CAP. 1. GENETICA DROJDIILOR. METODE MODERNE DE INVESTIGAIE A GENOMULUI DROJDIILOR

1.1 ASPECTE GENERALE DE GENETIC A DROJDIILOR

Drojdiile au ocupat ntotdeauna un loc important n istoria omenirii, datorit utilizrii lor n producerea pinii, a berii i a vinului. ncepnd ns din secolul al XIX-lea, odat cu cercetrile ntreprinse de L. Pasteur, drojdiile au devenit subiectul a numeroase studii tiinifice, care au permis att elucidarea unor aspecte de biologie i, mai trziu, genetic a celulei eucariote, ct i ameliorarea unor procedee industriale i biotehnologice.

Primele observaii privind ciclul de via al drojdiilor au fost fcute chiar la nceputul secolului XX, cunoscnd de atunci o permanent dezvoltare. Ele prezint un interes deosebit mai ales n nelegerea reglajului diviziunii celulare, care este strns legat de procesele de recombinare intercromozomale si de mecanismele de reparare a materialului genetic afectat de diveri factori mutageni.

Descoperirea i izolarea primelor secvene cromozomale (originea replicrii - ARS, centromeri - CEN, telomere - TEL) dateaz din jurul anilor 1980, n prezent, cel mai bine studiate fiind cele de la Saccharomyces cerevisiae. Pe lng implicarea lor n replicarea ADN (ARS), n desfurarea diviziunii celulare (CEN) i n meninerea cromozomilor (TEL), aceste secvene i-au gsit o aplicabilitate practic n construirea de vectori folosii pentru clonarea, exprimarea i chiar secreia unor compui heterologi de interes biotehnologic sau profilactic. n acest sens, un aport deosebit l-a avut i descoperirea n unele tulpini de drojii, a plasmidei 2 m, o macromolecul de ADN ce prezint mecanisme de replicare i reglaj independente de materialul genetic cromozomal.

Studiul genomului nuclear a fost completat cu stabilirea metodelor de determinare a

coninutului n baze azotate al ADN i cu apariia, n 1984, a primelor tehnici de electrocariotipare. Acestea din urm, permit separarea prin electroforez a cromozomilor ntregi de drojdie sub influena unui cmp electric pulsator i studiul relativ uor al complementului cromozomal prin analiza gelurilor astfel obinute.

Genomul extracromozomal al drojdiilor este reprezentat, n afar de plasmida 2 m, de sistemul killer si de ADN mitocondrial. Sistemul killer a fost descris pentru prima dat n 1963, ca fiind determinat de existena n citoplasm a unor particule de tip viral ce determin sinteza unor toxine care, eliminate n mediu pot determina moartea celulelor sensibile. Caracterizarea

acestor particule a nsemnat un pas important n nelegerea interaciilor dintre speciile de drojdii din cuvele de fermentaie din industria berii i vinului.

Elucidarea structurii ADN mitocondrial i studiul mutaiilor care pot afecta diferite gene mitocondriale, au permis acumularea de date referitoare la procesele de respiraie celular i la diverse ci metabolice specifice.

n concluzie, se poate spune c o caracterizare genetic complex a drojdiilor, cuprinde date privind morfologia i ciclul de via i analize asupra structurii fine a genomului lor nuclear i extranuclear.

Studiul genomului nuclear cuprinde date despre:

- structura secvenelor origini ale replicrii ORI sau ARS (Autonomously Replicating Seaquences = secvene de replicare autonom), a centromerilor (CEN) i a telomerilor (TEL);

- coninutul n baze azotate - cariotipul - numrul, dimensiunea i polimorfismul cromozomilor.

Studiul genomului extranuclear se refer la: - genomul mitocondrial;

- profilul plasmidial (prezena plasmidei 2 m sau 2 m - like); - sistemul killer.

1. 1. 1. Ciclul de via. Primele studii privind ciclul de via al drojdiilor dateaz de la nceputul secolului XX i

au dus la evidenierea unei alternane ntre faza haploid i diploid, pentru specii aparinnd genului Saccharomyces. Cercetri ulterioare au relevat faptul c, n timp ce unele specii pot prezenta ambele faze, altele exist n natur numai sub una dintre aceste forme, cealalt putnd fi indus prin modificarea anumitor caracteristici ale mediului de cretere.

La marea majoritate a drojdiilor apariia de noi celule este rezultatul procesului de nmugurire multilateral, un tip de diviziune celular n care mugurii apar pe o suprafa mare a celulei. Acest tip este n contrast cu nmugurirea bipolar - n care mugurii apar numai la polii celulei. Alte specii prezint nmugurire unipolar (mugurii apar numai la un pol al celulei). Drojdiile genului Schizosaccharomyces difer de alte tipuri de drojdii deoarece se divid exclusiv prin fisiune, proces reprezentat de apariia unui perete celular aproximativ n centrul celulei, mprind-o pe aceasta n dou pri. n contrast cu nmugurirea, celulele care se divid prin fisiune prezint o constricie slab sau nu prezint de loc constricie la nivelul peretelui celular nou format.

n afar de formarea de celule noi prin nmugurire sau fisiune, unele specii pot dezvolta hife sau pseudohife. Hifele se caracterizeaz prin lipsa constriciilor la nivelul pereilor

despritori, spre deosebire de pseudohife care prezint perei despritori, formndu-se prin nmugurire.

Drojdiile se pot reproduce sexuat, cu formare de ascospori, pot forma teliospori sau

bazidiospori. Ascosporii prezint forme variate i aspecte diferite a suprafeei observate la microscop. Cea mai ntlnit form este cea de plrie, dar mai pot avea i forme sferice, ovale, alungite, elipsoidale, cu pliuri pe suprafa. Bazidiosporii pot apare din teliospori sau din hife i au form elipsoidal sau alungit.

