UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ
Şcoala doctorală
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII
Raluca Maria PÂRLOG (POP)
STUDII DE METABOLOMICĂ APLICATE ASUPRA UNOR VARIETĂŢI DIFERITE DE CĂTINĂ (HIPPOPHAE RHAMNOIDES L.)
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. Dr. Carmen SOCACIU
Cluj-Napoca
2011
II
CUPRINS
Introducere ...................................................................................................................................IV
REZULTATE EXPERIMENTALE.............................................................................................VI
Capitolul I .....................................................................................................................................VI
Analiza metabolomică a diferitelor varietăţi de fructe şi frunze de catină pe baza biomarkerilor carotenoidici .................................................................................................................................VI
I.1. Analiza target a pigmenţilor carotenoidici din fructele şi frunzele de catină folosind combinaţia dintre tehnicile HPLC-PDA şi (U)HPLC-MS ............................................................... VI
I.1.1. Materiale şi Metode.....................................................................................................................................VI I.1.2. Rezultate şi Discuţii ...................................................................................................................................VII
I.1.2.1. Identificarea preliminară a carotenoidelor din fructele de catină folosind HPLC-PDA ..................VII I.1.2.2. Compoziţia în acizi graşi a extractului de carotenoide folosind GC-MS .........................................VII I.1.2.3. Confirmarea carotenoidelor din fructele de catină: identificarea structurii folosind U(HPLC)-MS....................................................................................................................................................................... VIII I.1.2.4. Cuantificarea carotenoidelor individuale din fructele de catină folosind RP-HPLC...................... XIX I.1.2.5. Identificarea preliminară a pigmenţilor din frunzele de catină folosind HPLC-PDA .................... XIX I.1.2.6. Confirmarea carotenoidelor din frunzele de catină: identificarea structurii folosind U(HPLC)-MS....................................................................................................................................................................... XIX I.1.2.7. Cuantificarea pigmenţilor individuali din frunzele de catină folosind RP-HPLC.............................. X
I.1.3. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei target a carotenoidelor folosind PCA................................................................................................................................................................................ X I.1.4. Concluzii......................................................................................................................................................XI
I.2. Amprenta metabolică, non-target, a pigmenţilor carotenoidici din fructele şi frunzele de catină folosind tehnica FTIR .............................................................................................................. XI
I.2.1. Materiale şi Metode.....................................................................................................................................XI I.2.2. Rezultate şi Discuţii ...................................................................................................................................XII
I.2.2.1. Amprenta FTIR al extractului carotenoidic obţinut din fructele de catină .......................................XII I.2.2.2. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei non-target al extractului carotenoidic obţinut din fructele de catină folosind PCA..............................................................................XII I.2.2.3. Amprenta FTIR al extractului carotenoidic obţinut din frunzele de cătină .................................... XIII I.2.2.4. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei non-target al extractului carotenoidic obţinut din frunzele de catină folosind PCA........................................................................... XIII
I.2.3. Concluzii................................................................................................................................................... XIV Capitolul II ................................................................................................................................ XIV
Analiza metabolomică a diferitelor varietăţi de fructe şi frunze de catină pe baza biomarkerilor flavonoid glicozidici................................................................................................................... XIV
II.1. Analiza target a flavonoid glicozidelor din fructele şi frunzele de catină folosind tehnica (U)HPLC-MS..................................................................................................................................... XIV
II.1.1. Materiale şi Metode ................................................................................................................................ XIV II.1.2. Rezultate şi Discuţii ................................................................................................................................. XV
II.1.2.1. Analiza flavonol glicozidelor din fructele de catină folosind RP-UHPLC-MS ............................. XV II.1.2.2. Cuantificarea compuşilor individuali de flavonol glicozide din fructele de catină folosind RP-UHPLC.........................................................................................................................................................XVII II.1.2.3. Identificarea flavonol glicozidelor din frunzele de catină folosind RP-UHPLC-MS ................ XVIII II.1.2.4. Cuantificarea compuşilor individuali de flavonol glicozide din frunzele de catină folosind RP-UHPLC.......................................................................................................................................................... XIX
II.1.3. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei target a flavonol glicozidelor folosind PCA....................................................................................................................................................... XX II.1.4. Concluzii .................................................................................................................................................. XX
II.2. Analiza comparativă a amprentelor metabolice a flavonol glicozidelor din fructele şi frunzele de catină folosind tehnica FTIR........................................................................................ XXI
II.2.1. Materiale şi Metode ................................................................................................................................ XXI
III
II.2.2. Rezultate şi Discuţii ................................................................................................................................ XXI II.2.2.1. Amprenta FTIR al extractului de flavonol glicozide obţinut din fructele de catină...................... XXI II.2.2.2. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei non-target a extractului de flavonol glicozide obţinut din fructele de catină folosind PCA..................................................................XXII II.2.2.3. Amprenta FTIR al extractului de flavonol glicozide obţinut din frunzele de catină....................XXII II.2.2.4. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei non-target a extractului de flavonol glicozide obţinut din frunzele de catină folosind PCA............................................................... XXIII
