+ All Categories
Home > Documents > UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale...

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale...

Date post: 11-Sep-2019
Category:
Upload: others
View: 10 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
44
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ ŞCOALA DOCTORALĂ ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII Ing. SIMONA VICTORIA ILEA (ZĂVOI) CARACTERIZAREA UNOR PLANTE MEDICINALE AUTOHTONE ŞI A UNOR BIOPRODUSE DERIVATE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. Dr. Carmen SOCACIU Cluj-Napoca 2011 1
Transcript
Page 1: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ

ŞCOALA DOCTORALĂ

ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII

Ing SIMONA VICTORIA ILEA (ZĂVOI)

CARACTERIZAREA UNOR PLANTE MEDICINALE AUTOHTONE ŞI A UNOR BIOPRODUSE DERIVATE

CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof Dr Carmen SOCACIU

Cluj-Napoca 2011

1

2

CUPRINS

INTRODUCERE 5

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PROPRII 7

CAPITOLUL I

PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATO-PROTECTOARE

CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ 7

CAPITOLUL II

COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI

HEPATOPROTECTOARE

8

CAPITOLUL III

CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR

HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE 8

III1 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDROALCOOLICE

ŞI HIDROGLICERICE 8

III 11 Materiale şi metode 8

III12 Rezultate şi discuţii 9

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS 9

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR 12

III13 Concluzii 14

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE 15

III 21 Materiale şi metode 15

III 22 Rezultate şi discuţii 16

III221 Analiza spectrometrică UV-VIS 16

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din

extractele metanolice 17

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR 17

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice 21

III23 Concluzii 24

3

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI SPECTROMETRIE

FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ CHEMOMETRICĂ 25

OBIECTIVE 25

IV 1 ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV 25

IV11 Materiale şi metode 25

IV12 Rezultate şi discuţii 25

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei specifice

a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de plantă 26

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi

T ( target = ţintit) 26

IV13 Concluzii 29

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR 29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice

a plantelor 30

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi

T ( target = ţintit) 32

IV23 Concluzii 33

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR 33

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR 33

V1 Materiale şi metode 34

V2 Rezultate şi discuţii 34

V21Analiza spectrometrica UV-Vis 35

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV 37

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR 38

V24 Concluzii 39

4

CONCLUZII GENERALE 41

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA 43

5

INTRODUCERE

Plantele medicinale au demonstrat de secole efectele lor benefice icircn profilaxia

şi terapia unor boli fără efecte secundare comparativ cu medicamentele de sinteză

Compoziţia acestora este dependentă de mulţi factori ontogenici şi fenotipici

influenţaţi de mediu vacircrstă perioada recoltării modalitatea de uscare şi păstrare dar

şi de tipul solventului utilizat la extracţie (Tămaş M 1999 Tămaş M şi I Oniga

2000) Datorită heterogenităţii lor naturale calitatea acestor plante din flora spontană

arată fluctuaţii astfel icircncacirct este nevoie de standardizarea extractelor autentificarea

testarea purităţii şi a acţiunii (Yadav NP şi Dixit 2008 Hussain Kşi col 2009)

Identificarea amprentei compuşilor fitochimici prin cromatografie şi spectroscopie

poate oferi informaţii utile despre compoziţia calitativă şi cantitativă a plantelor

medicinale cu recunoaşterea prin metode chemometrice a markerilor de

recunoaştere (Maloney V 2004 Bender DA 2005) şi discriminarea icircntre diferite

tipuri de plante sau extracte sau a formulelor standardizate (McGuffin Mşi col

1997 Liang YZ şi col 2004 Yadav NP şi Dixit 2008 Giri L şi col 2010) icircn

acord cu cerinţele WHO (WHO 2003)

Evaluarea produselor de plante medicinale prin amprenta lor metabolomică

poate fi realizată prin metode avansate ce includ cromatografia lichidă de icircnaltă

performanţă (HPLC cu detecţie UV(DAD) ELSD MS) sau gaz cromatografie cu

detecţie MS (GC-MS) cromatografie pe strat subţire cu cuantificare densitometrică

(HPTLC-densitometrie) spectrometrie vibraţională icircn icircnfraroşu sau Raman (FT-MIR

NIR Raman) spectrometrie de rezonanţă magnetică NMR sau o combinaţie a acestor

technici (Fan XH şi col 2006 Mattoli L şi col 2006 Gong F şi col 2005 Li S şi

col 2008 Hashimoto A şi T Kameoka 2008 Gong F şi col 2009 Giri L şi col

2010)

Spectroscopia UV-Vis este o tehnică simplă ieftină şi uşor de utilizat utilă

pentru a identifica şi cuantifica principalii compuşi fitochimici discriminacircnd icircntre

compuşii lipofilici şi hidrofilici icircn corelaţie cu polaritatea solvenţilor utilizaţi

Tehnica spectrometriei icircn Infraroşu cu transformantă Fourier (FTIR) e o

investigaţie rapidă şi ne-distructivă uşor de utilizat pentru a determina amprenta

6

extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode

fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col

2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători

rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi

cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)

Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn

polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie

Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză

celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)

Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o

importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol

deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)

Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale

autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut

ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn

vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma

acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două

părţi

Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)

Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi

compoziţie chimică generală

Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)

Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice

hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin

cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector

7

SCOP SI OBIECTIVE

Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor

plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea

compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector

prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit

1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic

hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode

analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu

Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)

2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie

HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru

interpretarea rezultatelor

4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

CAPITOLUL I

PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE

CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ

Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea

Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii

privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare

8

CAPITOLUL II

COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI

HEPATOPROTECTOARE

Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat

subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de

literatură

CAPITOLUL III

CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR

HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE

OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8

tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor

extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi

anume

I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de

extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate

II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi

cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a

bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a

concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor

extracte

Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu

obiective bine stabilite

III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-

ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE

III 11 Materiale şi metode

9

S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele

anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip

hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)

Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-

VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1

( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR

III12 Rezultate şi discuţii

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS

S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat

intensităţile de absorbţie (A)

Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe

domenii

Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide

polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide

Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau

derivaţi ai acizilor fenolici)

Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau

glicozilaţi

Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor

derivate prin oxidarea polifenolilor

Analiza chemometrică de tip PCA şi CA

Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale

extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate

A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis

B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm

10

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 2: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

2

CUPRINS

INTRODUCERE 5

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PROPRII 7

CAPITOLUL I

PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATO-PROTECTOARE

CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ 7

CAPITOLUL II

COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI

HEPATOPROTECTOARE

8

CAPITOLUL III

CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR

HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE 8

III1 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDROALCOOLICE

ŞI HIDROGLICERICE 8

III 11 Materiale şi metode 8

III12 Rezultate şi discuţii 9

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS 9

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR 12

III13 Concluzii 14

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE 15

III 21 Materiale şi metode 15

III 22 Rezultate şi discuţii 16

III221 Analiza spectrometrică UV-VIS 16

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din

extractele metanolice 17

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR 17

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice 21

III23 Concluzii 24

3

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI SPECTROMETRIE

FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ CHEMOMETRICĂ 25

OBIECTIVE 25

IV 1 ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV 25

IV11 Materiale şi metode 25

IV12 Rezultate şi discuţii 25

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei specifice

a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de plantă 26

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi

T ( target = ţintit) 26

IV13 Concluzii 29

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR 29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice

a plantelor 30

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi

T ( target = ţintit) 32

IV23 Concluzii 33

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR 33

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR 33

V1 Materiale şi metode 34

V2 Rezultate şi discuţii 34

V21Analiza spectrometrica UV-Vis 35

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV 37

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR 38

V24 Concluzii 39

4

CONCLUZII GENERALE 41

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA 43

5

INTRODUCERE

Plantele medicinale au demonstrat de secole efectele lor benefice icircn profilaxia

şi terapia unor boli fără efecte secundare comparativ cu medicamentele de sinteză

Compoziţia acestora este dependentă de mulţi factori ontogenici şi fenotipici

influenţaţi de mediu vacircrstă perioada recoltării modalitatea de uscare şi păstrare dar

şi de tipul solventului utilizat la extracţie (Tămaş M 1999 Tămaş M şi I Oniga

2000) Datorită heterogenităţii lor naturale calitatea acestor plante din flora spontană

arată fluctuaţii astfel icircncacirct este nevoie de standardizarea extractelor autentificarea

testarea purităţii şi a acţiunii (Yadav NP şi Dixit 2008 Hussain Kşi col 2009)

Identificarea amprentei compuşilor fitochimici prin cromatografie şi spectroscopie

poate oferi informaţii utile despre compoziţia calitativă şi cantitativă a plantelor

medicinale cu recunoaşterea prin metode chemometrice a markerilor de

recunoaştere (Maloney V 2004 Bender DA 2005) şi discriminarea icircntre diferite

tipuri de plante sau extracte sau a formulelor standardizate (McGuffin Mşi col

1997 Liang YZ şi col 2004 Yadav NP şi Dixit 2008 Giri L şi col 2010) icircn

acord cu cerinţele WHO (WHO 2003)

Evaluarea produselor de plante medicinale prin amprenta lor metabolomică

poate fi realizată prin metode avansate ce includ cromatografia lichidă de icircnaltă

performanţă (HPLC cu detecţie UV(DAD) ELSD MS) sau gaz cromatografie cu

detecţie MS (GC-MS) cromatografie pe strat subţire cu cuantificare densitometrică

(HPTLC-densitometrie) spectrometrie vibraţională icircn icircnfraroşu sau Raman (FT-MIR

NIR Raman) spectrometrie de rezonanţă magnetică NMR sau o combinaţie a acestor

technici (Fan XH şi col 2006 Mattoli L şi col 2006 Gong F şi col 2005 Li S şi

col 2008 Hashimoto A şi T Kameoka 2008 Gong F şi col 2009 Giri L şi col

2010)

Spectroscopia UV-Vis este o tehnică simplă ieftină şi uşor de utilizat utilă

pentru a identifica şi cuantifica principalii compuşi fitochimici discriminacircnd icircntre

compuşii lipofilici şi hidrofilici icircn corelaţie cu polaritatea solvenţilor utilizaţi

