Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

ELEMENTELE FIGURATE ALE SÂNGELUI

I. Hematiile ( globulele roşii )II. Leucocitele ( globulele albe )III. Trombocitele ( plăcuţele sanguine )

Frotiul sanguinSe ia o picătură de sânge obţinută prin puncţionarea unei vene

sau a unui capilar ( nu conţine anticoagulant – EDTA ) sau din sânge amestecat cu anticoagulant – EDTA şi se pune pe o lamă de sticlă anterior degresată cu alcool-eter. Cu marginea unei lame şlefuite se va întinde picătura de sânge. Mişcarea de alunecare uniform se realizează la un unghi de 25-30°. Se imprimă apoi lamei şlefuite o mişcare de translaţie uşoară, ceea ce permite sângelui să se întindă într-un strat subţire. Frotiul sanguin satisfăcător trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

Să fie subţire Să fie omogen Marginile să fie drepte Să prezinte franjuri la capătul lamei

Imediat după întinderea frotiului, lama se agită pentru uscarea rapidă la aer. Frotiul trebuie colorat cât mai curând întrucât, în lamele nefixate şi necolorate, celulele se alterează, pierzându-şi afinitatea tinctorială.

121

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Metode de colorare a frotiurilor:I. METODA MAY-GRÜNWALD-GIEMSA - rămâne cea mai ieftină şi accesibilă metodă în majoritatea laboratoarelor de la noi din ţară. Această metodă foloseşte două soluţii colorante:

- soluţia May-Grünmwald care este eozinat de albastru de metilen dizolvat în metanol absolut,

- soluţia Giemsa care este un amestec de doi coloranţi (un colorant bazic Azur II şi un colorant neutru Azur II eozină) dizolvaţi în metanol absolut şi glicerină. Există mai multe variante de colorare prin această metodă: a. Metoda 1:

fixare în alcool metilic - 15 minute uscare în aer - 15 minute colorare cu soluţia May-Grunwald buffer (soluţie tamponată)

timp de 5 minute, spălare în soluţie tamponată - 2 minute, colorare cu soluţia Giemsa tamponată - 25 minute spălare sub jet de apă de robinet - 5 minute uscare.

Reactivi: - alcool metilic; - soluţie "Sorenszen" tamponată:

soluţie A - 9,078g KH2P04 / 1 l; soluţie B - 11,876g NO2HP042H2O /11;

- soluţie May-Grunwald modificată pentru microscopie (soluţie de eozinat de albastru de metilen );- soluţie Giemsa pentru microscopie (soluţie de azur eozină şi albastru de metilen).

122

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Soluţiile de lucru se prepară astfel: - soluţia tamponată pentru lucru: 20 ml soluţie A + 21 ml soluţie B + 960 ml apă distilată se aduce la un ph de 7 - soluţie tamponată May-Grunwald: 50 ml soluţie May-Grunwald + 50 ml soluţie tamponată (se prepară săptămânal). - soluţie Giemsa tamponată: 10 ml soluţie Giemsa + 90 ml soluţie tamponată (se prepară zilnic).

b. Metodă de colorare May-Grunwald Giemsa modificată utilizează soluţii concentrate (soluţii stoc). Astfel, în acest caz se folosesc următoarele soluţii:

- reactiv May-Grunwald (stoc) - amestec de Eozină- Albastru de metilen (0,5 g) şi metanol 1OOg ( se schimbă la 2 săptămâni ),

- soluţie Giemsa ( stoc ) ( se schimbă zilnic ): - Azur II eozină - 0, 6 g - Azur II - 0,16 g - Glicerină - 50 g - Metanol - 100 g

Din aceste două soluţii stoc se prepară soluţiile de lucru: - May-Grunwald - 2/3 soluţie stoc May-Grunwald + 1/3 metanol Giemsa - Giemsa - 1/10 soluţie stoc Giemsa + 9/10 apă distilată.

Pentru colorare sunt necesare 5 etape: colorare cu soluţie de lucru May-Grunwald - 5 minute

(după fixarea prealabilă a frotiurilor prin uscare în aer urmată de postfixare în metanol,

spălare în apă de robinet, colorare cu soluţie Giemsa de lucru - 15 minute, spălare abundentă în apă de robinet,

123

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

uscare în aer.