II.2.3. Concluzii .............................................................................................................................................. XXIV Capitolul III............................................................................................................................ XXIV
Chemometrie comparativă bazată pe analiza integrată a varietăţilor de fructe şi frunze de cătină....................................................................................................................................... XXIV
III.1. Analiza comparativă ANOVA, PCA şi CA bazată pe analiza target a varietăţilor de fructe şi frunze de cătină .......................................................................................................................... XXIV
III.1.1. Materiale şi Metode ............................................................................................................................ XXIV III.1.2. Rezultate şi Discuţii............................................................................................................................ XXIV
III.1.2.1. Studiul general comparativ al conţinutului total de carotenoide şi flavonol glicozide din fructe şi frunze folosind analiza varianţei ANOVA................................................................................................ XXIV III.1.2.2. Analiza comparativă PCA şi CA bazată pe analiza target a varitetăţilor de fructe şi frunze de cătină folosind biomarkerii carotenoidici şi flavonol glicozidici .............................................................. XXV
III.1.3. Concluzii ............................................................................................................................................XXVII III.2. Analiza comparativă PCA şi CA bazată pe analiza non-target a varietăţilor de fructe şi frunze de cătină .............................................................................................................................XXVII
III.2.1. Materiale şi Metode ...........................................................................................................................XXVII III.2.2. Rezultate şi Discuţii...........................................................................................................................XXVII
III.2.2.1. Analiza comparativă PCA şi CA bazată pe analiza non-target a varitetăţilor de fructe şi frunze de cătină folosind amprenta FTIR al extractului de carotenoide şi flavonol glicozide................................XXVII
III.2.3. Concluzii ............................................................................................................................................. XXIX Concluzii generale.................................................................................................................. XXIX
Bibliografie ...............................................................................................................................XXX
IV
INTRODUCERE Metabolomica este una dintre ştiinţele "omice" care are ca şi componente cheie
urmatoarele două parţi majore: analiza chimică a tuturor metaboliţilor dintr-un extract de plante, urmată de cea de a doua, calculul şi interpretarea seturilor de date imense obţinute în urma analizelor. În vederea îndeplinirii acestor cerinţe, domeniul metabolomicii, ce se află într-o rapidă şi continuă dezvoltare, combină tehnologiile sofisticate de analiză, cu cele mai avansate metode statistice cum ar fi chemometria, pentru colectarea de informaţii şi interpretarea datelor. În ultimii zece ani, metode sensibile şi de înaltă rezoluţie, adecvate pentru determinarea unui set cât mai mare de metaboliţi au fost dezvoltate în concordanţă cu cele două abordări majore ale metabolomicii: analizele target şi non-target. Această abordare complexă face metabolomica un instrument important folosit pentru a explica, a înţelege şi a primi informaţii în multe domenii de cercetare, cum ar fi cele referitoare la bolile umane şi de nutriţie, descoperirea de noi medicamente, în fiziologia plantelor, industria alimentară şi altele.
În prezent, în România aplicaţiile importante ale metabolomicii ar trebui folosite în caracterizarea cătinei (Hippophae rhamnoides L.) fapt care ar compensa lipsa de informaţie în acest sens, şi care în momentul de faţă are ca efect diminuarea şi limitarea valorii şi aplicaţiile importante ale cătinei. Cătina este o plantă unică, folosită peste tot în lume în diverse aplicaţii cum ar fi: medicina, nutriţia, industria farmaceutică şi industria alimentară, conservarea solului şi altele.
Aşadar obiectivul acestei teze de doctorat a fost aplicarea studiilor de metabolomică, bazate atât pe analiza „target” cât şi „non-target” a unor varietăţi diferite de cătină (Hippophae rhamnoides L.). Folosirea a patru tipuri de metode de analiză avansată cum ar fi HPLC, (U)HPLC-MS, GC-MS şi spectroscopia FTIR combinate cu interpretarea chemometrică a datelor au fost utilizate în această teză pentru a caracteriza varietăţile romaneşti de cătină.
Principalele obiective sunt:
1. Analiza „target”(ţintită), folosită ca şi evaluarea calitativă şi cantitativă a carotenoidelor şi flavonol glicozidelor din fructele şi frunzele de cătină prin folosirea tehnologiilor metabolomice multiple, cum ar fi combinarea metodelor de separare cromatografice (HPLC-PDA) cu metodele spectrometrice de masă (UHPLC-MS).
2. Analiza „non-target” (ne-ţintită), utilizată ca metodă rapidă şi globală de evaluare a pigmenţilor carotenoidici şi flavonol glicozidici din frunzele şi fructele de cătină utilizând spectroscopia în infraroşu (FTIR).
3. Interpretarea chemometrică (Analiza Principalelor Componente) a rezultatelor obţinute în urma analizelor target şi non-target a carotenoidelor şi flavonol glicozidelor, cu scopul de a identifica biomarkerii de calitate şi autenticitate din rândul acestora.
4. Analize chemometrice comparative bazate pe analiza integrată a varietăţilor de fructe şi frunze de cătină (Analiza Principalelor Componente -PCA şi Analiza Cluster - CA)
Structura tezei: teza este structurată în două mari parţi şi anume: studiul de literatură (I) şi contribuţiile originale (II), parte ce include date despre condiţiile experimentale, măsurători, rezultate şi discuţii. Prima parte include două capitole (I-II):
Capitolul I descrie cele mai recente aspecte legate de metabolomică, cele mai avansate metode analitice de analiză folosite în acest domeniu precum şi importanţa chmemometriei în analiza datelor.
V
Capitolul II descrie proprietăţile cătinei (Hippophae rhamnoides L.) specia folosită ca şi obiect de studiu în acestă teză, făcându-se referire la detaliile legate de variabilitatea sa biologică şi geografică, la cei mai importanţi compuşi bioactivi ce prezintă importanţă pentru sănătatea şi nutriţia oamenilor.
A doua parte include trei capitole (III-V): Capitolul III include datele experimentale comparative, obţinute în urma analizei
metabolomice („target” şi „non-target”- sau amprenta metabolică) la cele şase varietăţi româneşti de cătină, comparând astfel fructele şi frunzele pe baza biomarkerilor carotenoidici
Capitolul IV descrie rezultatele analizei metabolomice („target” şi „non-target”) la fructele şi frunzele de cătină pe baza biomarkerilor flavonoid glicozidici
Capitolul V integrează toate datele folosind o metodă de analiză chemometrică comparativă (PCA şi CA)
O parte din datele incluse în acestă teză au fost obţinute la Food Chemistry Department,
Wageningen University, Wageningen, Netherlands printr-o colaborare cu Departamentul de Chimie şi Biochimie a Universităţii noastre de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară, Cluj-Napoca, Romania. Suportul financiar al acestui proiect a fost asigurat de bursa de doctorat POSDRU/6/1.5/S/20.
