2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
(continuare)
Metode turbidimetrice
http://namrataheda.blogspot.ro/2013/07/Măsurarea activității enzimatice a
lipazei din S.aureus
Rollof, J. et al., Acta path. Microbiol.
Immunol. Scand., Sect.B, 92,
155-158, 1984
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare
a activității enzimatice
Metode nefelometrice
https://www.pinterest.co.uk/
Măsurarea activității celulazei din
Trichoderma reesei
Mummi, M., J. et al., Anal. Biochem.,
116, 133-136, 1981
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare
a activității enzimatice
Metode nefelometrice
trends.directindustry.com/ Măsurarea activității enzimelor
pancreatice II. Lipase
Zinterhofer., L. et al., Clin. Chim.
Acta, 44, 173-178, 19873
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare
a activității enzimatice
Luminometria
Firefly (Photinus pyralis)
Etichetarea cu FITC a compușilor cu –NH2
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Luminometria
https://www.etsy.com/
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Polarimetria
Hidroliza zaharozei folosind
soluții de diluții 1:250, 1:500,
1:1000 de invertază din drojdie
McIntosh,. K.A. et al. (1998),
J. Pharm. Biomed. Anal.,
17, 1037-1045
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Metode electrochimice
Bisswanger, H. (2012) Practical Enzymology
Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany Ramsay, R. R. and Tipton, K. F. (2017)
Molecules, 2017, 22, 1192
Disfuncții ale gutei pentru
pacienți cu EED
https://www.pinterest.co.uk/pin/
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a
activității enzimatice
Etichetarea radioactivă
Metodă discontinuă de măsurare a activității
enzimatice (P pe filtru)
Rossomando, E.(Ed) HPLC in Enzymatic Analysis,
Capitol 1, Willey & Sons (1998)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Etichetarea radioactivă
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Alte metode
Separarea substratului și produșilor unei reacții
catalizate de adenozin kinaza
pe HPLC (fază inversă)
Rossomando, E.(Ed) HPLC in Enzymatic Analysis,
Capitol 1, Willey & Sons (1998)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor
imobilizarea prin adsorbție și includere a enzimelor
m = k1 Ck2
izoterma Freundlich
m =k1 k2 C
1 + k2 C
izoterma Langmuir
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor
imobilizarea prin adsorbție și includere a enzimelor
Cantitatea de enzimă adsorbită - parametri:
• Concentrația soluției enzimei care este supusă imobilizării
• Timpul de contact
• Tincubare
• Influența pH-ului
www.easybiologyclass.com
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor
imobilizarea prin adsorbție a enzimelor
Suporturi utilizate
• Suport mineral (Al2O3, argilă)
• Suport organic (amidon)
• Sefaroză mofificată
• Rășini schimbătoare de ioni
Interacțiunilor slabe
interacțiuni electrostatice
hidrofobe
punți de hidrogen
Mărimea particulelor
D = 500 nm – 1 mm
https://www.intechopen.com
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor
imobilizarea prin includere a enzimelor
• Sechestrarea enzimelor într-o matrice
• Matricea – polimeri solubili în apă
• Exemple de matrici
Geluri de poliacrilamidă
Triacetat de celuloză
Agar-agar
Gelatină
Caragenan
alginate
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor
imobilizarea prin includere a enzimelor
Avantaje - dezavantaje
Variază forma și natura matricilor
Dimensiunea porilor matricii poate fi ajustată
Posibile “scăpări” ale enzimelor cu M mică
Agarul și caragenanul – dimensiuni mari - pori
Dimensiunea porilor poate fi ajustată variind
conc polimerului
Metoda nu poate fi utilizată în procesele industriale
Preferată pentru experimente la scară mică
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
Legarea covalentă a enzimelor
Formarea de legături covalente între
enzimă și suport
Metodă preferată de imobilizare
Grupări chimice care pot forma legături
covalente cu suportul
Grupări amino, imino
Grupări -OH
Grupări -COOH
Grupări –SH și –SCH3
Grupări guanidil și imidazol
Nuclee fenolice
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
Legarea covalentă a enzimelor
Matrici / suporturi utilizate în legarea covalentă a enzimelor:
Carbohidrați: celuloză, DEAE celuloză, agaroză
Agenți sintetici: poliacrilamidă
Proteine (colagen, gelatină, albumină)
Matrici cu grupări amino: amino-benzil-celuloză
Suporturi anorganice: sticlă poroasă, silicagel
CNBr-agaroză și CNBr-Sepharose
Grupările –OH și –NH2 formează mai ușor legături covalente
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
Legarea covalentă a enzimelor
Metode de legare covalentă
Diazotare
Gr –NH2 suport ↔ Y sau H din enzimă
Formarea legături peptidice
–NH2 suport
HOOC- din enzimă
Illanes, Enzyme Bocatalysis. Principles and
applications, Springer (2008)
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
Legarea covalentă a enzimelor
Metode de legare covalentă
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
Legarea covalentă a enzimelor
Metode de legare covalentă
Utilizarea agenților polifuncționali
Portman, R.(2008), Biology of Metals,
22(2):363-375
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor
reticularea enzimelor
Metode de legare covalentă
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
Aplicații ale enzimelor imobilizate
Producerea industrială a
antibioticelor
băuturilor
aminoacizilor
Aplicații biomedicale
tratament
diagnoză
eliberare medicamente
Industrie alimentară
gemuri
jeleuri
siropuri
Cercetare
HPR – experimente blotting
proteaze – lizare celulară
2.6. Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea enzimei
Aplicații ale enzimelor imobilizate
Producerea biodieselului
din uleiuri vegetale
Managementul apelor reziduale
tratarea apelor de canal
tratarea efluenți industriali
Industrie textilă
degresare
bio-netezire
dezmembrare țesături
Industria detergenților
imobilizare lipaze
îndepărtarea murdăriei