Speciile de drojdii care se reproduc sexuat prezint celule 2 de tipuri de mperechere opuse. La S. cerevisiae, tipurile de mperechere sunt determinate de prezena uneia dintre cele 2 gene alele a sau , plasate la nivelul locului MAT (mating type): MAT a i, respectiv, MAT , pe braul drept al cromozomului III. Prezena genelor determin sinteza i secreia n mediu a unor proteine, denumite factori de mperechere, care sunt recunoscute de celulele tipului opus de

mperechere, declannd o serie de evenimente care duc n final la formarea de diploizi MAT a/ MAT . Unele tulpini de drojdii prezint o gen HO care codific o endonucleaz care produce o bre monocatenar la nivelul locusurilor de mperechere MAT, producnd interconversia locusului de mperechere, adic schimbarea tipului de mperechere al celulelor n cel de tip opus (pentru S. cerevisiae, celulele de tip a devin i invers). Astfel de tulpini se numesc homotalice. Tulpinile care prezint alela nefuncional ho, nu manifest procesul de interconversie i se numesc tulpini heterotalice.

1. 1. 2. Analiza genomului nuclear

(A) Secvenele ARS, CEN i TEL Secvenele ARS au fost descrise pentru prima dat n 1979 la S. cerevisiae, sunt circa 400 secvene /genom i se succed la fiecare 30 40 kpb. La nivelul lor ncepe replicarea ADN din cromozomi.

O secven ARS este constituit din 2 domenii (Fig. 1): (1) domeniul A format din 11 pb, cu secven relativ nalt conservat la toate speciile de drojdii (ACS ARS consensus seaquence) i procent de A/T ridicat (73- 82%):

5' (A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T) 3'

La nivelul acestei secvene se leag un complex format din 6 proteine (ORC origin of replication complex) de tip helicaze i ATP-aze, implicate n procesele de iniiere a replicrii ADN.

Mutaiile de la nivelul acestei regiuni duc la blocarea replicrii ADN. (2) domeniul B este constituit din 3 subdomenii:

B11 - se leag de complexul ORC, odat cu domeniul A B21 cu rol structural

B31 este situs de legare pentru proteina Abf1p

Domeniul B are funcie dubl: (i) asigur modificarea conformaional a ADN (plierea) la acest nivel, anterior legrii complexului ORC, facilitnd astfel aciunea ulterioar a acestuia; (ii) prin asocierea cu proteina Abf1p, mpiedic asamblarea ADN de la nivelul secvenei ARS n structuri nucleozomale, ceea ce l face accesibil interaciunii cu proteinele necesare replicrii.

Deleia domeniului B duce la anularea funciei secvenei ARS.

Fig. 1. Structura secvenei ARS la drojdii

Secvenele CEN Clarke i Carbon (1980) au izolat prima secvena centromeric din cromozomul III de la

S. cerevisiae. Importana deosebit a centromerilor rezid n faptul c la nivelul lor se formeaz kinetocorii la care se ataeaz fibrele fusului nuclear de diviziune.

Secvenele CEN au aproximativ 120 pb, fiind plasate n interiorul unei regiuni mai mari de 250 pb, cu rezisten cerscut la atacul nucleazelor. Nucleozomii de la acest nivel au o structur uor modificat fa de restul fibrei de cromatin, prezentnd o histon Cse4p, care interacioneaz cu histona H4.

Secvenele CEN sunt formate din 2 regiuni nalt omoloage (CDE I i CDE III) care flancheaz o regiune unic (CDE II), fiecare dintre acestea interacionnd cu una sau mai multe proteine (Fig. 2).

Fig. 2. Structura secvenei CEN la drojdii

Regiune CEN Dimensiune Protein ataat Observaii CDE I 9 pb CBF1 (dimer) Mutaiile de

blocheaz funla acest nivel reduc, dar nu

cia CEN CDE II 78 - 86 pb

st nivel reduc, dar nu

Cse4, Mif2 Secven de baze conservat la toate speciile de drojdie Coninut - 90% A/T Mutaiile de la aceblocheaz funcia CEN

CDE III 11 pb CBF 3 (tetramer: 3A, 3B, 3C, 3D)

Mutaiile punctiforme de la acest nivel inactiveaz funcionarea CEN Proteina CBF 3 asigur asocierea cu fusul de diviziune i este implicat n deplasarea cromozomilor n cursul diviziunii celulare.

Trebuie subliniat faptul ca CDE I i CDE III pot prezenta variaii ale secvenei de baze azo

TCCGAAA

Secvenele TEL

tate, pe cnd CDE II este conservat la toate drojdiile : CDE I: A/G TCAC A/G TG

CDE III: TGTTT T/C TGNTT

zint terminaiile cromozomilor i sunt extensii lineare, monocatenare ale mo

rele sunt formate din secvene repetate n tandem de 5 8 pb, cu grad nalt de

EL sunt nrudite cu cele de la ciliatul Tetrahymena, fiind formate

din sec

sau T (G)1-3(TG)1-6

TT

ng aceste terminaii de ADN monocatenar, n structura telomerelor la drojdii, intr i 2 reg

nucleosomi n care histonele sunt hiperacetilate.

Telomerele repre

leculelor de ADN din care sunt constituii acetia. Ele au rolul de a proteja capetele cromozomilor mpotriva recombinrii, fuziunii cu ali cromozomi sau a degradrii lor de ctre nucleaze. De asemenea, joac un rol important n determinarea numrului de runde de replicare pentru o celul normal.

n general, telome

similitudine chiar ntre eucariote ndeprtate i deci, relativ puternic conservate n cursul evoluiei. ntre genuri i specii diferite apar ns variaii n ceea ce privete structura secvenelor i, mai ales, dimensiunile lor.

La drojdii, secvenele Tvene T(G)1-3 repetate de un numr variabil de ori:

Saccharomyces cerevisiae TGTGGGTGTGGTG

Candida glabrata GGGGTCTGGGTGCTG

Candida albicans GGTGTACGGATGTCTAACTTC

Kluyveromyces lactis GGTGTACGGATTTGATTAGGTATGT

Pe l

iuni subtelomerice notate Y' i X (Fig.3), formate din ADN dublucatenar constituit din secvene repetate C 1-3 A/TG 13, mpachetate n structuri denumite telosomi, care sunt de fapt

Regiunea Y' este plasat n imediata vecintate a telomerelor, spre captul cromozomilor, avnd o dimensiune de 5,2 - 6,7 kpb. Ea poate exista n 0 - 4 copii / telomer.

