27.03.2011
1
Metode de
analiză a genelor
Expresia genelor
ADN ARNm Proteină Caracter
5’-ATTGCAAGATTACCATGT-3’ Catena codogenă (netranscrisă)
3’-TAACGTTCTAATGGTACA-5’ Catena anticodogenă (transcrisă)
Transcripţie
5’-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3’ ARNm
Translaţie
Leu – Ala – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid
Maturizare
Caracter fenotipic normal
Expresia genelor
ADNmut ARNmmut Proteinăan Caracteran
5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ mutaţie G4→A
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
Transcripţie
5’-AUUACAAGAUUACCAUGU-3’ ARNmmut
Translaţie
Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptidan
Caracter fenotipic anormal
Analiza genelor
Secvenţiere
PCR
Southern-blot
Hibridare in situ
ADN Proteine ARN
Northern-blot
RT–PCR
Hibridare in situ
Western-blot
Secvenţiere
Analiza funcţiei
Analiza
histochimică
Utilizarea tehnicilor de analiză a acizilor nucleici în medicină
Analiza ADN:
• depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al bolilor genetice (prenatal, postnatal precoce);
• identificarea polimorfismului individual → dactiloscopie genomică (analiza filiaţiei);
• depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul bolilor infecţioase şi gradului de infectare.
Analiza ARNm:
• analiza expresiei genice ţesut-specifică;
• evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice.
Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin
acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)
27.03.2011
2
RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z M
-
+
10 kb
8 kb
6 kb
4 kb
2 kb
12 kb
10 kb
6 kb
5 kb
2,5 kb
2,5 kb
10 kb
6 kb
5 kb
PCR – reacția de polimerizare în lanț
Principiile PCR clonarea in vitro = amplificare
• Replicare semiconservativă, repetată
• Specificitatea primerilor sintetici pentru gena–ţintă
• Hibridizarea ADN-ţintă – primer ← complementar:
• Denaturare termică a ADN - de cercetat
Modificarea ciclică a temperaturii:
• Denaturare
• Renaturare
• Sinteză
Componentele necesare pentru clonarea in vitro (PCR):
• ADN de cercetat
• Primeri specifici secvenţei de clonat –
• Complimentari secvenţelor flancante
• Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă
• Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTP)
• Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii:
• - tº de denaturare ADN
• - tº de renaturare (ADN+primer)
• - tº de polimerizare (elongarea catenelor noi de ADN)
Etapele tehnicii PCR
•Denaturarea ADN la 96oC
A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante
•Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor
•Elongarea catenelor ADN la 72oC
B. Repetarea automată a procedurilor de denaturare-
renaturare-elongare de 30-35 ori
C. Analiza produşilor PCR
- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor
27.03.2011
3
Extragerea ADN Pregătirea
componentelor pentru
PCR
Amplificarea
ADN-ţintă
Electroforeza
produşilor PCR
Colorarea şi
vizualizarea produşilor
PCR
Interpretarea
rezultatelor
Avantajele PCR
• Metodă rapidă
• Metodă ieftină
• Utilizarea cantităţilor mici de material analizat
• Nu necesită izotopi radioactivi
• Interpretarea uşoară a rezultatelor
Dezavantajele PCR
• Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice amplificate
• Necesitatea primerilor sintetici, specifici secvenţei analizate
Utilizarea PCR • Identificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidice
• Identificarea mutaţiilor punctiforme (substituţiile nucleotidice)
• Identificarea expresiei genice (RT-PCR)
• Dactiloscopia genomică (filiaţie)
• Identificarea agenţilor infecţioşi
• Identificarea gradului de infecţie (quantitative PCR)
• Identificarea produselor PCR în timp real (Real-Time PCR)
Identificarea inserţiilor / deleţiilor Identificarea mutaţiilor punctiforme
27.03.2011