Tehnica spectrometriei icircn Infraroşu cu transformantă Fourier (FTIR) e o

investigaţie rapidă şi ne-distructivă uşor de utilizat pentru a determina amprenta

6

extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode

fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col

2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători

rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi

cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)

Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn

polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie

Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză

celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)

Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o

importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol

deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)

Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale

autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut

ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn

vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma

acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două

părţi

Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)

Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi

compoziţie chimică generală

Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)

Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice

hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin

cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector

7

SCOP SI OBIECTIVE

Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor

plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea

compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector

prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit

1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic

hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode

analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu

Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)

2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie

HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru

interpretarea rezultatelor

4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

CAPITOLUL I

PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE

CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ

Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea

Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii

privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare

8

CAPITOLUL II

COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI

HEPATOPROTECTOARE

Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat

subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de

literatură

CAPITOLUL III

CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR

HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE

OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8

tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor

extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi

anume

I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de

extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate

II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi

cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a

bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a

concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor

extracte

Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu

obiective bine stabilite

III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-

ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE

III 11 Materiale şi metode

9

S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele

anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip

hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)

Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-

VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1

( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR

III12 Rezultate şi discuţii

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS

S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat

intensităţile de absorbţie (A)

Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe

domenii

Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide

polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide

Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau

derivaţi ai acizilor fenolici)

Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau

glicozilaţi

Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor

derivate prin oxidarea polifenolilor

Analiza chemometrică de tip PCA şi CA

Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale

extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate

A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis

B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm

10

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 3: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

3

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI SPECTROMETRIE

FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ CHEMOMETRICĂ 25

OBIECTIVE 25

IV 1 ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV 25

IV11 Materiale şi metode 25

IV12 Rezultate şi discuţii 25

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei specifice

a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de plantă 26

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi

T ( target = ţintit) 26

IV13 Concluzii 29

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR 29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice

a plantelor 30

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi

T ( target = ţintit) 32

IV23 Concluzii 33

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR 33

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR 33

V1 Materiale şi metode 34

V2 Rezultate şi discuţii 34

V21Analiza spectrometrica UV-Vis 35

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV 37

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR 38

V24 Concluzii 39

4

CONCLUZII GENERALE 41

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA 43

5

INTRODUCERE

Plantele medicinale au demonstrat de secole efectele lor benefice icircn profilaxia

şi terapia unor boli fără efecte secundare comparativ cu medicamentele de sinteză

Compoziţia acestora este dependentă de mulţi factori ontogenici şi fenotipici

influenţaţi de mediu vacircrstă perioada recoltării modalitatea de uscare şi păstrare dar

şi de tipul solventului utilizat la extracţie (Tămaş M 1999 Tămaş M şi I Oniga

2000) Datorită heterogenităţii lor naturale calitatea acestor plante din flora spontană

arată fluctuaţii astfel icircncacirct este nevoie de standardizarea extractelor autentificarea

testarea purităţii şi a acţiunii (Yadav NP şi Dixit 2008 Hussain Kşi col 2009)

Identificarea amprentei compuşilor fitochimici prin cromatografie şi spectroscopie

poate oferi informaţii utile despre compoziţia calitativă şi cantitativă a plantelor

medicinale cu recunoaşterea prin metode chemometrice a markerilor de

recunoaştere (Maloney V 2004 Bender DA 2005) şi discriminarea icircntre diferite

tipuri de plante sau extracte sau a formulelor standardizate (McGuffin Mşi col

1997 Liang YZ şi col 2004 Yadav NP şi Dixit 2008 Giri L şi col 2010) icircn

acord cu cerinţele WHO (WHO 2003)

Evaluarea produselor de plante medicinale prin amprenta lor metabolomică

poate fi realizată prin metode avansate ce includ cromatografia lichidă de icircnaltă

performanţă (HPLC cu detecţie UV(DAD) ELSD MS) sau gaz cromatografie cu

detecţie MS (GC-MS) cromatografie pe strat subţire cu cuantificare densitometrică

(HPTLC-densitometrie) spectrometrie vibraţională icircn icircnfraroşu sau Raman (FT-MIR

NIR Raman) spectrometrie de rezonanţă magnetică NMR sau o combinaţie a acestor

technici (Fan XH şi col 2006 Mattoli L şi col 2006 Gong F şi col 2005 Li S şi

col 2008 Hashimoto A şi T Kameoka 2008 Gong F şi col 2009 Giri L şi col

2010)

Spectroscopia UV-Vis este o tehnică simplă ieftină şi uşor de utilizat utilă

pentru a identifica şi cuantifica principalii compuşi fitochimici discriminacircnd icircntre

compuşii lipofilici şi hidrofilici icircn corelaţie cu polaritatea solvenţilor utilizaţi

Tehnica spectrometriei icircn Infraroşu cu transformantă Fourier (FTIR) e o

investigaţie rapidă şi ne-distructivă uşor de utilizat pentru a determina amprenta

6

extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode

fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col

2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători

rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi

cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)

Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn

polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie

Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză

celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)

Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o

importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol

deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)

Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale

autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut

ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn

vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma

acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două

părţi

Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)

Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi

compoziţie chimică generală

Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)

Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice

hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin

cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector

7

SCOP SI OBIECTIVE

Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor

plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea

compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector

prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit

1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic

hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode

analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu

Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)

2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie

HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru

interpretarea rezultatelor

4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

CAPITOLUL I

PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE

CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ

Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea

Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii

privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare

8

CAPITOLUL II

COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI

HEPATOPROTECTOARE

Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat

subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de

literatură

CAPITOLUL III

CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR

HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE

OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8

tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor

extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi

anume

I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de

extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate

II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi

cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a

bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a

concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor

extracte

Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu

obiective bine stabilite

III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-

ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE

III 11 Materiale şi metode

9

S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele

anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip

hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)

Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-

VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1

( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR

III12 Rezultate şi discuţii

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS

S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat

intensităţile de absorbţie (A)

Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe

domenii

Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide

polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide

Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau

derivaţi ai acizilor fenolici)

Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau

glicozilaţi

Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor

derivate prin oxidarea polifenolilor

Analiza chemometrică de tip PCA şi CA

Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale

extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate

A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis

B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm

10

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 4: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

4

CONCLUZII GENERALE 41

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA 43

5

INTRODUCERE

Plantele medicinale au demonstrat de secole efectele lor benefice icircn profilaxia

şi terapia unor boli fără efecte secundare comparativ cu medicamentele de sinteză

Compoziţia acestora este dependentă de mulţi factori ontogenici şi fenotipici

influenţaţi de mediu vacircrstă perioada recoltării modalitatea de uscare şi păstrare dar

şi de tipul solventului utilizat la extracţie (Tămaş M 1999 Tămaş M şi I Oniga

2000) Datorită heterogenităţii lor naturale calitatea acestor plante din flora spontană

arată fluctuaţii astfel icircncacirct este nevoie de standardizarea extractelor autentificarea

testarea purităţii şi a acţiunii (Yadav NP şi Dixit 2008 Hussain Kşi col 2009)

Identificarea amprentei compuşilor fitochimici prin cromatografie şi spectroscopie

poate oferi informaţii utile despre compoziţia calitativă şi cantitativă a plantelor

medicinale cu recunoaşterea prin metode chemometrice a markerilor de

recunoaştere (Maloney V 2004 Bender DA 2005) şi discriminarea icircntre diferite

tipuri de plante sau extracte sau a formulelor standardizate (McGuffin Mşi col

1997 Liang YZ şi col 2004 Yadav NP şi Dixit 2008 Giri L şi col 2010) icircn

acord cu cerinţele WHO (WHO 2003)

Evaluarea produselor de plante medicinale prin amprenta lor metabolomică

poate fi realizată prin metode avansate ce includ cromatografia lichidă de icircnaltă

performanţă (HPLC cu detecţie UV(DAD) ELSD MS) sau gaz cromatografie cu

detecţie MS (GC-MS) cromatografie pe strat subţire cu cuantificare densitometrică

(HPTLC-densitometrie) spectrometrie vibraţională icircn icircnfraroşu sau Raman (FT-MIR

NIR Raman) spectrometrie de rezonanţă magnetică NMR sau o combinaţie a acestor

technici (Fan XH şi col 2006 Mattoli L şi col 2006 Gong F şi col 2005 Li S şi

col 2008 Hashimoto A şi T Kameoka 2008 Gong F şi col 2009 Giri L şi col

2010)

Spectroscopia UV-Vis este o tehnică simplă ieftină şi uşor de utilizat utilă

pentru a identifica şi cuantifica principalii compuşi fitochimici discriminacircnd icircntre

compuşii lipofilici şi hidrofilici icircn corelaţie cu polaritatea solvenţilor utilizaţi

Tehnica spectrometriei icircn Infraroşu cu transformantă Fourier (FTIR) e o

investigaţie rapidă şi ne-distructivă uşor de utilizat pentru a determina amprenta

6

extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode

fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col

2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători

rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi

cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)

Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn

polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie

Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză

celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)

Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o

importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol

deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)

Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale

autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut

ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn

vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma

acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două

părţi

Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)

Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi

compoziţie chimică generală

Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)

Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice

hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin

cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector

7

SCOP SI OBIECTIVE

Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor

plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea

compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector

prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit

1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic

hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode

analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu

Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)

2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie

HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru

interpretarea rezultatelor

4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

CAPITOLUL I

PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE

CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ

Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea

Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii

privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare

8

CAPITOLUL II

COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI

HEPATOPROTECTOARE

Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat

subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de

literatură

CAPITOLUL III

CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR

HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE

OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8

tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor

extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi

anume

I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de

extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate

II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi

cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a

bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a

concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor

extracte

Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu

obiective bine stabilite

III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-

ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE

III 11 Materiale şi metode

9

S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele

anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip

hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)

Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-

VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1

( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR

III12 Rezultate şi discuţii

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS

S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat

intensităţile de absorbţie (A)

Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe

domenii

Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide

polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide

Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau

derivaţi ai acizilor fenolici)

Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau

glicozilaţi

Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor

derivate prin oxidarea polifenolilor

Analiza chemometrică de tip PCA şi CA

Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale

extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate

A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis

B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm

10

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 5: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

5

INTRODUCERE

Plantele medicinale au demonstrat de secole efectele lor benefice icircn profilaxia

şi terapia unor boli fără efecte secundare comparativ cu medicamentele de sinteză

Compoziţia acestora este dependentă de mulţi factori ontogenici şi fenotipici

influenţaţi de mediu vacircrstă perioada recoltării modalitatea de uscare şi păstrare dar

şi de tipul solventului utilizat la extracţie (Tămaş M 1999 Tămaş M şi I Oniga

2000) Datorită heterogenităţii lor naturale calitatea acestor plante din flora spontană

arată fluctuaţii astfel icircncacirct este nevoie de standardizarea extractelor autentificarea

testarea purităţii şi a acţiunii (Yadav NP şi Dixit 2008 Hussain Kşi col 2009)

Identificarea amprentei compuşilor fitochimici prin cromatografie şi spectroscopie

poate oferi informaţii utile despre compoziţia calitativă şi cantitativă a plantelor

medicinale cu recunoaşterea prin metode chemometrice a markerilor de

recunoaştere (Maloney V 2004 Bender DA 2005) şi discriminarea icircntre diferite

tipuri de plante sau extracte sau a formulelor standardizate (McGuffin Mşi col

1997 Liang YZ şi col 2004 Yadav NP şi Dixit 2008 Giri L şi col 2010) icircn

acord cu cerinţele WHO (WHO 2003)

Evaluarea produselor de plante medicinale prin amprenta lor metabolomică

poate fi realizată prin metode avansate ce includ cromatografia lichidă de icircnaltă

performanţă (HPLC cu detecţie UV(DAD) ELSD MS) sau gaz cromatografie cu

detecţie MS (GC-MS) cromatografie pe strat subţire cu cuantificare densitometrică

(HPTLC-densitometrie) spectrometrie vibraţională icircn icircnfraroşu sau Raman (FT-MIR

NIR Raman) spectrometrie de rezonanţă magnetică NMR sau o combinaţie a acestor

technici (Fan XH şi col 2006 Mattoli L şi col 2006 Gong F şi col 2005 Li S şi

col 2008 Hashimoto A şi T Kameoka 2008 Gong F şi col 2009 Giri L şi col

2010)

Spectroscopia UV-Vis este o tehnică simplă ieftină şi uşor de utilizat utilă

pentru a identifica şi cuantifica principalii compuşi fitochimici discriminacircnd icircntre

compuşii lipofilici şi hidrofilici icircn corelaţie cu polaritatea solvenţilor utilizaţi

Tehnica spectrometriei icircn Infraroşu cu transformantă Fourier (FTIR) e o

investigaţie rapidă şi ne-distructivă uşor de utilizat pentru a determina amprenta

6

extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode

fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col

2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători

rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi

cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)

Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn

polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie

Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză

celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)

Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o

importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol

deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)

Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale

autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut

ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn

vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma

acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două

părţi

Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)

Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi

compoziţie chimică generală

Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)

Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice

hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin

cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector

7

SCOP SI OBIECTIVE

Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor

plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea

compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector

prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit

1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic

hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode

analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu

Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)

2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie

HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru

interpretarea rezultatelor

4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

CAPITOLUL I

PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE

CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ

Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea

Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii

privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare

8

CAPITOLUL II

COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI

HEPATOPROTECTOARE

Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat

subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de

literatură

CAPITOLUL III

CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR

HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE

OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8

tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor

extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi

anume

I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de

extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate

II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi

cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a

bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a

concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor

extracte

Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu

obiective bine stabilite

III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-

ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE

III 11 Materiale şi metode

9

S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele

anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip

hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)

Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-

VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1

( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR

III12 Rezultate şi discuţii

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS

S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat

intensităţile de absorbţie (A)

Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe

domenii

Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide

polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide

Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau

derivaţi ai acizilor fenolici)

Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau

glicozilaţi

Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor

derivate prin oxidarea polifenolilor

Analiza chemometrică de tip PCA şi CA

Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale

extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate

A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis

B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm

10

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 6: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

6

extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode

fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col

2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători

rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi

cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)

Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn

polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie

Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză

celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)

Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o

importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol

deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)

Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale

autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut

ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn

vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma

acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două

părţi

Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)

Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi

compoziţie chimică generală

Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)

Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice

hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin

cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector

7

SCOP SI OBIECTIVE

Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor

plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea

compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector

prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit

1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic

hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode

analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu

Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)

2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie

HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru

interpretarea rezultatelor

4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

CAPITOLUL I

PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE

CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ

Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea

Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii

privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare

8

CAPITOLUL II

COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI

HEPATOPROTECTOARE

Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat

subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de

literatură

CAPITOLUL III

CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR

HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE

OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8

tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor

extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi

anume

I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de

extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate

II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi

cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a

bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a

concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor

extracte

Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu

obiective bine stabilite

III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-

ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE

III 11 Materiale şi metode

9

S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele

anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip

hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)

Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-

VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1

( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR

III12 Rezultate şi discuţii

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS

S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat

intensităţile de absorbţie (A)

Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe

domenii

Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide

polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide

Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau

derivaţi ai acizilor fenolici)

Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau

glicozilaţi

Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor

derivate prin oxidarea polifenolilor

Analiza chemometrică de tip PCA şi CA

Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale

extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate

A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis

B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm

10

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 7: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

7

SCOP SI OBIECTIVE

Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor

plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea

compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector

prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit

1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic

hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode

analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu

Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)

2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie

HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru

interpretarea rezultatelor

4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

CAPITOLUL I

PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE

CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ

Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea

Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii

privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare

8

CAPITOLUL II

COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI

HEPATOPROTECTOARE

Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat

subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de

literatură

CAPITOLUL III

CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR

HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE

OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8

tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor

extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi

anume

I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de

extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate

II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi

cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a

bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a

concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor

extracte

Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu

obiective bine stabilite

III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-

ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE

III 11 Materiale şi metode

9

S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele

anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip

hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)

Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-

VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1

( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR

III12 Rezultate şi discuţii

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS

S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat

intensităţile de absorbţie (A)

Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe

domenii

Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide

polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide

Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau

derivaţi ai acizilor fenolici)

Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau

glicozilaţi

Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor

derivate prin oxidarea polifenolilor

Analiza chemometrică de tip PCA şi CA

Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale

extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate

A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis

B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm

10

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 8: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

8

CAPITOLUL II

COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI

HEPATOPROTECTOARE

Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat

subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare

Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de

literatură

CAPITOLUL III

CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR

HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE

OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8

tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor

extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi

anume

I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de

extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate

II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi

cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a

bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a

concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor

extracte

Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu

obiective bine stabilite

III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-

ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE

III 11 Materiale şi metode

9

S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele

anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip

hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)

Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-

VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1

( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR

III12 Rezultate şi discuţii

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS

S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat

intensităţile de absorbţie (A)

Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe

domenii

Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide

polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide

Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau

derivaţi ai acizilor fenolici)

Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau

glicozilaţi

Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor

derivate prin oxidarea polifenolilor

Analiza chemometrică de tip PCA şi CA

Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale

extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate

A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis

B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm

10

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 9: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

9

S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele

anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip

hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)

Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-

VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1

( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR

III12 Rezultate şi discuţii

III121 Analiza spectrometrică UV-VIS

S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat

intensităţile de absorbţie (A)

Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe

domenii

Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide

polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide

Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau

derivaţi ai acizilor fenolici)

Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau

glicozilaţi

Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor

derivate prin oxidarea polifenolilor

Analiza chemometrică de tip PCA şi CA

Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale

extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate

A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis

B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm

10

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 10: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis

B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm

10

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 11: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice

Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza

spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol

(E) şi glicerină (G)

Analiza chemometrică subliniază că

1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi

Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi

Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la

lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide

2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi

se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici

3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi

fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul

se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici

4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de

acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are

similitudini cu Cătina fructe 11

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 12: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

12

5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi

frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este

caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar

grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi

lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte

bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi

cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn

timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară

III122 Analiza spectrometrică FT-MIR

Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că

Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al

probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi

arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La

extractul gliceric diferenţele sunt mici

Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric

ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din

compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide

Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri

de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat

icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest

semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide

şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide

Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)

diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi

neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste

plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a

legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi

care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine

reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 13: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G

Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E

evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn

extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară

Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR

FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de

absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate

A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR

B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

13

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 14: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR

Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi

glicerină (G)

S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

III13 Concluzii

Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor

etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi

cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice

din fiecare plantă

Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile

icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7

6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn

flavonoide au avut zona 2 mai intensă

Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de

extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce

14

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 15: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

15

absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn

zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4

Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din

probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază

semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6

Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4

Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR

al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de

Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi

icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate

la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai

mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile

( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA

Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin

proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi

lipidici polari

Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de

fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt

prezentate icircn Cap IV

III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE

III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn

paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1

acid clorhidric)

Analiza spectrometrică UV-Vis

Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a

comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)

Determinarea conţinutului de polifenoli totali

Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda

FOLIN-CIOCAcircLTEU

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 16: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

Analiza cromatografică HPLC-UV

Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de

plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis

utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin

Analiza spectrometrică FT-MIR

Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate

III 22 Rezultate şi discuţii

III221 Analiza spectrometrică UV-Vis

Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor

plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor

extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-

290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi

pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2

EFM2)

Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi

( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)

şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru

plantele 1-6

Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)

sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific

16

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 17: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile

EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)

III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de

Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască

III223 Analiza spectrometrica FT-MIR

Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi

respectiv Sunătoare

Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor

fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic

Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint

750-2000 cm-1

2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0

0 1

0 2

0 3

0 4

0 5

0 6

0 7

0 8

Abso

rban

ce a

u

W a v e n u m b e r ( c m -1 )

0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l

FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)

Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)

17

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 18: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

A

0005

01015

02025

03035

04045

00625 0125 025 05 1

intensitate

conc acgalic (mgml)