Rezultatul coloraţiei: nuclei violet, citoplasmele cu nuanţe de albastru sau roşu în funcţie de tipul de celulă.

Cu cât o celulă este mai tânără, cu atât citoplasma ei este mai bazofilă, dat fiind concentraţia mare de acid ribonucleic. Pe măsura maturării, celula devine tot mai acidofilă, deoarece scade concentraţia în acid ribonucleic, ex: evoluţia eritroblaştilor. Limfocitele conţin o cantitate mică de acid ribonucleic în citoplasmă, pe când plasmocitele au o cantitate mare.

Diagnostic: Pe lamă se evidenţiază numeroase celule colorate foarte

diferit (panoptic). Predomină elementele celulare anucleate, reprezentate de

hematii. Elementele celulare nucleate ( granulocitele ) prezintă în

citoplasmă granulaţii diferit colorate şi repartizate.Se studiază: frotiul din sânge uman colorat panoptic.Numai cu obiectivul de imersie vom recunoaşte şi vom studia fiecare element figurat în parte, urmărind forma celulelor, aspectul nucleilor şi forma, mărimea şi modul de repartizare al granulaţiilor.

I. Hematiile ( globulele roşii ) sunt elemente figurate anucleate. au formă de disc biconcav cu marginile rotunjite ( acest

aspect reprezintă o perfectă adaptare la funcţia respiratorie- au suprafaţa cea mai mare la volumul cel mai redus ).

la coloraţia panoptică May-Grunwald-Giemsa (MGG) hematiile sunt acidofile (roz-intens), apar mai colorate spre

124

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

periferie, unde grosimea este maximă şi mai slab colorate în centru ( zonă numită depresiune centrală ).

Diametrul lor variază între 7,2-7,5 µm. Numărul de eritrocite pe mm³ este de 5 400 000 la bărbaţi cu

variaţii de ± 800 000 şi de 4 800 000 la femei, cu variaţii de ± 600 000. La nou-născut valorile apar mai ridicate 5 000 000, cu variaţii de circa ± 1 000 000.

Frotiul sanguin normal – hematii şi trombocite.Coloraţie MGG.

II. Leucocitele ( globulele albe )

125

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Sunt singurele elemente figurate nucleate prezente în condiţii fiziologice într-un frotiu sanguin.

Clasificarea leucocitelor se face în funcţie de prezenţa unor granulaţii în citoplasmă în: granulocite şi agranulocite. Vechea nomenclatură folosea termenul de leucocite polimorfonucleare (PMN) pentru granulocite şi termenul de leucocite mononucleare pentru agranulocite.

În funcţie de afinitatea tinctorială a granulaţiilor din citoplasmă, granulocitele (PMN) se clasifică în 3 categorii: neutrofile, eozinofile şi bazofile;

Leucocitele mononucleare sunt de 2 tipuri: limfocitele şi monocitele.

1. Neutrofilele- 50-70% Au dimensiuni între 10-15 µm Nucleul este lobat, format din 2-5 lobi, uniţi prin filamente de

cromatină.(> 5 lobi, neutrofilele sunt hipersegmentate, ex: deficienţe de vitamina B 12 sau acid folic ).

Citoplasma este de culoare roz, conţinînd un mare număr de granulaţii. Granulaţiile specifice sunt colorate în violet, mici, punctiforme, egale între ele şi repartizate în toată citoplasma.

Creşterea numărului de neutrofile peste limita maximă ( absolută sau procentuală) se numeşte neutrofilie. Se întâlneşte în infecţiile şi inflamaţiile acute.

Scăderea numărului de neutrofile se numeşte neutropenie. Ex: boli infecţionse ca febra tifoidă şi paratifoidă, gripa etc.

126

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Frotiu periferic-Neutrofil

2. Eozinofilele 2-4% Sunt elemente leucocitare acidofile, granuloase. Au dimensiuni între 12-16 µm. Nucleul este bazofil, bilobat, având aspect caracteristic de

″nucleu în desagă″. Citoplasma este eozinofilă, prezentând granulaţii roşii-

cărămizii, mari, egale între ele şi uniform repartizate în citoplasmă-aspect caracteristic de ″icre de manciuria″ ( granulaţiile respectă nucleul ).

