Universitatea de Medicină şi Farmacie“Gr. T. Popa” Iaşi

FACULTATEA DE MEDICINADomeniul: MEDICINA - MICROBIOLOGIE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Infectii asimptomatice cu transmitere sexuală. Utilitatea

clinică a determinării cantitativeprin Real Time PCR a genotipurilor

cu risc înalt de HPV

Conducător doctoratProf. Univ. Dr. Luminiţa Smaranda Iancu

DoctorandRamona Gabriela Ursu

IAŞI, 2011

2

Membrii – referenți specialiști ai comisiei de doctorat au fost numiți prin decizia nr. 15007 din 3.08.2011:

Ø Prof. Univ. Dr. Mircea Onofriescu – UMF „Grigore T. Popa”, Iași Ø Prof. Univ. Dr. Simona Ruță – UMF „Carol Davila”, București Ø Prof. Univ. Dr. Roxana Moldovan – UMF „Victor Babeș”, Timișoara Susținerea publică a tezei de doctorat va avea loc în data de 10.11.2011, ora

9.00, în sala SOCIETĂȚII DE MEDICI ȘI NATURALIȘTI, IAȘI.

3

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa” Iaşi FACULTATEA DE MEDICINA

Domeniul: MEDICINA - MICROBIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT

REZUMAT

Infecţii asimptomatice cu transmitere sexuală. Utilitatea clinică a determinării cantitative prin Real Time PCR a

genotipurilor cu risc înalt de HPV

Conducător doctorat Prof. Univ. Dr. Luminiţa Smaranda Iancu

Doctorand Ramona Gabriela Ursu

IAŞI 2011

4

CUPRINS

PARTEA GENERALĂ 1. Introducere 2. Stadiul actual al cunoașterii

2.1. Structura papillomavirusurilor 2.1.1.Componente virale și proprietăți fizice 2.1.2.Genomul HPV și ciclul replicării virale

2.2. Clasificarea papillomavirusurilor 2.3. Istoria naturală a infecției HPV

2.3.1. Caracteristicile epiteliului cervical 2.3.2. Transmiterea infecției HPV 2.3.3. Progresia leziunilor

2.4. Mecanisme carcinogenetice 2.4.1. Capacitatea transformantă a HPV 2.4.2. Interacțiunea HPV cu factorii de mediu

2.5. Metode de diagnostic ale cancerului cervical și a leziunilor precanceroase 2.5.1. Metode de inspecție vizuală 2.5.2. Metode citologice și histologice 2.5.3. Metode de biologie moleculară

2.6. Alternative terapeutice ale leziunilor precanceroase și ale cancerului cervical

2.7. Prevalența, incidența, persistența și clearance-ul infecției HPV 2.8. Profilaxia cancerului cervical și a leziunilor precanceroase

Bibliografie PARTEA PERSONALĂ 3. Obiectivele studiului 4. Epidemiologia infecției cu HPV 5. Optimizarea metodei de detecție a 37 genotipuri HPV 6. Optimizarea tehnicii Real Time PCR pentru cuantificarea HPV 16 și a HPV 18 7. Validarea tehnicii de genotipare prin participarea la HPV Proficiency Testing, WHO 8. Prevalența și distribuția genotipurilor HPV în rândul femeilor din zona Moldovei 9. Corelații ale încărcăturii virale a HPV 16 și HPV 18 cu gradul displaziei cervicale și cu factorii de risc ai neoplaziei cervicale 10. Testarea ADN/HPV post intervenție chirurgicală excisională 11. Evaluarea riscului de evoluție către neoplazia cervicală pentru pacientelor HIV + 12. Infecții asimptomatice cu transmitere sexuală 13. Concluzii generale 14. Originalitatea contribuțiilor proprii 15. Perspectivele pe care le deschide teza Bibliografie

5

1. Introducere Cei mai frecvenți agenți etiologici ai infecțiilor cu transmitere sexuală (ITS)

sunt Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Haemoplilus ducreyi, Chlamydia trachomatis, virusul herpes simplex 2, virusul papilloma uman, Trichomonas vaginalis. Este binecunoscut faptul că cele mai multe ITS sunt simptomatice, dar nu se cunoaște frecvența și importanţa infecţiilor asimptomatice în transmiterea ITS. Pe baza prezenței simptomelor, indivizii pot fi divizaţi în mai multe categorii: indivizi “simptomatici” (simptomele sunt prezente); indivizi cu infecţie “inaparentă” (individul prezintă simptome dar nu sunt recunoscute ca fiind produse de o ITS); persoane “asimptomatice”- aceasta categorie este importantă, deoarece numai pacienţii “simptomatici” vor solicita tratament specific. Dintre infecțile produse de agenți etiologici amintiți, numai în cazul şancrului moale, majoritatea indivizilor sunt simptomatici, cu un număr considerabil de infecţii inaparente. Studiile de istorie naturală care analizează infecţiile cu HPV, Neisseria gonorrhoeae şi Chlamydia trachomatis indică faptul că aceşti indivizi rămân în mod caracteristic asimptomatici, pe când indivizii cu herpes genital prezintă în mod tipic infecţie inaparentă şi nu asimptomatică.

Dintre toți acești agenți care produc infecții genitale, studiul din cadrul tezei de doctorat a analizat doar infecțiile produse de HPV.

Cancerul cervical este al treilea cancer diagnosticat ca frecvenţă şi a patra cauza de deces prin cancer în rândul femeilor din întreaga lume, însumând, pentru anul 2008, 9% (530.000) din totalul neoplaziilor noi şi 8% (275.000) din totalul deceselor prin cancer. Peste 85% din decesele înregistate au fost semnalate în țările în curs de dezvoltare, incidenţa cea mai ridicată la nivel mondial pentru cancerul cervical fiind regasită în Africa, Asia și America de Sud, iar cele mai scăzute valori au fost semnalate în Asia de Est, Australia și America de Nord (1). În lipsa aplicării unor măsuri preventive susţinute, se preconizează că decesele datorate cancerului de col uterin ar putea creşte cu aproape 25% în următorii 10 ani (2). Pe de altă parte, majoritatea femeilor din ţările în curs de dezvoltare nu au acces la programele de profilaxie a cancerului de col uterin, ceea ce explică diagnosticarea acestei forme de cancer în stadii care depăşesc prin severitate, capacităţile terapeutice actuale (3).

România, cu o populaţie de 9.44 milioane femei cu riscul de a dezvolta cancer de col uterin, se situează pe primul loc în Europa în ceea ce priveşte incidenţa (23.9 0/0000) şi mortalitatea (11.6%) prin cancerul de col (iunie 2010) (4). Estimările actuale indică faptul că în fiecare an aproximativ 3450 de femei sunt diagnosticate cu cancer de col uterin şi aproape 2100 mor din cauza bolii. Deşi după formularea relaţiei de cauzalitate dintre HPV şi cancerul de col uterin, în majoritatea ţărilor au fost iniţiate studii extinse în vederea cunoaşterii prevalenţei şi distribuţiei infecţiei cu HPV (Human Papilloma Virus), în România, studii similare au fost întreprinse sporadic, pe loturi nesemnificative, iar datele rezultate nu au fost

6

sistematic raportate, motiv pentru care, despre România se afirmă că „nu sunt date disponibile” despre aceşti indicatori (Raport OMS, 2009). În acest context, se justifică necesitatea studiilor privind răspândirea acestei infecţii, ca argument ştiinţific pentru eficienţa vaccinării pe scară largă, şi nu în ultimul rând, pentru instituirea programelor naţionale de supraveghere şi screening pentru populaţia la risc (5).

Harald zur Hausen a formulat, în 1976, ipoteza că HPV joacă un rol important în etiologia cancerului de col uterin, identificând împreună cu echipa sa, în perioada 1983-1984, genotipurile HPV 16 şi HPV 18 în tumori ale cervixului; descoperirea a fost răsplătită cu Premiul Nobel pentru Medicină şi Fiziologie (2008) (6).

Rolul HPV în oncogeneză este demonstrat cu certitudine nu numai pentru cancerul de col uterin ci şi în etiologia altor tipuri de cancere anogenitale (anus, vulvă, vagin, penis) sau cancere ale capului şi gâtului. Genotipurile HPV 16 şi 18 sunt responsabile pentru aproximativ 70% din toate de cazurile de cancer de col uterin din întreaga lume, fiind recunoscute ca înalt oncogene, împreună cu alte serotipuri (e.g. 31, 35, 52 sau 58) (7).

Spre deosebire de alte neoplazii, cancerul de col uterin poate fi prevenit prin programe de screening concepute pentru a identifica şi trata leziunile precanceroase. Acestea presupun: metode de inspecție vizuală, metode bazate pe analiza histologică și citologică a ţesuturilor infectate şi nu în ultimul rând, prin metode de testare a ADN/HPV. Terapia leziunilor precanceroase poate fi chirurgicală, prin tehnici distructive (e.g. crioterapie, electrocauterizare, termocoagulare), sau prin tehnici de excizie, de îndepărtare chirurgicală (LEEP – loop electrosurgical excision procedure – procedura de excizie prin diatermocauterizare şi LLETZ –loop electrosurgical excision of the transformation zone – excizia chirurgicală a zonei de transformare). Urmărirea pacientelor după aceste proceduri chirurgicale, presupune colposcopie, eventual, testarea ADN / HPV (8).

Perspectiva studiilor epidemiologice privind incidenţa şi prevalenţa infecţiilor cu HPV se va răsfrânge în trecerea de la profilaxia de tip secundar (screening), la profilaxia primară (prin vaccinare), în paralel cu eficientizarea programelor de promovare a sănătăţii (9).

În prezent sunt comercializate pe scară largă, la nivel mondial, două vaccinuri HPV. Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) recunoaşte importanţa cancerului de col uterin ca problemă globală de sănătate publică şi recomandă vaccinarea HPV, ca vaccinare de rutină (10).

7

3. Obiectivele studiului

Lipsa datelor într-o țară aflată pe primul loc în Europa în ceea ce privește incidenta si mortalitatea prin cancer cervical, necesitatea acumulării de date științifice utile decidenților politici pentru stabilirea strategiei de prevenire și control a BTS (boli cu transmitere sexuală), inclusiv infecțiile HPV, au condus la stabilirea următoarelor obiective științifice ale acestei teze de doctorat:

1. optimizarea și validarea metodelor de genotipare utilizate pentru diagnosticul infecţiilor determinate de HPV și pentru determinarea încărcăturii virale;

2. evaluarea prevalenței și distribuției infecției HPV în lotul de studiu, ca argument util strategiilor de vaccinare;

3. evaluarea corelațiilor între nivelul încărcăturii virale a ADN HPV 16 & 18 și gradul displaziei cervicale, în vederea intervenţiei terapeutice în stadii incipiente;

4. evaluarea prin teste ADN HPV a pacientelor post intervenție excisională, pentru aprecierea statusului eradicării /persistenţei infecţiei;

5. evaluarea prevalenței infecției HPV în rândul pacientelor HIV pozitive;

6. evaluarea prevalenței infecției HPV în rândul persoanelor asimptomatice;

7. aprecirea contribuţiei co-factorilor implicaţi în oncogeneza cervicală.

4. Epidemiologia infecţiei cu HPV

La începutul anilor ’90 studii epidemiologice bazate pe tehnici de biologie moleculară şi cercetări privind istoria naturală a infecţiei cu Human Papilloma Virus (HPV) localizată la nivelul tractului genital, au adus dovezi suficient de puternice pentru a atribui un rol cauzal determinant al HPV în inducerea cancerului cervical.

Această asociere a fost evaluată pe baza criteriilor de cauzalitate elaborate de experţi din colectivitaţi de cercetare, de la institute internaţionale de renume. Modelul propus de această relaţie de cauzalitate este valabil la nivel mondial şi nu există alte dovezi alternative care să explice etiologia cancerului cervical. HPV a fost astfel propus drept “cauză necesară” a cancerului cervical. Concret, conceptul de cauză necesară implică faptul că neoplazia cervicală nu se poate dezvolta în absenţa persistenţei AND/HPV. Stabilirea acestei relaţii de cauzalitate a condus la dezvoltarea sistemelor de detecţie ADN/HPV, cu

8

importante consecinţe practice pentru diagnosticul precoce al displaziilor cervicale şi pentru monitorizarea încărcăturii virale a ADN-ului genotipurilor oncogene. De asemenea, această descoperire a dus la iniţierea programelor de prevenţie primară a infecţiei determinate de HPV, prin descoperirea formulei vaccinale.

Dovada etiologică a implicării HPV în producerea cancerului cervical a fost demonstrată de studii populaţionale în întreaga lume.

Studii de prevalenţă au demonstrat că, în condiţii optime de testare (probe de ţesut adecvate şi tehnici sensibile de diagnostic), ADN/HPV poate fi identificat în toate probele de cancer cervical. Fac excepţie doar forme rare de limfoame cervicale, sarcoame şi alte tipuri histologice rare.

Studiile caz-control au demonstrat în mod constant riscul pentru femeile pozitive cu genotipuri înalt oncogene (genotipuri HR HPV – High Risk HPV). De a dezvolta cancer cervical pentru femeile HR HPV pozitive, în comparaţie cu loturile martor. Studiile comparative au presupus testarea femeilor care aveau caracteristici similare cu cele ale pacientele din lotul de studiu: vârstă, status educaţional, expunerea la factori de risc adiţionali. Pacientele HPV pozitive pentru 16 sau 18 se consideră a avea un risc mult mai crescut decât pacientele infectate cu alte serotipuri. Din acest motiv, serotipurile 16 şi 18 fac parte din categoria HR HPV, împreună cu genotipurile 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68.

Sudiile de cohortă (femei care au fost urmărite în timp prin repetarea testării ADN/HPV şi a examenelor citologice Papanicolau) au demonstrat că riscul absolut de progresie a leziunilor induse de HPV 16 sau 18 către neoplazia cervicală intraepitelială de grad 3 (CIN – Cervical Intraepithelial Neoplasia) este foarte mare în comparaţie cu infecţia cu celelalte genotipuri înalt oncogene (1).

Programele de prevenţie primară (prin vaccinare) şi secundară (prin screening) au demonstrat că prin reducerea expunerii la HPV este posibilă reducerea incidenţei CIN 2 / 3 şi, prin extensie, este posibilă reducerea incidenţei cancerului cervical.

În ţările în curs de dezvoltare sunt înregistrate 80% din cazurile de cancer cervical; pentru anumite colectivitaţi riscul cumulativ este cuprins între 1,5 – 3 %, în timp ce în ţările dezvoltate se situează în jurul valorii de 3,6% din totalul de cazuri noi, cu un risc cumulativ de 0,8% în rândul femeilor până la vârsta de 65 ani. În general, cele mai scăzute rate (< 15/100.000) sunt înregistrate în Europa (cu excepţia ţărilor din Europa de Est), America de Nord şi Japonia.

Incidenţa este crescută mod deosebit în America Latină (33,5/100.000), Africa Subsahariană (31,0) şi în Asia de Sud Est (18.3). Numitorul comun pentru ţările în curs de dezvoltare este reprezentat de status-ul socieoeconomic scăzut şi

9

de lipsa programelor de screening indispensabile în detectarea precoce a leziunilor canceroase şi precanceroase.

La nivel global modalităţile de diagnostic şi tratament duc de multe ori la stoparea evoluţiei leziunilor, rata de mortalitate fiind substanţial mai scăzută decât incidenţa, situându-se în jurul valorii de 55%. Pe de altă parte, cancerul cervical afectează femei relativ tinere, ceea ce duce automat la scăderea speranţei de viaţă. O estimare recentă concluzionează că neoplazia cervicală este cea mai importantă cauză de “pierdere de ani de viata” pentru ţările în curs de dezvoltare. În America Latină, Caraibe şi Europa Centrală, cancerul cervical aduce o contribuţie mai mare la pierderea anilor de viaţă, în comparaţie cu boli ca tuberculoza sau SIDA.

HPV este considerat în prezent al doilea factor de risc neoplazic (după fumat), fiind implicat în inducerea a 5% dintre cancerele umane în total, a 10% din neoplaziile la femei şi înregistrând 15% dintre cancerele femeilor din ţările în curs de dezvoltare (2).

Proiectul GLOBOCAN (bază de date a Agenţiei Internaţionale pentru Studiul Cancerului ; IARC – International Agency for Research on Cancer) are ca scop furnizarea estimărilor actualizate ale incidenţei şi mortalităţii principalelor categorii de cancer, la nivel naţional, pentru toate ţările din lume. Estimările GLOBOCAN sunt publicate pentru anul 2008 (42), pe sexe şi pe grupe de vârstă, bazându-se pe datele recente furnizate de IARC; la acestea se adaugă informaţiile oficiale disponibile pe site-urile instituţiilor de sănătate publică şi datele provenite din “surse locale”. Dificultăţile în interpretarea acestor date sunt explicate măcar în parte de faptul că sursele de date sunt în continuă creştere şi ele nu pot fi sistematizate şi comparate deoarece înregistrarea acestora nu se face după o metodologie unitară şi deci, există inegalităţi în ceea ce priveşte colectarea de date atât calitativ cât şi cantitativ. În ultimii ani există mai ales pentru ţările din S-E Europei preocuparea de a crea o bază de date unică în care datele sa fie culese unitar, după aceeaşi metodologie, în vederea creeării registrului naţional de cancere.

