Mecanisme moleculare ale virulentei si patogenitatii la drojdii

Genul Candida

• Peste 200 sp.• Cuprinde specii potential patogene: ex. C. albicans, C. glabrata,

C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, and C. inconspicua, C. dubliniensis • Cea mai cunoscuta si studiata – C. albicans

Caractere generale Microorganisme: eucariote, unicelulare, facultativ anaerobe, conditii de cultivare: 28-37º C, pH neutru

Principalii polimeri ai peretelui celular:Glucan si Manan

Adaptabilitate ridicata: unele specii de Candida pot suferii unele modificarii: morfologice (str. de suprafata) si biochimice (cresterea intensit. metabolice)

Coloniile apar sub mai multe forme: netede, rugoase, fibroase, zbarcite, franjurate fenotipe care apar odata la 10-104 cel. (reglajul SIR2 like).

Ex: col. alba neteda care avea capacit sa secrete aspatil proteinazele 1 si 3 a suferit modificari fenotipice devenind rugoasa de culoare gri si avand capacitatea sa secrete aspartil proteinaza 2.

Nise ecologice

• Nise permante: organismul uman si animal - tegumentului: C. parapsilopsis, guillermondii, krusei - tractului digestiv si genital: C. albicans, tropicalis,

krusei, glabrata

• Nise temporale:

- ape reziduale: C.albicans, guillermondii, maltosa - soluri poluate: C. albicans, tropicalis, robusta - plante: C. azyma, guillermondii, maltosa, zeylanoides

-Tegument-Tract digestiv-Tract uro-genital

Infectiile cauzate de Candida

Frecveta

- ocupa locul 4 in infectiile nosocomiale cu o mortalitate de 40%.

-se constata o morbiditate si mortalitate ridicata in cazul nou nascutilor

-75% din femei dezvolta o infectie vaginala iar 45% din cazuri sunt recurente

-mortalitate ridicata datorita: diagnosticare tarzie si rezistenta crescuta la compusi

cu activitate antifungica

Susceptibilitate crescutaSusceptibilitate crescuta

-- Persoanele cu imunitate scazuta

-Persoanele care urmeaza diferite tratamente cu: corticosteroizi,

antinoeplazice, antibiotice cu spectru larg, imunosupresoare

Puncte tari

Bacterii Drojdii

Plasticitatea genetica

Rezistenta ridicata la conditii de stres

Rata de diviziune ridicata

Multirezistenta la antibiotice

Ocupa nise variate

Mobilitate, sporulare...

Asemanare cu cel. umane

Aderenta ridicata la dispozitive medical

Rata de diviziune ridicata

Afectiunile produse de specii din genul Candida

• Candidoza muco-cutanata• Onicomicoza• Candidoza orofaringiana• Candidoza vulvo-vaginala• Candidoza de scutec• Candidoza neonatala

Candidoza muco-cutanata

• Zonele afectate: axilara, pliurile submamare, spatiile interdigitale, ombilicul.

• Caracterizata prin: eritem bazal cu margini solzoase, leziunile sunt inconjurate de

eruptii gen pustule care se sparg si produc rani deschise.

• Predispozitie crescuta:

disfunctii metabolice (diabetici, alcoolici, supraponderali)

persoane care lucreaza in medii cu risc crescut: spalatorii, pescarii, curatatorii

Onicomicoza•Infectii ale unghiilor produse de specii din genul Candida in asociere cu o serie de fungi: Trichophyton

rubrum determina peste 80% dintre onicomicoze

Aspectul unghiei se modifica in functie de locul de patrundere a fungului in lama cornoasa. Unghia devine galbena, alba sau maron inchis, ingrosata si sfarimicioasa in cazul invadarii portiunii terminale a acesteia. In situatia in care invazia fungica se face direct prin suprafata unghiei, pe aceasta apar la inceput pete albe (interpretate de multe ori ca «lipsa de calciu»), ulterior prezentindu-se moale, cu aspect prafuit, dar fara a se ingrosa sau detasa de patul unghial

