc

ool i

zopr

opilc

N

/A

A

C

A

A

A

A

A

A

N/A

Etan

ol

B

A

B

B

B

A

A

A

C

N/A

Met

anol

D

A

A

A

B

A

A

A

A

A

Anex 345

A

BS

Ace

tal

CPV

C

LD

PEPC

PE

EK

PP

PT

FE

PVC

PV

DF

Aci

zi

Aci

d ac

etic

gla

cial

D

D

B

A

B

A

B

A

D

C

Aqu

a R

egia

(HC

l 80%

, HN

O3

20%

)D

D

C

B

D

D

B

A

C

A

Aci

d ci

tric

D

B

B

D

A

A

A

A

B

A

Aci

d fo

rmic

D

A

A

D

A

C

A

A

A

A

HF

pn

la 7

5%

C

D

C

C

D

D

C

A

C

A

HC

l 37%

A

C

A

B

D

A

C

A

B

A

H2S

O4 1

0-75

%

B

D

A

A

B

D

A

A

A

A

H2S

O4 9

8%

N/A

N

/A

C

C

N/A

D

A

A

D

A

Aci

d tri

clor

acet

ic, T

CA

N

/A

N/A

N

/A

A

D

N/A

A

A

B

B

HN

O3 p

n la

50%

C

D

B

B

B

D

B

A

B

A

HN

O3

D

D

D

C

C

D

D

A

B

A

H3P

O4 m

ai c

once

ntra

t de

40%

) D

D

A

B

A

A

A

A

B

B

Baze

Am

onia

c D

D

A

B

D

A

A

A

A

A

Mg(

OH

) 2 B

A

A

A

A

A

A

A

A

A

KO

H

A

A

A

A

D

A

A

A

A

A


A

BS

Ace

tal

CPV

C

LD

PEPC

PE

EK

PP

PT

FE

PVC

PV

DF

NaO

H p

n la

80%

A

D

A

D

D

A

A

A

A

A

Alte

le

Ace

tald

ehid

D

A

D

C

C

A

A

A

D

D

Det

erge

ni

B

A

A

D

A

A

A

A

A

A

Form

alde

hid

B

A

A

B

A

A

C

A

A

A

H2O

2 A

D

A

C

A

A

B

A

A

A

Iod

D

D

D

A

N/A

C

C

A

A

A

AgN

O3

B

A

A

A

A

A

A

A

A

A

Ure

e B

A

A

A

D

A

A

A

D

A

NaO

Cl p

n la

20%

A

D

A

A

C

B

A

A

A

A

A =

com

patib

ilita

te e

xcel

ent,

B =

com

patib

ilita

te b

un, e

fect

e m

ici

o uoa

r de

colo

rare

sau

coro

ziun

e, C

= c

ompa

tibili

tate

rela

tiv

bun,

efe

cte

mai

pro

nuna

te, n

u se

reco

man

d pe

ntru

util

izar

ea c

ontin

u; p

ot a

prea

feno

men

e de

nm

uier

e sa

u um

flare

, D =

efe

cte

seve

re, n

u se

reco

man

d ut

iliza

rea,

N/A

= n

u ex

ist i

nfor

maii

des

pre

com

patib

ilita

te

Anex 347


FIGURA A1. Nomogram pentru conversia forei centrifuge (g) n vitez de rotaie (rpm).

Pentru a identifica pe nomogram o valoare necunoscut se traseaz o dreapt descris de dou puncte de pe celelalte dou coloane. Valoarea dorit se citete la intersecia dreptei cu coloana de interes. Pentru centrifugri la viteze mai mari se folosete nomograma din figura A2. Pentru valori precise, se utilizeaz ecuaia prezentat n subcapitolul dedicat centrifugarii, pagina 15.

Anex

349

FIGURA A2. Nomogram pentru conversia forei centrifuge (g) n vitez de rotaie (rpm).

Pentru a identifica o valoare necunoscut folosind nomograma reprezentat n figura se traseaz o dreapt descris de dou puncte de pe celelalte dou coloane. Valoarea dorit se citete la intersecia dreptei cu coloana de interes. Pentru valori precise, se utilizeaz ecuaia prezentat n n subcapitolul dedicat centrifugarii, pagina 15


FIGURA A3. Harta situs-urilor de restricie a plasmidului pUC19c A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; lacZ fragmentul Nterminal al genei ce codific galactozidaza din calea metabolic a lactozei; Ori originea de replicare provenind din plasmidul pMB1; bla(AmpR) confer rezisten la ampicilin) B. Secvena n zona MCS

B

A

Anex

351

FIGURA A4. Harta situs-urilor de restricie a plasmidului pBluescript II SK A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; f1 ori originea de replicare provenind din fag; lacZ fragmentul Nterminal al genei ce codific galactozidaza din calea de metabolic a lactozei; Plac promotorul sub controlul cruia este pus gena clonat; pUC ori originea de replicare provenind de la plasmidul pUC; bla(ApmR) gena ce confer rezisten la ampicilin) B. Secvena n zona MCS.

.

B

A


FIGURA A5. Harta situs-urilor de restricie a plasmidelor pET21a; A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; f1 ori originea de replicare provenind din fag lacZ fragmentul Nterminal al genei ce codific galactozidaza din calea metabolic a lactozei; face posibil selecia alb/albastr prin complementare alfa pe plci cu Xgal; ori originea de replicare provenind de la plasmidul pUC; lacI represorul din operonul lac cu rol n controlul expresiei genei clonate; bla(ApmR) gena ce confer rezisten la ampicilin) B. Secvena n zona MCS.

B

A

Anex

353

FIGURA A6. Harta situs-urilor de restricie a plasmidului pMAL-c5X A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; bla(ApmR) gena ce confer rezisten la ampicilin; ori originea de replicare provenind de la plasmidul pBlueScript; lacIq represorul din operonul lac cu rol n controlul expresiei genei clonate; P tac promotorul sub controlul cruia este pus gena clonat; malE maltose binding protein, proteina cu afinitate pentru maltoz din E.coli, rrnBT1T2 zona de semnalizare a sfritului transcripiei B. Secvena n zona MCS.

B

A

Bibliografie pentru Anexa

Bibliography

1. Ausubel, M. F., Brent, R., Kingston, E. R., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, A. J., Struhl, K.(2002) Short Protocols in Molecular Biology, p A2-1,. John Wiley & Sons Inc.

2. Chothia, C. (1976) The nature of the accessible and buried surfaces in proteins, Journal ofMolecular Biology, 105, 1-12.

3. Sweet, R. M., Eisenberg, D. (1983) Correlation of sequence hydrophobicities measuressimilarity in three-dimensional protein structure, Journal of Molecular Biology , 171, 479-88.

4. Dayhoff, M., Schwartz, R., Orcutt, B. (1978) A model of evolutionary change in proteins, Atlasof Protein Sequence and Structure, 5, 345-352.

Date post:	09-Jan-2016
Category:	Documents
Upload:	anisoara-nastas
View:	45 times
Download:	0 times

Biologie Moleculară

Documents