În România există această preocupare pentru formarea a 8 registre de cancer, deoarece recomăndările experţilor presupun creearea unui registru de cancer pentru populaţii cuprinse între 4 – 5 milioane de locuitori. Aceste precizări privind calitatea datelor înregistrate (incidenţă, mortalitate, morbiditate) sunt utile atunci când tentăm să comparăm valori ale diferitelor forme de cancer înregistrate, în diferite ţări de pe glob. De multe ori, diferenţele observate pot fi rezultatul utilizării unei metodologii diferite, sau care se modifică în timp, pentru aceeaşi ţară, ceea ce poate

10

duce la valori total diferite ale incidenţei pentru aceeaşi ţară. Utilizând informaţiile online furnizate de proiectul GLOBOCAN, identificăm pentru România o incidenţă de 23.9/0000 pentru neoplazia cervicală şi 3402 cazuri de cancer cervical. Pe baza acestor date putem observa incidenţa extrem de scăzută a cazurilor de cancer de col uterin în ţările din Europa de vest şi în Ţările Nordice, în America de Nord şi Australia. La pol opus se remarcă valorile îngrijorătoare întâlnite în ţările din Africa, America de Sud (50 – 56.3), India şi Romania. Lipsa programelor eficiente de screening precum şi gradul scăzut de informare al populaţiei feminine cu risc, sunt probabil principalele cauze ce au dus la creşterea incidenţei cancerului de col uterin în aceste zone ale globului. Date recente (iunie 2010) situează România pe primul loc în Europa în ceea ce priveşte incidenţa (23.9) şi mortalitatea (11.6) prin cancerul de col, din totalul celor 20 de ţări europene analizate (4).

Fig. 1: Incidenţa şi mortalitatea estimată pentru cancerul de col uterin, pentru 20 de ţări din Europa (4) (http://globocan.iarc.fr)

11

Din ianurie 2010, Centrul de Informare pentru HPV şi cancerul cervical (WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer) a dat publicităţii date oficiale privind incidenţa cancerului cervical. (2) În acest raport, pentru România se menţionează că “nu sunt date disponibile referitoare pentru primele 10 genotipuri HPV, în rândul femeilor cu şi fără leziuni cervicale”, în comparaţie cu datele disponibile pentru Europa sau cele de la nivel mondial.

Lipsa acestor date pentru România poate fi explicată, macar în parte, prin dificultatea centralizării unor date după o metodologie unică şi prin absenţa unui soft-ware dedicat, pentru înregistrarea corectă, completă şi unitară a datelor privind cancerele înregistrate la nivel regional, respectiv naţional. O a doua explicaţie este lipsa fondurilor necesare testării prin tehnici de biologie moleculară, în vederea stabilirii prevalenţei şi distribuţiei genotipurilor HPV în rândul populaţiei feminine.

În acest context, studiul propus, are ca prim obiectiv estimarea prevalenţei infecţiei cu HPV în rândul femeilor din zona de Nord Est a Moldovei, precum şi distribuţia genotipurilor HPV în raport cu gradul displaziei cervicale, prin utilizarea unei metode sensibile de detecţie a genotipurilor de HPV. Al doilea obiectiv este acela de a stabili rolul încărcăturii virale ca biomarker în diagnosticarea leziunilor displazice, obiectiv care presupune selectarea pacientelor HPV 16 şi HPV 18 pozitive, monitorizarea încărcăturii virale, astfel încât să putem stabili acea valoare prag a încărcăturii virale utilă diagnosticului precoce, în vederea instituirii măsurilor terapeutice în timp util.

Tranziţia de la cercetare la implementarea de rutină Multiple studii transversale au demonstrat faptul că testarea ADN/HPV este mult mai sensibilă pentru CIN2 decât citologia, dar mai puţin specifică (14). Tabel I: Comparație între sensibilitate, specificitate pentru citologie vs testare ADN/HPV

Sensibilitate Specificitate HPV 96 (94 – 97) 91 (90 – 91) Citologie 53 (49 – 57) 96 (96 – 97)

Rezultatele prezentate în Tabelul II au fost obţinute prin analiza

rezultatelor a mai multor triale randomizate (NTCC – Italia, Public Health Trial – Finlanda, Swedescreen, POBASCAN – Olanda, ARTISTIC – Anglia), realizate între anii 2006 – 2008.

12

Fig. 2: Cele mai frecvente tipuri de HPV în rândul femeilor cu / fără leziuni

cervicale, în ţări din Europa de Est şi la nivel mondial (http://www.who.int/hpvcentre/en) (2)

Tranziţia de la cercetarea la implementarea rezultatelor cercetării

necesită un timp îndelungat şi este în mod particular dificilă atunci când este deja stabilit un program de screening. Toate acestea reprezintă o provocare pentru noile modalităţi de testare, pentru că implementarea de noi metode de screening naţional presupune şi consideraţii politice. O asemenea problemă s-a pus în Anglia, şi anume, un proiect multicentric randomizat şi-a propus să evalueze dacă testarea HPV poate reduce incidenţa cancerului cervical într-o manieră cost – eficientă.

13

Discrepanţa între cercetare şi implementare poate fi diminuată prin proiecte randomizate, cum ar fi programe naţionale de screening. Prin asemenea tipuri de proiecte se poate demonstra că utilizând o singură rundă de testare HPV se poate cheltui mai puţin decât realizând 2 runde de citologie în mediu lichid. Un asemenea proiect poate fi indeplinit în ţări unde există un program de screning al cancerului cervical foarte bine organizat şi sistematizat. Implementarea presupune de asemenea ca femeile testate să primească mai multe informaţii despre testarea ce urmează a li se realiza, precum şi o infrastructură adecvată pentru urmărirea pe termen îndelungat (programe de screening organizate şi iniţiative ale guvernelor de a participa la aceste acţiuni) (15).

Suntem pregătiţi pentru implementarea testării AND HPV ca metodă de screening primar ?

Una din cele mai importante descoperiri medicale în ultimii 50 de ani a fost indentificarea HPV drept cauză primară a cancerului cervical. Este cunoscut faptul că, virtual, toate cazurile de cancer cervical sunt produse de HPV, iar această informaţie a fost utilizată pentru a obţine vaccinuri împotriva a două tipuri majore de HPV (16 şi 18), care cauzează aproximativ 70% din toate neoplaziile cervicale la nivel mondial. De asemenea, aceaaşi informaţie a condus la dezvoltarea de teste screening care identifică virusul direct în celulele cervicale, în opoziţie cu abordarea convenţională de a observa anomaliile citologice cauzate de virus. Rolul screening-ului pentru tipurile HR HPV se regăseşte în 3 situaţii:

a. managementul leziunilor cu risc scăzut, în care prezenţa unui HR HPV sugerează o leziune CIN;

b. “test of cure” în cazul femeilor tratate pentru leziunile CIN cu grad înalt;

c. test de screening primar: sensibilitatea crescută a testării HPV indică faptul că testele ADN pot fi folosite ca test unic de screening primar, iar citologia poate fi utilizată ca test de triaj pentru femeile HPV pozitive.

Specialişti în domeniu au revizuit o multitudine de teste care au evidenţiat că testarea HPV este mult mai sensibilă decât citologia şi poate fi, în mod sigur realizată la intervale mai mari de timp. Studii viitoare vor propune un nou algoritm pentru utilizarea testării HPV ca unic test de screening pentru femeile cu vârsta peste 30 de ani (15).

14

5. Optimizarea metodei de detecţie a 37 tipuri HPV cu ajutorul kitului Linear Array HPV Genotyping Test

Principiul procedurii – testul Linear Array HPV Genotyping test se bazează pe 4 etape majore:

1. prelucrarea probelor recoltate de la paciente; 2. amplificarea PCR a ţintelor ADN, utilizând primeri HPV; 3. hibridizarea ampliconilor; 4. detecţia prin determinare colorimetrică a produselor amplificate.

1. Recoltarea produselor patologice de la nivelul colului uterin se realizează cu ajutorul periuţelor Cervex Brush care se descarcă în recipientele pentru transportul probei (ThinPrep PreservCyt Solution). După descărcarea periuţei în soluţia ThinPrep, aceasta se aruncă. 2. Amplificarea ţintelor: Amplificarea ţintelor ADN HPV este realizată cu ajutorul polimerazei AmpliTaq Gold care facilitează amplificarea “hot start”, precum şi cu ajutorul beta globinei ca şi control. Iniţial, mixul reacţiei PCR este încălzit pentru a activa polimeraza AmpliTaq Gold, ceea ce favorizează denaturarea ADN-ului viral şi a celui genomic, precum şi punerea în contact cu secvenţele primerilor ţintă. Pe masură ce amestecul se răceşte, primerii (upstream şi downstream) se fixează pe ţinta ADN. Polimeraza, în prezenţa Mg2+ şi a excesului de dNTPs, extinde fixarea primerilor până la formarea unui ADN dublu catenar de 450 perechi de baze, sau 268 perechi de baze pentru ampliconul de beta globină. Acest process este repetat pentru un anumit număr de cicluri (40), în fiecare ciclu având loc dublarea cantităţii de amplicon. Amplificarea are loc numai în regiunea genomului HPV sau a beta globinei, între cele mai apropiate perechi de primeri; nu are loc amplificarea întregului genom. Amplificarea selectivă: Amplificarea selectivă a ţintelor de acid nucleic este obţinută prin utilizarea enzimei AmpErase (uracil-N-glicozilaza) şi a deoxiuridin trifosfat. Enzima AmpErase recunoaşte şi catalizează denaturarea lanţurilor ADN care conţin deoxyuridina, dar nu şi pe acele lanţuri ADN care conţin deoxitimidină. Deoxiuridina nu este prezentă în ADN-ul natural, dar este prezentă întotdeauna în ampliconi, datorită faptului că Mastermix-ul conţine deoxiuridină – trifosfat; prin urmare, numai ampliconii conţin deoxiuridină. Enzima AmpErase, care este inclusă în Mastermix, catalizează desfacerea deoxiuridenei care conţine ADN, în reziduuri de deoxiuridină, prin deschiderea lanţului de deoxiriboză la nivelul C1. În timpul primului ciclu termic, la pH-ul alcalin al Mastermixului, lanţurile de ADN ale ampliconilor se rup la poziţia deoxiuridinei. Enzima

15

AmpErasa este inactivă la temperaturi peste 55 ºC, şi, prin urmare nu va distruge ampliconii ţintă. După amplificare, orice rest enzimatic este denaturat prin adaugarea soluţiei de denaturare, ceea ce previne degradarea ampliconilor. 3. Reacţia de hibridizare: După amplificarea PCR, ampliconii HPV şi de beta globină sunt chimic denaturaţi şi formează un singur lanţ de ADN, prin adăugarea soluţiei de denaturare. Ampliconii denaturaţi sunt trasferaţi în godeurile corespunzatoare din taviţa de hibridizare, godeuri care conţin lichidul de hibridizare şi un singur strip din kit (strip care conţine probe de HPV şi beta globină). Ampliconii fixaţi de biotină vor hibridiza acele probe oligonucleotidice care conţin secvenţa corespunzătoare probei complementare. În plus, stripurile kitului sunt sensibilizate şi pentru o probă oligonucleotidică cross-reactivă care hibridizează cu genotipurile HPV 33, 35, 52 58. Ampliconul care conţine secvenţe apropiate (1 până la 3 neconcordanţe), complementare probei, vor hibridiza cu această bandă. 4. Reacţia de detecţie: După reacţia de hibridizare, stripurile sunt spălate pentru a îndepărta materialul nefixat. Se adaugă în tăviţa de hibridizare un conjugat: peroxidaza de hrean – streptavidina. Aceasta se va fixa pe ampliconii hibridizaţi cu oligonucleotidele de pe strip. Stripul este supus unor etape de spălare pentru a îndeparta excesul de streptavidina. Se adaugă un substrat – soluţie care conţine peroxid de hidrogen şi 3, 3’, 5, 5’ tetrametilbenzidină (TMB). În prezenţa peroxidului de hidrogen, streptavidina fixată catalizează oxidarea TMB către formarea unui complex albastru, care precipită la poziţia probei unde a fost relizată hibridizarea. Stripul este citit vizual prin compararea benzilor de pe strip cu şablonul din kitul Linear Array HPV Genotyping Test (16).

Interpretare rezultate Linear Array HPV Genotyping test: Ø test calitativ in vitro ce detectează prezenţa a 37 genotipuri HPV:

• 13 genotipuri cu risc înalt oncogen: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68;

• 24 genotipuri cu risc intermediar şi scăzut oncogen: 6, 11, 26, 40, 42, 45, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, IS39, CP6108;

• beta globina – martor de recoltare, purificare, amplificare corecte a ADN / HPV.

16

Fig. 3: Şablon de interpretare, martor pozitiv şi negativ, stripul pacientei 24,

pozitiv pentru HPV 16 – infecţie unică

Fig. 4: Şablon de interpretare, martor pozitiv şi negativ, stripul pacientei 14, pozitiv pentru HPV 16 şi HPV 18– infecţie multiplă

Concluzii:

1. Îndeplinirea criteriilor de validare impuse de protocoalele de lucru ale producătorilor ne-au permis confirmarea rezultatelor şi optimizarea tehnicii de lucru pentru genotiparea HPV.

2. Validarea în cazul testului de genotipare a fost posibilă prin îndeplinirea criteriilor de calitate pentru martorul pozitiv şi negativ, cat şi prin prezenţa benzilor de beta globină (cu cele două valori, “high”, respectiv “low”).

17

6. Optimizarea tehnicii Real Time PCR pentru cuantificarea ADN/HPV 16 și a ADN/HPV 18

În anul 1996, compania Applied Biosystems (ABI) a realizat primul

instrument Real Time PCR (PCR în timp real) comercial – instrumentul denumit ABI 7700. De atunci, RT qPCR (RT CPCR – PCR cantitativ în timp real) a devenit cea mai exactă şi sensibilă metodă pentru detecţia şi cuantificarea acizilor nucleici. Principiul RTPCR: intensitatea fluorescenţei din sistemul de reaţie este direct proporţională cu cantitatea iniţială a produsului de amplificat; vizualizarea este posibilă prin utilizarea unei molecule fluorescente (26). Comparaţie PCR versus RT PCR :

o fluorescenţa este măsurată în timpul fiecărui ciclu de amplificare (semnalul este direct propoţional cu cantitatea produsului PCR) ;

o curbele de amplificare cresc după un număr de cicluri care este proporţional cu cantitatea iniţială de matriţă (template) ADN;

o raportarea la valorile curbei standard va oferi date legate de cuantificarea produsului dorit (27).

o momentul în care se vizualizează produsul reacţiei de amplificare: § în reacţia PCR clasică, rezultatele se evidenţiază în gelul de

electroforeză, după ce amplificarea s-a finalizat şi când pot apare inhibitori ai reacţiei;

§ în RT PCR, măsurarea fluorescenţei se realizează în timpul fiecărui ciclu de amplificare. Aceasta permite cuantificarea ţintei înainte de acumularea inhibitorilor, inactivarea polimerazei.

Evaluarea datelor qPCR Odată ce experimentul a fost finalizat, se realizează analiza datelor obţinute. Această analiză presupune anumiţi paşi:

o Analiza preliminară a datelor: § corectia baseline; § setarea threshold cycle; § verificarea controalelor negative / pozitive; § verificarea probelor necunoscute; § realizarea analizei specifice a experimentului:

• curba standard - cuantificarea absolută / parametri; • quantificarea relativă; • “curba de melting” / topire (doar pentru SYBR Green).

Baseline – este ciclul iniţial în RTPCR când se poate observa o mică schimbare în semnalul fluorescent, de obicei regăsindu-se la ciclurile 3-15.

18

Threshold cycle / Ct – primul ciclul PCR la care fluorescenţa măsurată de instrument este determinată peste nivelul semnalului de fond (back-ground) (fig 24). Cuantificarea absolută:

• presupune construirea unei curbe standard pentru fiecare ţintă; • curba standard este realizată dintr-o serie de diluţii ale unei probe

cu o concentraţie cunosctă; • Ct-ul fiecărui standard se situează pe axa orizontală, iar pe axa

verticală sunt notate valorile logaritmice ale concentraţiilor cunoscute;

• curba standard este utilizată pentru a estima concentraţia probelor necunoscute.

Parametrii unei curbe standard corect realizată: o eficienţă înaltă: 90% - 110%; o precizie bună: 0,985 – 1,00; o variabilitate scăzută între standarde.

Etapele de lucru: Ø recoltare produse patologice; Ø purificare ADN – HPV; Ø cuantificare AND/HPV 16 şi HPV 18 prin Real Time PCR.

1. Recoltarea produselor patologice şi purificarea ADN HPV se realizează similar testului de genotipare, anterior detaliat. Singura deosebire este faptul că protocolul nu presupune concentrarea probei prin centrifugare, tehnica Real Time PCR fiind mult mai sensibilă decât PCR –ul clasic.