Regiun

e mici repetitive cu dimensiuni de 35 560 pb.

area ADN dublucatenar cromozomal la acest nivel.

ea Y' se poate muta de pe un cromozom pe altul n timpul diviziunii celulare mitotice

sau meiotice, prin recombinare mediat de RAD52. Regiunea X se gsete spre interiorul cromozomului, spre centromer i are o dimensiune

variabil: 0,3 3,75 kpb, fiind compus din 5 secven

n interiorul celor dou regiuni Y' i X, au fost identificate secvene ARS cu rol n replic

Fig. 3. Structura secvenei TEL la drojdii

Dimensiunea i func ne nucleare: - TEL1 i TEL2 controleaz lungimea telemorelor;

azei;

ferit de cel obinuit de replicare e, telomeraz, care utilizeaz

secven

tion Effect), datorat

mple

Determinarea conminutului n baze azotate reprezint, la ora actual, o caracteristic ate, pentru fiecare specie de drojdie studiat fiind

stabilite

iile asociate telomerelor sunt reglate de ge

- PIF1 ADN helicaz care inhib replicarea necontrolat a telomerelor; - EST1 codific polimeraza din componena telomer- TLC1 determin sinteza ARN din structura telomerazei.

Replicarea telomerelor se realizeaz dup un mecanism dia ADN dublucatenar, implicnd aciunea unei ribonucleoprotein

a repetitiv monocatenar TG ca matri n sinteza catenei pereche. Telomerele au capacitatea de a represa transcrierea genelor plasate n vecintatea telomerelor, fenomen numit efect de poziie (TPE Telomere Posico xrii histonelor cu proteine Rap1, Sir3 i Sir4. Fenomenul este metastabil, adic, ntr-o populaie de celule, o gen telomer-linkat este transcris n unele celule, iar n altele nu. Cu toate acestea, genele implicate n metabolismul anumitor zaharuri (SUC - sucroz, MAL - maltoz, MEL - melibioz), se gsesc plasate preferenial n apropierea telomerelor.

(B) Coninutul n baze azotate a ADN

menionat n toate determinatoarele de specialit procentele ntre care variaz aceste valori. De regul, datele se refer la procentul molar

de guanin i citozin al ADN, notat mol % GC. S-a constatat ca, n general, procentul GC al

drojdiilor ascomicete este de aproximativ 30 - 50% n timp ce la drojdiile basidiomicete este de

50 - 70%. Exceptnd zona ngusta a valorilor de 48 - 52% unde apar unele suprapuneri, clasa

drojdiilor imperfecte poate fi determinat satisfctor prin calcularea procentului GC. Estimarea coninutului n G+C al moleculelor de ADN se poate realiza prin metode

directe i indirecte:

ADN cu obinerea unui amestec de nucleotide din care se determin, de fapt,

i citozin din molecul, densitatea unei molecule de ADN

lor azotate

guanina

vent utilizat, fiind simpl i cu un grad nalt de

rbia ADN dublu

Metode directe tehnica HPLC (high performance liquid chromatography); se bazeaz pe hidrolizaprocentul tuturor bazelor azotate;

Metode indirecte - se bazeaz pe faptul c proprietile fizice ale ADN sunt puternic influenate de coninutul n guanineste cu att mai mare cu ct coninutul su n guanin i citozin este mai ridicat existnd o relaie linear ntre densitatea de plutire a diferitelor tipuri de ADN i coninutul lor n G+C.

Coninutul G+C se poate determina indirect, prin tehnica densitii de plutire a ADN (buoyant density) - densitatea ADN dublu-catenar crete linear cu proporia baze

i citozina; substratul chimic al acestei relaii const n existena a trei puni de hidrogen ntre perechile de baze G-C, care devin astfel mai compacte i mai dense dect perechile de baze A-T, unite doar prin dou puni de hidrogen. Metoda care permite aprecierea coninutului n G+C prin determinarea temperaturii de topire - Tm a ADN este ns cel mai frecreproductibilitate. Tm (melting midpoint) reprezint temperatura n grade Celsius la care, dintr-o mas de molecule ADN, jumtate din ele se gsesc n stare dublu catenar i jumtate n stare monocatenar (sunt denaturate), respectiv temperatura de echilibru ntre ADN dublucatenar (ADNdc) i ADN monocatenar (ADNmc). Termenul de topire (melting) este utilizat deoarece nclzirea furnizeaz energia necesar ruperii legturilor de hidrogen. Denaturarea ncepe n regiunile bogate n A-T i continu progresiv n cele cu coninut crescut n G+C, astfel nct valorile Tm depind direct de acesta; ele cresc proporional cu mol % GC, datorit cantitii mai mari de energie necesar pentru a desface cele trei legturi de hidrogen dintre guanin i citozin, spre deosebire de perechea A-T, care prezint numai dou legturi de hidrogen. Bazele purinice i pirimidinice din structura ADN absorb radiaiile UV cu =260nm, lungime de und care este folosit pentru determinarea cantitativ a ADN. Absocatenar nativ la 260nm este mai mic dect absorbia mononucleotidelor sale componente, fenomenul fiind denumit efect hipocromic i se datoreaz interactiunilor electronice dintre bazele azotate stivuite din structura dublu-helical a ADN nativ, fapt ce diminueaz cantitatea de lumin pe care o poate absorbi fiecare baz. Dac ADN dublu catenar nativ este supus denaturrii termice se produce o cretere a absorbiei luminii la 260nm de circa 40% n funcie de tipul de

ADN, fenomen cunoscut sub denumirea de efect hipercromic. Acest efect crete cu coninutul n A-T, iar temperatura de topire cu coninutul n G+C. Prin nclzirea la temperaturi cuprinse ntre 60-1000

i se separ n molecule monocatenare. C moleculele de ADN sufer o rupere

a legturilor de hidrogen ce leag bazele azotate Dinamica procesului de denaturare termic este urmarit prin efectul hipercromic creterea capacitii de absorbie a radiaiilor UV, la lungimea de und de 260nm i care are loc n timpul denaturrii. Valorile absorbanei la 260nm (A260) se nscriu n grafic, rezultnd curba de shift hipercromic (Fig. 4 a ; b)

(a)

(b)

Fig. 4. Aspectul general al curbei de shift hipercromic pentru tulpini de drojdii izolate din medii poluate cu com ui petrolieri

(a - Rhodotorula glutinis ; Candida parapsilosis)

n funcie de e relaii matematice. entru drojdii se folosesc cele stabilite de Owen (1985) i Frank (1971):

