1
RAPORTARE ȘTIINȚIFICĂ
RAPORTUL ȘTIINȚIFIC ȘI TEHNIC (RST)
ETAPA DE EXECUȚIE NR. 4
Elaborarea unui ghid metodologic de autentificare pentru certificarea branzeturilor
traditionale in vederea valorificarii pe piata unica. Testarea componentelor integrate,
validarea functionala a platformei web si a exploatarii in mediul real
Proiect PCCA nr. 153/2014
Director proiect: Conf. dr. Dan Sorin Daniel
2
CUPRINS
1. Obiectivele fazei de execuţie .......................................................................................... 3
2. Rezumatul fazei .............................................................................................................. 3
3. Descrierea ştiinţifică şi tehnică ...................................................................................... 4
3.1. Dezvoltarea, testarea protocolului PCR pentru autentificarea produsului finit ....... 4
3.2. Construirea hărţii izotopice a brânzeturilor autentice din zona Transilvaniei ............ 9
3.3. Testarea/validarea componentelor integrate. Validarea functionala a platformei web
si a exploatarii in mediul real ........................................................................................... 11
3.3.1. Modificari in baza de date .................................................................................. 11
3.3.2. Introducerea valorilor masurate ......................................................................... 13
3.3.3. Modificari de functionalitate .............................................................................. 14
3.3.4. Prezentarea datelor ............................................................................................. 16
3.4.5. Testarea functionarii Portalului .......................................................................... 19
3.4. Ghid metodologic de autentificare a brânzeturilor tradiţionale ................................ 20
3.5. Diseminarea rezultatelor ........................................................................................... 20
4. Concluzii ...................................................................................................................... 20
3
1. Obiectivele fazei de execuţie
1. Dezvoltarea, testarea protocolului PCR pentru autentificarea produsului finit.
2. Construirea hartii izotopice a branzeturilor autentice din zona Transilvaniei
3. Testarea/validarea componentelor integrate. Validarea functionala a platformei web
si a exploatarii in mediul real
4. Elaborarea ghidului metodologic de autentificare a produselor traditionale
5. Diseminarea rezultatelor
2. Rezumatul fazei
În vederea identificării originii brânzeturilor tradiţionale, folosind metode moleculare
de analiză s-au prelevat 44 probe recoltate în intervalul februarie-iulie 2017 de la exploataţiile
de taurine şi ovine luate în studiu. Frecvenţa de apariţie a falsurilor la producătorii de brânzeturi
declarate din lapte de oaie a fost foarte ridicatǎ (67%), 16 din probele de produse lactate pozitive
la ADN de vacă şi achiziţionate de pe piaţǎ fiind în concentraţii mai crescute de 10%, cea mai
crescută falsificare fiind înregistrată în cazul brânzei telemea produsă de către producătorii din
zona de şes. Acest procent este îngrijorǎtor, având în vedere faptul cǎ diversitatea şi numǎrul
producǎtorilor este mult mai scăzut decat în cazul produselor lactate de vacă.
Diferentierea probelor de branza (telemea si cas) in functie de originea geografica (zona
de provenienta - cele 3 zone: Zona A – montană, Zona B – deal, zona C - şes) are ca cei mai
buni markeri: Rb, K, Li, δ13C cazeina, Mg, W si Sr. Cei mai buni markeri in acest caz au fost:
Li, δ13C cazeina, Ti, K, Tl, Rb, Cu, B, Mg, Na, As, Er, Sm, W, Dy si Sn. Diferentierea probelor
de telemea in functie de producator a relevant că cei mai buni predictori obtinuti au fost: Be,
Co, Sr, P, As, Mn, Eu, Dy, Ag, K, Tb, Te, Sm, Ca, Ru si Cd. Valoarea izotopica 13C din probele
“bulk” de lapte de vaca si oaie a fost mai scazuta decat cea din cazeina, ca si consencinta a
fractionarii izotopice aparute in timpul sintezei lipidelor in plante si animale, cazeina
necontinand lipide In general, s-au obtinut diferente izotopice mai mari intre probele de telemea
si cazeina extrasa din aceste probe, fata de cele de cas si cazeina aferenta. Aceste diferente ar
putea fi explicate prin continutul diferit de grasimi pe cale le contin aceste produse lactate, casul
avand un continut mai ridicat de grasime decat telemeaua.
Prin platforma web, realizata in cadrul proiectului, s-a realizat culegerea datelor
necesare identificarii originii produselor obtinute in cele trei zone de analiza (documente
asociate prelevarii probelor din zonele de analizat, buletine de analiza cu rezultatele masurate,
matrice de parametri, etc). De asemenea, platforma web realizeaza vizualizarea datelor in
diferite moduri: tabelar, grafice, diagrame sau harti cu distributia geografica a parametrilor si
demontreaza totodata posibilitatea trasabilitatii parcursului si a responsabilitatilor pentru
actiunile asociate cu probele prelevate, analizate si publicate.