•Transmitere: infectiei fungica se transmite fie prin contact direct, fie indirect prin folosirea in comun a unor obiecte precum unele articole de imbracaminta si incaltaminte, obiecte folosite in igiena personala (unghiera, forfecuta pentru unghii, pila pentru unghii, prosop), baile publice (dusumeaua, gratarul de lemn

din saune, bazine de inot). •Persoane predispuse: unghie incarnata, varsnicii, tratament prelungit de antibiotice

Candidoza orofaringiana • Candida este prezenta in flora normala a orofaringelui aceasta devine patogena in diferite

cazuri: imunitate scazuta: bolnavi varstnici, diabetici, cu neoplasme, antibioterapie de lunga durata, SIDA, alimentatia (deficiente nutritionale ale: riboflavinelor, folatilor, Fe.) insa aceasta poate fi contactata si in urma consumarii unor alimente infestate

• Candida albicans este cea mai frecventa specie implicata in aparitia candidozei bucale poate fi si asociata si cu infectii bacteriene cu: streptococi, stafilococi, enterococi

• Clinic, se prezinta sub forma unei zone triunghiulare aspre, eritematoase si/sau edematoase, localizata la nivelul ambelor si, mai rar, a uneia dintre comisurile bucale.

• La copii această afecţiune este frecvent asociată cu defecte genetice şi disfuncţii ale glandelor endocrine

Candidoza vulvo-vaginala

• determinata de Candida albicans in proportie de 90-85% sau Candida glabrata, krusei, inconspicua.

• Factorii care favorizeaza aparitia candidozei vulvovaginale sunt reprezentati de: administrarea pe o perioada mai lunga a antibioticelor, contraceptivelor, sarcina, diabetul, si anumite boli endocrine, poate fi transmisa sexual

• Approximativ 75% din femei dezvolta infectia odata in viata si 40–50% sunt recurente.

• Este frecvent intalnita in cazul femeilor insarcinate in trimestrul al treilea de sarcina si poate determina complicatii ale fatului.

• Scurgeri albicoase, discomfort

Candidoza neonatala

• Candidoza neonatală este transmisă nou- născutului in momentul nasterii in urma tranzitarii tractului vaginal şi se constată prezenţa acesteia la 5% din nou- născuţi; apare de cele mai multe ori în cavitatea bucală sau mai rar sub forma unei infecţii a pielii în jurul anusului şi în jurul organelor genitale.

• La nou-nascuţi , candidoza generalizata se dezvoltă doar în mod excepţional în condiţii de imunitate precară. Infectarea copilului în timpul naşterii, poate duce la apariţia candidozelor pulmonare, care îi poate produce moartea mai ales dacă nou- născutul este preamatur

Candidoza de scutec

• Candidoza de scutec apare la puţin timp de la naştere şi este determinată de invadarea speciilor genului Candida datorită umidităţii crescute.

• Acest lucru este posibil exclusiv din motive de igienă, în mod special prin neschimbarea scutecului bebeluşului. Leziunile care se dezvolta la nivelul tegumentelor acestuia sunt leziuni eritematoase tip satelit (pustule

satelit), cu eroziuni ale tegumentelor.

Reguli generale – administrarea tratamentelor antifungice

• evitarea toxicitatii• asigurarea dozelor optime • monitorizarea complicatiilor

Mecanismele de virulenta la speciile din genul Candida

Aderenţa – Adezinele

Dimorfismul celular (blastospori, pseudohife, tubi de germinaţie, hife)

Modificarea fenotipica

Producerea unor enzime extracelulare- proteinaze, fosfolipaze, lipaze, esteraze, DN-aze,

Formarea biofilmului

Rezistenta la substante antifungice

C. albicans patogena/nepatogena

Figure 1. Tesut inainte de infectie

Figure 3. infectia cu C. albicans dupa 48h drojdiile destabilizeaza tesutul

Figure 2. Infectiia cu tulpini de C. albicans nepetogena

Etapele procesului infectios

Aderenta

• Aderenta celulara este esentiala in procesul de colonizare a celulele epiteliale si de

formare a biofilmelor.

• Adezinele se leaga la componente ale matricei extracelulare cum ar fi laminina,

fibrinogenul si fibronectina

• Adezinele Als, Ala si Hwp1 fac parte din grupul de proteine din peretele celular

glicozilfosfatidilinozitol dependente.