(C) Stpariia i dezvoltarea tehnicilor electroforetice speciale care permit separarea n stare

in caracterizarea seturilor de cromozomi

aparinn

pb

Tm se poate exprima mol % GC, folosind numeroas

P

% mol G+C = 2.08 x Tm - 106,4 ( dup Owen, 1985) % mol G+C = 2.44 x (Tm - 53.9) ( dup Frank, 1971)

ructura cariotipului; electrocariotiparea. A

tact a moleculelor de ADN cromosomal au facut posibild unor eucariote inferioare (protozoare i fungi) care, de altfel, prezint dificulti n

aplicarea analizelor clasice citogenetice i genetice. Astfel, n cazul drojdiei Saccharomyces cerevisiae, analiza grupelor de linkage era, pn nu de mult, singura metod de numrare i difereniere ntre cromozomi. Prin cartare genetic s-a stabilit existena a 16 cromosomi cu o dimensiune medie cuprins ntre 500 1000 kpb. Dimensiunile reduse i lipsa diferenierii cromozomilor n timpul mitozei i meiozei, au constituit un impediment n realizarea cariotipului la drojdii prin metode clasice aplicabile la celelalte eucariote.

Ideea utilizrii unei separri electroforetice n stare intact a moleculelor de ADN cromozomale ca alternativ la cariotiparea prin metode clasice a fost mult timp vehiculat, dar acest lucru a f

i

izrilor moleculare de tip Southern blott cu sonde m

gth polymorphism

CLP),

riginal a fost utilizate de Schwartz i Cantor (1984) pentru orice sistem de elec

a moleculelor de ADN; (3) rezoluia benzilor electroforetice; (4) suprafaa de gel care permite o bun separare (Tab. 1).

ost posibil numai n 1982 cnd Schwartz i colab. au reuit construirea unui nou sistem de electroforez i au artat c mobilitile electrice ale moleculelor de ADN de cteva sute de kpb sunt strns dependente de dimensiunile lor cnd sunt supuse migrrii n geluri de agaroz n prezena a 2 cmpuri electrice alternative. Apariia electroforezei n cmp electric pulsator (pulsed field gel electrophoresis - PFGE) i modificrile ulterioare aduse de ali cercettori acestei tehnici au creat premisele unei noi abordri a studiului cromozomilor de drojdii. Tehnica PFGE permite separarea moleculelor de ADN cu dimensiuni cuprinse ntre 50 10 000 kpb (10 Mb).

Cmpurile electrice pulsatorii sunt aplicate n diferite direcii. Tehnica este optim pentru separarea cromozomilor de S. cerevisiae care au de la 200 kb la 3 Mb. Tehnica a mai fost aplicat cu succes i la specii aparinnd genurilor Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces, Hanseniaspora, Candida.

Pentru speciile de drojdii care nu prezint ciclu sexuat pentru care nu pot fi realizate n laborator experimente de ncruciri, realizarea hibrid

arcate corespunztoare unor gene markeri pentru fiecare cromozom n parte (cromozomi separai prin PFGE) a permis stabilirea grupelor de linkage. De asemenea, combinarea tehnicii PFGE cu restricia cromosomilor separai electroforetic a permis realizarea hrilor genetice. Tehnica PFGE are o larg utilizare i n construirea sau definirea unor biblioteci de cromozomi cu rol n clonarea genelor i n cartare. n acest sens, n ultimii ani cea mai important utilizare a PFGE a fost izolarea secvenelor genomice mari inserate n vectorii de tip YAC.

Posibilitatea separrii intacte a cromosomilor a relevat faptul c majoritatea speciilor sunt caracterizate de un polimorfism de lungime al cromozomilor (chromosome len

proces datorat rearanjamentelor cromozomale din timpul mitozei i meiozei sau care apar ca urmare a unor mutaii.

Termenul de PFGE rmane ns confuz din cauza numrului mare de acronime utilizate n cursul anilor. Termenul o

troforez care utilizeaz cmpuri electrice alternative. Ulterior au fost atribuite diferite denumiri unor sisteme PFGE care implic variaii ale geometriei electrozilor, omogenitii i reorientrii cmpului electric. Marea majoritate a acestor nume sunt utilizate pentru a descrie un anumit tip de design al aparatului (geometria electrozilor, circuitul electric, etc) i nu un anumit mecanism de separare a moleculelor de ADN.

Diferenele majore dintre aceste sisteme se refer la: (1) posibilitatea obinerii de benzi electroforetice clare; (2) viteza de separare

Toate tehnicile PFGE pot fi utilizate pentru separarea moleculelor de ADN de pn la 1 Mb ; tehnicile difer ns prin gradul de dependen a mobilitii moleculelor funcie de masa lor, prin claritatea i gradul de curbur a benzilor electroforetice rezultate n final.

Acronim Sistem de electroforez Referine PFGE Pulsed field gradient gel electrophoresis Schwartz i Cantor (1984) OFAGE Orthogonal field alternating gel Carle i Olson (198

electrophoresis 4)

TAFE Transverse alternating gel electrophoresis Gardiner i colab. (1986) FIGE Field inversion gel electrophoresis Carle i colab. (1986) CHEF Contour clamped homogenous el

field ectric Chu i colab. (1986)

RGE Rotating gel electrophoresis Cross-filed gel electrophoresis

Serwer (1987) 7) Southern i colab. (198

Rotaphor Rotating electrodes gel electrophoresis Biometra Waltzer ) Cross field gel electrophoresis Anand i colab. (1989PACE controlled 1988) Programmable autonomously

electrodes Clark i colab. (

ZIFE Zero integrated field electrophoresis Turmel i colb. (1990) ST/RIDE Simultaneous tangential/ rectangular

inversion decussate electrophoresis Kolble i Sim (1991)

Tab. 1. Acronime pentru sisteme PFGE (

aram

S e t extrem ii ale diferiilor parametrii, cum su u cmp (nainte /

invers ozei, compoziia i concentraia tamponului

dup Birren, 1993) P etrii care afecteaz sistemele PFGE

istemele de lectroforez speciale de tip PFGE sun de sensibile la variant: schimbarea timpului de migrare ntr-o anumit direcie sa

forward / reverse), tipul i concentraia agarde electroforez (Tab. 2). Parametrii controlai n gelul de electroforez

Condiiile de migrare Caracteristicile probelor Unghiul de reorientare Omogenitatea campului electr

