DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR MICROBIENE
ETAPELE INVESTIGARII DE LABORATOR A UNUI PACIENT INFECTAT
Mediul de cultivare reprezintă un substrat nutritiv, de complexitate diferită, care favorizează creşterea şi dezvoltarea microorganismelor în condiţii artificiale, de laborator.
Cerinţe minime, obligatorii:
1. Să asigure cantităţi optime de apă şi substanţe nutritive necesare creşterii şi multiplicării microorganismelor;
2. Să asigure sursa de carbon şi energie;
3.Să asigure sursa de azot necesară biosintezei acizilor nucleici şi proteinelor;
4. Să conţină săruri minerale, cu rol în menţinerea echilibrului ionic al celulei (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn, Fe2+, Co2+);
5. Să asigure factori de creştere necesari pentru dezvoltarea unor microorganisme cu exigenţe de creştere;
6. Să ofere un pH optim pentru dezvoltarea microorganismelor;
7. Să ofere condiţii de aerare corespunzătoare tipului de metabolism respirator al microorganismului care urmează a fi cultivat;
8. Să fie steril şi repartizat în recipiente sterile.
PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA
- prepararea mediilor: din ingrediente de baza/pulberi deshidratate
- insotite de certificat de calitate (atesta cresterea si supravietuirea microorganismului tinta si inhibarea/supresarea cresterii altora)
- aspecte care influenteaza prepararea unui mediu: calitatea materialelor utilizate, calitatea apei, calitatea placilor Petri, calitatea aditivilor, sterilitatea sangelui
- stocarea mediilor: loc ferit de lumina si calduramediile cu sange, alte lichide biologice, antibiotice – la frigider
Controlul calitatii mediilor- testare pH – sa nu depaseasca 0.2 unitati.- sterilitate- testarea performantelor de crestere microbiana
CGP Enterobacterii Bacterii Gram negative fastidioase
Enterococcus faecalis (ATCC 29212)
Citrobacter freundii Moraxella catarrhalis
S. aureus (ATCC 25923) Enterobacter cloacae N. gonorhoeae
S. epidermidis K. pneumoniae N. meningitidis
Str. agalactiae Proteus mirabilis
Str. mitis E. coli (ATCC 25922)
S. typhimurium Sh. flexneri
Str. pneumoniae Yersinia enterocolitica
Str. pyogenes
Fungi Alti BGN Anaerobi
C. albicans Acinetobacter lwoffi Bacteroides fragilis
Ps. aeruginosa (ATCC 27853)
Cl. perfringens
Tulpini de referinta recomandate pentru controlul mediilor (WHO, 2003)
* Nota: Tulpina de referinta - orice microorganism caracterizat la nivel de gen si specie clasificat si descris conform caracteristicilor si originii obtinut dintr-o colectie recunoscuta la nivel national sau international
Teste de performanta realizate pe mediile uzuale (WHO, 2003)
Mediu Tulpina testata Prezenta cresterii/aspectul coloniilor sau mediului
Agar bila esculina 24h Enterococcus faecalisStreptococ alfa-hemolitic
Da/innegrirea mediuluiNu
Geloza sange, 24h, CO2 Streptococcus pyogenesStreptococcus pneumoniae
Da/ beta-hemolizaDa/alfa-hemoliza
Gelatinaza 24h E. coliSerratia marcescens
-+
Uree 24h E. coliP. mirabilis
-+ (roz)
Neconformitate Sursa
Agar nesolidificat corespunzator Depasirea temperaturii de sterilizare, pH scazut care poate determina hidroliza acida a agarului, eroare de cantarire a ingredientului, omogenizare insuficienta, calitate necorespunzatoare a agarului
pH necorespunzator Sticlarie contaminata chimic, apa impura, supraincalzirea mediului la sterilizare, pH masurat incorect, deteriorarea mediilor deshidratate
Culoare modificata Sticlarie murdara, apa impura, supraincalzirea mediului la sterilizare, pH necorespunzator, deteriorarea mediilor deshidratate
Precipitate Supraincalzirea mediului la sterilizare, apa impura, sticlarie contaminata, deteriorarea mediilor deshidratate