4
3. Descrierea ştiinţifică şi tehnică
3.1. Dezvoltarea, testarea protocolului PCR pentru autentificarea produsului finit
S-au prelevat 36 probe în intervalul februarie-iulie 2017 de la exploataţiile de taurine şi
ovine luate în studiu (zona montană A: 4 probe telemea vacă; 4 probe caş vacă, 4 probe caş
oaie; 4 probe telemea oaie; zona deal B: 4 probe caş vacă; 4 probe telemea vacă; zona şes C: 4
probe telemea vacă; 4 probe caş vacă; 4 probe telemea oaie; 4 probe caş oaie). În vederea
identificării speciei furnizoare de lapte şi implicit a fraudelor în cazul produselor finite, au fost
supuse testării toate probele de caş şi telemea de oaie şi doar o parte din probele de brânză
provenite de la taurine. În vederea interpretării corecte a rezultatelor s-au utilizat probe de
referinţă de brânză de vacă şi oaie.
Protocolul de autentificare a speciei în cadrul produselor lactate dezvoltat şi optimizat
cu succes în etapă 3-a, a făcut posibilă cuantificarea ADN-ului de amestec pe baza etalonului
creat şi a tehnicii de amplificare descrise în cele ce urmează: extracţia ADN-ului s-a realizat cu
ajutorul unui kit de extracţie Genomic Isolate II (Bioline), special creat pentru extracţia din
ţesuturi. Nefiind specific pentru produsele alimentare, iar brânzeturile fiind o categorie aparte
datorită temperaturilor ridicate din timpul procesării, acesta a fost testat în premieră şi pe acest
tip de produse. Prima etapă a constat în cântărirea a 0,025g din fiecare probă şi plasarea în
tuburi individuale Eppendorff de 1,5ml; Proteinaza K s-a reconstituit mai apoi după
instrucţiunile din kit-ul ISOLATE II Genomic DNA Kit: 180μl soluţie Buffer + 25μl proteinaza
K pentru fiecare proba. S-a adăugat proteinaza K reconstituită în tuburile cu probe, s-a vortexat
şi s-a incubat la termobloc la 56°C timp de 2 ore până la liza completă a probelor. La scoaterea
probelor din termobloc s-a mai vortexat o dată. Pentru determinarea corespunzǎtoare s-a
reconstituit soluţia de lizǎ (Lysis Buffer G3) prin omogenizarea a douǎ soluţii: soluţia
concentratǎ de lizǎ (G2) existentǎ în kit cu soluţia apoasǎ (G1) pentru a stabili concentraţia
optimǎ necesarǎ. Din aceastǎ soluţie reconstituitǎ s-au adăugat câte 200μl la fiecare probă şi s-
a vortexat. După ce s-a efectuat acest pas, probele au fost menţinute la termostat la o
temperaturǎ de 70°C timp de 10 minute, iar dupǎ ce timpul a expirat acestea au fost din nou
vortexate. Peste probele realizate până la acest moment s-a mai adăugat 210μl etanol (conc. 96-
100%) pentru fiecare probǎ, iar mai apoi s-a vortexat energic pentru omogenizarea probei cu
etanolul adǎugat. Aceastǎ etapǎ trebuie respectatǎ cu stricteţe având în vedere faptul cǎ etanolul
are rolul de a spǎla ADN-ul şi practic inhibitorii de reacţie vor fi înlǎturați prin diluţie. Dupǎ
spǎlarea ADN-ului se vor introduce colonițele de ADN (Genomic DNA Spin Column) se
introduce în tuburi de 2 ml, peste care se introduce proba şi se centrifughează la 11.000 rpm
timp de 60 de secunde. După centrifugare se îndepărtează lichidul, iar tuburile se folosesc în
continuare. La fiecare probǎ s-au adăugat 500μl Wash Buffer GW1, s-a centrifugat la 11.000
rpm timp de 60 de secunde, după care s-a îndepărtat din nou lichidul iar tuburile s-au reutilizat.
La fiecare probǎ s-au adǎugat 600μl Wash Buffer GW2, se centrifughează la 11.000 rpm timp
de 60 de secunde, se îndepărtează lichidul iar tuburile s-au reutilizat din nou. Mai apoi s-a
centrifugat la 11.000 rpm timp de 60 de secunde pentru a îndepǎrta eventualele reziduuri de
etanol, s-au aruncat tuburile de 2ml iar tuburile (Genomic DNA Spin Column) s-au pus în tuburi
sterile de 1,5ml. Peste fiecare tub s-au adǎugat câte 100μl Elution Buffer pentru fiecare proba,
încălzit în prealabil la 70°C, în centrul membranei tuburilor (Genomic DNA Spin Column), şi
s-au incubat la temperatura camerei timp de un minut. Pentru a capta ADN-ul, pasul final a fost
centrifugarea la 11.000 rpm timp de 60 de secunde. Dupǎ ce protocolul a fost finalizat, probele
5
de ADN au fost cuantificate la spectrofotometrul Nanodrop ND 1000 pentru a verifica dacǎ
acestea sunt corespunzǎtoare pentru realizarea tehnicii PCR.