VI
REZULTATE EXPERIMENTALE
CAPITOLUL I
ANALIZA METABOLOMICĂ A DIFERITELOR VARIETĂŢI DE
FRUCTE ŞI FRUNZE DE CATINĂ PE BAZA BIOMARKERILOR
CAROTENOIDICI
I.1. ANALIZA TARGET A PIGMENŢILOR CAROTENOIDICI DIN FRUCTELE ŞI FRUNZELE DE CATINĂ FOLOSIND COMBINAŢIA DINTRE TEHNICILE HPLC-PDA ŞI (U)HPLC-MS
I.1.1. Materiale şi Metode Probele Fructele si frunzele provenind de la şase soiuri de cătină Hippophae rhamnoides L., ssp. Carpatica (Victoria, Tiberiu, Sf. Gheorghe, Serpenta, Şerbăneşti 4, şi Ovidiu) au fost culese manual, la maturitate, de pe un câmp experimental aflat în Staţiunea de Cercetări FRUCTEX din Bacău (România), în prima săptămână din octombrie 2008. Fructele şi frunzele au fost îngheţate şi depozitate la -20 ° C. Înainte de extracţie, seminţele au fost separate de fructe. Substanţele chimice Acetonitrilul de puritate UHPLC / MS şi acetatul de etil au fost achiziţionate de la Biosolve BV (Valkenswaard, Olanda). Apa a fost preparată folosind un sistem Milli-Q de purificare a apei (Millipore, Billerica, MA, Statele Unite ale Americii). Toate celelalte substanţe chimice au fost achiziţionate de la Merck (Darmstadt, Germania). Extracţia pigmenţilor Carotenoidele totale şi clorofila au fost extrase atât din fructele cât şi din frunzele de cătină congelate (1g), folosindu-se ca şi solvent de extratie metanol: acetat de etil: eter de petrol (1:1:1, v / v / v) după Pârlog şi colab. (2009). Analiza acizilor graşi prin GC-MS Analiza compoziţiei acizilor graşi din extractele carotenoidice din fructe a fost realizată cu ajutorul aparatului Trace GC Ultra. Probele au fost încărcate (volumul injectabil 1 μ L), pe o coloană Restek Famewax (30 m, 0,25 mm ID, 0,25 μ m PEG). Datele referitoare la spectrometria de masă au fost obţinute cu ajutorul unui spectrometru de masă DSQ II MS pe intervalul 50-650 Da. Metaboliţii au fost identificaţi pe baza modelelor de fragmentare a spectrelor de masă în comparaţie cu cele ale standardelor autentice (FAME RM-3, O7256-1AMP Lot 100 mg, Supelco). Analiza pigmenţilor prin UHPLC–MS Probele au fost analizate folosind un sistem Accela Thermo UHPLC (San Jose, CA, SUA), echipat cu pompe Acella 1250, autosampler şi un dector cu foto-diodă (PDA). Volumele de 5 μL au fost injectate pe o coloană Waters Acquity UPLC BEH Shield RP18 (2,1 x 150 mm, 1,7 uM). Acetatul de etil cu 0,1% v / v acid formic (solventul A), acetonitrilul acidulat cu 0,1% v / v acid formic (solventul B), şi acetonitril: apă 1:1 (v / v) cu 0,1% v / v acid formic (solventul C) au fost utilizaţi ca eluenţi. Detectorul a fost setat la 450 şi 660 nm pentru detectarea carotenoidelor, respectiv a clorofilelor. Debitul provenit de la sistemul RP-UHPLC de 100 μL/min, a fost direcţionat către un spectrometru de masă (San Jose, CA, Statele Unite ale Americii) Thermo Scientific LTQ XL, echipat cu sursă ESI.
VII
Cuantificarea pigmentului prin RP-HPLC Probele au fost cuantificate pe baza unui sistem HPLC Shimadzu, format din pompe LC-20AT, degazor DGU-20A3 şi detector cu detecţie foto-diodă SPD-M20A UV-VIS. Analiza RPHPLC a fost efectuată pe o coloană RP LiChrosorb 18 (250 x 4,6 mm, 5 μ m). Faza mobilă a constat în acetonitril: apă 9: 1 (v / v) cu 0,25% trietilamină (solvent A) şi acetat de etil, cu 0,25% trietilamină (solvent B) după Pintea şi colab. (2005). Pigmenţii au fost cuantificati folosind ca standard intern Sudan I. Analize statistice Clasificarea şi discriminarea între soiurile de fructe si frunze de cătină be baza compoziţiei pigmenţilor carotenoidici a fost realizată prin Analiza Principalelor omponente (PCA), folosind softul UnscramblerX, versiunea 10.1, CAMO Software AS.
I.1.2. Rezultate şi Discuţii I.1.2.1. Identificarea preliminară a carotenoidelor din fructele de catină folosind HPLC-PDA
În total, în fructele de cătină au fost identificaţi un număr de 27 de compuşi. Dintre aceştia, 12 au fost identificati ca şi carotenoide libere, în timp ce restul au fost identificaţi ca şi esteri ai carotenoidelor β−criptoxantină, luteină si zeaxantină. Identificarea lor a fost confirmată cu ajutorul GC-MS-ului şi (U)HPLC-MS-ului după cum este descris în capitolele următoare.
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5
0
1 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0
4 5 0 n m
T im e (m in )
23
65
4
7
1 0
1 1 1 7
1 6 1 81 9
2 0
2 1
2 3
2 48
9
1 3
1 2
1 41 5
2 2 2 52 6 2 7
Fig. 1. Amprenta reprezentativă HPLC–PDA a pigmenţilor din fructele de catină aparţinând varietăţii Victoria, înregistrată la 450 nm. Pentru atribuirea picurilor a se vedea Tabelul 1 Fig. 1. Representative HPLC-PDA of pigments, to fingerprint Victoria seabuckthorn berry variety, recorded at 450 nm. For peak assignment see Table 1
I.1.2.2. Compoziţia în acizi graşi a extractului de carotenoide folosind GC-MS Compoziţia în acizi graşi a extractulului de carotenoide din fructele de cătină a fost determinată cu ajutorul GC-MS-ului în scopul de a stabili care acizi graşi ar putea fi esterificati cu carotenoidele. Trebuie menţionat că acizii graşi din fructele de catină ar putea proveni fie din acizii graşi liberi, din esterii de carotenoide sau din triacilgliceridele reziduale, co-extrase odată cu carotenoidele (Kallio şi colab., 2002;. Yang şi Kallio, 2006). Principalul acid gras major identificat a fost acidul palmitic (C16: 0) ce a variat între 28% şi 44% în varietatea Ovidiu, respectiv Tiberiu, urmat de acidul oleic (C18: 1), cu valori cuprinse între 17% şi 34% în varietatea Tiberiu şi Ovidiu şi acidul palmitoleic (C16 : 1) cu valori cuprinse între 21% şi 28% în varietăţile Tiberiu respectiv, Victoria. Aceste valori au fost în conformitate şi cu alte studii efectuate pe fructele de cătină provenite din România (Vescan şi colab., 2010).