Intervalul de schimbare a Concentraia ADN ic directiei de migrare

Tipul de agaroz

Concentraia srurilor Gradientul de voltaj Temperatura

Concentraia tamponului de electroforez

Contaminarea cu proteine

Tab. 2. Factorii care influ obilitatea p E

*Modificrile acestor para att viteza de separare a moleculelor de ADN ct i intervalul de dimensiuni ale acesto tehnica respectiv.

unei

nor benzi electroforetice cu o rezoluie ct mai mare. n acest scop sunt luate n consideraie informa

eneaz rezoluia i m robelor* n sistemele PFGmetrii influeneazra pentru care poate fi aplicat

Optimizarea parametrilor de electroforez n teniciile PFGE, urmrete asigurarea bune separri a moleculelor de ADN cromozomal de diferite dimensiuni, precum i obinerea u

iile referitoare la :

Gradientul de voltaj reprezint diferena dintre potenialele electrice ale electrozilor din sistemul de electroforez. Aceasta este de fapt fora care determin migrarea moleculelor de ADN n gel.

neaz att viteza d

a probelor n prezena diferitelor tampoa

cis,

importa

ne cu trie ionic slab. Un cmp electric de 10 V/cm, sau ma

Se exprim n voli/ cm de gel. Alegerea unui anumit voltaj este critic pentru scala de dimensiuni ale moleculelor de ADN care pot fi izolate i influeneaz viteza de migrare a probelor. Pentru a obine rezoluii comparabile n geluri care au aplicate voltaje diferite, trebuie schimbate att timpul de migrare ct i intervalul de schimbare a sensului de migrare.

Gelul de agaroz este obinut prin utilizarea unui tip special de agaroz (Agarose for Pulsed Field Electrophoresis Running Gel - SIGMA). Concentraia agarozei influe

e separare a moleculelor ct i scala de dimensiuni a moleculelor ce pot fi separate prin electrocarotipare. Astfel, concentraii mari ale agarozei duc la scderea mobilitii moleculelor, dar fr un efect clar asupra pattern-ului de separare a acestora. De fapt, rezoluia benzilor este bun n cazul folosirii unei agaroze cu dimensiuni ale porilor de circa 120 nm (concentraie 1%). Descreterea concentraiei agarozei este asociat cu : viteza de migrare mai mare ; separarea unor molecule de dimensiuni mai mari ; benzile din gel sunt mai difuze. Astfel, pentru separarea unor

molecule de circa 1-2500 kb, se folosete agaroz de concentraie 1%, iar pentru dimensiuni mai mari ale ADN se folete agaroz de concentraie 0.7 0.8%.

Tamponul de electroforez. Mobilitatea i rezoluia probelor de ADN sunt influenate de tamponul de electroforez. Dei diferena ntre mobilitate

ne folosite (Tris-acetat sau Tris-borat) este de numai circa 20%, aceast diferen este semnificativ n cazul separrii moleculelor de ADN mai mari de 2 Mb. Viteza de migrare a ADN este cu 25% mai mare n tampoane cu trie ionic mai mic - TBE 0.5X sau TAE 0.5X.

Forma cmpului electric. Unghiurile de reorientare. Se pare c unele aspecte legate de forma cmpului electric sunt critice pentru reuita tehnicilor de electrocariotipare. Mai pre

nte sunt unghiurile formate ntre cele 2 cmpuri electrice aplicate. Obinerea unei rezoluii bune presupune reorientarea unghiurilor de migrare cu peste 100%. Sistemele standard sunt

proiectate pentru un unghi de 120o. Noile sisteme comercializate au posibilitate de variaie a unghiului de reorientare. Unghiurile de reorientare mici (106o) permit separarea mai rapid a moleculelor de ADN mai mari de 2 Mb.

Timpul de puls. n experimentele de electrocariotipare, moleculele de ADN migreaz n geluri de agaroz n prezena unor tampoa

i puin, este aplicat alternativ n dou direcii. Pentru a migra n gel, moleculele de ADN trebuie s-i schimbe direcia de micare ca rspuns la schimbarea direciei cmpului electric. Separarea moleculelor se datoreaz faptului c timpul necesar schimbrii direciei de migrare depinde de mrimea moleculelor de ADN. De cele mai multe ori, timpul necesar reorientrii moleculelor crete odat cu dimensiunea lor. Ca urmare, un parametru cheie n sistemele PFG l

constituie timpul de puls care reprezint timpul pentru care cmpul electric este aplicat ntr-o anumit direcie nainte ca aceasta s fie schimbat.

n general, dimensiunea maxim a moleculelor de ADN care pot fi izolate depinde de timpul de puls. Astfel, acesta variaz de la 0.1 sec pentru separarea de molecule cu dimensiuni mai mici de 100 kb, pn la 1000 sec sau mai mult pentru molecule de circa 10 Mb.

Tipuri de tehnici PFGE

Tehnica OFAGE (ortogonal field alternation gel electrophoresis) introdus de Carle i Olson rechi de electrozi astfel plasai nct produc cmpuri electrice n diagonal

p mai mare (aproape

dublu) p

e, n comparaie cu o tulpina marker - S. cerevisiae YPH 80 (Sigma).

XI

V i V

n 1984, utilizeaz 2 pe la unghiuri mai mari de 90o. Datorit neomogenitii cmpului aplicat moleculele de

ADN migreaz pe o traiectorie curb departndu-se de centru, asigurnd totui apariia unor benzi clare (Fig. 4). Actualmente tehnica a fost nlocuit cu altele mai performante.

n tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis) Olson i Carle (1985) - este schimbat cu 180o polaritatea cmpului electric la fiecare ciclu cu un tim

entru direcia spre anod. Relaia ntre viteza de migrare i dimensiunea moleculelor de ADN este complex i, de regul, impune creterea timpului de schimbare a direciei de migrare, proces numit ramping. La unele drojdii care prezint cromozomi de dimensiuni mari, cum este cazul celor din genul Saccharomyces, s-a reuit separarea cromosomilor fr ramping (Spencer, 1989).

n Fig. 5 este reprezentat profilul (pattern-ul) cromozomal al unei tulpini de laborator de S.

cerevisia

cromozomi 1 2 3 4 5 6

C X

III

IX III VI

I

Fig. 5. Pattern-ul electroforetic al cromozomilor de S. cerevisiae evdeniat prin tehnica FIGE (godeuri: 1-5 - S. cerevisiae S288c, 6 - S. cerevisiae YPH80)

Se observ ea a 7 cromozomi din cei 16: I - 245 kb; VI - 280 kb; III - 360 kb; IX -

450 kb i VIII (care co-migreaz datorit dimensiunilor apropiate) - 555 kb; XI - 680 kb. separar

; V

Cea de-a 7-a band electrofoetic (notat cu C) este reprezentat de molecule de ADN cromozomal care nc nu s-au separat n condiiile de desfurare a electroforezei.