Tehnica PCR pentru identificarea ADN-ului de vacă din probele analizate
Pentru a putea evidenţia cu ajutorul tehnicii PCR, prezenţa ADN bovin în produsele
lactate de oaie s-au preluat primeri specifici ambelor specii (tab. 1). În cadrul acestei cercetǎri
setul de primeri specifici s-a obţinut în aşa manierǎ încât primerul Forward sǎ fie comun
ambelor specii (bovin și ovin). Aceşti primeri ar trebui sǎ producǎ un amplicon de mǎrimea a
126 pb la ADN de vacǎ și de 332 la ADN de caprǎ, respectiv 430 la ADN de oaie. Prezenţa
ADN de vacǎ în amestecuri de lapte şi brânzeturi s -a realizat prin amplificarea secvenţei ţintǎ
a ADNmt cu primerii specifici de vacǎ (Primeri 1 şi 2) descriși ȋn tabelul nr.1.
Tabel nr. 1.
Secvențele de primeri utilizați ȋn cadrul aplicǎrii tehnicii PCR simplex și multiplex
Secvența (5’- 3’) Lungime Temperature de
topire
Specificitate
specie
Primer 1
ACTAGATCACGAGCTTGA
TCACCATGC
27 pb 60.2 comun
Primer 2
ATGCCTCCTAAAATTCATT
AATATGCG
27 pb 60.1 vacǎ
Primer 3
GCTACAGGGCATAGATTT
CGATGCATGACT
27 pb 60.1 oaie
Ȋn paralele s-au efectuat determinǎri PCR de control, cu primeri specifici de oaie
(Primeri 1 şi 3) care au fost utilizaţi pentru a identifica diferitele concentraţii de lapte în amestec.
Toate amplificǎrile PCR s-au realizat într-un volum final de reacţie de 25 µl. Pentru a evita
orice amplificare nespecificǎ s-a realizat un protocol iniţial de amplificare în gradient pornind
de la o temperaturǎ de aliniere a primerilor de 60ºC, gradual redusǎ cu 1ºC pânǎ la atingerea
temperaturii de 54ºC. La 54ºC, s-au realizat 35 de cicluri. În fiecare ciclu temperatura de aliniere
a fost urmatǎ de un pas de elongaţie la 72ºC timp de 30 de secunde. Extensia finalǎ s-a realizat
la 72ºC timp de 10 min. PCR duplex s-a realizat prin coamplificarea atât a segmentului ţintǎ
din cadrul ADN de vacǎ cât şi a celui de caprǎ/oaie.
Protocolul PCR a urmǎrit urmǎtorii pași:
Etapa I: Pregătirea probelor pentru PCR simplex: s-au pregătit tuburi Eppendorff de capacitate
200µl în care sau adǎugat: 12 ,5 µl MasterMix, 1µl primer Forward; 1µl primer Reverse, 4 µl
ADN şi 6,5 µl apǎ purǎ PCR. Volumul final: 25µl.
Etapa II: Pregătirea probelor pentru PCR duplex: s-au pregătit tuburi Eppendorff de capacitate
200µl în care sau adǎugat: 12 ,5 µl MasterMix, 1µl primer Forward; 1µl primer Reverse Vacǎ,
1µl primer Reverse Bivol, 4 µl ADN şi 5,5 µl apǎ purǎ PCR. Volumul final: 25µl.
Etapa III: Amplificarea probelor: amplificarea probelor s-a realizat cu ajutorul unui
termocycler (G-STORM).Aceastǎ etapǎ presupune supunerea probelor la diferite temperaturi
pentru a reconstitui fragmentul de ADN amplificat. În cadrul programului de amplificare s-a
urmărit pentru realizarea PCR simplex protocolul următor: Denaturarea: 1x95°C→5 minute;
Alinierea primerilor în mai multe stadii: 35x95°C→1 minut, 35x54°C→1 minut (primeri de
vacǎ), 35x62°C→1 minut (primeri de caprǎ/oaie), 40x72°C→1 minut; Elongaţia finală: 1x72°C
→10 minute. În cadrul programului de amplificare s-a urmărit pentru realizarea PCR multiplex
protocolul următor: Denaturarea: 1x95°C→5 minute; Alinierea primerilor în mai multe stadii:
6
35x95°C→1 minut, 35x58,5°C→1 minut, 40x72°C→1 minut; Elongaţia finală: 1x72°C →10
minute.
Etapa IV: Obţinerea profilelor electroforetice: s-a realizat prin migrarea probelor de ADN
amplificat într-un gel de agaroză de concentraţie 1,2%, iar pentru colorarea şi vizualizarea
produşilor s-a folosit RedSafe (1,7µl – 35 ml/gel; 7µl – 140 ml/gel). Gelul de agaroză a fost
introdus într-o cuvă de electroforeză iar citirea şi interpretarea reacţiei s-a realizat cu ajutorul
unui transiluminator BioRad.