2. Quantificarea HPV 16 şi 18 utilizând kiturile Path-HPV16 Real-time PCR detection kit for Human Papillomavirus, Path-HPV18 Real-time PCR detection kit for Human Papillomavirus, 2 x Precision TM Mastermix, PrimerDesign, cu ajutorul instrumentului qPCR – STRATAGENE, MX3000P:

Fig. 5: Termocyclerul Stratagene MX3005P

19

v Kitul 2 x Precision TM Mastermix conţine: buffer, 0,025 U/ µl

Taq Polimerază, 5 mM MgCl2, dNTP Mix (200 µM pentru fiecare dNTP) (29).

v Kiturile Path-HPV16 Real-time PCR detection kit for Human Papillomavirus şi Path-HPV18 Real-time PCR detection kit for Human Papillomavirus conţin:

Probe lucrate şi optimizate: a. Pacienta H. L., 29 ani, cu următorul istoric:

- 6.04.09: HSIL; - 12.04.09: HPV 16 pozitivă.

Parametrii generaţi de soft-ul instrumentului pe baza celor 5 standarde s-a încadrat in limitele normale (fig. 8):

o eficienţă înaltă: 99,2 % (90% - 110%); o precizie bună: 0,999 (0,985 – 1,00);

Fig 6: Curba standard optimizată realizată pentru 5 standarde

b. Pacienta V. D, 23 ani, pozitivă pentru HPV 18, 53, 54.

Fig 7: Curba standard (pacienta V.D.)

o eficienţă înaltă: 93,5% (90% - 110%); o precizie bună: 0,997 (0,985 – 1,00).

Concluzie: În această etapă a cercetării a fost optimizată cuantificarea încărcăturii virale prin RT PCR, pentru genotipurile înalt oncogene de HPV, respectiv tipurile 16 şi 18.

20

7. Validarea tehnicii de genotipare prin participarea la HPV Proficiency Testing

(WHO HPV LabNet Report on HPV DNA Proficiency Panel 2010)

Evaluarea vaccinării HPV, implementarea efectivă și monitorizarea programului de vaccinare HPV necesită utilizarea de metode corecte de detecție și de tipare a ADN HPV, care pot fi comparate la nivel internațional.

WHO Global HPV LabNet este o inițiativă a OMS (Organizația Mondială a Sănătații) al cărei scop este sprijinirea implementării vaccinării HPV la nivel mondial, prin standardizarea laboratoarelor și asigurarea calității testării HPV și a metodelor de genotipare utilizate pentru evaluarea vaccinării anti HPV și pentru supravegherea și monitorizarea programelor de vaccinare. (http://www.who.int/biologicals/vaccines/hpv/en/index.html ).

O strategie importantă pentru atingerea acestui demers este dezvoltarea, pregătirea și validarea unui panel de proficiență pentru a califica metodele de genotipare și laboratoarele în care se utilizează aceste metode.

Apelul pentru participarea la acest studiu de competenţă a fost publicat pe site-ul OMS și trimis apoi birourilor regionale ale OMS în data de 10 aprilie 2010, pentru publicul larg. Scopurile acestui panel au fost:

a. Evaluarea competenţei metodelor de tipare a HPV utilizate în mod curent în laboratoare la nivel mondial;

b. Evaluarea sensibilității detecției tipurilor specifice de HPV, prin diferite metode de lucru;

c. Identificarea problemelor fiecărei metode utilizate de rutină. Metoda de realizare a testului de proficiență Compoziția panelului: în laboratorul de referință LabNet Global Reference Laboratory (GRL) al University Hospital in Malmö, Suedia, au fost primite genóme complete ale HPV clonate în plasmide, însoțite de apobarea scrisă a aparținătorilor de a fi utilizate în acest panel de proficiență OMS.

Toate probele au fost plasmide diluate în ADN uman placentar (Sigma-Aldrich no 7011), până la o concentrație de 10 ng/l. Tipurile de HPV incluse au fost: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68a (HPV 68 prototip) și 68b (ME 180 izolat prin microscopie electronică). Trei probe suplimentare, A, B și C au fost linii celulare utilizate ca și control pentru purificarea ADN, primul pas al genotipării HPV. Compoziția panelului este redată în tabelul XV.

21

Distribuirea PP: după validare, PP a fost distribuit în perioada iunie – august, 2010, către 105 laboratoare din 6 regiuni OMS, în urma apelului de participare și urmare a solicitărilor primite din partea laboratoarelor. Nu a fost solicitată nici o taxă de participare din partea laboratoarelor. Distribuirea PP a fost de asemenea plătita de către WHO HPV LabNet. Numărul laboratoarelor incluse în PP, în funcție de regiune OMS a fost (fig. 39):

o 1 (AFRO – Regional Office for Africa); o 5 (EMRO – Regional Office for the Eastern Mediterranean); o 49 (EURO – Regional Office for Europe); o 9 (SEARO – Regional Office for South East Asia); o 18 (WPRO – Regional Office for Western Pacific); o 23 (Regional Office for the Americas – AMRO, sau Pan American

Health Organization – PAHO).

Fig 8: Distribuirea la nivel mondial a laboratoarelor care au trimis rezultatele

pentru panelul de proficiență ADN/ HPV

Au fost returnate către GRL 132 seturi de date cu rezultatele genotipării HPV, înainte de dead-line, de la 98 de laboratoare. 73 de laboratoare au trimis datele obținute utilizând o singură metodă de genotipare, 17 laboratoare au utilizat câte 2 metode de genotipare HPV, 7

22

laboratoare au utilizat 3 metode, iar un laborator a genotipat probele utilizând 4 metode diferite.

În anul 2008, panelul HPV – OMS a fost pregătit, administrat și distribuit de laboratorul de referință din Suedia. Datorită resurselor limitate ale laboratorului de referință, în 2010, acesta doar a pregătit materialele, iar subcontractarea, administrarea și distribuția probelor a fost realizată de compania non-profit EQUALIS (External Quality Assurance in Laboratory Medicine In Sweden), activă în domeniul asigurării controlului extern. Modelul utilizat pentru testarea din 2010 a decurs bine și este considerat un model de organizare pe termen îndelungat, în ceea ce privește distribuirea panelurilor de proficiență HPV în fiecare an. Analiza datelor: datele analizate în acest raport includ toate rezultatele care au fost trimise înainte de data de 1 noiembrie 2010. Datele au fost compilate de către EQUALIS și transferate apoi GRL pentru analiza rezultatelor. Fiecare set de date a primit un număr cuprins între 1 și 132. Aceste date au fost analizate în funcție de regiunea laboratorului și de metoda utilizată pentru genotipare.

Din datele trimise, s-a remarcat faptul că laboratoarele participante au utilizat metode comerciale precum și metode „in-house” (Tabelul 2). Proporția rezultatelor corecte pentru genotiparea HPV, raportate de fiecare laborator în parte, a fost analizată în funcție de metoda utilizată. Un set de date analizat a fost considerat proficient / competent dacă a detectat cel puțin 50 unități internaționale (UI) de HPV 16 și HPV 18 în 5 µl proba și 500 genóme echivalent (GE) în 50 µl pentru alte tipuri HPV, fie în infecții unice, fie in infecții multiple. Pentru stabilirea proficienței/competenței, a fost de asemenea stabilită condiția de a nu se fi raportat mai mult de un genotip ca reacție fals pozitivă. Aceasta corespunde unei specificități de 97 %. Rezultate: 98/105 laboratoare au raportat 132 seturi de date. 4 seturi de date au fost obținute utilizând metode care nu au diferențiat genotipurile HPV sau rezultatele au fost raportate ca HPV 16, 18 „și alte genotipuri HR HPV”. Aceste seturi de date nu au fost incluse în analiza genotip – specifică din acest raport. Fiecare set de date trimis de fiecare laborator în parte a fost analizat, iar participanții au primit o scrisoare de feed back în noiembrie 2010.

Fig. 41 include numai datele care au fost obținute prin testarea a mai mult de două genotipuri HPV (118 seturi de date). Rezultatele laboratoarelor care au au genotipat numai HPV 16 și 18 au fost excluse din această figură.

23

Fig. 9: Proficiența testării ADN/HPV în funcție de regiunea OMS

Fig. 10: Imaginea celor 48 de stripuri obţinute prin prelucrarea probelor ADN/HPV – OMS

Rezultatele obținute în laboratorul de Virusologie Moleculară al

UMF „Grigore T. Popa”, Iași, pentru care am fost evaluați ca fiind proficienți pentru genotiparea HPV, sunt redate în tabelul XVIII (42).

24

Tabel II: Rezultatele obținute la HPV Proficiency Testing 2010, OMS

Panel ID HPV type(s) in the panel Content (IU or GE per 5 µl)

Your results Linear Array

50 µl input volume 1 59 50 HPV 59

2 31 500 HPV 31 3 6, 16, 18, 51 500 HPV 6, 16, 18, 51 4 45 500 HPV 45

5 16 50 HPV 16 6 35, 59, 66, 68ME 500 HPV 35, 59, 66, 68; * 7 56 500 HPV 56 8 18 50 NEGATIVE 9 35 500 HPV 35;* 10 68ME 500 HPV 68 11

11, 16, 31, 33, 58 50 HPV 11, 16, 31, 33,

58;*. 12 51 50 HPV 51 13 6 500 HPV 6 14 58 500 HPV 58; * 15 66 50 HPV 66 16 39, 45, 52, 56, 68a 500 HPV 39, 45, 56, 52. 17 33 500 HPV 33 18 39 50 HPV 39 19 52 500 HPV 52. 20 68 50 NEGATIVE

21 11 500 HPV 11 22

11, 16, 31, 33, 58 500 HPV 11, 16, 31, 33,

58;* 23 16 5 HPV 16 24 56 50 HPV 56

25 33 50 HPV 33 26 6, 16, 18, 51 50 HPV 6, 16, 18, 51. 27 Negative 0 NEGATIVE

28 35 50 HPV 35; * 29 18 5 HPV 18 30 58 50 HPV 58; * 31 68ME 50 HPV 68 32 39, 45, 52, 56, 68 50 HPV 39, 45, 52, 56; * 33 6 50 HPV 6 34 45 50 HPV 45

35 68 500 NEGATIVE

25

36 66 500 HPV 66 37 11 50 HPV 11 38 59 500 HPV 59 39 52 50 HPV 52 40 35, 59, 66, 68ME 50 HPV 35, 59, 66, 68;* 41 31 50 HPV 31

42 39 500 HPV 39 43 51 500 HPV 51 A 16 25 NEGATIVE; B none 0 NEGATIVE; C 16 2500 HPV 16 LOW;

* menționăm că toate datele prezentate în acest raport au fost traduse cu permisiunea organizatorilor panenului de proficiență (53).

8. Prevalenţa şi distribuţia genotipurilor HPV în rândul femeilor din zona Moldovei

Obiective: Estimarea prevalenţei şi distribuţiei genotipurilor HPV

în zona de Nord a Moldovei. Corelarea infecţiei HPV cu factorii de risc ai displaziei cervicale.

Material şi metode: în perioada septembrie 2009 – mai 2011 am genotipat 353 de probe ADN purificat din celule cervicale, recoltate de la pacientele invitate să participe la studiu. Participantele au semnat formularul de consimţământ informat aprobat de Comisia de Etică a Universităţii de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa”, Iaşi.

Înainte de recoltarea de celule cervicale, medicii ginecologi au completat, împreună cu pacientele, date personale ale acestora. În acest formular de solicitare a analizei de genotipare HPV am încercat sa aflăm care sunt co-factorii displaziei cervicale: numărul de naşteri, utilizarea de contraceptive orale, fumatul, numărul de parteneri sexuali, alte infecţii genitale (Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Candida albicans, virusul herpes simplex), rezultatul examenului citologic Babeş Papanicolau. De asemenea, am solicitat în acest formular date despre utilizarea tratamentului antiinflamator în antecedente, dacă a existat suspiciune macroscopică sau simptomatologie sugestivă (fig. 46).

26

Datele anamnestice ale pacientelor precum şi rezultatul testărilor au fost prelucrate cu ajutorul programului de prelucrare statistică a datelor - SPSS 16.0.

negative64%

infectii unice25%

infectii multiple11%

Fig. 11: Prevalența infecțiilor HPV

Fig. 12: Formularul de solicitare a analizei de genotipare HPV

27

În tabelul IV este redată prevalența genotipurilor HPV în toate infecțiile detectate, iar în fig. 15 sunt redate frecvențele genotipurilor HPV în cazul pacientelor cu citologie normală și patologică. Tabel III: Prevalenta genotipurilor HPV pentru toate tipurile de infecții: unice și multiple

Tip HPV Frecventa Procent

negativ 226 64,0

16 35 9,91

53 20 5,66

51 18 5,09

18, 31 11 3,11

52 10 2,83

6, 42 8 2,26

58, CP6108 7 1,98

45 6 1,69

33, 66, 70 5 1,41

68, 73, 84 4 1,13

56, 82 2 0,65

40 1 0,28

Fig. 13: Cele mai frecvente genotipuri HPV identificate in rândul femeilor din

Nordul Moldovei, cu citologie normală şi patologică

28

Concluzii:

• genotiparea prin testarea ADN /HPV este cea mai indicată metodă de screening pentru cancerul cervical, datorită sensibilităţii, criteriilor de validare şi obiectivităţii cu care se fac interpretările;

• identificarea tipului de HPV oferă posibilitatea evaluării displaziei cervicale post conizaţie;

• prevalenţa genotipurilor HPV 16 şi HPV 18 în rândul pacientelor testate a fost de 9.91 %, respectiv 3.11, ceea ce justifică necesitatea vaccinării anti – HPV în zona noastră, mai ales pentru HPV16;

• studiul de faţă permite selectarea pacientelor HPV 16 şi HPV 18 pozitive, care vor fi urmărite în dinamică, prin tehnica Real Time PCR, în vederea stabilirii “valorii prag” a încărcăturii virale, cât mai precoce, ideal, anterior evoluţiei către neoplazia cervicală, în vederea instituirii terapiei chirurgicale;

• deoarece genotiparea HPV permite evaluarea fenomenului de persistenţă a infecţiilor cu HR HPV, se impune, pe viitor, repetarea testării la 6, respectiv 12 luni, pentru a departaja obiectiv, infecţiile tranzitorii, de cele permanente;

9. Corelaţii ale încărcăturii virale a HPV16 și HPV 18 cu gradul displaziei cervicale și cu factorii de risc ai neoplaziei cervicale

Material şi metodă:

Am cuantificat prin Real Time PCR probele ADN HPV detectate pozitive pentru HPV 16 (34 paciente) şi HPV 18 (8 paciente) prin tehnica de genotipare Linear Array HPV Genotyping Test.

Determinarea încărcăturii virale a fost realizată cu ajutorul kiturilor Precision 2X qPCR mastermix, Path-HPV16 Real-time PCR detection of Human Papillomavirus 16 Advanced kit şi Path-HPV18 Real-time PCR detection of Human Papillomavirus 18 Advanced kit. Amplificarea în timp real a utilizat termocyclerul MX 3005P, Stratagene.

Determinările prin Real Time PCR au fost realizate în 4 sesiuni de lucru.

29

A. Setarea godeurilor: standarde in dublu, controale, probe paciente

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV

Fig. 14: Imaginea plăcuțelor RT PCR setate

B. Profilul termic al experimentului a presupus 1 ciclu de 10’ la 95° C şi 50 de cicluri formate din două segmente: primul segment a presupus 15 sec la 95 ° C şi al doilea 1 min la 60 ° C.

Fig. 15: Profilul termic al experimentului

30

C. “RUN”: odată setate godeurile şi profilul termic, s-a selectat opţiunea “RUN” a soft-ului Stratagene. Întregul experiment a avut o durată de 72,5 minute. D. Evaluarea rezultatelor s-a putut realiza şi în timpul amplificării PCR, “în timp real”, iar în lucrarea de faţă am redat doar rezultatele finale ale experimentului. Evaluarea calităţii unei determinări prin Real Time PCR trebuie să urmeze paşii următori de analiză preliminară: - examinarea curbelor de amplificare; - verificarea / ajustarea liniei de background; - verificarea / ajustarea “threshold’; - verificarea controalelor (negative, pozitive); - verificarea probelor testate; - analiza specifică a experimentului.

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV Fig. 16: Curbele de amplificare

31

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV Fig. 17: Verificarea controalelor

Sesiunea IISesiunea I

Sesiunea III

Sesiunea IV

Sesiunea IV

Sesiunea IV

Sesiunea IV Fig. 18: Curbele standard ale celor 4 sesiuni

32

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV

Fig. 19: Numărul de cópii virale detectate

Analiza spectrofotometrică a acizilor nucleici, proteinelor și a culturilor celulare face parte din rutina zilnică a unui laborator modern. NanoPhotometrulTM universal combină masurătorile probelor, începând de la 0,7 µl până la volumele standard ale probelor – 3500 µl. Măsurătorile probelor în volume mai mici de 1 µl sunt realizate fără a fi necesare prezența cuvetelor, cu ajutorul celulei integrate LabelGuardTM Microliter. Etapele de măsurare a ADN-ului purificat cu ajutorul nanodropului NanoPhotometerTM Pearl sunt:

- pipetarea probei de ADN în centrul ferestrei de măsurare; - atașarea capacului; - curățarea ferestrei de măsurare cu un șervețel fără praf; - îndepărtarea surplusului de probă din oglinda capacului cu un

șervețel. Proba de măsurat este pipetată direct pe fereastra de măsurare.

Închiderea capacului favorizează formarea unei picături de lichid la o grosime a stratului optic exact definită (fig. 24). Tehnologia de compresie a probei ADN elimină riscul evaporării probei și de asemenea evită costurile unor calibrări repetate.