VIII
I.1.2.3. Confirmarea carotenoidelor din fructele de catină: identificarea structurii folosind U(HPLC)-MS Carotenoidele libere identificate au fost luteina, zeaxantina, β- criptoxantina,α- caroten , γ caroten , β caroten şi licopen (picurile 1-12) date raportate până acum şi de alţi autori (Giuffrida şi colab., 2011;. Pintea şi colab., 2005;. Yang şi Kallio, 2005). Restul picurilor (13-27) au reprezentat fracţiunea esterilor conţinând mono-esteri de β- criptoxantină (picurile 13 şi 15), mono-esteri de zeaxantină (picurile 14, 16, 17, 18), di-esteri de luteină (picurile 19, 22, 23, 25, 26) şi di-esteri de zeaxantină (picurile 20, 21, 24, 27).
Tabel 1 Datele LC-(ESI) MS şi identificarea carotenoidelor găsite în fructele de catină.
Table 1 LC-(ESI) MS data and identification of carotenoids found in seabuckthorn berries.
No Nr.
UVmax (nm) [M+H]+ MS2 product ions (relative intensity)
Fragmentele ionice MS2 (intensitatea relativă)
Structure assignment Structura atribuită
1 448, 474 569 569(18), 551(25), 533(2), 476(100) Luteină 2 454, 480 569 551(20), 533(5), 476(100) Zeaxantină 3 436, 461, 492 553 553(10), 535(100), 497(6), 460(18) β Criptoxantină 4 363, 471, 502 537 - γ Caroten 5 345, 362, 443,
467,498 537 - cis Licopen
6 448, 473, 505 537 - Licopen
7 436, 463, 494 537 - cis γ Caroten 8 430, 456, 488 537 - δ Caroten 9 423 ,449, 474 537 444(10), 400(5) α Caroten 10 455, 480 536 444(100) β Caroten 11 337, 416, 448,
474 536 444(100) 15,15’cis β
Caroten 12 453 536 444(100) cis β Caroten 13 448, 474 791 791(16), 698(100), 535(70), 443(65) C16–β
Criptoxantină 14 453, 480 779 779(54), 687(100), 551(50) C14- Zeaxantină 15 791 791(26), 698(100), 535(70), 443(68) C16–β
Criptoxantină 16 453, 479 779 779(98), 687(100), 551(50) C14– Zeaxantină 17 453, 480 807 807(18), 715(100), 551(36) C16- Zeaxantină 18 453, 479 807 807(100), 715(62), 551(32) C16– Zeaxantină 19 448, 475 989 989(12), 896(32), 761(42), 669(100), 533(12), 441(20) C14-C14- Luteină 20 452 1017 1017(5), 925(70), 761(68), 669(100), 533(32), 441(48) C14–C16-
Zeaxantină 21 453, 480 1017 1017(5), 925(52), 789(42), 697(100), 533(18), 441(36) C16–C14-
Zeaxantină 22 448, 475 989 989(5), 896(46), 761(84), 669(100), 533(16), 441(30) C14-C14–Luteină 23 448, 475 1045 1045(2), 953(26), 789(48), 697(100), 533(7), 441(18) C16–C16-Luteină 24 453, 480 1045 1045(2), 953(30), 789(100), 697(94), 533(16), 441(28) C16–C16-
Zeaxantină 25 448 1045 1045(8), 953(32), 789(100), 697(90), 533(18), 441(24) C16–C16-Luteină 26 448 1073 1073(100), 817(50), 789(40), 533(2) C16–C18-Luteină 27 452 1045 1045(62), 953(24), 789(100), 697(68), 533(14),
441(16) C16–C16– Zeaxantină
IX
I.1.2.4. Cuantificarea carotenoidelor individuale din fructele de catină folosind RP-HPLC Compoziţia carotenoidelor a înregistrat variaţii mari între soiuri, Şerbăneşti având aproape dublu conţinutul (151 mg/100 g DW), comparativ cu Sf. Gheorghe (80 mg/100 g DW) şi Victoria (70 mg/100g DW), şi aproape triplu, comparativ cu Ovidiu (59 mg/100 g DW) şi Tiberiu (56 mg/100 g DW). Carotenoidele esterificate au corespuns la cca. 62% din totalul carotenoidelor, în acord cu alte determinări (Andersson şi colab., 2009;. Yang şi Kallio, 2005). În fracţiunea esterificată raportul dintre mono-şi di-esteri a fost întotdeauna în favoarea di-esterilor cu o valoare medie de 2,3, fapt care confirmă că în timpul procesului de maturare carotenoidele sunt mai bine păstrate în formele lor interesterificate, deoarece sunt mai stabile.
I.1.2.5. Identificarea preliminară a pigmenţilor din frunzele de catină folosind HPLC-PDA Figura 2 reprezintă cromatograma HPLC al extractului reprezentativ de frunze al varietăţii Victoria. Profilul lor HPLC a fost înregistrat atât la 450 nm cât şi la 660 nm, datorită prezenţei clorofilelor în extractul de carotenoide. După cum se poate observa în Fig. 2, în frunze, luteina şi carotenoidele hidroxilate nu sunt esterificate.
5 10 15 20 25 30
0
10000
20000
30000
40000 660 nm
A.U
.