Rezultatele obținute la aplicarea tehnicii PCR simplex
Ȋn vederea testǎrii probelor lactate de oaie s-a testat același protocol PCR simplex doar
cǎ primerii desigur utilizați au fost specifici pentru oaie și pentru vacǎ. Dupǎ cum se poate
observa și din figura 5.2. la amplificarea cu primeri specifici de oaie, aceștia au fost foarte
specifici neamplificȃndu-se și produși secundari de reacție.
Figura 1. Rezultatele obținute la amplificarea probelor prin PCR simplex și testarea
primerilor de oaie și de vacǎ ; M: marker de ADN (100 de perechi de baze) ; 1 – proba martor
pozitiv pentru ADN de oaie (436 pb) ; 2 – 6 – probe pozitive la amplificarea cu primeri
specifici de oaie; 7- proba martor pozitiv ADN de vacǎ ; 8 – probǎ negativǎ pentru ADN de
vacǎ ; 9 – probǎ pozitivǎ la ADN de vacǎ
Așa cum se poate observa din figura 1, ȋn cazul probelor de oaie, testarea s-a realizat
inițial ca și ȋn cazul celor de caprǎ prin tehnica PCR simplex. Ȋn cazul brânzeturilor din lapte de
oaie s-a constatat o prevalențǎ mai scǎzutǎ a adaosului de lapte de vacǎ. Astfel, majoritatea
probelor au fost pozitive la ADN de oaie și negative la ADN de vacǎ (fig. 1). Pentru a putea
aproxima concentrațiile posibile de ADN de vacǎ din amestecul ȋn produsele lactate studiate,
am realizat diluții de ADN de vacǎ/oaie, dupǎ care probele s-au amplificat. Aceastǎ testare a
concentrațiilor se realizeazǎ direct din ADN-ul extras pur de vacǎ dupa care probele sunt
amplificat iar interpretarea se realizeazǎ dupǎ intensitatea benzilor amplificate. Deși nu este o
tehnicǎ recunoscutǎ ca fiind sigurǎ ȋn estimarea concentrațiilor totale de ADN din amestec, ea
a mai fost testatǎ si de cǎtre alți cercetǎtori ce susțin acuratețea ei. Am dorit sa testǎm acest
lucru prin prisma faptului cǎ ADN-ul de vacǎ este acceptat ȋn produsele lactate de altǎ origine
ȋn concentrație de sub 0.1%. Urmele de ADN de vacǎ sunt acceptate datoritǎ faptului cǎ acest
lucru poate sǎ se ȋntȃmple mai ales ȋn unitǎțile mari de producție datoritǎ contaminǎrii
ȋncrucisate sau utilizǎrii acelorași echipamente ȋn procesarea laptelui. Chiar dacǎ se utilizeazǎ
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
M
436 126 pb
7
dezinfectanți și se igienizeazǎ desigur utilajele, ȋn mod curent nu folosesc și soluții de
decontaminare ADN.
Figura 2. Amplificarea probelor amestec de concentrații cunoscute: 1- ADN vacǎ <0.1%; 2
– ADN vacǎ <0.5%; ADN vacǎ – 10%; ADN vacǎ >10%.
Prin urmare am constituit patru probe martor de concentrație <0.1% ADN, ADN <
0.5%, ADN - 10% și ADN >10%. Așa cum se poate observa din figura 2, la amplificare am
constatat cǎ proba 1 de concentrație <0.1% avea o vizibilitate mai scǎzutǎ ȋn gel, proba 2 de
<0.5% o bandǎ la fel de vizibilǎ, proba de concentrație 10% și peste 10% prezenta o bandǎ
vizibilǎ, strǎlucitoare. Dupǎ realizarea acestui etalon al ADN-ului de vacǎ ȋn amestecuri de
concentrații diferite s-a interpretat intensitatea benzii obținute.
Figura 3. Estimarea concentrațiilor de ADN amestec de vacǎ ȋn probele lactate de oaie
Așa cum se poate observa din figura 5.5. ȋn cazul probelor lactate de oaie la care s-a
relavat benzi pozitive, majoritatea au relevat benzi de intensitate redusǎ ceea ce semnificǎ ca
probabilul amestec s-a realizat ȋn concentrație redusǎ (<0.1%; 0.5%). Probele 19,20,21,31,32
au relevat intensitǎți mai crescute ale benzilor ceea ce semnficǎ o concentrație mai ridicatǎ de
ADN de vacǎ (>10%).
Rezultatele obţinute la aplicare tehnicii PCR multiplex
La aplicarea tehnicii PCR multiplex s-a relevat compatibilitatea primerilor din punct de
vedere al temperaturii. Astfel, în figura 4 se poate observa amplificarea în aceaşi reacţie atât a
primerilor ADN-ului de oaie cât şi a ADN-ului de vacă. După aplicarea tehnicii PCR simplex,
doar probele relevate pozitive au fost confirmate prin această tehnică.