Inhibarea dezvoltarii microorganismelor/crestere redusa/selectivitate redusa
Supraincalzirea mediului la sterilizare, sticlarie sau apa contaminata, deteriorarea mediilor deshidratate, erori de cantarire a ingredientelor si de omogenizare a acestora
Surse de neconformitate privind calitatea mediilor de cultura
Clasificarea mediilor de cultura
După complexitate şi scopul utilizării:•Medii uzuale simple (ex. bulion simplu, agar nutritiv);•Medii speciale (sunt medii cu grade diferite de complexitate care permit creşterea preferenţială a anumitor specii dintr-un amestec heterogen de microorganisme dintr-o probă sau evidenţierea anumitor caractere particulare de metabolism ale microorganismului cultivat):
•medii selective conţin unul sau mai mulţi agenţi inhibitori reprezentaţi de coloranţi, antibiotice, săruri biliare care pot limita sau inhiba multiplicarea anumitor specii de microorganisme dintr-o probă cu încărcătură microbiană mixtă (mediu BSA, mediu MacConkey);•medii de îmbogăţire -oferă condiţii preferenţiale de creştere pentru anumite specii bacteriene, care se vor multiplica mai rapid decât microorganismele asociate (ex. geloză-sânge, geloză chocolat);•medii diferenţiale - evidenţiază anumite particularitaţi metabolice, utile în identificarea unei anumite specii de microorganisme: sistemele multitest;•medii de transport care asigură supravieţuirea tulpinilor microbiene în proba recoltată până în momentul însămânţării (ex. mediu Cary-Blair);•medii de conservare sau de întreţinere care asigură supravieţuirea microorganismelor în laborator pe o anumită perioada de timp (ex. mediu OMS, mediu YPG).
După consistenţă:•medii lichide;•medii solide;•medii semisolide (ex. mediu OMS, mediu cu gelatina);•medii deshidratate.
După provenienţă:•medii naturale (lichide: must de malţ, lapte; solidificate: cartof glicerinat); •medii artificiale sunt medii cu compoziţie chimică semidefinită, care conţin o bază naturală (lichide: bulion, apă peptonată; solidificate: geloză, gelatină).
Denumire mediu Caracteristici Recomandare
Mediu Geloza nutritiva Mediu de cultura uzual care contine extract de carne, peptona, NaCl si agar
- mediu de cultură de uz general pentru cultivarea microorganismelor nepretenţioase
Mediu Geloză sange Mediu Geloza nutritiva cu adaos de sange de berbec defibrinat
- mediu de imbogatire, care permite cresterea majoritatii microorganismelor
Geloză Mueller-Hinton II (NCCLS)
Mediu geloza cu concentraţie foarte scăzută de tiamină şi timidină precum şi cu nivel corespunzător de Ca şi Mg
- mediu folosit pentru testarea sensibilităţii microorganismelor la antibiotice
Medii de cultivare a bacteriilor
Geloza chocolat geloză de bază suplimentată cu factori decreştere, după adăugarea sângelui mediul incalzeste la 80 °C timp de 10 min.
Neisseria, Haemophilus
Bila Esculina Azida agar
- contine esculina, azida de sodiu (inhibitor pt. specii Gram-negative) si bila de bou (inhibitori de Gram pozitive)-este imbogatit cu hidrolizat enzimatic de cazeina, proteoza-peptona si extract de vita- hidroliza esculinei ajuta la detectarea streptococilor apartinand grupului D.
Izolarea speciilor de Enterococcus faecium si E. faecalis capabile sa hidrolizeze esculina, cu acumularea in mediu a unui precipitat negru rezultat din combinarea esculetolului cu citratul fericHidrolizeaza esculina in prezenta bilei
Baird Parker Agar
-contine extract de drojdie suplimentat cu complex de vitamine B care stimuleaza cresterea bacteriana, glicina si piruvat de sodiu pentru a stimula cresterea sp. de Staphylococcus. -telurit de potasiu si de clorura de litiu inhiba cresterea altor specii bacteriene decat Staphylococcus.