• Expresia genelor care codifica aceste proteine este reglata de factori transcriptionali ca

Bcr1, Tec 1, Nrg 1, Tup 1.

• Capacitatea de aderenta este dependenta de starea celulelor, astfel in stare germinativa

(hifa) aderenta este de 5 ori mai mare decat in faza de blastospori. Factorii care contribuie la

cresterea aderentei formelor hifale include schimbari calitative ale adezinelor si exprimarea

unor adezine specifice.

Testarea capacitatii de aderenta la substrat inert si la linii celulare

A. Candida albicans ATCC 10231

B. Candida parapsilosis CBS 604

C. C. albicans CMGB 318

D. C. albicans CMGB 319

E. C. albicans CMGB 320

F. C. albicans CMGB 321

G. C. albicans CMGB 322

H. C. parapsilosis CMGB 323

I. C. parapsilosis CMGB 324

J. C. albicans CMGB 325

K. C. albicans CMGB 326

L. C. albicans CMGB 327

FORMAREA DE BIOFILME

Enzimele hidrolitice produse de speciile din genul Candida

ProteinazeFosfolipaze

LipazeEsterazeFosfatazeDN-aze

Rolul enzimelelor hidrolitice

• Achizitia de nutrienti

• Distrugerea membranei celulare

• Diseminare

• Inactivarea moleculelor implicate in apararea organismului

gazda

Proteinazele produse de specii din genul Candida

• Aspartil proteinaze

• Serin proteinaze

• Cistein proteinaze

• Metalo proteinaze

Aspartil proteinazele

• Codificate de gene SAP [SAP 1-10] • Proteinele Sap functie similara si cu proprietati diferite (masa molec., pH izoelectric)• Proteina matura dimensiuni 35-48kDa si contine doua regiuni conservate care

interactionaza cu resturile de acid aspartic • Sap 1-8 secretate extracelular iar 9 si 10 sunt ancorate de membrana prin GPI

(glicozilfosfatidilinozitolul) • Molecule scindate de aspartil proteinaze sunt:

- matrixul extracelular si prot. de supafata ex.: colagenul, laminina, fibronectina mucinul sunt degradate cu o rata mai mare de Sap2.

-diferite proteine ale gazdei implicate in aparare precum: lactoferina salivara, alpha-macroglobulinele, precursori ai factorilor de coagulare, macrofagele, majorit imunoglabulinelor inclusiv IgA care e rezistent la majoritatea proteinazelor bateriene.

-componente cheie ale sitemului imunitar precum: citokinele proinflamatorii interleukina 1beta, lactoperoxidaze, catepsina D, comp. complement

Astfel proteinele Saps au rol in mentinerea raspunsului inflamator la nivelul epiteliului in vivo.

• Aspartil proteinazele sunt inhibate de pepstatin A, un hexapeptid izolat din tulpini de Streptomyces

Expresia genelor SAP• reglajul SAP are loc la nivel transcriptional se sintetizeaza o prepropeptida care e

cu aprox 60 de aa mai mare decat enzima matura si este alcatuita din molecula semnal si propeptida

• Scindarea are loc la nivelul RE si este realizata de o proteinaza, dupa care este transportata de o proteinaza Kex2-like iar capatul carboxi e procesat la nivelul AG pentru a obtine enzima activa.

• Exprimate constititiv: SAP9 si SAP10 sau in functie de conditiile de mediu (restul proteinelor)

Expresia este influentata de:• pH, ( Sap 1 si 3 actioneaza la pH acid, iar Sap 2,4 si 6 sunt stabile la pH neutru)• temperatura, (la 250 C, creste rata transcrierii genei Sap8 )• sursa de N, (albumina serica bovina –Sap 2)• forma morfologica (Sap 4-6 exclusiv formele de hifa si Sap 1-3 secretate de

formele blastospori) • un alt factor care este implicat in reglajul expresiei genelor Sap este localizarea

infectiei cu Candida si interactiunea cu celulele gazdei

Evidenţierea activităţii proteinazelor

Serin proteinazele

• Active pH 5-7.2 • Hidrolizeaza mai multe substraturi cel inclusiv matrixul

extracel. si dif. prot serice

Metalo proteinazele

• Fam Rbt5 sunt implicate in acumulare de Fe de la niv hemoglobinei

• Fe necesar in metab cel. drojd

• In timpul infectiei cel de drojdii sunt supuse riscului actiunii sp. reactive de O2 care apartin sistemului de aparare al gazdei