M 1 2 3 4
8
Figura 4. Rezultatele obţinute la aplicarea tehnicii PCR multiplex în probele lactate de oaie
Aşa cum se poate observa din figura 4, brânzeturile declarate din lapte de oaie regăsite pozitive
la ADN-ul de vacă prin tehnica PCR simplex au fost confirmate şi prin tehnica multiplex. După
cum se poate observa din figura 4, ADN-ul de oaie (436 pb) s-a amplificat mult mai evident,
banda fiind de intensitate mai crescută, iar în cazul ADN-ului de vacă, benzile din nou prezintă
intensităţi diferite simbolizând un adaos variat.
Fig. 5. Concentraţia de ADN bovin în brânzeturi declarate din lapte de oaie
Această metodă, aplicată în cadrul acestui studiu, se bazează pe amplificarea unor
regiuni ţintă din ADN-ul mitocondrial, cu o limită de detecţie de 0.1% adaos posibil. Acest
lucru este susţinut de asemenea şi de alte cercetări efectuate în produsele lactate de capră şi oaie
(Piknov şi col. (2002). Metoda de referinţă Europeană de identificare a falsurilor de amestec
din produsele lactate este cea de focalizare izoelectrică a proteinelor, ce prezintă o limita de
1%. Cozzolino şi col. (2001) consideră ca detecţia limită de 5% este suficientă pentru
demonstrarea adaosului nedeclarat. Acesta a mai susţinut faptul că orice amestec de sub 5%
adaos nu produce un efect economic eficient de aceea nici nu se prea practică în cantităţi atât
de reduse. Frecvenţa de apariţie a falsurilor la producătorii de brânzeturi declarate din lapte de
oaie a fost foarte ridicatǎ (67%), 16 din probele de produse lactate pozitive la ADN de vacă şi
achiziţionate de pe piaţǎ fiind în concentraţii mai crescute de 10% (fig. 5), cea mai crescută
falsificare fiind înregistrată în cazul brânzei telemea produsă de către producătorii din zona de
şes. Acest procent este îngrijorǎtor, având în vedere faptul cǎ diversitatea şi numǎrul
producǎtorilor este mult mai scăzut decat în cazul produselor lactate de vacă.
67%
33%
<10%
>10%
126 pb
436
9
3.2. Construirea hărţii izotopice a brânzeturilor autentice din zona Transilvaniei
Pe baza datelor furnizate de către partenerul INCDTIM Cluj-Napoca, privind rapoartele
izotopice analizate din probele de brânzeturi, s-au generat hărţile izotopice cu ajutorului platformei Web
TradFood 2014, care este alcătuită dintr-un Portal Web TradFood-2014 si din bazele de date aferente
acestuia.
Figura 6. Afisarea unor harti de ansamblu si de detaliu
Pentru implementarea acestei platforme Web au fost folosite tehnologii de la firma Microsoft
care includ: mediul de dezvoltare Visual Studio 2010, limbajul C#, mediile de lucru .NET 4.0 si
ASP.NET 4.0, sistemul de gestiune al bazelor de date SQL Server 2008 R2 Express, componentele din
ADO.NET, precum si unele pachete si biblioteci de functii si pachete de componente suplimentare, care
vor fi mentionate acolo unde este cazul (aspecte descrise în manual de utilizare v1.2 TradFood 2014).
10
Figura 7. Afisarea valorii masurate prin plasarea cursorului “mouse”-ului pe un marcher secundar
Figura 8. Afisarea unei harti de detaliu cu rapoarte izotopice
Pentru a obtine o astfel de reprezentare sub forma unei harti trebuie selectata pagina ‘Caract.’
care permite lucrul cu valorile masurate ale parametrilor, cu alte cuvinte cu caracteristicile ale unitatilor
de productie. Dupa selectarea valorilor masurate pentru Rapoartele izotopice de interes si afisarea hartii
principale (in stinga Fig. 6), se poate obtine harta de detaliu (in dreapta Fig. 6) cu un clic pe marcherul
principal, evidentiat. Din harta de detaliu se pot obtine informatii in privinta unitatii de productie, a
elementului analizat (matrice), a tipului de analiza efectuata si a parametrului masurat (Fig. 6), cu un
clic pe marcherul principal. Apoi, cu un clic pe oricare dintre marcherele secundare din harta de detaliu
11
se obtin informatii in privinta valorii masurate, a unitatii de masura, a datei efectuarii analizei si a
buletinului de analiza care a insotit masuratoarea (Fig. 7). O data cu introducerea completa a datelor
colectate pentru proiect (documentele si valorile masurate ale paramatrilor) a fost posibila realizarea
unor reprezentari grafice care sa ilustreze una dintre cerintele initiale: realizarea unor harti cu
reprezentari grafice ale Rapoartelor izotopice (Fig. 8).
3.3. Testarea/validarea componentelor integrate. Validarea functionala a platformei web
si a exploatarii in mediul real
In etapa a 4-a (2017) Platforma Web a fost folosita, in continuare, pentru introducerea
si stocarea datelor primare si a documentelor pentru proiect. Au intervenit si citeva modificari,
in structura bazei de date si a componentelor pentru introducere, stocare si prezentare a datelor,
modificari menite sa imbunatateasca si sa extinda functionalitatea pusa la dispozitia
utilizatorilor Portalului TRADFOOD-2014.