FIGE este un sistem foarte simplu n care un dispozitiv pemite schimbarea periodic a polaritii electrozilor ntr-un sistem convenional de electroforez. n sistemele FIGE se ine cont de 4 pa

u cmpurile electrice forward i reverse cu durate

Astfel, s-a constatat c n cazul aplicrii unui tim

rametrii: gradientele de voltaj pentru direcia nainte i invers (forward i reverse) i durata de migrare a probelor n fiecare dintre cele 2 direcii. Pentru a impune migrarea nainte a probelor de ADN, produsul dintre gradientul de voltaj i timpul de schimbare trebuie s fie mai mare pentru direcia forward dect pentru direcia reverse.

Dup modul de selectare a parametrilor menionai, se cunosc mai multe tipuri de FIGE: (i) standard FIGE - este folosit acelai voltaj pentr

diferite; (ii) FIGE asimetric sau AVFIGE - pentru cele dou cmpuri electrice cu durate egale sunt utilizate voltaje diferite; (iii) ZIFE - zero integrated field electrophoresis - pentru cele

dou cmpuri difer att durata ct i voltajele (Tab. 3) Mobilitatea moleculelor de ADN n cmp electric funcie de mrimea lor este mai

accentuat n cazul FIGE dect al altor tehnici PFGE. p de puls egal sau a unor voltaje egale pentru cele 2 direcii de migrare, moleculele de

dimensiuni mici i mari migreaz rapid, cele de dimensiuni intermediare migreaz mai ncet, iar moleculele cu dimensiuni apropiate de limita de detectabilitate, sunt aproape imobile. Cu ct

proporia ntre timpii de puls sau voltajul celor 2 direcii (nainte i invers) de migrare descrete, cu att crete dimensiunea moleculei de ADN pentru care se nregistreaz mobilitatea cea mai sczut. Cu toate acestea, tehnica FIGE nu este eficient pentru separarea moleculelor cuprinse ntre 1 10 Mb. Grosimea benzilor electroforetice crete substranial cu ct moleculele se apropie de dimensiuni de ordinul Mb, ceea ce nseamn o rezoluie slab.

Sistemul Avantaje Dezavantaje

GV - acelai FIGE erit

Aparat ieftin, uor de constru

Comigrare pronunat a fragmentelor (inversia de band); benzi difuze an la 3

TS - dif it. ; rzoluie de p

Mb. GV - diferit AVFIGE TS - acelai

ptim pentru molecule de ADN de 1-50kb.

n

ii de migrare.

Rezoluie o Necesit aparatur care s asigure plus voltaje diferite pentru cele doudirec

GV - diferit ZIFE TS - diferit

Rezoluie superioar; fenomenul de inversie deband e

ste minim. u cele dou

Timp de migrare mai lung; necesit aparatur care s asigure n plus voltaje diferite pentrdirecii de migrare.

aie ntre diferitele tTab. 3. Compar ipuri de

GV - gradientul de voltaj pentru cele dou cmpuri (direcii) - timp de schimbare a direciei de migrare a moleculelor de ADN n cmp e mpul de aciune a cmpurilor electrice)

sisteme FIGE (Birren, 1993) forward i reverse; TS

lectric (ti

(1989), Meese i Meltzer (1990) folosete o arie hexagonal n care sunt plasai muli electrozi mici conecta

se pe gel i, cu toate c sunt omogene producnd benzi clare, inte

nomously controlled electrode). Acest sistem permite controlul

precis i v

1. 1. 3. ANALIZA GENOMULUI EXTRANUCLEAR

importan deosebit n studiile de genetic a drojdiilor o au analizele efectuate pe ADN m t este aproximativ aceeai pentru toate speciile de drojd

d o dimensiune de 25 kpb

i un con

Tehnica CHEF (contour clamped homogeneous electric fields) descris de Chu

i n serie astfel nct cmpurile electrice se ntretaie n unghiuri de 120o. Benzile rezultate

sunt mai clare i pe acelai gel poate fi ncrcat un numr mare de probe. O variant a acestei tehnici este RGE (rotating gel) n care se utilizeaz cmpuri electrice ntretiate omogene rezultate prin rotirea gelului cu 90o la fiecare ciclu.

n TAFE (transverse alternating field electrophoresis) - Gardiner i Patterson (1989) cmpurile electrice sunt transver

nsitatea cmpului i unghiurile de orientare a moleculelor n cursul migrrii variaz n lungimea gelului. Deoarece aparatul folosit este vertical, gelul este mai greu de manipulat i dimensiunea lui este limitat.

Cel mai sofisticat i flexibil sistem utilizat la ora actual n electrocariotipare este PACE (programmable auto

arierea tuturor parametrilor, fcnd astfel posibil studiul relaiei dintre mobilitatea ADN i timpul de schimbare a direciei de migrare, voltaj, unghiurile cmpurilor electrice aplicate, concentraia agarozei i temperatura.