(catalaza, SOD, p. soc termic)

Fosfolipazele

Fosfolipaza A (hidrolizeaza leg. acil dintre esterii AG)

Fosfolipaza B (hidrolizeaza leg. acil din pozitia 1 si 2 de la nivelul glicerolului)

Fosfolipaza C (hidrolizeaza leg. fosfodiesterice de la niv. scheletului fosfolipidic producand 1,2- aacil-lizofosfolipid sau 1-acil-lizofosfolipid)

Fosfolipaza D (scindeaza leg. fosfodiesterica obtinandu-se acid fosfatidic si colina sau etanol amina.

FOSFOLIPAZELE

• Expresie ridicata in timpul invaziei datorita scind legaturilor esterice dintre glierofosfolipidele mb. cel.

• Prezente si la alte microorganisme: Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, neoformans, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii;

• Difera modul de actiune si legaturile pe care la scindeaza;

• in ultimii ani au fost puse in evidenta si la late specii de Candida precum: glabrata, parapsilosis, tropicalis, krusei;

• Prima gene identificata a fost PLB1 care se afla pe cromozomul 6 si care prezinta o omologie de secventa de 45% cu gena PLB1 de la S. cerevisiae

Expresia fosfolipazelor

• Genele PLC sunt exprimate in ambele forme morfologice

• Expresia genei PLB1 este reglata de factori nutritinali, de temperatura de pH, cat si de faza de crestere

• Secretia fosfolipazei B a fost evidentiata in timpul invaziei tractului gastrointestinal la soareci dar nu si in cazul infectiei vaginale

Evidenţierea activităţii fosfolipazice

(incubare de 48 de ore)

Lipazele

• Codificate de genele LIP 1-10 (1965) prot. Prezinta o similaritate in aa de pana la 80%

• Hidrolizarea TAG in glicerol si AG

• Sunt reglate si exprimate diferit

• Evidentiate prin cultivarea cu tween ca unica sursa de C

• Stabilitate termica ridicata, rezistenta la solventi organici si la actiunea unor proteinaze

• Rol: digestia lipidelor pt acumulare de nutrienti, aderarea la cel gazdei, initierea proc

inflamatorii si competenta cu alte microorganisme,

• Actineaza asupa gr. esterice de la niv mona di si triacizi glicerolilor si de la niv

fosfolipidelor

Expresia genelor LIP

• Au fost evidentiate si la speciile: C. tropicalis, parapsilosis, krusei si glabrata

• Tote genele LIP contin secvente conservate 4 resturi de Cys, un situs N-glicozilat si

acelasi grad de hidrofobicitate.

• Gena LP7 mai contine la capatul N-terminal o secv semnal.

• Genele LIP3–LIP6 au fost evidentiate in diferite medii si in toate fazele de crestere.

• Genele LIP1, LIP3, LIP4, LIP5, LIP6 si LIP8 sunt exprimate atat in mediu cu Tween 40

ca unica sursa de C dar si in mediu fara lipide.

• Expresia genelor LIP a fost studiata si pe model animal si s-a constatat ca genele

LIP4–LIP8 sunt exprimate la toate animalele.

• LIP1, LIP2, LIP3 si LIP9 au fost detectate in infectiile gastrice insa nu sunt exprimate

in infectiile mucoasei orale.

Hemolizinele

• Tulpinile de Candida prezinta hemoliza de tip si

• Insuficiente date obtinute pana la ora actuala, hemoliza a fost asociata cu mai

multi factori: prezenta unei mananproteine, producerea de fosfolipaze, lipaze,

proteinaze extracelulare

• Expresia factorilor implicati in hemoliza este dependenta de forma unicelulara

sau hifala, de conditiile de mediu (sursa de carbon, temperatura

Evidenţierea activităţii hemolitice

Evidenţierea activităţii hemolitice(incubare de 24/48 de ore)

DN-azele

• Rol in degradarea Neutrophil extracellular traps (NETs) • Inhibarea unor mecanisme de generare a speciilor reactive de oxigen in

cazul neutrofilelor

Diseminarea in organism

Candida albicans invadeaza tesutul cu ajutorul pseudohifelorPoate patrunde in sange pe la nivelul epiteliilor lezate dar si pe la nivelul mucoasei intestinale.Dispozitivele medicale (catetere, endoproteze, implanturi dentare, articulatii artificiale)

Principalele clase de antifungice

• Polienele (amfotericina B, nistatinul, natamicinul, candicin etc.)