3.3.1. Modificari in baza de date
Modificari in TFP2014DB
Pentru asigurarea mecanismului de blocare a conturilor de utilizator dupa un numar de
incercari de conectare esuate a fost extins tabelul TFP2014_Utilizatori prin crearea unuia nou,
numit TFP2014_Utilizatori_LO
a carui structura este prezentata mai jos:
TFP2014_Utilizatori_LO
UserID int Unchecked
Name nvarchar(50) Unchecked
Password nvarchar(50) Checked
Email nvarchar(100) Unchecked
LoginFailureCount smallint Checked
Locked bit Checked
Cimpurile nou introduse contorizeaza, pe de o parte, incercarile de conectare esuate, iar la
atingerea unui numar de 5 esecuri contul va fi blocat, prin setarea cimpului Locked pe valoarea 1, el
devenind inutilizabil.
Nota:
Deblocarea unui cont blocat de utilizator o poate face numai un utilizator in rol de ‘Admins’.
De asemenea a fost creat un nou tabel TFP2014_UtilizatorRoluri_LO cu structura
asemanatoare celui vechi TFP2014_UtilizatorRoluri si care este prezentat mai jos:
TFP2014_UtilizatorRoluri_LO
UserID int Unchecked
RoleID int Unchecked
12
Proceduri stocate modificate:
TFP2014_ActualizeazaUtilizator_LO
TFP2014_AdaugaUtilizator_LO
TFP2014_AdaugaUtilizatorRol_LO
TFP2014_ConectareUtilizator_LO
TFP2014_IaApartenentaRol_LO
TFP2014_IaRoluriPeUtilizator_LO
TFP2014_IaUnUtilizator_LO
TFP2014_IaUtilizator_LO
TFP2014_IaUtilizatori_LO
TFP2014_StergeUtilizator_LO
TFP2014_StergeUtilizatorRol_LO
In acelasi scop au fost modificate corespunzator componentele Portalului care asigura administrarea
rolurilor si a securitatii Portalului.
Modificari in TF2014DB
Adaugarea unor elemente analizate (matrici) noi
Pentru a putea fi introduse valorile masurate ale parametrilor in conformitate cu buletinele de
analiza primite, au fost adaugate doua elemente analizate noi: furaj concentrat (porumb si faina)
- diferit fata de furajul uscat (fin – trifoi/lucerna uscata) si cazeina.
Figura 9. Elementele analizate noi
Initial, in conformitate cu specificatiile proiectului, parametrul cazeină a fost inclusa in
rindul parametrilor masurabili in analizele de tip Fizico-chimice pentru probele de Lapte. In
2016 s-au facut analize in care Cazeina a fost folosita in postura de element analizat (matrice)
determinindu-se Raportul izotopic pentru Carbon. In aceste conditii cazeina a fost introdusa si
in tabelul cu Elemente analizate.
13
3.3.2. Introducerea valorilor masurate
Efortul principal din aceasta etapa a fost canalizat spre introducerea si stocarea datelor
pentru documentele gestionate de Portal si a valorilor masurate pentru diferitii parametri ai
elementelor analizate care au constituit probele analizate in cadrul proiectului.
Figura 10. Procese verbale (PV) in Portalul TradFood-2014
Pentru usurarea procesului de introducere a valorilor masurate, mecanismul de import
in masa din foi de calcul Excel folosit in cazul valorilor masurate pentru diferitii parametri
(caracteristicilor unitatilor de productie) a fost extins si aplicat si in cazul proceselor verbale si
a buletinelor de analiza. In cazul ambelor tipuri de documente introducerea detaliilor (DPV si
DBA) a fost posibila prin proceduri asemanatoare cu cele pentru importul datelor pentru
definirea PV si BA. Mai intii au fost introduse 201 procese verbale de prelevare probe, impreuna cu
detaliile care precizeaza tipurile de analize solicitate pentru fiecare element analizat (matrice) pentru
care s-a prelevat o proba. Apoi, au fost introduse cele 330 buletine de analiza care consemneaza
rezultatele obtinute in urma analizelor efectuate pe probele prelevate, adica valorile masurate ale
parametrilor (caracteristici ale unitatilor de productie).
Figura 11. Buletine de analiza (BA) in Portalul TradFood-2014
14
In fine, din introducerea tuturor valorilor aferente acestor documente a rezultat popularea
tabelelor cu valorile masurate ale parametrilor in numar de 3181 valori masurate ale parametrilor numite
si caracteristici ale unitatilor de productie si vizualizabile in pagina ‘Caract.’.
Figura 12. Valorile masurate ale parametrilor (caracteristici ale unitatilor de productie) in Portalul
TradFood-2014
3.3.3. Modificari de functionalitate
In vederea imbunatatirii securitatii Portalului, a fost introdus mecanismul de blocare a unui
cont atunci cind se depaseste un numar de incercari de conectare esuate. Limita maxima permisa a
incercarilor nereusite a fost fixata la 5, iar depasirea ei conduce la blocarea contului.