33

Fig. 20: Utilizarea nanodropului în laboratorul de biologie moleculară

Sesiunea a IV-a de RT PCR a beneficiat de avantajele utilizării nanodropului NanoPhotometerTM Pearl (achiziționat în cadrul grantului ID_1642). În tabelul V s-a facut corespondența între numărul de cópii virale detectate prin RT PCR, numărul CT-urilor și valoarea ADN cuantificată prin nanodrop.

Tabel IV: Asociere valoarea ADN cuantificată prin nanodrop ,

număr copii virale și valoarea CT-urilor Nr.

Probă testată Cuantificare

ADN nanodrop (µg/ml)

Număr cópii detectate în

proba inițială

Valoarea Ct corespunzătoare fiecărei probe

1 3,493 No Ct No Ct 2 12,5 1,593 x 103 29,73 3 3,493 No Ct No Ct 4 24,5 No Ct No Ct 5 18,5 4, 072 x 102 31,66 6 31,4 7, 915 x 105 20,97 7 18 3, 341 x 105 22,19 8 26,9 3, 722 x 10 35,04 9 15,5 1,321 x 103 30,00 10 9,481 No Ct No Ct

34

Cu ajutorul programului SPSS versiunea 16.0 am analizat statistic, descriptiv, prin crostabulare, relațiile dintre încărcăturile virale și diagnosticul citologic. Așa cum se poate vedea în figura 22, cele mai mari încărcături virale (105 și 106 cópii ADN / HPV 16, respectiv) au fost detectate în 40% din cazurile de LGSIL și în 60% în cazurile cu HGSIL. Totusi, am detectat o încărcare virală de 105 cópii și în cazul unei paciente cu citologie normală, și în cazul uneia cu celule atipice, ceea ce sugerează că încărcătura virală nu poate fi un marker eficient de detecție a femeilor cu risc crescut de evoluție către neoplazia cervicală.

De asemenea, am evaluat relația dintre încărcăturile virale și factorii de risc (fumat, contraceptive orale, grupul de vârstă, tipul infecției HPV unică versus multiplă).

Cele mai mari valori ale încărcăturilor virale ale ADN/HPV 16 au fost detectate la grupurile de vârstă 20 – 30 și 40 – 50 ani. De asemenea, cópii virale de ordinul a 106 au fost identificate și la paciente cu vârsta cuprinsă între 50 – 60 ani.

Pentru lotul nostru studiat, fumatul nu a fost un factor de risc care să fie corelat cu valori ridicate ale cópiilor virale de ADN/HPV 16. Cele mai ridicate valori ale cópiilor virale au fost detectate în lotul nostru pentru pacientele care au declarat că nu au utilizat contraceptive orale. Cele mai ridicate valori ale cópiilor virale de HPV 16 au fost detectate în cazul infecțiilor unice cu HPV 16, rezultat comparabil cu cele găsite și de alți autori.

Fig. 21: Corelații între încărcăturile virale ale ADN/HPV 16 și rezultatele

examenului citologic

35

Grupa de vârsta Fumat

ContraceptiveTipul infecției HPV

Fig. 22: Corelații între numărul de cópii virale și factorii de risc ai neoplaziei

cervicale Concluzii: • Diversitatea valorilor încărcăturii virale detectate in raport cu gradul

displaziei cervicale (am detectat încărcături virale mari, de 105 – 106 cópii virale, atât in situaţiile în care pacientele aveau HSIL, cum era de aşteptat, dar şi in cazurile cu LSIL, ASCUS si chiar cu citologie normala), a făcut imposibilă stabilirea unei valori limită, care să indice intervenţia chirurgicală terapeutică.

• Pentru 7 dintre pacientele testate am realizat monitorizarea lor, la 6, 12 si 18 luni, prin genotipare şi prin cuantificarea ADN HPV 16 &18 prin Real Time PCR.

• Lipsa de aderenţă a pacientelor la monitorizarea la care au fost invitate să participe, conform formularului de consimţământ informat, se poate explica prin neînţelegerea necesităţii urmăririi pacientelor în vederea precizării evoluţiei bolii.

• Se impune informarea populaţiei cu privire la relaţia dintre infecţiile determinate de HPV şi cancerul cervical ca şi la utilitatea participării la programele de monitorizare.

36

10. Testarea ADN/HPV post-intervenție chirurgicală excisională

Strategiile terapeutice în cazul bolii bolii confirmate colposcopic pot fi distructive sau excizionale. Nu există nici un avantaj demonstrat pentru nici una din tehnicile chirurgicale conservatoare pentru tratarea și eradicarea neoplaziei cervicale intraepiteliale. Superioritatea chirurgiei excizionale este dată însă de rata de succes a terapiei. Terapiile excisionale sunt preferate în majoritatea circumstanțelor, deoarece ele sunt în mod clar superioare metodelor distructive, având avantajul posibilității evaluării histologice a zonei de transformare. Examinarea histologică a țesutului excizat permite anatomopatologului să recunoască sau să elimine existența unui cancer microinvaziv, a unei boli glandulare sau a implicării marginilor zonei de transformare (90).

Monitorizarea după terapia CIN utilizând examenul citologic a fost cea mai frecventă procedură de urmărire, dar eficiența ei a fost discutată datorită sensibilității scăzute pentru detecția CIN prin această metodă. Deoarece infecția HPV este esențială pentru dezvoltarea și menținerea CIN, detecția ADN/HPV poate detecta leziunile CIN reziduale sau recurente mai rapid și cu o sensibilitate mai ridicată. Unele studii au identificat că ADN/HPV este de obicei eliminat dupa terapia eficientă a CIN, iar persistența ADN/HPV este predictivă pentru recurență. Studiile întreprinse până în prezent au analizat câteva metode diferite de terapie, care au fost identificate a avea rate de succes diferite în clearance-ul ADN/HPV, sugerând că testarea ADN/HPV este utilă pentru evaluarea diferitelor tehnici de terapie (92).

Unul din obiectivele tezei de doctorat a fost evaluarea tipului de infecție HPV, tranzitorie versus infecţie persistentă, la 6 luni de la intervenția chirurgicală, evaluată cu un test sensibil de identificare a ADN/HPV: Linear Array HPV genotyping test. Pentru atingerea acestui obiectiv, au fost analizate cazurile selectate din rândul pacientelor genotipate HPV.

21 paciente (22 – 46 ani) au fost testate post intervenție chirurgicală excizională. Au fost incluse în acest studiu toate pacientele care împreună cu ginecologul au completat formularul de consimțământ informat pentru participarea la studiu, precum și formularul de solicitare a genotipării HPV (fig. 46); în acest formular se cere menționarea motivului solicitării genotipării HPV (screening, testare post intervenție chirurgicală, suspiciune macroscopică, control după tratament radio-chirurgical, simptomatologie sugestivă sau investigațiii preoperatorii).

37

Metoda de lucru și kiturile utilizate au fost aceleași ca cele descrise în capitolul 4.

Rezultatele acestui studiu pot fi sumarizate astfel: • anterior intervenției chirurgicale:

– 14,2% (3/21) dintre paciente au fost pozitive pentru HPV 16;

– 4,7% au fost pozitive cu HPV 31 (1/21) și respectiv HPV 53 (1/21);

– o pacientă a prezentat infecție multiplă cu tipurile HPV 31, 51, 54;

• genotiparea post-intervenție terapeutică a identificat trei infecții persistente:

– două infecții unice (HPV 18 și respectiv HPV 51); – o infecţie cu tipuri HPV multiple (6, 39);

• 3 paciente negative pentru ADN/HPV post – conizație au prezentat aceleași rezultate citologice patologice pe toată durata monitorizării, nefiind influiențate de terapia excisională.

Utilizând tehnica Linear Array HPV Genotyping Test am identificat o persistență a infecției HPV, atât cu HR cât și cu LR în 14,28% din cazurile testate.

Din lotul pacientelor testate post – conizatie am selectat 3 cazuri particulare: Prezentări de caz: 1

• Pacienta N.L, 30 ani – displazie severă – examene citologice repetate: HGSIL – examene colposcopice repetate: sugestive pentru infecția

HPV • 2 intervenții excizionale

– 2 testări ADN/HPV la 6 luni: ambele negative pentru oricare din cele 37 genotipuri HPV testate

– ultimul examen citologic: normal Observație: posibilă afectare a celulelor cervicale produsă de tratamentul hormonal urmat de pacientă. Acesta este un exemplu de caz care a suferit multiple intervenții chirurgicale, marcante afectiv pentru pacientă, din cauza subiectivității testelor citologice și colposcopice. Prezentări de caz: 2

• N. M., 32 ani – examen citologic periodic: ASCUS, LGSIL, HGSIL – test ADN/HPV pozitiv pentru HPV 16, persitent la 6 luni – conizaţie

38

– retestare prin genotipare la 6 luni: HPV negativ Observaţie: eficienţa conizaţiei, certificată prin testarea ADN/HPV. Infecție persistentă tratată eficient prin conizație, confirmată prin testul ADN. Pacienta este menținută în programul de urmărire. Prezentări de caz: 3

• D.C., 45 ani – examen citologic: ASCUS

• testare ADN/HPV prin metoda HC II: negativ – examen citologic: HGSIL – genotipare HPV LA: HPV 18 – biopsie la 6 luni: HPV 18 – examen citologic: ASCUS – genotipare la 6 luni dupa biopsie: HPV 18 – se menține hemoragia intermenstruală – histerectomie totală (mai 2011): CIN 2

Observaţie: lipsa concordanței între examenle citologice și cele de biologie moleculară. Examenul citologic nu a fost concordant cu persistența ADN HPV 18. Concluzii:

Numărul redus de paciente urmărite post-conizaţie impune revizuirea consimţământului informat, astfel încât pacientele să înţeleagă avantajele participării la studii similare, ca modalitate de monitorizare a reactivării infecţiei persistente, ce impune strategii terapeutice diferite

Există evidențe științifice despre faptul că testarea HPV după terapie poate prezice eșecul tratamentului cu o sensibilitate semnificativ mai mare și cu specificitate similară, în comparație cu citologia repetată și cu statusul histologic al marginilor. Dat fiind acest risc al recurenței infecției HPV, se impune realizarea unor protocoale de urmărire a pacientelor, în funcție de statusul ADN/HPV și cel al citologiei. În cazul pacientelor ADN/HPV pozitive dar cu citologie normală, se impune repetarea testării ADN/HPV la 5 ani, dar trebuie avut grija la impactul unui rezultat HPV pozitiv asupra pacientei.

Sunt încă discuții legate de perioada de realizare a unui test HPV după terapie. Timpul optim de a efectua o testare ADN/HPV a fost analizat doar în câteva studii: o proporție substanțială de femei a eliminat virusul la 3 luni, dar semnificativă este perioada de 3 – 6 luni post terapie. După 6 luni, eliminarea virusului este rar posibilă (119, 120).

Utilizarea testării HPV post terapie ar trebui explorată pentru realizarea de noi protocoale pentru monitorizarea după terapia CIN. Evidențele științifice sugerează de asemenea că urmărirea consecutivă a

39

femeilor negative atât pentru HPV cât și pentru citologie ar trebui să fie mai puțin intensă. Se recomandă implementarea și monitorizarea cu grijă a pacientelor, prin diferite protocoale de urmarire. Se impun studii de analiză a protecției pe termen îndelungat a unui rezultat HPV negativ, precum și realizarea de ghiduri naționale și europene pentru management și urmarire. În figura 98 este prezentat un posibil algoritm de urmărire a femeilor după terapia leziunilor CIN: Colposcopie Colposcopie Acceptabilă inaceptabilă (CIN 2, 3 recurenta) Proceduri de urmarire propuse pentru monitorizarea post terapie Excizie / ablația Procedura zonei de transformare diagnostică excisională Citologie Testare ADN/HPV Citologie și/sau colposcopie Negativ ≥ ASC HPV pozitiv HPV negativ Screening Colpscopie

Screening de rutină de rutină

Fig. 23: Algoritm de monitorizare după terapia leziunilor CIN (adaptat după 90)

40

11. Evaluarea riscului de evoluție către neoplazia cervicală în cazul pacientelor HIV pozitive

HPV ca factor de risc pentru HIV

Numeroase studii au detectat o prevalență și o incidență mai mare, precum si o persistență a infecției HPV și a displaziilor anogenitale în cazul femeilor și bărbaților HIV pozitivi, în comparație cu subiecții negativi pentru HIV.

Studiul HERS (HIV Epidemiology Research Study) a identificat că aproape toate tipurile HPV se pare că persistă în rândul femeilor HIV pozitive, în comparație cu cele HIV negative (OR = 2,5). Fenomenul de persistență a fost de 1,9 ori mai mare, cu nivele CD4 < 200 celule / µl, în comparație cu femeile cu nivele CD4 > 500 celule / µl (123). Prevalența infecției HPV crește odată cu scăderea imunității. Astfel, în cazul pacientelor HIV negative, prevalența HPV a fost de 29,8% și apoi a crescut după cum urmează: 51,7% pentru cazurile cu CD4 > 200 și cu ARN/HIV < 20.000 copii, 66% pentru cazurile cu CD4 > 200 dar cu ARN/HIV > 20.000 și a crescut apoi la 76% în cazul în care CD4 < 200 celule / µl (124).

Există evidențe consistente despre faptul că displazia cervicală este mult mai prevalentă în rândul femeilor HIV infectate, în comparație cu femeile seronegative. 15 – 40% dintre femeile HIV pozitive prezintă displazie evidentă, acest procentaj fiind de 10 – 11 ori mai mare decât în cazul femeilor negative (125). Frecvența și severitatea frotiurilor citologice precum și displaziile confirmate histologic crește odată cu scăderea CD4. În aceste cazuri, displazia este asociată cu o implicare extensivă la nivelul cervixului și deseori implică și alte situsuri (vagin, vulvă, regiunea perianală) (126). Lot de studiu, metoda, rezultate În perioada februarie – iunie 2011 am testat ADN/HPV din celule cervicale recoltate de la paciente cunoscute HIV/AIDS pozitive, monitorizate de o echipa de medici ginecologi a Spitalul Clinic de Obstetrica si Ginecologie „Cuza Voda”, Iași.

Lotul testat a inclus 20 de paciente cu media vârstei de 21 de ani (limite 19 – 30 ani). 10 / 20 (50%) dintre femeile testate au fost detectate pozitive pentru HPV, dintre care doar 3 au fost infecții unice HPV (52, 68 și respectiv 84). 35% (7/20) paciente au prezentat infecții cu multiple tipuri HPV, fiind detectate între 2 și 7 genotipuri HPV pe strip (fig. 24).

41

negative50%

infectii unice15%

infectii multiple35%

negative infectii unice infectii multiple

Fig. 24: Rezultatele genotipării lotului de paciente HIV pozitive

Infecțiile cu multiple tipuri HPV detectate au fost: - pacienta C. A.: HPV 51, 52, 55, 68, CP 6108; - pacienta D.I.: HPV 6, 16, 51, 52, 66, 73, 83; - pacienta S. E: HPV 6, 16, 73, 82; - pacienta A. A.: HPV 39, 42, 51, 73; - pacienta P. C.: HPV 31, CP 6108; - pacienta B. C.: HPV 6, 11, 52, 58; - pacienta T. A-M.: HPV 42, 53, 82, CP 6108.

În fig. 27 am redat imaginea câtorva din aceste stripuri cu multiple benzi albastre care corespund infecțiilor cu multiple tipuri HPV.

Fig. 25: Imaginea unor stripuri cu multiple benzi detectate corespunzătoare

infecțiilor cu multiple tipuri HPV

42

Pentru pacientele care au fost pozitive și pentru HPV 16, am cuantificat ADN/HPV 16 prin Real Time PCR. Prezentarea principiului RT PCR și validarea experimentului a fost prezentată în capitolul 3.7. În tabelul VI am prezentat rezultatele obținute pentru aceste două paciente: cuantificarea ADN cu ajutorul nanodropului, valorile Ct-urilor și numărul de cópii virale detectate prin Real Time PCR.

Tabel V: Rezultatele cuantificării ADN/HPV 16 pentru două paciente HIV +

Paciente Rezultat genotipare

LA Valoare

ADN citită la

nanodrop

Număr Ct / RTPCR

Număr cópii ADN/HPV

16

D.I. HPV 6, 16, 51, 52, 66, 73, 83

18,5 31,66 4,072 x 102

S.E. HPV 39, 42, 51, 73 26,9 35,04 3,722 x 10 Discuții: lotul nostru, deși mic ca dimensiune, prezintă aceleași caracteristici ca și loturile mari din studiile citate anterior. În primul rând prevalența ADN/HPV în rândul femeilor HIV pozitive este de 50%, versus 32,1% din lotul nostru prezentat în capitolul 3.4. Dintre infecțiile HPV detectate în cazul femeilor HIV pozitive, doar 30% au fost infecții unice, restul fiind infecții cu multiple tipuri HPV. HPV 16 a fost detectat doar în două din infecțiile mutiple, cele mai frecvente HR HPV detectate în aceste cazuri fiind 51 (3 paciente), 52 (3 paciente), 73 și CP6108 (câte 2 paciente).Ca și în cazul altor infecții cu multiple tipuri HPV, încărcatura virală a ADN/HPV 16 a fost mai mică decât în cazul infecțiilor unice. Concluzii: se impune monitorizarea atentă a acestor paciente, mai frecvent decît în cazul femeilor HIV negative, chiar dacă media lor de vârstă este de doar 21 ani, din cauza riscului mai mare de persistență a infecțiilor HPV în cazul femeilor HIV pozitve. Pentru țara noastră se recomandă de asemenea protocolul „scren – and – treat” pentru monitorizarea acestor paciente (135).