(A) Structura ADN mitocondrial O

itocondrial (ADNmt). Structura genetic a ADNmii, cu meniunea c ntre diferite genuri sau chiar ntre speciile aceluiai gen pot apare

diferene n ceea ce privete dimensiunea i chiar conformaia ADNmt. Pentru Saccharomyces cerevisiae, ADNmt este reprezentat de o molecul de ADN

dublucatenar covalent nchis, complexat cu proteine histon-like, avninut foarte ridicat de AT comparativ cu cel nuclear: 75 80% (Fig. 6). La nivelul ADNmt exist gene codificatoare pentru:

subuniti ale citocrom oxidazei c - CO 2, CO 3, CO 1: oxi1, oxi2 i, respectiv, oxi3 apoproteina citocromului b: cyt b 3 subuniti - 6, 8 i 9 - ale complexului de sintez al ATP ATP-aza mitocondrial subunitile ologmicin sensibile ale ATP-azei: oli2, aap1

24 specii moleculare de ARN, grupate ntr-un cluster S din subunitatea 30S i

n formnd RNazaP cu rol n maturarea ARNt siae, subunitile complexului NADH

deh i de

drojdii.

specii moleculare ale ARN ribozomal (ARNr): ARNr 15ARNr 21S din subunitatea 50S

proteina din subunitatea ARNr 30S: var 1 ARN 9S complexeaz o protei

Un fapt interesant este acela c la S. cereviidrogenaz sunt codificate de gene nucleare i nu mitocondriale, ca n cazul altor speci

ARNr 21S

CO2

CO3

ARNr 15S

CO1

oxi 1

oxi 2

par

oxi 3aap 1

ATPaza 8

oli 2

ATPaza 6

oli 1ATPaza 9 var

box

Cit

ocr o

m b

oli 2, aap 1 - gene care codifica pentru subunitatile oligomicin - sensubile ale ATPazeioxi 1, 2, 3 - gene care codifica pentru subunitatile citocrom-oxidazei (CO 2, 3, 1)box - codifica pentru citocrom b

par - functie inca nedeterminatavar - proteina a subunitatii ribozomale mici

introniexoni

Fig. 6. Harta genetic a ADN mitocondrial la S. cerevisiae

n genomul dro din 5% dintre

gene, 2 dintre genele purttoare fiind ns situate la nivelul ADNmt: (I) oxi3; (II) cob box.

d

jdiilor, intronii sunt rar ntlnii, fiind prezeni la mai puin

Codul genetic mitocondrial prezint abateri de la cel universal, 3 codoni fiind tradui iferit :

Codon Codul genetic universal Codul genetic mitocondrial

UGA STOP Trp

Au fost determinate masel leculare ale ADNmt a unor specii de drojdii:

Saccharomyces cerevisiae 15.4 X 106 Da - 54 X 106 Da; Schizosaccharomyces pombe - 12.5 X

106 Da;

GC pentru C. kefyr i maxima de 26.1% mol GC pentru C. zeylando

AUA Ile Met

CUA Leu Thr

e mo

Kluyveromyces lactis - 24 X 106 Da; Yarrowia lipolytica - 29 X 106 Da; Williopsis

(Hansenula) mrakii 36.4 X 106 Da. Pentru toate aceste specii ADNmt se prezint sub form circular covalent nchis (CCC), cu excepia lui W. mrakii pentru care ADNmt este linear. Pentru diferite specii de Candida s-au determinat dimensiunile ADNmt ca fiind cuprinse ntre 19 kpb

pentru C. glabrata i 52 kpb pentru C. tropicalis. De asemenea, majoritatea speciilor i tulpinilor de Candida prezint ADNmt sub form covalent circular nchis (CCC), numai pentru puine tulpini ADNmt se prezint sub form linear.

Bak i colab. (1969) au stabilit coninutul n guanin i citozin a ADNmt pentru 5 specii de Candida, cu minima de 13.9% mol

ides i pentru Sacch. cerevisiae la care % mol GC a fost de 12.7%. n Fig. 7 este reprezentat o schem general de comparaie ntre diferite specii de Candida fiind urmrite dimensiunile ADNmt i coninuturile n GC a ADNmt i ADN nuclear.

Fig. 7. Comparaie ntre caracteriticile ADNmt de la diferite specii

aparinnd genului Candida i Lodderomyces

(B) ADN plasmidial 2 m

cerevisiae a fost determinat prezena unui ADN extracromosomal, reprezentat de ADN plasmidial 2m, denumit astfel dup dimensiunea conturul

NA",

prezena

pb (Fig. 8).

/ 2 m like

n nucleul unor tulpini de Saccharomyces

ui su. Plasmida este mpachetat n cromatina din nucleu i se replic numai o singur dat n cursul unui ciclu celular, n timpul fazei S, independent de materialul genetic cromosomal.

ADN plasmidial 2 m are o dimensiune total de 6318 pb i este prezent n 60 - 100 copii / celul, numrul de copii crescnd cu gradul de ploidie. Plasmida reprezint un tip de "selfish D

sa nefiind asociat cu exprimarea unor caractere fenotipice deosebite, ci doar cu un aspect uor zimat al coloniilor i cu un timp de generaie de 1.5 3% mai mare pentru celulele gazd (notate cir+), comparativ cu celulele care nu prezint acest tip de ADN (notate ciro).

Din punct de vedere structural plasmida 2 m prezint 2 regiuni unice (U1 i U2) de 2774 pb i, respectiv, 2346 pb, separate de 2 regiuni cu secvene invers repetate (IR) de 599

Fig. 8. Structura plasmidei 2 m de la Saccharomyces cerevisiae

Cele dou reEP1 i REP2 care codific pentru proteine necesare segregrii plasmidei i reglrii

expresie

ginea replicrii plasmidei ; ecvene din

structura

secven core de 8 pb la capetele creia se leag proteina Flp1p prin intermed

r redus de specii de drojdii. Toate

giuni unice cuprind secvenele: R

i genice;

REP3 (STB) cu rol n segregarea plasmidei i meninerea numrului de copii; ARS ori

FLP1 codific o recombinaz (Flp1p) care se leag specific la nivelul unei s locusului FRT.

Locusul FRT este plasat la nivelul regiunii IR i este format din 3 secvene de cte 13 pb cu orientare invers i o

iul unui rest de Tyr. Complexul format din FRT i proteina Flp1p apare i are rol n procesul de recombinare din timpul replicrii ADN plasmidial.

n afar de plasmida 2 m de la S. cerevisiae, pn n prezent au fost identificate 6 structuri plasmidiale similare (plasmide 2 m - like), numai la un num

aceste pl

cesul de recombinare

dintre re

struirea vectorilor de tip shuttle

asmide au dimensiuni mici (4647 6615 pb) i conin 2 regiuni cu secvene invers repetate care mpart genomul n 2 pri aproximativ egale, cu secvene unice (Tab. 4).

Toate aceste plasmide conin 3 sau 4 regiuni codificatoare dintre care una pentru o protein cu mare omologie de secven cu Flp1p i care este implicat n pro

giunile invers repetate. Toate plasmidele conin cel puin o secven ARS, fie la nivelul uneia dintre regiunile unice, fie n imediata lor vecintate (Fig. 9).