Nota:
Deblocarea unui cont blocat de utilizator o poate face numai un utilizator in rol de ‘Admins’.
Figura 13. Verificarea elementelor de identificare pentru contul de utilizator
15
S-au introdus conditii de valabilitate, verificate, pentru validitatea adresei de e-mail (folosindu-
se in acest scop un control ASP.NET de validare RequiredFieldValidator cu o “regular expression”)
si a parolei (minimum 6 caractere) pentru contul de utilizator!!!
Nota:
Pentru parola se solicita si confirmarea acesteia prin reintroducere intr-un cimp separat.
Acest tip de validare a datelor introduse este folosit si in cazul tuturor celorlalte machete pentru
introducerea/editarea datelor. Un exemplu tipic in acest sens este verificarea formatului seriei si
numarului cartii de identitate si a codului numeric personal utilizate pentru identificarea persoanelor de
contact din unitatile de productie si a personalului implicat in procesul de prelevare a probelor.
Figura 14 a si b – Validarea datelor introduse la adaugarea unei unitati de productie
Pentru asigurarea sigurantei stergerilor inregistrarilor din baza de date a Portalului a fost
introdus un mecanism de atentionare a utilizatorului si de solicitare a unei confirmari suplimentare
inainte de declansarea operatiunii de stergere propriu-zise. Fig. 15 ilustreaza functionarea acestui
mecanism, care se declanseaza dupa ce utilizatorul a actionat, cu clic, pe butonul de legatura ‘Sterge
aceasta inregistrare’.
Figura 15. Confirmarea stergerii unei inregistari din baza de date a Portalului
16
Actionarea butonului OK are ca efect executarea stergerii inregistrarii, in timp ce actionarea
butonului Cancel duce la abandonarea tentativei de stergere.
3.3.4. Prezentarea datelor
Una dintre functionalitatile cerute pentru Portal a fost aceea de a se putea reprezenta grafic, printr-o
diagrama sau pe o harta, valorile masurate pentru parametrii alesi.
Diagrame
In cele doua figuri care urmeaza este prezentata modalitatea de reprezentare grafica a valorilor masurate
pentru parametrul NTG obtinute in urma unor analize de tip Indicatori sanitari pentru elementul analizat
Lapte vaca. Fig. 16. ilustreaza modalitatea de selectare a valorilor masurate in pagina ‘Caract.’ a
Portalului.
Figura 16. Preselectarea valorilor masurate pentru parametrul NTG
Dupa selectarea tipului de diagrama dorit – in cazul de fata 2D linie este generata si afisata diagrama
rezultanta prin actionarea butonului Afiseaza diagrama pe care o putem vedea in Fig. 17.
17
Figura 17. Afisarea valorilor masurate pentru NTG ca o diagrama de tip linie
3.1.3.5. Raportarea erorilor
In cazul in care sunt depistate erori in functionarea Portalului, detalii asupra acestora sunt
raportate fie in cadrul paginilor Portalului (Fig. 13), fie sunt inregistrate cu ajutorul mecanismului de
Jurnalizare a erorilor (oferit de sistemul de operare Windows), fie sunt utilizate ambele posibilitati de
raportare.
Figura 18. Eroare raportata la tentativa de stergere a unei inregistrari
18
In acest scop a fost folosit mecanismul de inregistrare a erorilor in jurnalele sistemului de
operare Windows (jurnalul Application). Sunt vizate mai ales erorile care apar ca urmare a operatiilor
de la interfata dintre componentele Portalului si sistemul de gestiune a bazelor de date SQL Server 2008
R2 Express, adica in componentele DAL (Data Access Layer). Verificarea prezentei unor erori
inregistrare se face incepind cu deschiderea aplicatiei Event Viewer din Windows Administrative
Tools (in Windows 10, de exemplu), apoi se extinde nodul Windows Logs si se selecteaza jurnalul
Application.
Figura 19. Jurnalul cu erori de aplicatie din Event Viewer
In cazul unei erori detectate in componentele DAL ale Portalului sunt stocate doua inregistrari,
iar continutul cimpului Source va permite identificarea originii erorii (componenta DAL care a generat
eroarea) (Fig. 20).
Figura 20. Pereche de inregisterari stocate pentru o eroare la nivelul DAL
In prima inregistrare sunt detaliate cauzele erorii (Fig. 21), iar intr-a doua este prezintata comanda SQL
Server care a provocat eroarea (Fig. 22).
19
Figura 21. Inregistrarea care descrie eroarea detectata
Figura 22. Inregistrarea care stocheaza comanda SQL executata
3.4.5. Testarea functionarii Portalului
In cadrul acestei etape s-a continuat testarea componentelor Portalului TRADFOOD-2014 in
vederea inlaturarii defectiunilor ascunse si a imbunatatirii modului de prezentare a datelor, a
performantelor si a sigurantei in functionare.