12. Infecții asimptomatice cu transmitere sexuală În legatură cu amploarea şi importanţa infecţiilor asimptomatice transmise pe cale sexuală, este binecunoscut faptul că cele mai multe infecţii transmise pe cale sexuală (ITS) sunt simptomatice, dar nu este definit exact conceptul ITS asimptomatice, si nu se cunoaște frecvenţa lor sau importanţa infecţiilor asimptomatice în transmiterea ITS.

43

În acest sens se impune alcătuirea unui cadru conceptual pentru categorizarea ITS în funcţie de simptomatologie, determinarea proporţiei indivizilor cu infecţie asimptomatică si de asemenea, se impune estimarea proporţiei transmiterii ITS datorită infecţiilor asimptomatice. Conceptul poate fi construit pe baza prezenței simptomelor, indivizii fiind divizaţi în mai multe categorii: indivizi “simptomatici” (simptomele sunt prezente); indivizi cu infecţie “inaparentă” (individul prezintă simptome dar nu sunt recunoscute ca fiind produse de o ITS); persoane “asimptomatice”- această categorie este importantă, deoarece, numai pacienţii “simptomatici” vor solicita tratament specific. Analizând studii de transmitere care au evaluat pacienţi simptomatici, pacienţi asimptomatici sau cu infecţii inaparente, s-a observat că aceştia au un rol important în transmiterea ITS, iar partenerii sexuali ai indivizilor cu ITS, simptomatici sau nu, sunt în mod caracteristic asimptomatici. Atât publicul larg cât şi cadrele medicale trebuie să aprecieze importanţa naturii asimptomatice a ITS. Mesaje de sănătate publică concentrate pe simptomele ITS se vor finaliza cu un impact semnificativ asupra transmiterii acestor infecţii. În acelaşi scop, cadrele medicale trebuie să intensifice evaluarea riscului pacienţilor, screening-ul acestora pentru ITS, precum şi acordarea de informaţii corecte.

Este important de discutat potențialul impact al unui test HPV pozitiv asupra unei femei, precum și mesajul transmis acestei femei, atât ei cât și partenerului ei în timpul consilierii. Se impune explicarea semnificației unui test ADN HPV pozitv și se indică literatura adecvată acestor paciente. Pacientele vor fi sfătuite ce măsuri să ia în legătură cu partenerul lor și de asemenea, partenerul va trebui informat. Se va verifica necesitatea unei monitorizări ulterioare psihologice și de asemenea pacientele vor fi consiliate din punct de vedere sexual. Viitorul prevenției cancerului cervical presupune utilizarea testării ADN HPV ca test primar de screening, precum și prevenția secundară într-o populație complet vaccinată. Principiile unui program de screening populațional presupun testarea unui grup mare al populației aparent sanatoase, pentru a detecta semnele precoce ale bolii. Screening-ul este intenționat a ținti / viza în special acele persoane care vor beneficia cel mai mult din urma acestui screening, iar scopul unui screening este obținerea unui beneficiu maxim de sănătate pentru populație. Clinicienii au un rol important în transferul de informație către paciente, pentru a favoriza scăderea anxietății pacientelor detectate HPV pozitiv. În cazul detectării unui test HPV pozitiv este necesară concentrarea pe elementele cheie ale mesajului pentru a scădea anxietatea pacientelor. Mesajul ar trebui să

44

conțină cunoștinte despre faptul că tipurile HPV sunt heterogene, având riscuri diferite pentru dezvoltarea cancerului cervical; de asemenea, mesajul ar trebui să conțină informații despre prevalența crescută a infecției HPV și de asemenea, ar trebui avută în vedere componenta motivațională a prevenției cancerului cervical (136). Monitorizarea și consilierea femeilor HPV pozitive, cu citologie normală

Din lotul pacientelor testate prin genotipare în rândul femeilor care nu și-au realizat niciodată un test Papanicolau, am detectat 33,3% paciente ADN/HPV pozitive, iar în cazul femeilor cu un test Papanicolau normal am identificat 19,2% pozitive. În ambele situații, cazurile ADN HPV pozitive au presupus infecții cu tipuri HRHPV, LRHPV, pHRHPV, precum și infectii cu multiple genotipuri HPV. Putem afirma că în cazul femeilor fără testarea citologică am identificat 33,3% infecții HPV asimptomatice, iar cazul pacientelor cu Papanicolu normal am identificat 19,2% infecții asimptomatice și inaparente (fig. 26: 1-fără citologie efectuată, 2-citologie normală).

1 2

HR-HPV

LR-HPV

NEGATIVE

0102030405060708090

HR-HPVpHR-HPVLR-HPVMULTIPLE INFECTIONSNEGATIVE

Fig. 26: Rezultatele testării ADN/HPV în cazul femeilor fără examen

citologic sau cu rezultat normal al examenului Papanicolau

În momentul în care am comunicat rezultatul testării ADN/HPV în cazul acestor două categorii de paciente, am identificat situații delicate, de neacceptare, în momentul inițial, al rezultatului genotipării HPV. Neacceptarea se datorează faptului ca pacientele erau în momentul testării, asimptomatice, și nu voiau sa accepte faptul că au fost detectate pozitive pentru un virus care poate produce cancer.

Având în vedere ritmul rapid al inovaţiei în prevenirea și controlul cancerului de col uterin, au fost realizate puține eforturi concentrate pentru diseminarea informației către publicul larg, într-un mod adecvat și semnificativ. Cele mai multe femei au aflat de HPV în momentul primirii unui rezultat anormal pentru frotiul Papanicolau. Puține persoane înteleg legatura dintre HPV și cancerul cervical. Infecția HPV este o infecție

45

transmisă pe cale sexuală foarte frecventă, care însă rareori evoluează către cancer.

Se impun eforturi pentru optimizarea programelor educaționale de sănătate publică, care să presupună informarea pacientelor care urmează să fie monitorizate, informarea pacientelor pentru înțelegerea relației dintre un test citologic anormal și un test ADN HPV pozitiv și cum plasează aceste rezultate o pacientă la risc pentru cancerul cervical. Este importantă facilitatea luării unei decizii importante de către pacienta cu privire la status-ul infecției HPV (62). Literatura de specialitate sugerează că detecția unui HR HPV la o femeie este un indicator important pentru evoluția către CIN 2 sau chiar grade mai avansate ale displaziei cervicale. În rândul femeilor cu vârsta peste 30 ani, cu citologie negativă, CIN 3 a fost identificat pe parcursul a 10 ani de monitorizare în 21% din cazurile HPV 16 pozitive și în 18% în cazul pacientelor HPV 18 pozitive. În cazul femeilor pozitive pentru alte HR HPV, riscul pentru CIN 3 a fost doar de 1,5% (62).

Probe recoltate de la femei HPV pozitive dar cu citologie negativă trebuie testate prin genotipare HPV, iar femeile detectate pozitive pentru genotipuri specifice HR HPV, cum ar fi HPV 16 și 18 trebuie evaluate și colposcopic. Femeile pozitive pentru alte HR HPV trebuie retestate la 12 luni prin citologie și prin testare ADN HPV. Acest algoritm de urmărire va permite femeilor cu risc de a avea un rezultat fals negativ citologic să fie evaluate colposcopic (63).

Multe femei testate în screening-uri populaționale care au fost detectate HPV pozitive au avut un rezultat citologic negativ. Într-un studiu care a înrolat mai mult de 213.000 femei cu vârsta de 30 ani, prevalența HPV a fost de 6,5% și doar 58% dintre femei au avut un rezultat concordant între rezultatul testării HPV și rezultatul evaluării citologice (136). Femeile HPV pozitive necesită consilierea cu privire la riscul de evoluție către CIN 2, cu privire la sursa infecției și la gradul lor de infectivitate. Riscul de a avea o leziune CIN 2 nedetectată în cazul femeilor HPV pozitve cu citologie negativă a fost detectat a fi între 2,4 – 5,1% (137 – 142). Este important de menționat că în cazul femeilor cu vârsta peste 30 ani, majoritatea femeilor HPV pozitive devin HPV negative după monitorizare. Un studiu din Franța a detectat, după o perioadă de 6 luni de urmărire, că 60% din pacientele monitorizate au devenit negative (143).

Pe baza acestor considerente, cel mai adecvat management al acestor paciente este monitorizarea prin citologie și testarea ADN HPV la 12 luni. Pacientele care la testări repetate sunt în mod persistent HPV

46

pozitive, ar trebui evaluate colposcopic, în timp ce femeile care devin negative la ambele teste ar trebui retestate după 3 ani (algoritm fig. 27) (62).

Citologie negativă

HPV (-) HPV (+)

Screening de rutină Repetarea ambelor teste la 12 luni (nu mai devreme de 3 ani) Ambele negative Citologie (-), HPV (+) Citologie anormală, HPV (+)

Screening de rutină Colposcopie Management conform

(3 ani) ghid ASCCP

Fig. 27: Utilizarea testelor ADN HPV în screening-ul cancerului cervical pentru femeile cu vârsta peste 30 ani, cu citologie negativă (adaptat după 62)

13. Concluzii generale

România se situează pe primul loc în Europa în ceea ce privește incidența (23,9/100,000) și mortalitatea (11.6/100,000) prin cancerul de col uterin. În pofida acestor date, rapoartele OMS menționează că nu sunt date disponibile pentru țara noastră referitor la prevalența genotipurilor HPV în rândul femeilor cu diferite diagnostice citologice.

Introducerea testării prin RT PCR a infecţiilor simptomatice şi asimptomatice, induse de HPV, reprezintă pentru zona noastră o noutate, deoarece este primul studiu care abordează la nivel molecular, relaţia dintre

47

aceste infecţii şi cancerul cervical, utilizând infrastructura Laboratorului de Microbiologie din cadrul Facultăţii de Medicină a UMF „Gr. T. Popa” Iaşi. Au fost optimizate metodele de biologie moleculară ce au fost utilizate în realizarea obiectivelor știintifice ale tezei (metoda de detecție a 37 genotipuri HPV prin tehnica Linear Array HPV Genotyping Test si tehnicia Real Time PCR pentru cuantificarea HPV 16 și a HPV 18).

Pe parcusul celor 3 ani destinaţi cercetării ştiinţifice în cadrul doctoranturii, am realizat genotiparea probelor pentru un lot reprezentativ de paciente (353), iar rezultatele privind prevalența genotipurilor cu risc înalt oncogen detectate (9,91% pentru HPV 16 și 3,11% HPV 18), susțin introducerea vaccinării anti HPV în zona noastră. Genotiparea prin tehnica Linear Array HPV Genotyping test a fost validată prin participarea la un panel internațional de testare a proficienței, organizat de către OMS.

Pacientele pozitive pentru HPV 16 și 18 au fost testate prin tehnica Real Time PCR, în vederea stabilirii unei valori prag a încărcăturii virale, utile pentru identificarea precoce a riscului de evoluție către cancerul cervical. Diversitatea valorilor încărcăturii virale detectate în raport cu gradul displaziei cervicale (mai exact, am detectat încărcături virale mari, de 105 – 106 cópii virale, atât în situațiile în care pacientele aveau HSIL, cum era de așteptat, dar și în cazurile cu LSIL, ASCUS și chiar cu citologie normală), a facut imposibilă stabilirea unei valori limită, care să indice intervenţia chirurgicală terapeutică. Cuantificarea prin RT PCR este utilă în cazul în care se poate realiza testarea în dinamică a încărcăturii virale, pentru a evalua istoria naturală a infecției cu genotipurile înalt oncogene.

Pentru şapte dintre pacientele testate am realizat monitorizarea lor la 6, 12 și18 luni, prin genotipare și prin cuantificarea ADN HPV 16 și 18 prin Real Time PCR. Lipsa de aderență a pacientelor la monitorizarea la care au fost invitate să participe, conform formularului de consimțământ informat, se poate explica prin neînțelegerea necesității urmăririi pacientelor în vederea precizării evoluției bolii. Se impune educarea populației cu privire la conexiunea dintre HPV și cancerul cervical și la utilitatea participării la programele de monitorizare. Necesitatea monitorizării prin testarea ADN HPV se impune și în cazul pacientelor tratate excizional, pentru displazii cervicale de grad înalt. Am evaluat prin testarea ADN HPV, 21 paciente, la 6 luni după intervenția chirurgicală și am detectat o persisteță a infecţiei HPV, atât cu HR cât şi cu LR în 14,28% din cazurile testate (două infecții unice: HPV 18 și respectiv HPV 51, și o infecţie cu tipuri HPV multiple - 6, 39). Se impune revizuirea consimţământului informat, astfel încât pacientele să înţeleagă avantajele participării la astfel de studii, ca modalitate de monitorizare a reactivării

48

infecţiei persistente, ce impune strategii terapeutice diferite. În unele ţări, colposcopia, cu o sensibilitate ce variază în limite foarte largi (24 – 96 %) este o tehnică abandonată, în favoarea tehnicilor de biologie moleculară. Testarea pentru genotipurile HPV înalt oncogene, după terapia excizională, este cea mai sensibilă metodă (96%) pentru stabilirea leziunilor CIN reziduale sau recurente.

O altă categorie de femei care necesită monitorizare prin testare ADN HPV o reprezintă femeile cu vârsta peste 30 ani, asimptomatice, ADN HPV pozitive dar cu citologie negativă. În cazul femeilor cu Papanicolu normal am identificat 19,2% infecţii HPV asimptomatice (4 paciente pozitive pentru HPV 16 și alte 4 paciente din această categorie, pozitive cu HPV 18). Categoria persoanelor “asimptomatice” este importantă, deoarece, numai pacienţii “simptomatici” vor solicita tratament specific. Ghidurile europene recomandă monitorizarea atentă a acestor paciente prin testarea ADN HPV.

În contextul transmiterii simultane a mai multor agenţi infecţioşi, o atenție particulară trebuie acordata pacientelor HIV – HR HPV pozitive. Am testat 20 de paciente HIV pozitive, cu media vârstei de 21 de ani: 50% au fost pozitive pentru HPV, dintre care 70% au prezentat infecţii cu tipuri HPV multiple, fiind detectate concomitent între 2 şi 7 genotipuri HPV. Prevalența ADN/HPV în rândul femeilor HIV pozitive a fost de 50%, versus 32,1%. HPV 16 a fost detectat doar în două dintre infecțiile multiple, cele mai frecvente HR HPV detectate în aceste cazuri fiind 51 (3 paciente), 52 (3 paciente), 73 și CP6108 (câte 2 paciente). Ca şi în cazul altor infecții cu tipuri HPV multiple, încărcătura virală a ADN/HPV 16 a fost mai mică decât în cazul infecțiilor unice. Se impune monitorizarea atentă a acestor paciente, mai frecvent decât în cazul femeilor HIV negative, chiar dacă media lor de vârstă este de doar 21 ani, deoarece prevalența infecției HPV creşte odată cu scăderea imunității, iar cancerul cervical în rândul femeilor HIV pozitive nu pare să fi scăzut în era HAART.

Cele mai multe infecţii transmise pe cale sexuală (ITS) sunt simptomatice, dar nu se cunoaște frecvenţa lor sau importanţa infecţiilor asimptomatice în transmiterea ITS.

Din lotul pacientelor testate prin genotipare în rândul femeilor care nu și-au realizat niciodată un test Papanicolau, am detectat 33,3% paciente ADN/HPV pozitive, iar în cazul femeilor cu un test Papanicolau normal am identificat 19,2% pozitive. În ambele situații, cazurile ADN HPV pozitive au presupus infecții cu tipuri HRHPV, LRHPV, pHRHPV, precum și infectii cu multiple genotipuri HPV. Putem afirma că în cazul femeilor fără testarea citologică am identificat 33,3% infecții HPV asimptomatice, iar cazul

49

pacientelor cu Papanicolu normal am identificat 19,2% infecții asimptomatice și inaparente.

Până în prezent țările dezvoltate au ajuns la stadiul în care se preconizează posibilitatea eradicării cancerului cervical (teoretic sunt îndeplinite toate condițiile eradicării unei infecții HPV) şi ar fi de dorit ca și în țara noastră să se realizeze un screening organizat pentru detectarea cancerului cervical în stadii incipiente, prin introducerea la nivel național a genotipării HPV. Vaccinarea anti HPV, în asociere cu testarea ADN HPV, ar putea conduce la scăderea incidenței și mortalității cancerului cervical pentru țara noastră.

Studiul de faţă a fost posibil prin utilizarea fondurilor aferente proiectului de cercetare câştigat prin competiţie naţională: „Tehnica Real Time PCR ca instrument practic în diagnosticul şi monitorizarea infecţiilor HPV”, grant CNCSIS, IDEI_1642.

14. Originalitatea contribuţiilor proprii Ø Introducerea pentru prima dată a două metode de biologie

moleculară (PCR clasic urmat de hibridizare și Real Time PCR) în activitatea de rutină a Laboratorul de Virusologie, din cadrul Disciplinei de Studiu Microbiologie, a Facultăţii de Medicină, ca etapă preliminară iniţierii studiului infecţiei HPV şi a relaţiei acesteia cu cancerul de col.

Ø Evaluarea prevalenței genotipurilor HPVcirculante în zona de Nord a Moldovei pe un lot reprezentativ, cu obținerea unor rezultate care susțin implementarea vaccinării anti HPV în zona noastră.