• Azolii: imidazoli (ketoconazolul, clotrimazolul, miconazolul ) triazoli (fluconazol, voriconazol, posaconazol, itraconazol) tiazoli (abafuginul)

• Alilaminele (terbinafina, amorolfina, butenafina)

• Morfolinele (amorolfine)

• Echinocandinele (caspofungin, micafungin, anidulafungin)

• Altele: 5-fluorocitozina, acidul benzoic

Determinarea sensibilitatii la diferite substante antifungice

Testarea calitativă

A B C D

Testarea cantitativă

A B

C D

Fluconazolul

• Timp de injumatatire: 30h

• Metabolizat de ficat 12%

• Excretat- renal 61-88%

• Utilizat in: infectii interne Cryptococcus (meningitei criprococica)

• Infectii ale cavitatii bucale si esofagului, pielii, sange, cailor urinare si vaginale produse de Candida

• Toxicitate: scazuta

Mecanismul de actiune

• Fluconazolul actioneaza asupra enzimei lanosterol-14α-demetilaza

impiedicand formarea ergosterolului si astfel sunt acumulati compusi

toxici in organism

• Ergosterolul este un sterol care se gaseste la nivelul membranei celulare a

drojdiilor si care are rol in mentinrea functionalitatii membranei

Mecanismul de actiune/ rezistenta al fluconazolului

Echinocandinele

• Tratarea sp. Candida (rezist. la trazoli), actiune fungistatica asupra speciilor Aspergillus

• Caspofungina –tratarea candidemiei, candidozei esofagiene, neutropeniei febrile• Micafunginul- transplant de cel stem hematopoetice, candidoze esofagiene• Anidulafunginul- Food and Drug Administration în februarie 2006

Puncte tari• Toxicitate relativ scazuta• Grad de interactiune cu alte medicamente redusPuncte slabe• Costul de productie ridicat

Alilaminele• Clorhidratul de butenafinaşi terbinafina au fost introduse in 1993, în Japonia.

• Terbinafina actioneaza asupra: unei game largi de dermatofiti, fungi si drojdii

din genul Candida

• Terbinafina (administrata pe cale orala) este utilizata in tratarea

onicomicozelor, este bine tolerata de organismul uman si prezinta relativ un

grad scazut de interactiune cu celelalte medicamente. Este considerat ca

facand parte din prima linie de tratament alaturi de itraconazol in cazul

micozelor cutanate negeneralizate (restranse)

Amfotericina B

• Sintetizat in 1957• Timp de injumatatire: prima faza-24h, a doua faza-15 zile• Excretat: renal si biliar• Amphotericin B este produsa de Streptomyces nodosus.• Spectru larg de actiune: Candida, Aspergillus, Trichosporon beigelii, Fusarium. • Nefrotoxicitate ridicata• Pt scaderea toxicitatii s-a adaugat o coada lipidica pt a impiedica legarea de

colesterol (scadere cu 45-75%)

Mecanismul de actiune al amfotericinei B

Mecanismul de rezistenta

• Scaderea concentratiei de ergosterol de la nivelul membranei plasmatice (in urma aparitei unei mutatii la nivelul unor enzime implicate in biosinteza ergosterolului )

• Cele mai frecvente mutatii apar la nivelul genelor care codifica pentru enzimele implicate in ultimele etape ale sintezei ergosterolului. Mutatiile conduc la o scadere a sensibilitatii la poliene fara o destabilizare a

membranei celuare.

Directii de cercetare

• Descoperirea unor metode rapide de identificare si detectare a tulpinilor de Candida patogene

• Gasirea unor noi compusi cu actiune antifungica

• Intelegerea mecanismelor moleculare implicate in patogenitate

• Metode de control a tulpinilor patogene de la nivel clinic