Dei principala aplicabilitate a plasmidei 2 m o constituie utilizarea secvenei ARS uneori, alturi de secvenele REP1, REP2 i REP3 (STB) n conpentru drojdii, determinarea prezenei sale sau a plasmidelor 2 m like, poate fi folosit ca un indiciu privind posibila apartenen a unei tulpini necunoscute la una dintre speciile la care au fost identificate aceste forme de ADN extracromosomal.

Dimensiune (pb) Plasmida Sursa de izolare U1 U2 IR T

pSR Zygosaccharomyces rouxii 2654 1679 959 6251 pSB1 Zygosac 2300 6550 charomyces bailii 2900 675 pSB2 Zygosaccharomyces bailii 2457 2004 5415 477 pSB3 Zygosaccharomyces rouxii 3168 2665 391 6615 pSM1 Zygosaccharomyces fermentati 2552 2160 352 5416 pKD1 Kluyveromyces drosophilarum 2137 1928 346 4757 2 m Saccharomyces cerevisiae 2774 2346 599 6318

U1 regiunea un ic; IR iunea repe nt lasmid.

. 4. T e ntal droj

iilor filogenetice dintre diferitele specii de drojdii g d, s-a observat c nu exist o corelare ntre acestea

ic mare; U2 regiunea unic m reg invers tat; T reaga pTab ipuri de plasmide 2 m lik nite la dii.

n ceea ce privete folosirea plasmidelor 2 m / 2 m - like n scopul stabilirii rela

az

i relaiile filogenetice determinate de similitudinea secvenei de baze a plasmidelor. Astfel, plasmidele pSB3 i pSR1 sunt cel mai ndeprtate plasmide dac se ia n consideraie gradul de omologie ntre secvenele REP1; cu toate acestea, ambele plasmide au fost izolate, se menin i se propag la fel de bine n tulpini de Z. rouxii.

Fig. 9. Structura tipurilor de plasmide 2 m like ( dup Broach, 1991)

(C) Sistemul killer

Producerea de ctre unele specii de drojii de exotoxine cu aciune antimicrobian mediat de receptori membranari, reprezint un fenomen relativ bine cunoscut, descris pentru prima dat la S. cerevisiae, de Bevan i Makower (1963). Capacitatea acestor exotoxine de a determina moartea celulelor aparinnd aceleai specii sau unor specii congenice, le-a conferit denumirea de toxine killer. Sinteza lor este asigurat de: (a) elemente genetice citoplasmatice, cu transmitere non-Mendelian, virus-like particles (VLPs), al cror material genetic este reprezentat de molecule de ARN dublu-catenar (Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii,

Hanseniaspora uvarum); (b) plasmide ADN lineare (Kluyveromyces lactis, Pichia acaciae,

Pichia pastoris); (c) gene nucleare (numr redus de tulpini de Saccharomyces cerevisiae; tulpini aparinnd speciilor: Pichia farinosa, Williopsis mrakii, Pichia klyveri).

Actualmente, cel mai bine studiat este sistemul killer de la Saccharomyces cerevisiae

(Fig. 10). Tulpinile cu potenial killer aparinnd acestei specii sunt incluse n trei grupe principale: K1, K2 i K28. Dei aceste toxine difer prin compoziia de aminoacizi, structur i modul de aciune, prezint mecanisme de sintez, procesare i secreie similare. Celulele aparinnd aceluiai grup sunt rezistente reciproc la toxina secretat, pe cnd celulele de drojdie aparinnd la grupe diferite (sau chiar specii diferite) sunt, de regul, sensibile reciproc. Astfel, spre exemplu, toxina sintetizat de o tulpin slbatic de Candida determin moartea celulelor aparinnd speciilor C. glabrata, P. anomala, K. lactis, P. membranefaciens, Rh. rubra i S.

cerevisiae. Celulele productoare de toxin killer sunt notate K+, celulele sensibile la toxin K-, iar cele care nu prezint caracer killer - K0.

Sinteza toxinelor este asigurat de prezena n citoplasm a dou tipuri de particule VLP: L-A i M.

particule L-A denumite i particule helper; au diametrul de 39 nm, iar prezena lor nu determin moartea celulei gazd, comportndu-se asemntor virusurilor latente, fr ciclu litic; materialul genetic este reprezentat de o molecul de ARN dublu-catenar de 4.6 kb, care se replic asemntor retrovirusurilor; conine informaia genetic necesar sintezei proteinelor capsidale i unei ARN polimeraze, necesare pentru ncapsidarea i replicarea att a particulelor L-A, ct i M.

particule M trei clase: M1, M2 i M28, responsabile de sinteza toxinelor killer specifice (K1, K2 i, respectiv, K28) i a factorului de imunitate; particule virale cu aceeai dimensiune ca L-A (39 nm) i al cror material genetic este reprezentat de mai multe molecule de ARN dublu-catenar de dimensiuni mici: M1 1.8 kb, M2

1.5 kb i M28 1.9 kb.

Fig. 10. Sistemul killer la S. cerevisiae structur i mod de aciune

n literatura de specialitate au fost descrise i dou grupe de gene nucleare care intervin n meninerea i replicarea particulelor L-A i M: (1) 8 gene superkiller SKI1 SKI8 cu rol n

scderea numrului de copii al M1 i n represarea procesului de traducere a ARNm al M1 i L-A; (2) 30 de gene maintenance of killer MAK importante n transmiterea i meninerea fenotipului killer, acionnd, n principal, la nivelul particulelor M i, mai puin, asupra L-A (genele MAK3, MAK10 i PET18). Deoarece fenotipul killer este caracteristic numai unui numr redus de specii de drojdii i, respectiv, numai anumitor tulpini aparinnd acestor specii, poate fi utilizat i drept criteriu de identificare taxonomic.

CAP. 1. GENETICA DROJDIILOR. METODE MODERNE DE INVESTIGAIE A GENOMULUI DROJDIILORFig. 4. Aspectul general al curbei de shift hipercromic pentru tulpini de drojdii izolate din medii poluate cu compui petrolieriTipuri de tehnici PFGE

PlasmidaZygosaccharomyces rouxii

Saccharomyces cerevisiae