Time (min)
IS
1
23
4 6 7
8 9
10
Fig. 2. Amprenta reprezentativă HPLC–PDA a pigmenţilor din frunzele de catină aparţinând varietăţii Victoria, înregistrată la 450 nm şi 660 nm. Pentru atribuirea picurilor a se vedea Tabelul 2. Fig. 2. Representative HPLC-PDA pigments fingerprint of Victoria seabuckthorn leaf variety recorded at 450 nm and 660 nm. For peak assignment see Table 2.
I.1.2.6. Confirmarea carotenoidelor din frunzele de catină: identificarea structurii folosind U(HPLC)-MS În urma analizei UHPLC-MS a extractului de carotenoide, au fost identificaţi 11 pigmenţi, după cum sunt enumeraţi în următorul tabel.
X
Tabel 2 Datele LC-(ESI) MS şi identificarea carotenoidelor găsite în frunzele de catină.
Table 2 LC-(ESI) MS data and pigment identification in seabuckthorn leaves.
No UVmax (nm) [M+H]+ MS2 product ions (relative intensity)
Fragmentele ionice MS2 (intensitatea relativă)
Structure assignment
Structura atribuită 1 414, 438, 466 601 583(80), 565(20), 509(100) Neoxantina 2 417, 440, 471 601 583(80), 565(20), 509(100) Violaxantina 3 410, 665 593 533(100) Feoforbida a 4 447, 475 569 569(18), 551(25), 533(2), 476(100) Lutein 5 453, 476 569 551(20), 533(5), 476(100) Zeaxantina 6a 456, 646 907 629(100) Clorofila b 6b 456, 646 907 629(100) Clorofila b 7a 413, 431, 663 893 615(100) Clorofila a 7b 413, 431, 663 893 615(100) Clorofila a 8a 411, 504, 666 871 593(100), 533(50) Feofitina a 8b 410, 505, 666 871 593(100), 533(50) Feofitina a 9 454, 481 536 444(100) β Caroten 10 449, 475 536 444(100) cis β Caroten 11 449, 475 536 444(100) cis β Caroten
I.1.2.7. Cuantificarea pigmenţilor individuali din frunzele de catină folosind RP-HPLC Comparând fructele cu frunzele de cătină, s-a observat că, conţinutul total de carotenoide din frunze (exprimate în miligrame pe substanţa uscată) a fost, în medie, de 6 ori mai mare decât totalul carotenoidelor din fructe.
I.1.3. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei target a carotenoidelor folosind PCA Pentru a face o interpretare adecvată a compoziţiei carotenoidelor, referitoare la efectul influenţei originii genetice asupra varietăţilor de cătină, a fost efectuată analiza PCA folosindu-se datele cantitative. Fig. 3A reprezintă plotul scorurilor referitor la discriminarea fructelor pe baza carotenoidelor, în timp ce Fig. 3B reprezintă plotul scorurilor referitor la discriminarea frunzelor pe baza pigmenţilor din frunze.
A
B
Fig. 3. Analiza Principalelor Componente (PCA) aplicată pentru fructele şi frunzele de cătină. A. Reprezentarea scorurilor PCA pentru diferitele varietăţi de fructe de catină B. Plotul scorurilor PCA pentru diferitele varietăţi de frunze de catină Fig. 3. Principal Component Analysis (PCA) score plots for seabuckthorn berries and leaves. A. PCA scores plot for different seabuckthorn berry varieties B. PCA scores plot for different seabuckthorn leaf varieties.
XI
I.1.4. Concluzii Datele acumulate în urma determinărilor cantitative şi calitative care au avut ca scop utilizarea carotenoidelor ca şi biomarkeri metabolici, au evidenţiat diferenţe calitative şi cantitative între fructe şi frunze, precum şi între diferitele varietăţi de fructe şi frunze de cătină. Ulterior integrarea datelor a fost realizată cu ajutorul chemometriei. În concluzie putem preciza că:
1. Analiza calitativă HPLC-PDA poate releva diferenţe semnificative între tipurile de carotenoide existente în fructele şi frunzele de cătină. Carotenoidele esterificate au fost prezente doar în fructe. În urma analizei HPLC-PDA s-au identificat 27 de carotenoide în fructele de cătină şi 11 pigmenţi în frunzele de cătină. Structura lor a fost confirmată ulterior de analiza UPLC-MS.
2. Am aplicat cu succes analiza GC-MS ca o metodă nouă, originală pentru a efectua, în mod direct, analiza target a carotenoidelor din fructele de cătină, eliminând procedurile de curăţare în prealabil a extractului. Folosind această analiză s-a constatat că esterificarea carotenoidele din fructele de cătină s-a efectuat în principal cu acizi graşi saturaţi, cum ar fi palmitic şi miristic.
3. Referitor la cele şase soiuri de cătină (Hippophae rhamnoides L., ssp. Carpatica) fructele şi frunzele investigate au înregistrat mari variaţii cantitative între compuşii individuali identificaţi.
• Dintre fructe, varietatea Şerbăneşti a avut cel mai ridicat conţinut în carotenoide, reprezentată în principal de diesterii de zeaxantină (154 mg/100g DW), în timp ce varietatea Serpenta a avut cel mai mic conţinut de carotenoide (29 mg / 100g DW).
• Spre deosebire de fructe, frunzele au avut un conţinut mult mai ridicat de carotenoide libere. Cel mai mare conţinut s-a înregistrat în varietatea Ovidiu (418 mg / 100 g DW) iar cel mai mic conţinut în varietateaTiberiu (275 mg / 100 g DW).
4. Analizele chemometrice au relevat contribuţia semnificativă atât a comuşilor minori cât şi celor majori, ce au influenţă asupra amprentelor lor metabolice, asupra clasificării chemotaxonomice cât şi asupra autenticităţii acestora.
Prin urmare, diferenţierea clară a fructelor de cătină aparţinând varietăţii Şerbăneşti faţă de celelalte varietăţi fost posibilă datorită concentraţiei mari de compuşi majori cum ar fi dipalmitatul de zeaxantină (picul 24) şi β-caroten (picul 10). Aşadar carotenoidele majore, împreună cu cele minore, cum ar fi cis γ-caroten (7), cis licopen şi licopen (5 şi 6) au avut de asemenea o influenţă importantă în gruparea probelor, permiţând gruparea varietăţilor de fructe în cinci grupe.