4
Identificarea agenţilor infecţioşi
Stabilirea paternităţii (filiaţiei) Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR
Dependenţa cantităţii de produse amplificate de concentraţia ADN genomic utilizată în PCR. S-a utilizat ADN în cantitate de: 1 – 0,5 μg, 2 – 0,25 μg, 3 – 0,1 μg, 4 – 0,02 μg
Concentraţiile critice ale substanţelor pentru inhibarea activităţii Taq-polimerazei
Substanţa Concentraţia critică
SDS >0.005% (m/v)
Fenol >0.2% (v/v)
Etanol >1% (v/v)
Isopropanol >1% (v/v)
CH3COONa >5 mM
NaCl >25 mM
EDTA >0.5 mM
Optimizarea condiţiilor de
desfăşurare a PCR Caracteristica primerilor utilizaţi în PCR
Gena Secvenţa Lungimea, baze % G+C Tm, oC
ACE 5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ 24 54 59
5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’ 25 48 58
AT1 R 5’-CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3’ 20 65 58
5’-GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3’ 23 48 55
NOS 5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3' 22 55 57
5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' 24 54 59
Dependenţa cantităţii produselor PCR de temperatura de renaturare a primerilor. În condiţiile PCR s-a utilizat: 1 – toC optimală -5oC; 2 – toC optimală; 3 – toC optimală +5oC.
Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR
Dependenţa cantităţii produselor PCR de concentraţia ionilor Mg2+. Concentraţia utilizată de MgCl2: 1 – 2,5mM; 2 – 5mM.
Dependenţa cantităţii de ADN amplificat de numărul de cicluri PCR.
1 – 30 cicluri; 2 – 35 cicluri; 3 – 40 cicluri.
27.03.2011
5
Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE
Analiza electroforetică în gel de agaroză de 2% a produselor PCR rezultate din amplificarea ADN uman cu primeri corespunzători genei ACE.
M – marcher al lungimii; 1 – genotip I/D; 2 – genotip D/D; 3 – genotip I/I.
I
D
Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS
M 1 2 3
Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători genei NOS. M – marcher al lungimii; 1 – genotip G/G; 2 – genotip T/T; 3 – genotip G/T.
G
T
Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R
Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători
genei AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I.
M – marcher al lungimii; 1 – genotip A/A; 2 – genotip A/C
A
C
Tehnica Real-time-PCR
ARMS-PCR Utilizarea tehnicii microarray
• Izolarea ARN din diferite ţesuturi
• Izolarea ARNm
• Amplificarea prin intermediul RT-PCR
• Marcarea cu agenţi fluorescenţi
• Hibridarea cu ADN fixat în micocipuri
• Analiza rezultatelor
27.03.2011
6
Tehnica Southern-blot
• Bazată pe RFLPs
• Hibridizare cu sonde marcate
• Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un suport solid (pe membrane de nitroceluloză)
Hibridarea acizilor nucleici
• Unirea complementară a fragmentelor (moleculelor) de acizi nucleici:
• ADN de cercetat cu
• sonda oligonucleotidică
• În reacţie participă molecule monocatenare
• Moleculele ADN-ţintă sunt fixate
• Moleculele-sonde sunt marcate radioactiv sau fluorescent
• Identificarea complexelor hibride se realizează prin intermediul autoradiografiei
Tehnica Southern-blot
Extragerea ADN Restriţia ADN Electroforeza ADN
Denaturarea şi
transferul ADN
pe membrane
Autoradiografia Hibridare cu sonda
Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
Utilizarea tehnicii Southern-blot
• Identificarea inserţiilor / deleţiilor mari
• Identificarea mutaţiilor punctiforme ce afectează SR
• Dactiloscopia genomică RFLPs
RFLPs şi analiza genotipului
Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C
Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2
B (Nm)
C (mm)
A (NN)
27.03.2011
7
Dezavantajele Southern-blot
• Necesită cunoaşterea hărţii de restricţie a genei ţintă
• Necesită cantităţi mari de material biologic
• Metodă îndelungată, cu multe etape