Izolarea stafilococilor coagulazo-pozitivi care se vor dezvolta sub forma unor colonii de culoare neagra prin reducerea teluritului de potasiu. Sp. de Staphylococcus care prezinta lecitinaza degradeaza mediu si se formeaza un halou in jurul coloniilor. O zona opaca de precipitat poate aparea datorita prezentei lipazei
Manitol Salt Agar (Mediu Chapman)
-Contine peptona, agar, continut mare de clorura de sodiu si indicator de pH rosu fenol
-Continutul mare de sare inhiba dezvoltarea microorganismelor, cu exceptia celor halofile
S. aureus coagulazo-pozitivi produc colonii inconjurate de o zona galbena stralucitoare, SCN produce colonie roz, fara zona de halou.
Medii de cultivare a bacteriilor
Denumire mediu
Caracteristici Recomandare
Mac Conkey
Agar
Contine saruri biliare ca inhibitori de crestere pentru specii bacteriene de coci Gram pozitivi si cristal violet ca
indicator de pH
Mediu de diferentiere a speciilor de enterobacterii lactozo fermentative (virajul culorii mediului la rosu) de
cele non-fermentative (virajul culorii mediului la galben)
Medii de cultivare a bacteriilor
Denumire mediu
Caracteristici Recomandare
Salmonella Shigella agar
contine lactoza, saruri biliare, citrat feric si indicator de pH- rosu neutru. Sarurile selecteaza bacteriile Gram –negative. Celelalte componente diferentiaza intre speciile Gram-negative.
E. coli fermenteaza lactoza din mediu, rezultand colonii roz. (Nu produce hidrogen sulfurat).Membrii genului Salmonella nu fermenteaza lactoza, dar produc hidrogen sulfurat, rezultand colonii clare, cu centru negru. Membrii genului Shigella, nu fermenteaza lactoza, nu produc hidrogen sulfurat, deci vor determina aparitia unor colonii incolore.
Medii de cultivare a bacteriilor
Medii de cultivare a bacteriilorDenumire
mediuCaracteristici Recomandare
Mediu A.A.B.T.L (Bromothymol-blue Lactose Agar)
mediu fara inhibitori, lactozat si cu indicator de pH- albastru de brom timol.
-pentru diferenţierea coloniilor lactozo-pozitive de cele lactozo-negative
-folosit mai ales pentru Enterobacteriaceae (lactoza degradată în acid determină indicatorul de pH, albastru de bromothymol, să-şi schimbe culoarea în galben. Alcalinizarea produce o colorare albastră).
Mediu cromogen diferential
utilizat pentru evidentierea simultana a tuturor microorganismelor ce cauzeaza infectii de tract urinar.
Mediul Löwenstein-Jensen (ou, cartof, verde malachit, asparagină, glicerină)
Medii de cultivare a bacteriilor
mediu pt. cultivarea micobacteriilor
Mediile multitest
TSI – Triple Sugar Iron + indicator de pH
Fermentarea zaharurilor
Glucoza
Lactoza
Zaharoza
Detectarea tiosulfat-
reductazei
Fe SO4
Rosu fenol
Alte aspecte
Permit evidentirea simultana a mai multor caractere biochimice
Medii de cultivare a bacteriilor
Mediile multitest
MIU – Mobilitate Indol Ureaza
Opacizarea uniforma a mediului
Metabolizarea triptofanului cu producere de indol volatil
Inrosirea benzii de hartie de filtru
Metabolizarea ureei inrosirea mediului
Medii de cultivare a bacteriilor
Mediile multitest
MILF – Mobilitate Indol Lizin-decarboxilaza Fenil-alanin-dezaminaza
Metabolizarea triptofanului cu
producere de indol volatil
Inrosirea benzii de hartie de filtru
Opacizarea uniforma a mediului
Fermentarea glucozei – acumulare de acizi
Virajul culorii la galben (R -)LDC determina acumularea de cadaverina
Virajul culorii la violet (R+)
Adaugarea 1-2 pic FeCl3
Aparitia unui inel verde
Medii de cultivare a bacteriilor
Medii de cultivare a bacteriilor
Mediu Agar Simmons Citrate: unica sursa de C (citrat de Na) +
indicator de pH (albastru de brom fenol)
Citrat +Citrat -
Mediu Sabouraud - mediu selectiv utilizat pentru cultivarea drojdiilor, mucegaiurilor si a unor microorganisme acidurice
Medii de cultivare a fungilor