127

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Creşterea numărului de eozinofile peste limita maximă ( absolută sau procentuală) se numeşte eozinofilie. Dintre cauzele eozinofiliei amintim bolile alergice şi parazitare.

Scăderea numărului de eozinofile din sânge este denumită eozinopenie; prezintă importanţă clinică redusă.

Frotiu periferic – Eozinofil

3. Bazofilele 0.5-1%. Au dimensiuni cuprinse între 8-10 µm. Nucleul bazofil are aspectul mai puţin segmentat, apărând

uşor scobit, aspect caracteristic de ″frunză de trifoi″. Citoplasma este eozinofilă. Granulaţiile din citoplasmă sunt bazofile ( albastru-indigo ),

au dimensiuni şi forme variabile, sunt inegal răspândite în citoplasmă, dispuse uneori şi pe suprafaţa nucleului- mascând aspectul nucleului.

128

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Prin bazofilie se înţelege creşterea numărului de bazofile din sînge. Bazofilia însoţeşte de obicei niveluri crecute de Ig E, în cursul reacţiilor inflamatorii din colite ulcerative, artrite reumatoide, urticarie etc.

Scăderea numărului de bazofile nu are nici o semnificaţie diagnostică.

Frotiu periferic- Bazofil şi limfocit mic.

4. Limfocitele 25-35 % Au diametrul variabil în sânge între 10-16 µm. Predomină limfocitele mici cu diametrul între 10-12 µm,

citoplasmă redusă, bazofilă ( albastru deschis ) şi nucleu rotund cu cromatina condensată ( nucleu hipercrom ), aspect de ″picătură de cerneală″. Au formă rotundă.

Limfocitele mari (12-16 µm ), care reprezintă în general 10% din limfocitele circulante, au citoplasmă mai abundentă, iar

129

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

cromatina nucleară este mai puţin condensată. Pot fi neregulate ca formă.

Limfocitele pot prezenta granulaţii azurofile în număr redus, granulaţii care conţin enzime lizozomale.

Creşterea numărului de limfocite se numeşte limfocitoză şi se întâlneşte în infecţiile virale ca: tusea convulsivă, mononucleoza infecţioasă. Cifrele maxime ale limfocitozei sunt întâlnite aproape constant în leucemia limfatică cronică.

Limfocitopeniile apar în caz de malnutriţie, radiaţii, infecţia cu HIV.

Frotiu sanguin-Limfocit mare.

5. Monocitele 4-8%

130

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Sunt celulele cele mai mari din sângele periferic cu dimensiuni între 12-20 µm.

Nucleul este neregulat, are aspectul literei C sau este reniform, iar cromatina nucleară are ″aspect pieptănat″,fără nucleoli; citoplasma este bazofilă, albastru-cenuşiu, cu granulaţii azurofile. Aceste granulaţii sânt dispersate omogen şi pot da întregii citoplasme o nuanţă rozată.

Forma celulei este adesea neregulată, iar citoplasma prezintă frecvent vacuole.

Reacţiile citochimice pot ajuta la identificarea monocitelor şi diferenţierea lor de granulocite. Esterazele nespecifice sunt utilizate ca un marker pentru monocite. În contrast cu esterazele din granulocite, esterazele din monocite sunt inhibate de florura de sodiu. Reacţia pentru esteraze nespecifice este pozitivă în promielocite şi mielocite. Astfel, testul de inhibiţie cu florură de sodiu este necesar pentru a diferenţia monocitele de granulocitele imature. Substraturile folosite ca reacţii citochimice: naftol AS-D cloracetatul este virtual specific pentru granulocite, iar alfa-naftol butiratul este caracteristic pentru monocite.

Funcţiile monocitului: Monocitul pătrunde în ţesutul conjunctiv şi se diferenţiază în macrofag. La locul infecţiei macrofagele reprezintă celula cu rol dominant, după moartea neutrofilelor, având capacitatea de a fagocita microorganismele, neutrofilele şi resturile tisulare distruse. De asemenea din monocite se diferenţiază osteoclastele, celule cu rol în remanierile osoase.

131

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Frotiu sanguin-Monocit.