20
3.4. Ghid metodologic de autentificare a brânzeturilor tradiţionale
Ghidul metodologic de autentificare a brânzeturilor tradiţionale este un instrument util
pentru producătorii care doresc să-şi certifice produsele lactate în vederea valorificării pe piaţa
naţională sau europeană. Acesta se adresează însă, mai ales specialiştilor din cadrul
laboratoarelor acreditate privind realizarea analizelor de laborator prin care aceste produse pot
fi autentificate, respectiv certificate.
Pe baza datelor obţinute în cadrul proiectului de cercetare am concluzionat că
următoarele metode analitice pot fi utilizate cu succes pentru autentificarea brânzeturilor
tradiţionale româneşti:
- Spectrometria de masă pentru determinarea rapoartelor izotopice ale carbonului şi
oxigenului;
- Spectrometria de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS) pentru analiza
elementală a substanţelor minerale (macro şi microelemente);
- Focalizarea izoelectrică a proteinelor (IEF);
- Identificare a ADN-ului de specie prin tehnica PCR
Menţionăm că aceste analize au fost dezvoltate, testate şi validate în cadrul
laboratoarelor de cercetare ale partenerilor implicaţi în consorţiul proiectului TradFood 2014,
respectiv INCDTIM, USAMV Cluj-Napoca şi UMF Cluj-Napoca. Aceste metode analitice au
fost descrise în cadrul rapoartelor ştiinţifico-tehnice, aferente etapelor 2 (2015), respectiv 3
(2016).
Metodologia de autentificare a acestor produse alimentare, presupune următoarele
etape:
1. Identificarea potenţialilor producători de brânzeturi tradiţionale, care doresc să-şi
autentifice produsele;
2. Recoltarea probelor de către reprezentanţii laboratoarelor acreditate;
3. Analizarea probelor prin metodele descrise mai sus;
4. Popularea platformei Web Tradfood 2014 cu rezultatele obţinute;
5. Analiza rezultatelor obţinute şi eliberarea buletinelor de analiză.
Pe baza acestor rezultate obţinute, producătorii vor putea iniţia procedurile oficiale de atestare
a brânzeturilor obţinute ca produse tradiţionale atât pe piaţa naţională cât şi europeană.
Obiectivele prevazute pentru etapa de executie nr 4 au fost realizate in totalitate.
3.5. Diseminarea rezultatelor
Rezultatele obţinute au fost prezentate în cadrul unor simpozioane naţionale cu
participare internaţională, fiind publicate în reviste de specialitate, după cum urmează: ISI (1
articol publicat), BDI (1 articol publicat), precum şi în cadrul unor conferinţe internaţionale (4
prezentări orale şi 1 poster). Rezultatele obținute în această etapă vor constitui materialul
necesar pentru un articol care va fi trimis spre publicare la o revistă indexată ISI.
4. Concluzii
Din totalul probelor de brânzeturi de oaie analizate prin tehnica PCR, 16 au relevat prezenţa
ADN-ului de vacă, ceea ce denotă un procent ridicat al falsurilor în cazul brânzeturilor
tradiţionale din lapte de oaie (67%), atât în cazul producătorilor din zona montană A, cât şi
din zona de șes C.
21
Tehnicile PCR simplex şi multiplex se pot utiliza cu succces pentru identificarea falsurilor
din produsele lactate tradiţionale.
Identificarea originii geografice este data de coroborarea rapoartelor izotopice ale
carbonului si oxigenului cu elementele Mn si Sr;
Diferentierea dintre laptele provenit de la cele doua specii (vaca si oaie) se face cu ajutorul
combinatiei de markeri: rapoarte izotopice ale hidrogenului si concentratia de Sr;
Diferentierea probelor de branza (telemea si cas) in functie de originea geografica (zona de
proveniente, cele 3 zone) are cei mai buni markeri: Rb, K, Li, δ13C cazeina, Mg, W, Sr;
Diferentierea probelor de cas in functie de producator s-a realizat cel mai bine cu ajutorul
rapoartelor izotopice ale carbonului din cazeina din cas si continutul elemental pentru: Li,
Ti, K, Tl, Rb, Cu, B, Mg, Na, As, Er, Sm, W, Dy, Sn;
Diferentierea intre probele de telemea in functie de producator are ca cei mai buni
predictori: Be, Co, Sr, P, As, Mn, Eu, Dy, Ag, K, Tb, Te, Sm, Ca, Ru si Cd.
Prin platforma web s-a asigurat:
culegerea datelor necesare identificarii originii produselor obtinute in cele
trei zone de analiza (documente asociate prelevarii probelor din zonele de
analizat, buletine de analiza cu rezultatele masurate, matrice de parametri,
etc);
vizualizarea datelor in diferite moduri: tabelar, grafice, diagrame sau harti
cu distributia geografica a parametrilor;
posibilitatea demonstrarii trasabilitatii parcursului si a responsabilitatilor
pentru actiunile asociate cu probele prelevate, analizate si publicate.