• Necesită izotopi radioactivi
• Necesită materiale costisitoare
Avantajele Southern-blot
• Este metodă foarte precisă
• Nu necesită cunoaşterea secvenţei nucleotidice analizate
• Nu necesită primeri sintetici
Tehnica Northern-blot
• Extragerea ARN din ţesutul ţintă
• Electroforeza ARN în condiţii de denaturare
• Transfer pe membrană de nailon
• Hibridarea cu sonda marcată
• Autoradiografia
Tehnica Northern-blot
Extragerea ARN Electroforeza ARN
Transferul ARN
pe membrane
Autoradiografia Hibridare cu sonda
Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
Utilizarea tehnicii
Northern-blot
• Identificarea expresiei genice în anumite ţesuturi, anumite condiţii
• Identificarea variantei de splicing a proARNm
• Identificarea nivelului de expresie
• Identificarea agenţilor infecţioşi (ribovirusuri)
Identificarea nivelului
de expresie şi a variantei
de splicing
27.03.2011
8
Secvenţierea ADN
Stabilirea secvenţei de nucleotide
• Metoda chimică (tehnica Maxam-Gilbert, 1973)
• Metoda dideoxi (tehnica Sanger, 1975)
• Metoda automată (cu utilizarea agenţilor fluorescenţi)
Tehnica dideoxi
• Sinteza enzimatică a ADN
• Utilizarea în paralel a nucleotidelor ce conţin deoxiriboză şi dideoxiriboză
• Stoparea sintezei în cazul incorporării ddNTP
5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ catena codogenă
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ catena anticodogenă (matriţă)
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTAC-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAA-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAG-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAGA-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAGATT-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACA-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAGAT-3’
A, T, C, T – ddNTP (2’,3’-ddNTP)
pentru stoparea sintezei
5’-ATTA -- primer marcat P32
pentru ADN-polimerază
A, T, C, T – dNTP (2’-dNTP)
pentru sinteza noilor catene
5’-ATTACAA-3’
5’-ATTACAAG-3’
5’-ATTACAAGA-3’
5’-ATTACAAGATT-3’
5’-ATTACA-3’
5’-ATTACAAGAT-3’
5’-ATTACAAGATTA-3’
5’-ATTACAAGATTACCA-3’
5’-ATTACAAGATTACCAT-3’
5’-ATTACAAGATTACCATG-3’
5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’
+
- A T C G
5’-ATTAC-3’
5’-ATTACAAGATTAC-3’
5’-ATTACAAGATTACC-3’ 5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’
A
T
G
C
Tehnica dideoxi
Extragerea ADN
Denaturarea ADN
Sinteza catenelor complementare utilizând primeri marcaţi cu 32P în prezenţa dNTP şi ddNTP
Electroforeza în condiţii de denaturare
Vizualizarea fragmentelor marcate prin autoradiografie
+
-
(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)
27.03.2011
9
Metoda automată Hibridarea
in situ
• Pregătirea preparatelor de cromozomi
• Denaturarea ADN
• Hibridarea cu sonda marcată
• Vizualizarea la microscopul optic
Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici
Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
cu nuclei interfazici
Hibridarea in situ pentru depistarea secvenţelor ADN
Hibridarea in situ cu
utilizarea probei sens (stânga)
şi antisens (dreapta)
Hibridarea in situ pentru depistarea secvenţelor ARN
Analiza
histochimică –
identificarea
proteinelor în ţesut
27.03.2011
10
Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor nucleici:
Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinţelor mutaţiilor.
Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice - prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naşterii copiilor cu anomalii genetice sau manifestării unor patologii severe.
Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea vectorilor de gene etc.).
Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în diagnosticul bolilor infecţioase.
Identificarea polimorfismelor individuale în analiza filiaţiei, în criminalistică.