Frotiu sanguin – Imagine comparativă: Limfocit (L) și monocit (M)

132

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

III. Trombocitele ( plăcuţele sanguine ): 150 000-400 000/mmc. Se formează din celulele precursoare numite megacariocite, în

urma fragmentării citoplasmei, proces ce se desfăşoară la nivelul măduvei hematogene.

Pe frotiurile colorate cu Giemsa, apar formate dintr-o zonă centrală, granulară, azurofilă numită granulomer; iar la periferie prezintă o zonă slab bazofilă numită hialomer.

Trombocitele au dimensiunile de 2-3 µm, formă neregulată, cu margini angulare şi sunt lipsite de nucleu.

Au rol esenţial în oprirea sângerării în hemostaza primară, prin formarea dopului plachetar; declanşarea coagulării şi menţinerea integrităţii peretelui vascular.

Trombocitopeniile reprezintă o modificare calitativă a acestor celule, manifestată prin scăderea numărului de trombocite. Apare în: aplazii medulare, infiltraţii medulare, deficit de vitamină B 12 şi acid folic, septicemie etc.

Trombocitozele reprezintă creşterea numărului de trombocite, manifestată prin tulburări de coagulare cu tromboze.

133

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

HEMATOPOEZA

Hematopoieza este procesul care asigură formarea si reânnoirea continuă a celulelor sângelui periferic. În general se păstrează un număr relativ constant de celule circulante iar hematopieza permite şi ajustarea necesităților organismului de anumite tipuri celulare la un anumit moment dat. Astfel, în hemoragii este crescută sinteza de hematii, în infecţii este crescută sinteza de granulocite etc.

Localizarea ţesuturilor hematopoietice - la adult este măduva roşie osoasă = măduvă roşie hematopoietică . Hematopoieza este realizată mai întâi prin procese de multiplicare a celulelor stem şi a celulelor precursoare, apoi urmează procesele de diferenţiere, când se întrerup diviziunile iar celulele exprimă proteine specifice pe membrană, iar în final are loc citodiaboza care constă în eliberarea celulelor mature în circulaţie.

Precursorii eritrocitari.

Nucleul Citoplasma Denumirea celuleiimatur (mare,

cromatină laxă, 2–5 nucleoli)

Intens bazofilă Proeritroblast

Cromatina devine grunjoasă

Intens bazofilă (conține numeroși

ribozomi)

Eritroblastul bazofil

134

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Cromatină condensată

Alternanţă bazofilă şi

eozinofilă (se sintetizează

hemoglobina)

Eritroblast policromatofil

Nucleu condensat Culoarea reticulocitelor

Eritroblast ortocromatic

Nucleul absent Reticulocite

Precursorii granulocitari

Nucleul Granule citoplasmatice

Denumirea celulei

imatur (mare, cromatină

dispersată, 2–5 nucleoli)

fără (citoplasma albastru-deschis)

mieloblast

doar granule azurofile

promielocite

Oval, uşor condensat

granule azurofile + granule neutrofile

sau  granule eozinofile

sau

Mielocit n.Mielocit e.Mielocit b.

135

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

granule bazofile

Forma literei C până la aspect

puternic escavat

metamielocite neutrofile metamielocite eozinofile metamielocite bazofile

Litera U -cu constricţii

Nesegmentat neutrofil

segmentat Neutrofil PMNEozinofil PMNBazofil PMN

136

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Frotiu medular, precursori eritrocitari cu proeritroblaşti

137

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Frotiu medular, metamielocit neutrofil şi PMN matur

138

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Frotiu medular – promielocit şi eritroblast.

139

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Frotiu medular, neutrofile.

140

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Frotiu medular - mielocit bazofil

141

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Frotiu medular - promielocite, seria neutrofilă, şi mielocit eozinofil.

142

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Frotiu medular – Nesegmentat (săgeți). Se observă nucleul intens colorat și cu aspect de litera C sau U, fără segmentări.

143

Histologie Medicală - Partea GeneralăLucrări practice

Elementele Figurate ale Sângelui_____________________________________________________________

Frotiu medular - Megakariocite. Porțiunile fragmentate vor fi eliminate în circulație ca și plăcuțe sanguine (trombocite).

144