5. Cataliza biochimic · Structura I ~ Structura T# Stabilizarea T# Lizozimul Carboxanioni...

transcript

5. Cataliza biochimică

Enzimele - situsuri de legare Substrat

Reactiile enzimatice Intermediari covalenti

cbc.arizona.edu

Formarea unui intermediar covalent acil

5.1. Interacțiunea enzimă-substrat

https://chem.libretexts.org/

Interactiunile

enzima-substratgrupari

bazice

nucleofile

ARNaza pancreatica bovina

www.namrata.co

E. Fischer-1894

Specificitatea enzimelor

D. Koshland-1958

Enzimeleproteine

specifice

Complementaritate parteneri

Stabilizarea starii de tranzitie??

Enzimelestructuri

flexibile

Modificarea conformatiei situs activ

Situs flexibil

Modelul de inducere a conformatiei

www.quora.com

iws.collin.edu

Modificarea conformatiei situsului activ

In prezenta substratului

Distorsionarea legaturilor chimice

ale substratului

energie mai mica

(clivarea substratului)

Matsunaga Y, Fujisaki H, Terada T, Furuta T, Moritsugu K, et al. (2012)

Minimum Free Energy Path of Ligand-Induced Transition in Adenylate Kinase.

PLOS Computational Biology 8(6): e1002555

Sol M. Resnick, and Alexander J. B. Zehnder Appl. Environ. Microbiol.

2000;66:2045-2051

5.2. Teoria starii de tranzitie

[X‡] = [X] -G‡

expconcentrația speciei

în starea de tranziție

research.cm.utexas.edu

= [X‡] = [X] -G‡

k1 =-G‡

k1 =S‡

exp-H‡

Rata de descompunere a speciei X

Constanta vitezei de reacție de ordinul I

Starea de tranzitie

maxim energetic

Intermediarii

Energii mai mici

Leg chimice formate

Starea de tranzitie a E. coli tARN-Adenozine Deaminazeihttp://pubs.acs.org/JACSbeta/

5.2 Postulatul lui Hammond

Reactia in etape: A I P

I -intermediar instabil

Structura I ~ Structura T#

Stabilizarea T#

Lizozimul

Carboxanioni

intermediari ~ T#

Protein structure and Function, Petsko &

Ringe, 2004

http://www.chemguide.co.uk/

5.3. Energia de activare

Enzimele reduc Ea a reactie

http://www.mtchs.org/BIO/

Constanta vitezei (k1)

ΔΔG҂ = 5,71 KJ/Mol

½ ΔG legatura de H

Constanta vitezei (k1) 6x

ΔΔG҂ = 34 KJ/Mol

1/10 ΔG C-C

ΔΔG҂ = Eanecat - Eacat

http://i.stack.imgur.com/KQSgM.jpg

Cataliza bazicaCataliza acida

Stabilizarea starii de tranzitie

Catena laterala

aminoaciziaspartat, glutamat, tirozina

histidina si lizina

Stari de tranzitie nefavorabile

Transfer proton

(baza)

Transfer proton

(acid)

5.4. Stabilizarea stării de tranziție

Carboxipeptidazele

Anhidraza carbonica

Structura situsului activ al

Carboxipeptidazei Ahttp://www.open.edu/openlearn/

Cataliza electrofilă

Stabilizarea starii

de tranzitie

Endonucleaza G

Arg 110 si Mg2+

Wu SL et al.

J. Biomed. Sci., 2009

Implicata in procesele

de proliferare celulara

(inclusiv apoptoza)

Proteina AIF și endonucleaza G

sunt eliberate din mitocondrie si

provoaca degradarea ADN-ului

http://www.protein.bio.msu.ru/

Cataliza electrofilă

Gruparea –OH a serinei

Cataliza nucleofila

În enzime- grupări nucleofile (în cataliză):

Serin proteaze

Colinesteraze

www.atsdr.cdc.gov

Cataliza nucleofila

Leucocitesteraza (LE)

http://slideplayer.com/slide/4366028/

existența unei infecții urinare

pH, conc. Proteinei, NO2-

https://drugsdetails.com

Indoxil + Sare diazoniu → azoderivat (violet)

Esterul ac. Indolcarboxylic → Indoxil + AcidLE

Limita de detecție 10-25 Leu/µl

Lipaze (situs activ)www.thermofisher.com

Fosfataza acida (E coli)

www.scielo.br

Cataliza nucleofila

Thomas, Shafee, (2014). "Evolvability of a viral protease: experimental evolution of catalysis, robustness and specificity". PhD Thesis. University of Cambridge.

Cataliza nucleofilă

Triada catalitică

gruparea -OH tirozinica

Topoisomerase IB situs activ

(PDB 1A36)

helicase.pbworks.com

Cataliza nucleofila

topoizomeraze

glutamin sintetaza

Cataliza nucleofila

Spodenkiewicz, M. et al,

Biology 2016, 5(4), 40

Homodecamer

2 x pentamer

glutamin sintetaza – deficiență

Cataliza nucleofila

Reprezentarea schematică a fiziopatologiei deficientei GS: scăderea

detoxifierii NH3 și împiedicarea reaprovizionării ciclului Gln-Glu-GABA

Spodenkiewicz, M. et al, Biology 2016, 5(4), 40

Glutamat-cistein ligaza

(γ-glutamilcistein sintetaza, EC 6.3.2.2)

William B. Musgrave et al.