Ø Obținerea proficienței pentru genotiparea HPV din partea experţilor OMS, prin participarea la un panel, la nivel mondial.

Ø Evaluarea încărcăturii virale pentru ADN HPV 16 si 18, evaluată prin RT PCR, în raport cu gradul displaziei cervicale;

Ø Studiul a fost axat şi pe atingerea altor obiective ale tezei de doctorat, cum au fost testarea ADN/HPV post intervenție excizională și evaluarea riscului de evoluție către neoplazia cervicală pentru pacientele HIV – HPV pozitive;

Ø Diagnosticul infecţiei HPV, inclusiv pentru pacientele încadrate ca HR HPV, urmat de terapia adecvată stadiului, cu scopul reducerii riscului de evoluţie nefavorabilă.

50

15. Perspectivele pe care le deschide teza Ø realizarea screening-ul cancerului cervical prin determinarea:

• markerilor corelaţi cu prezenţa virusului: § ADN /HPV; § HPV E6/E7 mARN / Real Time PCR; § genotiparea HPV.

• markerilor leziunilor cervicale: § p16INK4a CINTEC; § markerii de metilare (CADM1) / Real Time PCR;

Ø tranziţia de la cercetare, la implementarea ca diagnostic de rutină a genotipării HPV;

Ø diagnosticul infecțiilor asiptomatice cu ajutorul tehnicii Real Time PCR, pentru a surprinde boala cervicală în stadii incipiente, în vederea unei intervenţii terapeutice eficiente.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA: 1. Pagliusi S, Aguado MT. Efficacy and other milestones for human papillomavirus vaccine introduction, Vaccine

2004 23(5):569-578. 2. WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer (HPV Information Centre). Human Papillomavirus

and Related Cancers in World. Summary Report 2009. 3. F. Xavier Bosch, Global Burden & Epidemiology of HPV & associated diseases, HPV Today, July 2010. 4. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C and Parkin DM.

GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10 Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010. Available from: http://globocan.iarc.fr

5. Doorbar J., The natural history of papillomavirus disease; from silent and productive infections to neoplasia and latency, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops.

6. Harald zur Hausen et al, Classification of papillomaviruses, Virology 324 (2004) 17– 27 7. Margaret Stanley, Mechanisms of HPV infection and immunity - A state of the Art ,

HPV Immunity online WEBMINAR, Elselvier, 16 / 06 / 2010. 8. Mark Schiffman, HPV: Natural History of the infection from the epidemiologic and clinical perspective, The

26th International Papillomavirus Conference and Workshops. 9. Mark Schiffman et al. Classification of weakly carcinogenic human papillomavirus types: addressing the limits

of epidemiology at the borderline, Infectious Agents and Cancer 2009 4:8 doi:10.1186/1750-9378-4-8 10. Anna Barbara Moscicki, Natural history of infection in younger women: implication for screening, follow-up

and treatment, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops. 11. Margaret Stanley, How do HPV vaccines protect? , The 26th International Papillomavirus Conference and

Workshops. 12. Anthony B. Miller, Cervical cancer screening: the principles and evaluation parameters of the programme, The

26th International Papillomavirus Conference and Workshops. 13. Chris J.L.M. Meijer, Biological markers in cervical cancer screening, The 26th International Papillomavirus

Conference and Workshops. 14. Jack Cuyick, Rational transition from research studies to implementation in programmes, The 26th International

Papillomavirus Conference and Workshops. 15. Jack Cuyick et al., Overview of the European and North American studies on HPV testing in primary cervical

cancer screening Int. J. Cancer: 119, 1095–1101 (2006). 16. *** Linear Array HPV Genotyping Test, Roche Diagnostic handbook. 17. *** High Pure PCR Template Preparation Kit for genomic DNA (ROCHE Diagnostics) handbook 18. S Brismar-Wendel, M Froberg, A Hjerpe, S Andersson, B Johansson, Age-specific prevalence of HPV

genotypes in cervical cytology samples with equivocal or low-grade lesions, British Journal of Cancer (2009), 1 –7.

51

19. J. Jamison, R. T. Wilson and J. Carson , The evaluation of human papillomavirus genotyping in cervical liquid-based cytology specimens; using the Roche Linear Array HPV genotyping assay, Cytopathology 2009, 20, 242–248.

20. Christoph Koidl, MD; Michael Bozic; Ita Hadzisejdic, Comparison of molecular assays for detection and typing of human papillomavirus, Am J Obstet Gynecol, 2008;199:144.e1-144.e6.

21. Philip E. Castle, Carolina Porras, Wim G. Quint , Comparison of Two PCR-Based Human Papillomavirus Genotyping Methods, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. 2008, p. 3437–3445.

22. J. Jeronimo, N. Wentzensen, R. Long, M. Schiffman, Evaluation of Linear Array Human Papillomavirus Genotyping Using Automatic Optical Imaging Software, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2008, p. 2759–2765.

23. Matthew P. Stevens, Suzanne M. Garland, Jeffrey H. Tan, HPV Genotype Prevalence in Women With Abnormal Pap Smears in Melbourne, Australia, J. Med.Virol.81:1283–1291,2009.

24. Marinko Dobec, Fridolin Bannwart, Franz Kaeppeli, Pascal Cassinotti, Automation of the linear array HPV genotyping test and its application for routine typing of human papillomaviruses in cervical specimens of women without cytological abnormalities in Switzerland, Journal of Clinical Virology 45 (2009) 23–27.

25. Muñoz N, Bosch FX, de Sanjosé S, Herrero R, Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer, N. Engl. J Med., 2003, Feb 6; 348 (6); 518 – 27.

26. *** Introduction to Quantitative PCR, Stratagene, Methods and Application Guide; 27. Tevfik Dorak M., (editor) Real – Time PCR, BIOS Advanced Methods; 28. *** qPCR course - Freising, Germany, TATAA BIOEPS COURSE; 29. *** PrecisionTM 2X qPCR Mastermix handbook, Primer Design LTD, handbook. 30. *** Quantification of Human Papilloma Virus 16 (HPV 16) genomes, Primer Design handbook; 31. *** Quantification of Human Papilloma Virus 18 (HPV 16) genomes, Primer Design handbook; 32. *** Mx300XP_Demo_mature, Azra Dedic Biomedica Medizinprodukte GmbH. 33. WHO & IARC, IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenetic Risks to Humans, Human

Papillomaviruses, volume 90, Lyon, France, 2007. 34. van Duin, Snijders PJ, Meijer CJ, Human Papillomavirus 16 load in normal and abnormal cervical scrapes; an

indicator of CIN II/III and viral celearance, Int J Cancer, 2002, Apr 1; 98 (4); 590 – 5. 35. Peter J.F. Snijders, Albertus T. Hesselink, Chris J.L.M. Meijer, Determination of viral load thresholds in

cervical scrapings to rule out CIN 3 in HPV 16, 18, 31 and 33-positive women with normal cytology, Int. J. Cancer: 119, 1102–1107 (2006).

36. Albertus T. Hesselink, Chris J.L.M. Meijer, Peter J.F. Snijders1, High-risk human papillomavirus DNA load in a population-based cervical screening cohort in relation to the detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer, Int. J. Cancer: 124, 381–386 (2009).

37. Inger Gustavssona, Ivana Juko-Pecirepa, Ingrid Backlund, Comparison between the Hybrid Capture 2 and the hpVIR real-time PCR for detection of human papillomavirus in women with ASCUS or low grade dysplasia, Journal of Clinical Virology 45 (2009) 85–89.

38. Karin Biedermann, Nadia Dandachi, Maria Trattner, Comparison of Real-Time PCR Signal-Amplified In Situ Hybridization and Conventional PCR for Detection and Quantification of Human Papillomavirus in Archival Cervical Cancer Tissue, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2004, p. 3758–3765.

39. Ming Guo, Nour Sneige, Elvio G Silva, Distribution and viral load of eight oncogenic types of human papillomavirus (HPV) and HPV 16 integration status in cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma, Modern Pathology (2007) 20, 256–266.

40. Long Fu Xi, Nancy B. Kiviat, Denise A. Galloway, Effect of Cervical Cytologic Status on the Association between Human Papillomavirus Type 16 DNA Load and the Risk of Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade 3, The Journal of Infectious Diseases 2008; 198:324 –31.

41. Nelba Tábora, Annabelle Ferrera, Judith M. J. E. Bakkers, High HPV 16 Viral Load is Associated with Increased Cervical Dysplasia in Honduran Women, Am. J. Trop. Med. Hyg., 78(5), 2008, pp. 843–846.

42. Jean-Luc Prétet, Véronique Dalstein, Sylvain Monnier-Benoit, High risk HPV load estimated by Hybrid Capture II® correlates with HPV16 load measured by real-time PCR in cervical smears of HPV16-infected women, Journal of Clinical Virology 31 (2004) 140–147.

43. Elisa Leo, Simona Venturoli , Monica Cricca, High-throughput two-step LNA real time PCR assay for the quantitative detection and genotyping of HPV prognostic-risk groups, Journal of Clinical Virology 45 (2009) 304–310.

44. Tibor Takacs, Csaba Jeney, Laura Kovacs, Molecular beacon-based real-time PCR method for detection of 15 high-risk and 5 low-risk HPV types, Journal of Virological Methods 149 (2008) 153–162.

45. Roger A. Hubbard, Human Papillomavirus Testing Methods, Arch Pathol Lab Med—Vol 127, August 2003. 46. Francois Coutlée,, Helen Trottier, Simon Gagnon, Low-risk human papillomavirus type 6 DNA load and

integration in cervical samples from women with squamous intraepithelial lesions, Journal of Clinical Virology 45 (2009) 96–99.

47. Roberto Flores-Munguia, Erin Siegel, Walter T. Klimecki, and Anna R. Giuliano, Performance Assessment of Eight High-Throughput PCR Assays for Viral Load Quantitation of Oncogenic HPV Types, Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 6, No. 2, May 2004.

52

48. Francesco Broccolo, Stefania Chiari, Andrea Piana, Prevalence and Viral Load of Oncogenic Human Papillomavirus Types Associated With Cervical Carcinoma in a Population of North Italy, Journal of Medical Virology 81:278–287 (2009).

49. Martina Schmitza, Cornelia Scheungraber, Jörg Herrmann, Quantitative multiplex PCR assay for the detection of the seven clinically most relevant high-risk HPV types, Journal of Clinical Virology 44 (2009) 302–307.

50. Merja P. Ruutu, Satu-Maria Kulmala, Panu Peitsaro, The performance of the HPV16 real-time PCR integration assay, Clinical Biochemistry 41 (2008) 423–428

51. Christopher Payan, Alexandra Ducancelle, Mohamed H. Aboubaker, Human Papillomavirus Quantification in Urine and Cervical Samples by Using the Mx4000 and LightCycler General Real-Time PCR Systems, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Mar. 2007, p. 897–901.

52. Ramona Gabriela Ursu, Luminiţa Smaranda Iancu, HR-HPV viral load, p16INK4a: predictive of persistence infection, 25th International Papillomavirus Conference. Malmo, May, 2009.

53. Carina Eklund, Keng-Ling Wallin, Ola Forslund, Joakim Dillner, WHO HPV LabNet Report on HPV DNA Proficiency Panel, 2010

54. De Sanjose et al. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a meta-analysis. Lancet Infect Dis 2001 7(7): 453 – 459.

55. K S Cuschieri et al., Multiple high risk HPV infections are common in cervical neoplasia and young women in a cervical screening population, J Clin Pathol 2004;57:68–72

56. Silvia Franceschi, Oral contraceptives and cervical cancer, HPVToday, 17. 57. Stuart Collinsa et al., Cigarette smoking is an independent risk factor for cervical intraepithelial neoplasia in

young women: A longitudinal study, Eur J Cancer. 2010 January ; 46(2): 405–411. 58. Ann Nielsen Acquisition of high-risk human papillomavirus infection in a population-based cohort of Danish

women, Sex Transm Dis. 2009 October ; 36(10): 609–615 59. Giancarlo Ripabelli et al., Prevalence and genotype identification of human papillomavirus in women

undergoing voluntary cervical cancer screening in Molise, Central Italy, Cancer Epidemiology 34 (2010) 162–167

60. Ameli Trope et al., Performance of Human Papillomavirus DNA and mRNA Testing Strategies for Women with and without Cervical Neoplasia, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2009, p. 2458–2464

61. *** NanoPhotometerTM Pearl hand book 62. Carcopino X, Henry M, Benmoura D, Fallabregues AS, Richet H, Boubli L, Tamalet C., Determination of HPV

type 16 and 18 viral load in cervical smears of women referred to colposcopy., J Med Virol. 2006 Aug;78(8):1131-40.

63. Snijders PJ, Hogewoning CJ, Hesselink AT, Berkhof J, Voorhorst FJ, Bleeker MC, Meijer CJ., Determination of viral load thresholds in cervical scrapings to rule out CIN 3 in HPV 16, 18, 31 and 33-positive women with normal cytology., Int J Cancer. 2006 Sep 1;119(5):1102-7

64. Yoshida T, Sano T, Kanuma T, Owada N, Sakurai S, Fukuda T, Nakajima T., Quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of the type distribution, viral load, and physical status of human papillomavirus in liquid-based cytology samples from cervical lesions., Int J Gynecol Cancer. 2008 Jan-Feb;18(1):121-7.

65. Syrjänen K, Kulmala SM, Shabalova I, Petrovichev N, Kozachenko V, Zakharova T, Pajanidi J, Podistov J, Chemeris G, Sozaeva L, Lipova E, Tsidaeva I, Ivanchenko O,Pshepurko A, Zakharenko S, Nerovjna R, Kljukina L, Erokhina O, Branovskaja M, Nikitina M, Grunjberga V, Grunjberg A, Juschenko A, Santopietro R, Cintorino M, Tosi P, Syrjänen S., Epidemiological, clinical and viral determinants of the increased prevalence of high-risk human papillomavirus (HPV) infections in elderly women., Eur J Gynaecol Oncol. 2008;29(2):114-22.

66. Hesselink AT, Berkhof J, Heideman DA, Bulkmans NW, van Tellingen JE, Meijer CJ, Snijders PJ., High-risk human papillomavirus DNA load in a population-based cervical screening cohort in relation to the detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer., Int J Cancer. 2009 Jan 15;124(2):381-6.

67. Broccolo F, Chiari S, Piana A, Castiglia P, Dell'Anna T, Garcia-Parra R, Maneo A, Villa A, Leone EB, Perego P, Maida A, Mangioni C, Cocuzza CE., Prevalence and viral load of oncogenic human papillomavirus types associated with cervical carcinoma in a population of North Italy., J Med Virol. 2009 Feb;81(2):278-87.

68. Winer RL, Harris TG, Xi LF, Jansen KU, Hughes JP, Feng Q, Welebob C, Ho J, Lee SK, Carter JJ, Galloway DA, Kiviat NB, Koutsky LA., Quantitative human papillomavirus 16 and 18 levels in incident infections and cervical lesion development., J Med Virol. 2009 Apr;81(4):713-21.

69. Xi LF, Edelstein ZR, Meyers C, Ho J, Cherne SL, Schiffman M., Human papillomavirus types 16 and 18 DNA load in relation to coexistence of other types, particularly those in the same species., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2009 Sep;18(9):2507-12.

70. Damay A, Didelot-Rousseau MN, Costes V, Konate I, Ouedraogo A, Nagot N, Foulongne V, Van de Perre P, Mayaud P, Segondy M., Viral load and physical status of human papillomavirus (HPV) 18 in cervical samples from female sex workers infected with HPV 18 in Burkina Faso., J Med Virol. 2009 Oct;81(10):1786-91.

71. Yoshida T, Sano T, Oyama T, Kanuma T, Fukuda T., Prevalence, viral load, and physical status of HPV 16 and 18 in cervical adenosquamous carcinoma., Virchows Arch. 2009 Sep;455(3):253-9.

53

72. Singh A, Datta P, Jain SK, Bhatla N, Dutta Gupta S, Dey B, Singh N., Human papilloma virus genotyping, variants and viral load in tumors, squamous intraepithelial lesions, and controls in a north Indian population subset., Int J Gynecol Cancer. 2009 Dec;19(9):1642-8.

73. Xi LF, Koutsky LA, Castle PE, Edelstein ZR, Meyers C, Ho J, Schiffman M., Relationship between cigarette smoking and human papilloma virus types 16 and 18 DNA load., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2009 Dec;18(12):3490-6.

74. Dinc B, Rota S, Onan A, Bozdayi G, Taskiran C, Biri A, Güner H., Prevalence of human papillomavirus (HPV) and HPV-16 genotyping by real-time PCR in patients with several cervical pathologies., Braz J Infect Dis. 2010 Jan-Feb;14(1):19-23.

75. Ramanakumar AV, Goncalves O, Richardson H, Tellier P, Ferenczy A, Coutlée F, Franco EL., Human papillomavirus (HPV) types 16, 18, 31, 45 DNA loads and HPV-16 integration in persistent and transient infections in young women., BMC Infect Dis. 2010 Nov 11;10:326.

76. Carcopino X, Bolger N, Henry M, Mancini J, Boubli L, Olive D, Cleary S, Prendiville W, Tamalet C., Evaluation of type-specific HPV persistence and high-risk HPV viral load quantitation in HPV positive women under 30 with normal cervical cytology., J Med Virol. 2011 Apr;83(4):637-43. doi: 10.1002/jmv.22022.