I.2. AMPRENTA METABOLICĂ, NON-TARGET, A PIGMENŢILOR CAROTENOIDICI DIN FRUCTELE ŞI FRUNZELE DE CATINĂ FOLOSIND TEHNICA FTIR
I.2.1. Materiale şi Metode Probele de cătină Probele şi procedura de extracţie sunt descrise în detaliu în capitolul anterior (I). Analiza FTIR-HATR Spectrele FTIR au fost obţinute cu un spectrometru IR Shimatzu Prestige-21, cu HATR. Fiecare spectru a fost înregistrat în intervalul 4000-650 cm-1. Analize statistice Discriminarea între varietăţile de fructe si frunze s-a făcut cu ajutorul Analizei Principalelor Componente (PCA), cu Softul UnscramblerX, versiunea 10.1, Software CAMO AS.
XII
I.2.2. Rezultate şi Discuţii I.2.2.1. Amprenta FTIR al extractului carotenoidic obţinut din fructele de catină
Picurile caracteristice identificate în zona amprentei FTIR sunt reprezentate în Fig. 4. Picul major de la 1743 cm-1 apare datorită vibraţiilor de întindere a grupărilor carboxilice (C=O) din uleiuri volatile, trigliceride, esteri alifatici sau alţi compuşi din extractul de carotenoide (Li şi colab., 2004.; Rubio-Diaz şi colab., 2010.).
Picul de la 1743 cm-1 sugerează de altfel şi prezenţă mai mare a esterilor carotenoidici, β caroten sau licopen în extractul de carotenoide, compuşi identificaţi anterior şi prin HPLC-PDA (capitolul I). Aceeaşi bandă a fost atribuită şi pentru licopen şi β caroten în extractul de galbenele (Bunghez şi Ion, 2011).
Fig. 4. Regiunea amprentei specifice FTIR (600-1800 cm-1) a fructelor de catină aparţinând varietăţii Victoria Fig. 4. FTIR fingerprint region (600-1800 cm-1) of seabuckthorn berry, Victoria variety Următoarea bandă reprezentativă de la 1463 cm-1 apare datorită vibraţiilor de îndoire a metilenului -CH2 (sau vibraţiilor de forfecare) şi pot fi atribuite pigmenţilor licopenici (1463 cm-
1). Banda de la 1377 cm-1 se datorează inelului b-iononic din molecula de β-caroten, datorită îndoirii simetrice CH, (-CH3) (Abdul şi colab., 2010). Cele trei benzi de la 1161, 1116 şi 1093 cm-1 pot fi atribuite întinderii grupărilor de esteri C-O (Stuart, 2004).
I.2.2.2. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei non-target al extractului carotenoidic obţinut din fructele de catină folosind PCA
După cum se poate vedea în figura următoare, în zona definită de primele două componente principale, o distribuţie satisfăcătoare a grupurilor de probe a fost găsită datorită amprentelor lor FTIR. În general, fiecare probă a format grupări distincte în plotul bidimensional. Cinci dintre ele au fost amplasate de-a lungul axei PC2, în timp ce alt grup reprezentat de Serpenta a fost situat în colţul din stânga jos al plotului. Încărcăturile scorurilor (datele nu sunt prezentate) au identificat din spectrul IR, benzile responsabile pentru discriminarea probelor. În cazul grupului Ovidiu, banda de la 1745 cm-1, corespunzătoare grupărilor carboxilice din esterii carotenoidici (C=O), a avut o contribuţie majoră în gruparea probelor de-a lungul componentei PC2. Regiunea dintre 1850 şi 1500 cm-1 cuplată cu regiunea cuprinsă între 1500-1170 cm-1 este principalul factor în distribuţia probelor de-a lungul axei PC1.
XIII
Fig. 5. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale PC1 şi PC2 a spectrelor FTIR pre-tratate (normalizate, derivata a doua) pe intervalul 900-1800 cm-1, din fructele de catină. Fig. 5. Seabuckthorn berries score plots of the first two principal components, PC1 and PC2 for pre-treated (normalized and second derivative) FTIR spectra between 900-1800 cm-1.
I.2.2.3. Amprenta FTIR al extractului carotenoidic obţinut din frunzele de cătină Picurile caracteristice identificate în zona amprentei FTIR sunt reprezentate în Fig. 6.
Primul pic intens de la 1735 cm-1 în cazul amprentei frunzelor se datorează prezenţei fosfolipidelor sau datorită absorbţiei esterilor carbonil. În continuare, picurile de la 1652, 1608, 1550 şi 1515 cm-1, care sunt complet absente în fructe, sunt cauzate de clorofilele şi/sau conţinutul de proteine (Tavitian et al., 1986) .
După Konwar şi colab. (2011), spectrele IR ale clorofilei în solvenţii nepolari, sunt în general caracterizate printr-un pic de absorbţie la aproximativ 1653cm-1 (Konwar şi Baruah, 2011).
Fig. 6. Amprenta specifică regiunii FTIR (600-1800 cm-1) pentru frunzele de catină aparţinând varietăţii Victoria Fig. 6. FTIR fingerprint region (600-1800 cm-1) of seabuckthorn leaf, Victoria variety.
I.2.2.4. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei non-target al extractului carotenoidic obţinut din frunzele de catină folosind PCA
Ca şi în cazul fructelor, derivata a doua a spectrelor FTIR a permis analizei PCA generarea de-a lungul plotului scorurilor a şase grupuri bazate pe profilul carotenoidelor predominante din extracte (Fig. 7). Distribuţia grupurilor a fost făcută de-a lungul axei PC2. În cazul frunzelor, probele care au avut benzile de la 1458 cm-1 şi de la 1735 cm-1 bine reprezentate au fost situate în partea de sus a axei PC2. Banda de la 1458 cm-1 a fost produsă de către grupările CH- (CH2 forfecare şi îndoire) din compuşii carotenoidici iar banda la 1734 cm-1 a fost
XIV
produsă de grupările -C=O (vibraţiile de întindere ale esterilor) din fracţiunea lipidică a extractului de frunze.