1614

1743

B

02468

1012141618

00625 0125 025 05 1

aria

concacgalic (mgml)

16141743

Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1

Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat

coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972

18

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 19: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

y = 00805x + 00186R2 = 09972

0

002

004

006

008

01

012

0 02 04 06 08 1 12

concentratia acgalic (mgml)

inte

nsita

tea

la 1

743

1cm

FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1

Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare

şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)

Spectrele FTMIR au fost astfel comparate

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Sunatoare cu

acgalic 1 m gm l

W avenum ber (cm -1)

Acgalic 05m gm l

EM Sunatoare

EM Sunatoare cu

acgalic 05m gm l

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

EM Papadie cu

acgalic 1mgml

EM Papadie cu

acgalic 05mgml

Wavenumber (cm-1)

AcGalic 05 mgml

EM Papadie dil 110

Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)

Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1

Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai

mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn

Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii

19

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 20: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei

de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire

care are valoarea 8

Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante

investigate

FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui

amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)

3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1

0

1

2

3

4

5

6

E M F r u n z e c a t i n a

E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u

E M R o s t o p a s c a

E M A n g h i n a r e

Abs

orba

nce

au

W a v e n u m b e r c m - 1

E M P a p a d i e

E M C a t i n a f r u c t e

E M A m e s t e c a c f e n o l i c i

E M S u n a t o a r e

1236

7

8 5 4

FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de

compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV

Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn

regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată

pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat

8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a

fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)

Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7

specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice

pentru plantele 1-6

20

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 21: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele

trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6

Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor

FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi

fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ

corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10

x

FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici

totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de

spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743

cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1

III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice

Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un

raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au

timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte

molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 22: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele

metanolice

S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din

cromatogramele HPLC utilizacircnd formula

mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015

Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA

Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele

PCA şi CA

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia

plantele investigate

Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia

icircn compuşi fenolici

22

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 23: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

23

Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de

compoziţia lor icircn compuşi fenolici

Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile

concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din

cele 8 plante investigate

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 24: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

24

Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi

fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul

protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante

Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei

frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită

urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi

separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)

Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)

şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6

( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa

probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu

probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)

III23 Concluzii

Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că

1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face

amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au

valoare

2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi

glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din

aceste plante şi polaritatea lor

3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic

icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de

tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste

valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor

de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR

Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un

bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte

4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-

UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 25: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

25

caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode

rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de

acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea

biomarkerilor de autenticitate a acestor plante

CAPITOLUL IV

ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR

INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI

SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ

CHEMOMETRICĂ

Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de

investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare

randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor

glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare

OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI

Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei

plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit

I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea

compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită

ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV

IV11 Materiale şi metode

S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte

4 probe din fiecare tip de plantă)

Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-

MIR analiza chemometrică

IV12 Rezultate şi discuţii

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 26: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

26

IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei

specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de

plantă

Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică

icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi

derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi

( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de

25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)

Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile

care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin

cromatografia HPLC

IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =

ţintit)

Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a

evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute

Analiza de tip neţintit (NT)

Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante

investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele

HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate

semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii

ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA

Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)

In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7

componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 27: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

27

Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de

principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul

0-55 min) icircn system NT

Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative

deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele

de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact

In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT

Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor

aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe

intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT

Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1

R es idual X- v ar ian c e

( PC - 7)

Influence

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600Armurariu

Anghinare

Armurariu Armurariu

Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru

Catina fruCatina fru

PedicutaRostopa

Sunatoare

Sunatoare

Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru

Catina fru

Catina fru

Catina fruPapadie 1

Papadie 2 Sunatoare

Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca

3 sca

Pedicuta 4RostopascaRostopasca

Sunatoare

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 28: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)

Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT

FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele

de corelare

FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe

Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza

HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)

Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele

bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi

compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie

omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)

bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante

din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu

compoziţia plantelor medicinale

Analiza PCA de tip ţintit (T)

Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi

a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi

prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat

probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T

28

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 29: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea

scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2

componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T

consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic

para-cumaric trans cinamic şi elagic

Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para

cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente

Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte

extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales

cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact

IV13 Concluzii

Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se

diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt

rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea

principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55

min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn

sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare

IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR

29

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 30: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor

Rezultate şi discuţii

Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus

spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5

1Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Pedicuţă-Rostopască

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Păpădie-Anghinare

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm)-1

EM Rostopasca EM Pedicuta

1

2

3

4

5

67

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM papadie EM Anginare

1

3

4

5

678

2

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Armurariu-Sunătoare

2Spectre FTIR suprapuse pentru

extractele de Cătină frunze-fructe

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

30

Abs

orba

nce

au

Wavenumber (cm-1)

EM Sunatoare EM Armurariu

1

2

3

5

467

8

3500 3000 2500 2000 1500 100000

02

04

06

08

10

12

14

16

18 EM catina fruct

Abso

rban

ce a

u

Wavenumber (cm)-1

EM catina frunze2

6

5

3

417

8

FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate

luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 31: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din

spectrul FTIR

Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza

spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1

calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de

plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7

Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)

Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor

din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii

şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)

Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)

Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 32: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)

Bazată pe analiza spectrometrică FTIR

FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate

icircn vederea analizei PCA

FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B

Spectre Normalizate la 2200 cm-1

32

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 33: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

33

IV23 Concluzii

1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din

spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi

a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante

luată din loturi diferite

2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de

domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin

semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante

avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere

aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O

3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative

icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu

4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază

semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi

Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate

compact

5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă

gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri

icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri

semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate

Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de

grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică

CAPITOLUL V

OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT

HEPATOPROTECTOR

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu

potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior

Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 34: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

34

1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra

icircn formă de capsule de 03-05 g

2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea

conţinutului de fenoli totali

3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV

4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR

V1 Materiale şi metode

S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel

Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111

Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare

amestecate icircn raport de masa 111

S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2

O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100

ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi

a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC

b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC

c metanol cu 1 HCl concentrat

Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după

care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei

Metodele utilizate la analiza extractelor au fost

Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi

bioactivi (cap II)

Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin

cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi

Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier

(FTIR)(cap IV)

V2 Rezultate şi discuţii

Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 35: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

a

b

Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2

icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)

V21Analiza spectrometrica UV-Vis

Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip

1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2

Valorile concentraţiilor de polifenoli totali

Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de

compuşi polifenolici

Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su

Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su

Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce

conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din

determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte

35

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 36: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

36

Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi

col 2002 Socaciu C 2008a)

Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la

citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat

( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1

Tabel V1

Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru

fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)

Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de

extracţie(FE)

A1

B 0768 0423 100 1191

C 0936 0457 200 2786

A2 B 0330 0157 100 487

C 0556 0398 200 1908

Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol

( c) acidulat decacirct icircn apă (b)

Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile

mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat

In concluzie putem aprecia că

1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă

echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a

cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la

categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm

2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)

urmat de apa distilată (b)

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 37: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

37

V22 Analiza cromatografică HPLC-UV

Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor

din extracte dependent de solventul utilizat Astfel

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai

mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul

vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi

cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul

A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina

taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn

biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată

următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 38: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

38

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi

pseudohipericina )

bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn

flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi

polifenolici

V23 Analiza spectrometrică FT-MIR

Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi

domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale

specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe

marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului

de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul

de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică

FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora

sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă

specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn

timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1

Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)

indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai

mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri

de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce

biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă

glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de

protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 39: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

39

V24 Concluzii

Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele

1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate

avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule

avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )

Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel

bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat

are preponderent efect coleretic si colagog

bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă

1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei

hepatice

2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de

compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel

Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o

concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn

concentraţie medie de 1850 mg 100g

biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi

Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi

la categoria flavonoide şi acizifenolici

3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă

acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat

factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent

Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient

produşii fenolici

Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de

apa distilată (b)

4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de

tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 40: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

40

Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii

fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele

biopreparate A1 şi A2

Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1

dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage

acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic

Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare

varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din

biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina

silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi

icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi

pseudohipericina)

5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn

cele două biopreparate arată următoarele

bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic

protocatecuic şi clorogenic

bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce

valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general

extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind

icircn varianta de extract apos (b)

bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de

33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera

marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De

asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn

biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt

de asemenea markeri de recunoaştere

bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi

echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul

metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest

preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 41: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

41

avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt

semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi

pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este

mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac

icircn compuşi polifenolici

6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două

biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele

acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel

bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei

frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1

bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100

cm-1

bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona

(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor

Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o

concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai

acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-

colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi

explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a

fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd

potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii

unor biopreparate cu efect hepatoprotector

Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul

Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost

investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 42: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

42

Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele

concluzii

1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi

metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia

Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi

Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat

pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său

toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de

acsule cu produs solid micronizat

2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză

complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie

icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn

UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin

analiză chemometrică de tip PCA şi CA

5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din

fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin

cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie

porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate

semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei

6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial

hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)

Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie

amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze

Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111

Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de

compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi

fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)

Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici

(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 43: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

43

Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor

complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de

stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar

Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate

Originalitatea studiilor este conferită de

Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi

Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite

Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9

2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic

fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555

217-224

3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010

Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as

modern tools Res J Phytochem 4 234-241

4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with

Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302

5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for

chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-

2492

6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992

Phytochemistry 55 481-504

7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical

Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451

8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and

alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE
Page 44: UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · În general, plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate în polifenoli cu potenţial antioxidant

44

9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the

quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18

10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of

American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR

spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232

11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J

Chromatography B 812 53-70

12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by

Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy

Spectrochim Acta part A 64 321-326

13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99

14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F

Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)

1534-1545

15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products

Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL

16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja

2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some

important leads Med Res Rev 28(5) 746-72

17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances

by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25

18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and

green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415

19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to

use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-

278

20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală

Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu

Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin

Pharmacol 18 (B) 11-2

23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for

medicinal plants Geneva

24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J

Integr Biol 2 195ndash203

  • SCOP SI OBIECTIVE

Recommended