77. Marks M, Gravitt PE, Utaipat U, Gupta SB, Liaw K, Kim E, Tadesse A, Phongnarisorn C, Wootipoom V, Yuenyao P, Vipupinyo C, Rugpao S, Sriplienchan S, Celentano DD., Kinetics of DNA load predict HPV 16 viral clearance., J Clin Virol. 2011 May;51(1):44-9.

78. Li Y, Xiang Y, Zhang RF, Cai YP, Yang Y, Cheng XM, Zhu BL. , Viral load, genomic integration frequency of human papillomavirus 16 in cervical cancer and precancerous lesions, Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2011 Apr 5;91(13):906-10.

79. Nielsen A, Kjaer SK, Munk C, Osler M, Iftner T., Persistence of high-risk human papillomavirus infection in a population-based cohort of Danish women., J Med Virol. 2010 Apr;82(4):616-23.

80. Gunnell AS, Tran TN, Torrång A, Dickman PW, Sparén P, Palmgren J, Ylitalo N., Synergy between cigarette smoking and human papillomavirus type 16 in cervical cancer in situ development., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006 Nov;15(11):2141-7. Epub 2006 Oct 20.

81. Muñoz N, Castellsagué X, de González AB, Gissmann L., Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer., Vaccine. 2006 Aug 31;24 Suppl 3:S3/1-10. Epub 2006 Jun 23.

82. Rajeevan MS, Swan DC, Nisenbaum R, Lee DR, Vernon SD, Ruffin MT, Horowitz IR, Flowers LC, Kmak D, Tadros T, Birdsong G, Husain M, Srivastava S, Unger ER., Epidemiologic and viral factors associated with cervical neoplasia in HPV-16-positive women., Int J Cancer. 2005 May 20;115(1):114-20.

83. Wang SS, Schiffman M, Herrero R, Carreon J, Hildesheim A, Rodriguez AC, Bratti MC, Sherman ME, Morales J, Guillen D, Alfaro M, Clayman B, Burk RD, Viscidi RP., Determinants of human papillomavirus 16 serological conversion and persistence in a population-based cohort of 10 000 women in Costa Rica., Br J Cancer. 2004 Oct 4;91(7):1269-74.

84. Reesink-Peters N, Burger MP, Kleter B, Quint WG, Bossuyt PM, Adriaanse AH., Using a new HPV detection system in epidemiological research: change of views on cervical dyskaryosis?, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001 Oct;98(2):199-204.

85. Ho GY, Kadish AS, Burk RD, Basu J, Palan PR, Mikhail M, Romney SL., HPV 16 and cigarette smoking as risk factors for high-grade cervical intra-epithelial neoplasia., Int J Cancer. 1998 Oct 29;78(3):281-5.

86. del Amo J, González C, Belda J, Fernández E, Martínez R, Gómez I, Torres M, Saiz AG, Ortiz M., Prevalence and risk factors of high-risk human papillomavirus in female sex workers in Spain: differences by geographical origin., J Womens Health (Larchmt). 2009 Dec;18(12):2057-64.

87. Flores R, Papenfuss M, Klimecki WT, Giuliano AR., Cross-sectional analysis of oncogenic HPV viral load and cervical intraepithelial neoplasia., Int J Cancer. 2006 Mar 1;118(5):1187-93.

88. Ylitalo N, Sørensen P, Josefsson A, Frisch M, Sparén P, Pontén J, Gyllensten U, Melbye M, Adami HO., Smoking and oral contraceptives as risk factors for cervical carcinoma in situ., Int J Cancer. 1999 May 5;81(3):357-65.

89. Daling JR, Madeleine MM, McKnight B, Carter JJ, Wipf GC, Ashley R, Schwartz SM, Beckmann AM, Hagensee ME, Mandelson MT, Galloway DA., The relationship of human papillomavirus-related cervical tumors to cigarette smoking, oral contraceptive use, and prior herpes simplex virus type 2 infection., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1996 Jul;5(7):541-8

90. Arbyn M., Anttila A., Jordan J., Ronco G., Schenck U., Segnan N., Wiener H. G., Herbert A., Daniel J., von Karsa L., European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening, Second Edition, IARC.

91. Wright TC Jr, Massad LS, Dunton CJ, Spitzer M, Wilkinson EJ, Solomon D; 2006 American Society for Colposcopy and Cervical Pathology-sponsored Consensus Conference., 2006 consensus guidelines for the management of women with abnormal cervical cancer screening tests., Am J Obstet Gynecol. 2007 Oct;197(4):346-55. Review.

92. Jordan J, Martin-Hirsch P, Arbyn M, Schenck U, Baldauf JJ, Da Silva D, Anttila A, Nieminen P, Prendiville W., European guidelines for clinical management of abnormal cervical cytology, part 2., Cytopathology. 2009 Feb;20(1):5-16.

93. Strander B, Ryd W, Wallin KL, Wärleby B, Zheng B, Milsom I, Gharizadeh B, Pourmand N, Andersson-Ellström A., Does HPV-status 6-12 months after treatment of high grade dysplasia in the uterine cervix predict long term recurrence?, Eur J Cancer. 2007 Aug;43(12):1849-55.

54

94. Distéfano AL, Picconi MA, Alonio LV, Dalbert D, Mural J, Bartt O, Bazán G, Cervantes G, Lizano M, Carrancá AG, Teyssié A., Persistence of human papillomavirus DNA in cervical lesions after treatment with diathermic large loop excision., Infect Dis Obstet Gynecol. 1998;6(5):214-9

95. Arbyn M, Paraskevaidis E, Martin-Hirsch P, Prendiville W, Dillner J., Clinical utility of HPV-DNA detection: triage of minor cervical lesions, follow-up of women treated for high-grade CIN: an update of pooled evidence., Gynecol Oncol. 2005 Dec;99(3 Suppl 1):S7-11.

96. Paraskevaidis E, Arbyn M, Sotiriadis A, Diakomanolis E, Martin-Hirsch P, Koliopoulos G, Makrydimas G, Tofoski J, Roukos DH., The role of HPV DNA testing in the follow-up period after treatment for CIN: a systematic review of the literature., Cancer Treat Rev. 2004 Apr;30(2):205-11. Review.

97. Zielinski GD, Bais AG, Helmerhorst TJ, Verheijen RH, de Schipper FA, Snijders PJ, Voorhorst FJ, van Kemenade FJ, Rozendaal L, Meijer CJ., HPV testing and monitoring of women after treatment of CIN 3: review of the literature and meta-analysis., Obstet Gynecol Surv. 2004 Jul;59(7):543-53.

98. Nobbenhuis MA, Meijer CJ, van den Brule AJ, Rozendaal L, Voorhorst FJ, Risse EK, Verheijen RH, Helmerhorst TJ., Addition of high-risk HPV testing improves the current guidelines on follow-up after treatment for cervical intraepithelial neoplasia., Br J Cancer. 2001 Mar 23;84(6):796-801.

99. Bar-Am A, Gamzu R, Levin I, Fainaru O, Niv J, Almog B., Follow-up by combined cytology and human papillomavirus testing for patients post-cone biopsy: results of a long-term follow-up., Gynecol Oncol. 2003 Oct;91(1):149-53.

100. Almog B, Gamzu R, Kuperminc MJ, Levin I, Fainaru O, Niv J, Bar-Am A., Human papilloma virus testing in patient follow-up post cone biopsy due to high-grade cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2003 Mar;88(3):345-50.

101. Negri G, Gampenrieder J, Vigl EE, Haitel A, Menia E, Mian C., Human papilloma virus typing at large loop excision of the transformation zone of the cervix uteri., Anticancer Res. 2003 Sep-Oct;23(5b):4289-92.

102. Hernádi Z, Szoke K, Sápy T, Krasznai ZT, Soós G, Veress G, Gergely L, Kónya J., Role of human papillomavirus (HPV) testing in the follow-up of patients after treatment for cervical precancerous lesions., Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2005 Feb 1;118(2):229-34.

103. Denny LA, Wright TC Jr., Human papillomavirus testing and screening., Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2005 Aug;19(4):501-15

104. Coupé VM, Berkhof J, Verheijen RH, Meijer CJ., Cost-effectiveness of human papillomavirus testing after treatment for cervical intraepithelial neoplasia., BJOG. 2007 Apr;114(4):416-24.

105. Leguevaque P, Motton S, Decharme A, Soulé-Tholy M, Escourrou G, Hoff J., Predictors of recurrence in high-grade cervical lesions and a plan of management., Eur J Surg Oncol. 2010 Nov;36(11):1073-9.

106. Heymans J, Benoy IH, Poppe W, Depuydt CE., Type-specific HPV geno-typing improves detection of recurrent high-grade cervical neoplasia after conisation., Int J Cancer. 2010 Nov 9.

107. Liu Y, Li C, Wang J, Zhang W., Repeat low-grade squamous intraepithelial cytology with unsatisfactory colposcopy treated by the loop electrosurgical excision procedure: a retrospective study., Eur J Gynaecol Oncol. 2010;31(6):632-5.

108. Fambrini M, Penna C, Pieralli A, Bussani C, Fallani MG, Andersson KL, Scarselli G, Marchionni M., PCR detection rates of high risk human papillomavirus DNA in paired self-collected urine and cervical scrapes after laser CO2 conization for high-grade cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2008 Apr;109(1):59-64.

109. Jeong NH, Lee NW, Kim HJ, Kim T, Lee KW., High-risk human papillomavirus testing for monitoring patients treated for high-grade cervical intraepithelial neoplasia., J Obstet Gynaecol Res. 2009 Aug;35(4):706-11.

110. Ribaldone R, Boldorini R, Capuano A, Arrigoni S, Di Oto A, Surico N., Role of HPV testing in the follow-up of women treated for cervical dysplasia., Arch Gynecol Obstet. 2010 Aug;282(2):193-7.

111. Ostojić DV, Vrdoljak-Mozetic D, Stemberger-Papić S, Finderle A, Eminović S., Cervical cytology and HPV test in follow-up after conisation or LLETZ., Coll Antropol. 2010 Mar;34(1):219-24.

112. Ding Z, Jiang C, Shore T, Pather S, Dalrymple C, Atkinson K, Murali R, Yousef Al-Rayyan ES, Luo K, Carter J., Outcome of cervical intraepithelial neoplasia 2 diagnosed by punch biopsy in 131 women., J Obstet Gynaecol Res. 2011 Mar 13. doi: 10.1111/j.1447-0756.2010.01427.x.

113. Kucera E, Sliutz G, Czerwenka K, Breitenecker G, Leodolter S, Reinthaller A., Is high-risk human papillomavirus infection associated with cervical intraepithelial neoplasia eliminated after conization by large-loop excision of the transformation zone?, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001 Dec 10;100(1):72-6.

114. Kreimer AR, Guido RS, Solomon D, Schiffman M, Wacholder S, Jeronimo J, Wheeler CM, Castle PE., Human papillomavirus testing following loop electrosurgical excision procedure identifies women at risk for posttreatment cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 disease., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006 May;15(5):908-14.

115. Gök M, Coupé VM, Berkhof J, Verheijen RH, Helmerhorst TJ, Hogewoning CJ, Snijders PJ, Meijer CJ., HPV16 and increased risk of recurrence after treatment for CIN., Gynecol Oncol. 2007 Feb;104(2):273-5.

116. Fallani MG, Penna C, Marchionni M, Bussani C, Pieralli A, Andersson KL, Fambrini M., Prognostic significance of high-risk HPV persistence after laser CO2 conization for high-grade CIN: a prospective clinical study., Eur J Gynaecol Oncol. 2008;29(4):378-82.

117. Dyson S, Pitts M, Lyons A, Mullins R., Providing high quality information about human papillomavirus for women after treatment for high-grade cervical dysplasia., Sex Health. 2010 Mar;7(1):49-54.

55

118. Valasoulis G, Koliopoulos G, Founta C, Kyrgiou M, Tsoumpou I, Valari O, Martin-Hirsch P, Daponte A, Karakitsos P, Paraskevaidis E., Alterations in human papillomavirus-related biomarkers after treatment of cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2011 Apr;121(1):43-8.

119. Nobbenhuis MA, Meijer CJ, van den Brule AJ, Rozendaal L, Voorhorst FJ, Risse EK, Verheijen RH, Helmerhorst TJ., Addition of high-risk HPV testing improves the current guidelines on follow-up after treatment for cervical intraepithelial neoplasia., Br J Cancer. 2001 Mar 23;84(6):796-801.

120. Elfgren K, Jacobs M, Walboomers JM, Meijer CJ, Dillner J., Rate of human papillomavirus clearance after treatment of cervical intraepithelial neoplasia., Obstet Gynecol. 2002 Nov;100(5 Pt 1):965-71.

121. Soutter WP, Sasieni P, Panoskaltsis T., Long-term risk of invasive cervical cancer after treatment of squamous cervical intraepithelial neoplasia., Int J Cancer. 2006 Apr 15;118(8):2048-55.

122. Kalliala I, Dyba T, Nieminen P, Hakulinen T, Anttila A., Mortality in a long-term follow-up after treatment of CIN., Int J Cancer. 2010 Jan 1;126(1):224-31.

123. Schuman P, Ohmit SE, Klein RS, Duerr A, Cu-Uvin S, Jamieson DJ, Anderson J, Shah KV; HIV Epidemiology Research Study (HERS) Group., Longitudinal study of cervical squamous intraepithelial lesions in human immunodeficiency virus (HIV)-seropositive and at-risk HIV-seronegative women., J Infect Dis. 2003 Jul 1;188(1):128-36.

124. Silverberg MJ, Ahdieh L, Munoz A, Anastos K, Burk RD, Cu-Uvin S, Duerr A, Greenblatt RM, Klein RS, Massad S, Minkoff H, Muderspach L, Palefsky J, Piessens E, Schuman P, Watts H, Shah KV., The impact of HIV infection and immunodeficiency on human papillomavirus type 6 or 11 infection and on genital warts., Sex Transm Dis. 2002 Aug;29(8):427-35.

125. Strickler HD, Palefsky JM, Shah KV, Anastos K, Klein RS, Minkoff H, Duerr A, Massad LS, Celentano DD, Hall C, Fazzari M, Cu-Uvin S, Bacon M, Schuman P, Levine AM, Durante AJ, Gange S, Melnick S, Burk RD., Human papillomavirus type 16 and immune status in human immunodeficiency virus-seropositive women., J Natl Cancer Inst. 2003 Jul 16;95(14):1062-71.

126. Harris TG, Burk RD, Palefsky JM, Massad LS, Bang JY, Anastos K, Minkoff H, Hall CB, Bacon MC, Levine AM, Watts DH, Silverberg MJ, Xue X, Melnick SL, Strickler HD., Incidence of cervical squamous intraepithelial lesions associated with HIV serostatus, CD4 cell counts, and human papillomavirus test results., JAMA. 2005 Mar 23;293(12):1471-6.

127. Auvert B, Lissouba P, Cutler E, Zarca K, Puren A, Taljaard D., Association of oncogenic and nononcogenic human papillomavirus with HIV incidence., J Acquir Immune Defic Syndr. 2010 Jan 1;53(1):111-6.

128. Clarke B, Chetty R., Postmodern cancer: the role of human immunodeficiency virus in uterine cervical cancer., Mol Pathol. 2002 Feb;55(1):19-24.99. Gage JR, Sandhu AK, Nihira M, Bonecini-Almeida M da G, Cristoforoni P, Kishimoto T, Montz FJ, Martínez-Maza O., Effects of human papillomavirus-associated cells on human immunodeficiency virus gene expression., Obstet Gynecol. 2000 Dec;96(6):879-85.

129. Gray RH, Serwadda D, Kong X, Makumbi F, Kigozi G, Gravitt PE, Watya S, Nalugoda F, Ssempijja V, Tobian AA, Kiwanuka N, Moulton LH, Sewankambo NK, Reynolds SJ, Quinn TC, Iga B, Laeyendecker O, Oliver AE, Wawer MJ., Male circumcision decreases acquisition and increases clearance of high-risk human papillomavirus in HIV-negative men: a randomized trial in Rakai, Uganda., J Infect Dis. 2010 May 15;201(10):1455-62.

130. Cu-Uvin S., HPV as a risk factor for HIV, the 26th International Papillomavirus Conference, Montreal, Canada, 2010

131. Clifford GM, Gonçalves MA, Franceschi S; HPV and HIV Study Group., Human papillomavirus types among women infected with HIV: a meta-analysis., AIDS. 2006 Nov 28;20(18):2337-44

132. De Vuyst H, Lillo F, Broutet N, Smith JS., HIV, human papillomavirus, and cervical neoplasia and cancer in the era of highly active antiretroviral therapy., Eur J Cancer Prev. 2008 Nov;17(6):545-54.

133. Gervaz P, Hahnloser D, Wolff BG, Anderson SA, Cunningham J, Beart RW Jr, Klipfel A, Burgart L, Thibodeau SN., Molecular biology of squamous cell carcinoma of the anus: a comparison of HIV-positive and HIV-negative patients., J Gastrointest Surg. 2004 Dec;8(8):1024-30; discussion 1031.