Fig. 7. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale PC1 şi PC2 a spectrelor FTIR pre-tratate (normalizate, derivata a doua) pe intervalul 900-1800 cm-1, din frunzele de catină. Fig. 7. Seabuckthorn leaves score plots of the first two principal components, PC1 and PC2 for pre-treated (normalized and second derivative) FTIR spectra between 900-1800 cm -1.
I.2.3. Concluzii Conform datelor noastre experimentale, spectroscopia FTIR s-a dovedit a fi o tehnică
simplă şi sensibilă de analiză, folosită cu succes ca alternativă la tehnicile cromatografice scumpe, furnizând date semnificative pentru clasificare probelor.
În cazul frunzelor, regiunea specifică compuşilor lipofilici de la 900 la 1800 cm-1 a fost caracterizată de un număr variat de benzi datorită agregatelor lipidice cu proteinele în aparatul fotosintetic.
Regiunea de fingerprint (900-1800 cm-1) atât în cazul fructelor cât şi în cazul frunzelor a permis analizei PCA realizarea discriminării diferitelor varietăţi şi gruparea acestora în şase grupuri.
• În timp ce esteri acizilor graşi din frunze au aratat o bandă de absorbţie C=O la 1735 cm-1, esterii carotenoidelor cu acizii graşi din fructe au aratat o bandă de absorbţie C=O la 1742 cm-1
• Pe lângă contribuţia benzilor din zona 1800-1500 cm-1, care au avut principala influenţă în gruparea probelor, benzile din zona 1500-1200 cm-1 au fost, de asemenea, importante în clasificarea probelor.
CAPITOLUL II
ANALIZA METABOLOMICĂ A DIFERITELOR VARIETĂŢI DE FRUCTE ŞI FRUNZE DE CATINĂ PE BAZA BIOMARKERILOR
FLAVONOID GLICOZIDICI
II.1. ANALIZA TARGET A FLAVONOID GLICOZIDELOR DIN FRUCTELE ŞI FRUNZELE DE CATINĂ FOLOSIND TEHNICA (U)HPLC-MS
II.1.1. Materiale şi Metode Materiale Materialele folosite în acest experiment au fost descrise anterior (capitolul I). Reactivi şi standarde
XV
Acetonitrilul (ACN) utilizat pentru analizele UHPLC/MS a fost achiziţionat de la Biosolve BV (Valkenswaard, Olanda). Metanolul (MeOH) a fost achiziţionat de la Mallinckrodt Baker BV (Deventer, Olanda). Apa a fost preparată folosind un sistem de purificare a apei Milli-Q (MLQ) (Millipore, Billerica MA, USA). Hexanul şi acetona au fost achiziţionate de la Sigma-Aldrich (Steinheim, Germania). Toate celelalte substanţe chimice au fost achiziţionate de la Merck (Darmstadt, Germania). Prepararea soluţiei de standard extern (Rutina) Soluţia stoc a fost preparată în concentraţie de 1 mg/ml în soluţie apoasă de ACN 50% (v/v). Diluţii adecvate au fost făcute în intervalul 0,001-0,6 mg/ml. Cuantificarea derivaţilor flavonoidici a fost realizată pe baza unei curbe de calibrare cu rutină (r2 = 0.9986), făcute în triplicat. Extracţia flavonol glicozidelor Probele liofilizate (3 g) au fost degresate de două ori (2 x 300 mL Hexan). Reziduu a fost uscat la aer după care a fost extras folosind 150 mL de 70% (v/v) acetonă, soluţie apoasă. După fiecare extracţie, suspensia a fost centrifugată (1500 rpm, 15 min), iar peletul reextras de două ori folosindu-se acceaşi procedură. Toate fracţiile de 70% (v/v) acetonă au fost combinate şi concetrate ulterior până la eliminarea acetonei, folosind un rotaevaporator. Fracţia apoasă a fost mai apoi liofilizată, obţinându-se astfel cantitatea totală de polifenoli în forma unui extract uscat. Toate extraţiile au fost realizate în duplicat şi mai apoi analizate în duplicat cu ajutorul UHPLC-ului. În timpul extracţiilor şi a evaporării lumina a fost exclusă pe cât posibil folosindu-se folie de aluminiu. Monitorizarea eficienţei extracţiei prin metoda Folin Ciocalteu Cantitatea totală de polifenoli a fost determinată folosind metoda Folin Ciocalteu în conformitate cu Huang şi colab. (2005). Rezultatele au fost exprimate în echivalenţi ai acidului galic miligrame/ gram substanţă proaspătă, (mg de GAE/ 100 g of FW). Trei extracţii au fost suficiente pentru a extrage toţi polifenolii, din moment ce mai puţin de 1% polifenoli totali au fost extraşi în timpul celei de-a patra extracţii. Analiza RP-UHPLC Probele au fost analizate folosind un sistem Thermo Accela UHPLC (San Jose, CA, USA) echipat cu pompe, autosampler şi detector cu foto-diodă (PDA). Probele (5 µL) au fost injectate pe o coloană RP Hypersyl Gold C18, de 1.9 mm, (150 x 2.1 mm, marimea particulelor de 1.9 μm, Thermo Scientific). Apa acidifiată cu 0.1% (v/v) acid acetic şi 1% (v/v) ACN (eluentul A) şi acetonitril (ACN) acidifiat cu 0.1% (v/v) acid acetic (eluentul B) au fost utilizaţi ca faze mobile. Detectorul PDA a fost setat să masoare la lungimea de undă de 340 nm. Spectroscopia de masă (ESI-MS) Datele referitoare la spectrometria de masă au fost obţinute prin analiza probelor folsind un spectrometru de masă Thermo Scientific LTQ-XL (San Jose, CA, USA) echipat cu sursă ESI. MS-ul a fost conectat la un UHPLC prin intermediul unui “splitter” (Analytical Scientific Instruments (ASI), El Sobrante, CA), care a redus debitul fazei mobile spre UHPLC la 200 μL/min. Achiziţia datelor a fost făcută pe intervalul m/z 280-1000. Fragmentarea MS2 a fost efectuată întotdeauna pe cel mai intens pic din MS1. Analize statistice Diferenţierea între varietăţi în ceea ce priveşte conţinutul de flavonol glicozide a fost efectuată cu ajutorul analizei PCA (UnscramblerX Software, version 10.1, CAMO Software AS).