Biochem. J. 2013;450:63-72

Cataliza nucleofila

Biosinteza glutationului

Almuafri, F., et al.,

Blood Cells, Molecules and Diseases

2017;65:73-77

Anemie hemolitică moderată – 3 surori

Gruparea -SH a cisteinei - tiol proteaze

papaina

ficina

Papaina situs activ

www.cambridgemedchemconsulting.com

Cataliza nucleofila

Yao, Q. et al., PNAS,

2009. 106 (10) 3716-3721

tiol proteaze (bromelaina)

gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza

www.studyblue.com

Influenta bromelainei asupra unor mediatori

care intervin in inflamatia acuta

Srivastava, AK et al.,

Braz. Arch. Biol. Technol., 59, 2016

Cataliza nucleofila

•imidazolul din histidina

cresterea nucleofilicitatii gruparilor -OH si -SH

Cataliza nucleofila

Freeman and co,

Biochemistry, 2007

Ash, E. L., et al., H-bond: Proposal for

reaction-driven ring flip mechanism in serine

protease catalysis, PNAS, 2000, 97(19)

10371-10376

Cataliza nucleofila

• imidazolul din histidina

transferul grupei fosfat

Fosfoglicerat mutaza

Enzimă glicolitică

2,3-BPG ↑ eritrocite

Controlul afinității

gruparea –NH2 (lizinica) - cataliza acetoacetat decarboxilazei

Highbarger, L.A. and Gerlt, J.A,

Biochemistry, 35, 41-46, 2016

Gerlt, J.A. Nature Chemical Biology5, 454 – 455, 2009

Cataliza covalentă

gruparea –NH2 (lizinica) - cataliza acetoacetat decarboxilazei

Cataliza covalentă

Dovedirea intermediarului catalitic

gruparea –NH2 (lizinică) - cataliza transladolazei;

Transaldolaza situs activ

www.nature.com

chemwiki.ucdavis.edu

Cataliza covalentă

Cataliza electrofilă în cazul piridoxal fosfatului

Richard, J.P. et al.,

Current Opinion in Chemical Biology,

13(4), 2009, 475-483

Situs catalitic DAAtransferazeiBacillus sp. YM-1

https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/m-

csa/entry/66/

PLPY31K145

L201E177

• gruparea carboxilica (aspartat) - ATPaze (K+/Na+, Ca2+).

Cataliza nucleofila

www.rpi.edu

Structura Na,K-ATPazei cu ouabainahttps://www.researchgate.net/

Reactia: R1 R2 P

Etape determinanta

de viteza

Cinetica starii stationare

Starea stationara Sistemele dinamice

Rata formare = rata distrugere

Populatia tarii

Sisteme biochimice

metabolit

celula

X formare Ydegradare

vformare = vdegradare

Stare stationara

Intelegere metabolism

Stare prestationara

Analiza mecanisme

de reactie

Ecuatia Michaelis-Menten

Complex enzima-

substrat

Leonor Michaelis (1913)

[E] = constant rata de reactie

creste cu cresterea [S] pana

cand viteza maxima, Vmax,

este atinsa

v =[E]0[S]kcat

Km + [S]

E + S ES P + EKS kcat

Experimentele starii de ne-echilibru

[S][P]

Masurarea activitatii

¥ Discontinuu

- indepartarea probei la

intervale de timp

- analiza chimica

¥ Continuu

Modificarea absorbtiei

cromoforului (S sau P)

Reducerea NAD 340 nm

Absenta cromofor Reactii

cuplate

Hexokinaza catalizeaza reactia

–glucoza + ATP glucoz-6-fosfat + ADP

Cuplata cu reactia

- glucoz-6-fosfat (G-6-P) dehidrogenaza:

G-6-P + NADox 6-fosfogluconat + NADred

[NADred] cresterea DO340

Masurarea activitatii

KS =[E][S]

E + S ES P + EKS kcat

v = kcat [ES]

[E] = [E]0 - [ES] [ES] =[E]0[S]

KS + [S]

v =[E]0[S]kcat

Km + [S]

Reactia enzimei cu un singur substrat

E + S ES P + Ek1

Michaelis-Menten - premiza: ES E + S k2 << k-1

G. E. Briggs 1925

J. B. S. Haldane[ES] cinetica stationara

k2 ~ k-1

d[ES]/dt = 0 = k1[E][S] - k2[ES] - k-1[ES]

v =[E]0[S]k2

[S] + (k2 + k-1)/k1

(k2 + k-1)/k1 = Km

Cinetica reactiilor enzimatice -teoria starii stationare

Km = Ksk2 << k-1

v =[E]0[S]kcat

Km + [S]

[S] < < Km

v =kcat

[E]0[S]

a) Enzima libera + substrat

[S] = Km

v =kcat

b) Enzima saturata 50% cu substratul

[S] >> Km

v =kcat [E]0

c) Enzima saturata cu substratul

5. Cataliza biochimic · Structura I ~ Structura T# Stabilizarea T# Lizozimul Carboxanioni...

Documents