134. Kitchener H, Nelson L, Adams J, Mesher D, Sasieni P, Cubie H, Moore C, Heard I, Agarossi A, Casolati E, Denny L, Bradbeer C, Lyons F, Beattie G, Niemiec T., Colposcopy is not necessary to assess the risk to the cervix in HIV-positive women: an international cohort study of cervical pathology in HIV-1 positive women., Int J Cancer. 2007 Dec 1;121(11):2484-91.

135. Franceschi S., Epidemiology of HPV infection in HIV infected people, the 26th International Papillomavirus Conference, Montreal, Canada, 2010

136. Ogilvie G., Follow-up and counseling for HPV positive women with normal smears, the 26th International Papillomavirus Conference, Montreal, Canada, 2010

137. Kjaer S, Høgdall E, Frederiksen K, Munk C, van den Brule A, Svare E, Meijer C, Lorincz A, Iftner T., The absolute risk of cervical abnormalities in high-risk human papillomavirus-positive, cytologically normal women over a 10-year period., Cancer Res. 2006 Nov 1;66(21):10630-6.

138. Khan MJ, Castle PE, Lorincz AT, Wacholder S, Sherman M, Scott DR, Rush BB, Glass AG, Schiffman M., The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice., J Natl Cancer Inst. 2005 Jul 20;97(14):1072-9.

56

139. Goldie SJ, Kim JJ, Wright TC., Cost effectiveness of human papillomavirus DNA testing for cervical cancer screening in women aged 30 years or more., Obstet Gynecol. 2004 Apr;103(4):619-31.

140. Ronco G, Segnan N, Giorgi-Rossi P, Zappa M, Casadei GP, Carozzi F, Dalla Palma P, Del Mistro A, Folicaldi S, Gillio-Tos A, Nardo G, Naldoni C, Schincaglia P, Zorzi M, Confortini M, Cuzick J; New Technologies for Cervical Cancer Working Group., Human papillomavirus testing and liquid-based cytology: results at recruitment from the new technologies for cervical cancer randomized controlled trial., J Natl Cancer Inst. 2006 Jun 7;98(11):765-74.

141. Bigras G, de Marval F., The probability for a Pap test to be abnormal is directly proportional to HPV viral load: results from a Swiss study comparingHPV testing and liquid-based cytology to detect cervical cancer precursors in 13,842 women., Br J Cancer. 2005 Sep 5;93(5):575-81.

142. Cuzick J, Szarewski A, Cubie H, Hulman G, Kitchener H, Luesley D, McGoogan E, Menon U, Terry G, Edwards R, Brooks C, Desai M, Gie C, Ho L, Jacobs I, Pickles C, Sasieni P., Management of women who test positive for high risk types of human papillomavirus: the HART study., Lancet. 2003 Dec 6;362(9399):1871-6.

143. Clavel C, Masure M, Bory JP, Putaud I, Mangeonjean C, Lorenzato M, Nazeyrollas P, Gabriel R, Quereux C, Birembaut P., Papillomavirus testing in primary screening for the detection of high-grade cervical lesions: a study of 7932 women., Br J Cancer. 2001 Jun 15;84(12):1616-23.

LISTA ARTICOLE PUBLICATE

I. Ursu RG, Onofriescu M, Nemescu D, Iancu LS., Enhanced

molecular techniques for the diagnosis of human papillomavirus infections., Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2009 Oct-Dec; 113(4):1205-10.

II. Ramona Gabriela Ursu, Mircea Onofriescu, Dragoş Nemescu, Roxana Nemescu, Luminiţa Smaranda Iancu, Detection of HPV 16 and HPV 18 viral loads by Real Time PCR in women with cervical dysplasia, Analele Ştiinţifice Ale Universităţii „Alexandru Ioan Cuza”, Secţiunea Genetică Şi Biologie Moleculară, Tom XII, fasc. I, 2011, pag 25 – 29.

III. Luminiţa-Smaranda Iancu, Ramona Gabriela Ursu, Ecaterina Mariana Enache, Mircea Onofriescu, Particularitatile consimtamântului informat pentru pacientele HPV pozitive, Revista Romana de Bioetica, ISSN: 1583-5170

IV. RAMONA GABRIELA URSU, MIRCEA ONOFRIESCU, DRAGOS NEMESCU, LUMINITA SMARANDA IANCU, HPV prevalence and type distribution in women with or without cervical lesions in the North - East region of Romania, Virology Journal (trimis spre publicare).

57

CURRICULUM VITAE

Nume: Ramona Gabriela Ursu Data naşterii: 9 noiembrie 1977 Tel.: 0744269946 E-mail: ursuramona@yahoo.com Educatie:

o 2007 - prezent: doctorand în specialitatea Microbiologie, cu teza ”Infecţii cu transmitere sexuală asimptomatice. Utilitatea clinică a determinării cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor HPV cu risc înalt oncogen”;

o 2007 – 2008: Şcoala doctorală; o 2006 – 2007: Masterat de Epidemiologie clinică. Metodologia de studiu

în bolile multicauzale – Disciplina de Asistenţă Primară a Stării de Sănătate şi Epidemiologie; lucrare de dizertaţie: ”Determinarea cantitativă a genotipurilor Human Papilloma Virus cu risc înalt oncogen şi caracterizarea statusului integrării genomului HPV”;

o 1997 – 2003: Universitatea de Medicină şi Farmacie Iaşi, Facultatea de Medicină;

o 1993 – 1997: Liceul Teoretic "Ştefan cel Mare”, Suceava. Calificãri:

o 2009: Responsabil Management Calitate Transmed Expert o 2008: Medic Specialist Medicină de Laborator; o 2003 – 2008: Rezident Medicina de Laborator; o 2003: Diploma de Medic.

Experienta profesionalã: o 2008 – prezent : asistent, Disciplina de Microbiologie, UMF “Grigore T. Popa” Iaşi; o 2004 – 2008: preparator, Disciplina de Microbiologie, UMF “Grigore T. Popa” Iaşi.

Cursuri postuniversitare / burse: o 2010: Antimicrobial Stewardship: Measuring, Auditing and

Improving, ESCMID Postgraduate Education Course, 8 - 10 April 2010, Vienna, Austria

o 2009: Curs “Asigurarea calitatii in laboratoarele conform standardului ISO 15189”; o 2009: Curs perfectionare tehnica Real Time PCR (PCR cantitativ), prin participarea la cursul orgnizat de TATAA Biocenter, Freising, Germania; o 2009: curs postuniversitar ”Efectuarea şi interpretarea testelor de sensibilitate in vitro pentru principalele specii de interes medical în raport cu noile fenotipuri de rezistenţă”, UMF “Grigore T. Popa” Iasi, februarie - martie 2009;

58

o 2008: vizită de o săptămâna la Organizaţia Mondială a Sănătăţii, Departamentul HIV / AIDS, unde, sub indrumarea Dr. George Schmid am selectat bibliografia necesară analizei temei “Infecţii asimptomatice transmise pe cale sexuală”; o MD (Mobilitate Doctorală) realizată la Institutul de Virusologie “Ştefan S. Nicolau”, Bucureşti, pentru deprinderea şi aprofundarea tehnicii Real Time PCR (2008) – grant PNCDI – PNII : Proiecte de mobilitate a doctoranzilor (2/2008). o 2008: participare la ”Beating Cervical Cancer Webminar”, Global Videoconference World Cancer Congress, Geneva, International Union Against Cancer, August 28, 2008; o 2008: grant participare la “47th ESCMID Postgraduate Technical Workshop, Gene Expression during Infection”, March, 2008, Siena, Italia; o BD (Bursa Doctorală), Infecţii cu transmitere sexuală asimptomatice. Utilitatea clinică a determinării cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor HPV cu risc înalt oncogen, competiţie CNCSIS (51/2007); o 2007: grant participare la “A modern approach to the management of sexually transmitted diseases”, 45th ESCMID Postgraduate Education Course”, September, 2007, St. Petersburg, Rusia; o 2007: stagiu de perfecţionare în laboratorul de Virusologie din cadrul I.N.C.D.M.I. CANTACUZINO, Bucureşti - introducere în tehnicile: purificare ADN, PCR standard şi genotipare HPV prin metoda INNO LiPA, februarie 2007; o 2006: participare la SUMMER SCHOOL OF PUBLIC HEALTH, Institute of Public Health, Iunie, Iaşi, România; o 2005 - 2006: mobilitate ERASMUS SOCRATES la University of Southern Denmark, Institute of Public Health, Esbjerg; o 2005: participare la “4th ESCMID Summer School” Szeged, Hungary, June, 2005; o 2004: Curs Perfectionare Grecia – “Bioetica şi legislaţia sanitară în România”.

Activitate didacticã : o Stud. Silvia Salceanu; coordonatori: Ramona Ursu, Luminiţa Smaranda Iancu, Genotyping HPV in precancerous cervical lesions: AGC, ASC-US, ASC-H, LGSIL and HGSIL, CONGRESSIS 2011, Al 8-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi o Stud. Silvia Salceanu, coordonatori Ramona Ursu, Luminiţa Smaranda Iancu., Human Papillomavirus genotype prevalence in Paşcani, Romania, 64th International Students' and Young Scientists' Conference "Actual Problems of Modern Medicine", Kyiv, Ukraine , March 3-4th, 2011 o Stud: Ioana Sacară, Silvia Sălceanu; coordonatori: Ramona Gabriela Ursu, Luminiţa Smaranda Iancu, Optimization of Real Time PCR technique for HPV 16 viral load absolute quantification,

59

CONGRESSIS 2010, Al 7-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi o Stud. Oana Murariu, Olivia Jigăreanu; coordonatori: Ramona Gabriela Ursu, Luminiţa Smaranda, Breaking boundaries in Human Papilloma Viruses (HPV) infections diagnosis: from classical Papanicolau test to HPV DNA /mRNA tests, CONGRESSIS 2010, Al 8-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi o 2009: Challenges Related to Acceptability of Human Papilloma Virus Vaccines, Autor: Andreea-Georgiana Aiacoboae, Co-autori: Alexandru Lacatus, Victor Constantinescu, Coordonator ştiinţific: Assistant Ramona Ursu M.D., CONGRESSIS 2009, Al 6-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi o 2009: Genotyping Human Papillomavirus: Which Assay?, Autori: Salceanu Silvia Olivia, Coordonator ştiinţific: Assistant Ramona Ursu M.D., CONGRESSIS 2009, Al 6-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi o 2009: participare la conferinţa studenţilor cu prezentarea ”Implementarea vaccinării anti HPV”, în cadrul Săptămânii Europene de Prevenire a Cancerului de Col Uterin (18-24 ianuarie 2009) o 2008 : pregătirea practică a whorksop-urilor ”Real Time PCR & ELISA, as laboratory tool in the diagnosis of infectious diseases”, The 5th International Congress for Medical Students and Young Doctors, Iaşi, Romania o 2007: “Advantages of HPV genotyping by INNO – LiPA method”, studenţi: Ioana Sacară, Andrei Hristov, coordonator ştiinţific Ramona Ursu, CONGRESSIS 2007, the 4TH International Congress for Medical Students and Young Doctors, Iaşi o 2006: “Cauzal relation between HBV – HCC”, studenţi: Ioana Sacară, Andrei Hristov, coordonator ştiinţific Ramona Ursu, International Congres of Young Doctor and Students, Bucharest

Membru în proiecte de cercetare : o Tehnica Real Time PCR ca instrument practic în prognosticul şi monitorizarea infecţiilor cu virusuri papilloma umane cu risc oncogen înalt – grant PNCD2 - IDEI (1642/2008), director de proiect prof. dr. Iancu Luminţa Smaranda; o Diagnostic prenatal neinvaziv prin analiza moleculară a ADN fetal din plasma maternă - grant PNCD2 - IDEI (1155/2007), director de proiect prof. dr. Onofriescu Mircea; o Cercetări privind sinteza şi activitatea antibacteriană a unor derivate de acid-4-chinolon-3- carboxilic. Relaţii structură chimică-activitate biologică, grant CEEX, Faza III, director de proiect prof. dr. Mihai Nechifor (2007-2008).

Prezentări: o R. Ursu, M. Onofriescu, D. Nemescu, R. Nemescu, L.S. Iancu, HPV 16&18 viral load and risk factors for cervical cancer, The 27the

60

International Papillomavirus Conference 17-22 September 2011, Berlin, Germany o A C Anton, C Cojocaru, G Anton, R Ursu, D Socolov, M Grigore, S Chelemen, Multiple Electrosurgical Excisions – Treatment For Precancerous Cervical Lession, The 27the International Papillomavirus Conference 17-22 September 2011, Berlin, Germany o Ramona Gabriela Ursu, Cristina Ana Anton, Lavinia Dimitriu, Maria Carlan, Grigore Alexandru Dimitriu, Luminița Smaranda Iancu, Importanța testării ADN/HPV prin Linear Array Genotyping Test post intervenție excisională în neoplaziile intraepiteliale cervicale, 18-lea Congres al Societăţii Române de Medicină de Laborator, 25 - 28 mai 2011 la Sibiu o Ramona Ursu, M. Onofriescu, D. Nemescu, Silvia Sălceanu, Roxana Nemescu,Mioara Matei, Luminiţa Smaranda Iancu, Screeningul cancerului cervical: tranziţia de la evaluarea citologică, la testarea ADN/HPV, prin tehnici de biologie moleculară, Conferinta Nationala de Oncologie, Iasi, noiembrie 2010. o Ursu Ramona, Onofriescu Mircea, Nemescu Dragoş, Sălceanu Sivia, Nemescu Roxana, Matei Mioara, Iancu Luminiţa Smaranda, Prevalenţa şi distribuţia genotipurilor HPV în zona Moldovei; corelaţii între încărcătura virală de HPV 16 şi gradul displaziei cervicale, Conferinta, A II-a Conferinta Nationala de Microbiologie, 2010, Sinaia o Ramona Ursu, Luminiţa Smaranda Iancu, Prevalence of human papilloma virus types and viral load – Pap test correlation in Romania, 26th International Papillomavirus Conference and Workshops, Montreal, iulie 2010, poster P – 179. o Ramona Gabriela Ursu , Luminita Smaranda Iancu, Optimizarea tehnicii Real time PCR pentru cuantificarea genotipurilor înalt oncogene de HPV 16 şi 18, Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, octombrie 2009, Brasov O 2009: prezentarea posterului "HR-HPV viral load, p16INK4a - predictive of persistence infection" la conferinţa "25th International Papillomavirus Conference" , Malmo, Suedia, mai 2009 (facilitarea participării la conferinţă s-a datorat grantului oferit de International Papillomavirus Society, grant obţinut prin competiţie). o 2007: “HPV: viral load and physical status - clinical utility” în cadrul cursului “ A modern approach to the management of sexually transmitted diseases, 45th ESCMID Postgraduate Education Course”, St Petersburg, Rusia; o 2005: “Coinfection HBV – HCV” în cadrul şcolii de vară ESCMID, Szeghed, Ungaria.

Articole : o RAMONA GABRIELA URSU, MIRCEA ONOFRIESCU, DRAGOS

NEMESCU, LUMINITA SMARANDA IANCU, trimis spre evluare si publicare la Virology Journal

61

o Ursu RG, Onofriescu M, Nemescu D, Iancu LS., Enhanced molecular techniques f, HPV prevalence and type distribution in women with or without cervical lesions in the North - East region of Romania or the diagnosis of human papillomavirus infections., Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2009 Oct-Dec; 113(4):1205-10.

o Luminiţa-Smaranda Iancu, Ramona Gabriela Ursu, Ecaterina Mariana Enache, Mircea Onofriescu, Particularitatile consimtamnatului informat pentru pacientele HPV pozitive, Revista Romana de Bioetica, ISSN: 1583-5170

o Ramona Gabriela Ursu, M. Onofriescu, D. Nemescu, Luminiţa Smaranda Iancu Optimizarea unor tehnici de biologie moleculară pentru diagnosticul infecţiilor cu virusuri papilloma umane, Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, nr. 4, 113/09.

o Lucia Pintilie, Catalina Negut, C. Oniscu, M.T. Caproiu, M.Nechifor, Luminita Iancu, Cristina Ghiciuc, Ramona Ursu, Synthesis and Antibacterial Actyvity of some Novel Quinolones, Romanian Biotechnology Letters, Vol. 14, No. 5, 2009, pp. 4756 – 4767, http://ebooks.unibuc.ro/biologie/RBL/rbl5vol14/19.pdf

o Luminita Smaranda Iancu, Medea Berea, Ramona Ursu, M. Onofriescu, The prevalence of MRSA among the lying – in women and their new – born infants in two maternities from Iaşi,, Journal of Preventive Medicine, volume 14, 2006.

Activitate stiintificã: o membru societăţi ştiinţifice European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases International PapillomaVirus Society HPV Global Community o membru în comitete de organizare 2008: Cursul Epidemiologie şi Sănătate Publică, creditat CMR, cu participare internaţională - invitat Prof. Gabriel Gulis, University of Southern Denmark, Institute of Public Health, Esbjerg.

Experientã educationalã: o participare curs de PSIHOPEDAGOGIE organizat de UMF “Gr. T. Popa” Iaşi; lucrarea de Dizertaţie “Comunicarea didactică”, coordonator Conf. Dr. Şerban Turliuc.

Activitatea profesionalã: o 8 ani practică (laborator de bacteriologie - UMF “Gr. T. Popa”, Iaşi, laborator de virusologie - ISP Iaşi, laborator privat analize medicale).

Limbi strãine: engleza, franceza.