II.1.2. Rezultate şi Discuţii II.1.2.1. Analiza flavonol glicozidelor din fructele de catină folosind RP-UHPLC-MS
Figura 8 reprezintă amprenta cromatografică UHPLC a flavonol glicozidelor identificate în fructele de cătină. Izorhamnetina şi quercetina, cunoscute ca flavonolii majori din cătină (Chen şi colab., 2007) au fost deasemeanea compuşii derivaţi majori şi in profilul fructelor din
XVI
România. În total au fost identificaţi 26 de compuşi, descrişi în Tabelul 3.
Fig. 8. Amprenta reprezentativă, (U)HPLC–PDA, a flavonol glicozidelor din fructele de catină aparţinând varietăţii Victoria, înregistrată la 340 nm. Pentru atribuirea picurilor a se vedea Tabelul 3 Fig. 8. Representative (U)HPLC-PDA flavonol glycosides fingerprint of Victoria seabuckthorn berry variety, recorded at 340 nm. For peak assignment see Table 3
Tabel 3
Datele LC-(ESI) MS şi identificarea flavonol glicozidelor găsite în fructele de catină (Rosch et al., 2004)
Table 3 LC-(ESI) MS data and flavonol glycosides identification found in seabuckthorn berries (Rosch et
al., 2004)
No Nr
tR (min) Rt (min)
UV (nm) [M+H]+ m/z
MS2 MS3 Structure Assignment Structura atribuită
1 8.29 227, 351 773 (100) 611(20), 449(100), 303(35) 303 (100) Q 3-glucose-glucose-7-rhamnoside
2 8.41 227, 266, 351
773(100) 611(20), 449(100), 303(40) 303(100) Q 3-glucose-glucose-7-rhamnoside
3 8.64 227, 350 641(100) 479(100), 317(20) 317(100) I 3,7-diglucoside 4 8.77 227, 350 787(100) 641(38), 479(100), 317(36) 317(100) I 3-sophoroside-7-
rhamnoside 5 9.14 227, 353 787(100) 625(22), 463(100), 317(54) 317(100) I 3-glucose-
glucose-7-rhamnoside
6 9.77 227, 340 611(100) 465(2), 449(100), 303(27) 303(100) Q 3-glucoside-7-rhamnoside
7 9.95 227, 266, 351
757(100) 611(40), 449(18), 303(100)
303(52), 285(46), 257(100), 229(60), 164(42)
Q 3-rutinoside-7-rhamnoside
8 10.56 227, 269, 332
611(100) 465(38), 303(100) 303(100) Q 3-rutinoside (Rutin)
9 10.74 227, 351 625(100) 479(7), 463(100), 317(28) 317(100) I 3-glucoside-7-rhamnoside
10 10.98 228, 254, 354
625(100) 463(92), 479(13), 317(100) 317(100) I 3-glucoside-7-rhamnoside
11 11.12 226, 353 611(100) 465(38), 303(100) 303(64), 285(60), 257(100), 229(70), 153(64)
Q 3- rutinoside (Rutin)
XVII
Table 3 continuat
No Nr
tR (min) Rt (min)
UV (nm) [M+H]+ m/z
MS2 MS3 Structure Assignment Structura atribuită
12 11.19 227, 336 993(100) 957(2), 847(10), 625(2), 463(100), 317(70)
317(100) I 3-hydroxyferuloyl-feruloyl-glucoside-7-rhamnoside
13 11.30 226,269, 334
993(100) 957(2), 847(10), 625(2), 463(100), 317(60)
317(100) I 3-hydroxyferuloyl-feruloyl-glucoside-7-rhamnoside
14 11.48 227, 254, 353
465 303(100) 257(100), 304(78), 229(68), 165(52), 286(45)
Q 3-glucoside
15 11.67 229, 351 625(100) 479(24), 463(10), 317(100) 317(18), 302(100), 285(40)
I 3-rutinoside
16 12.31 226,352 625(100) 479(32), 463(3), 317(100) 302(100), 285(43), 317(14), 257(13)
I 3-rutinoside
17 12.54 227,254,354
625(100) 479(19), 463(3), 317(100) 302(100), 285(35), 314(14), 257(10)
I 3-rutinoside
18 12.73 226, 352 625(100) 479(20), 317(100) 317(20), 302(100), 285(40), 257(18)
I 3-rutinoside
19 12.96 228, 254, 353
479(100) 317(100) 302(100), 285(40), 317(13), 153(4)
I 3-glucoside
20 14.67 226, 300, 354
871(100) 835(2), 725(22), 563(100), 317(42)
317(100) I 3-acyl-glucoside-glucoside-7-rhamnoside
21 14.86 226, 352 725(100) 689(2), 563(100), 317(50) 317(100) I 3-acyl-glucoside-glucoside
22 16.28 226,253,370
303(100) 303(50), 285(57), 275(12), 257(100), 247(31), 229(76), 201(8), 165(55), 137(17)
229(100) Q
23 16.33 226, 257, 300, 355
871(100) 835(5), 828(2), 709(18), 641(2), 547(100), 317(60)
317(100) I 3-acyl-glucoside-glucoside-7-rhamnoside
24 17.04 226, 254, 370
463(100) 317(100) 302(100), 285(45), 257(10), 153(7)
I 3-rhamnoside
25 18.08 226, 257, 354, 378
709(100) 574(100), 317(33) 317(100) I 3-acyl-glucoside-rhamnoside
26 19.51 226, 254, 370
317(100) 317(17), 302(100), 285(45), 274 (10), 257(12), 229(5), 201 (3), 165 (8)
302(2), 285(32), 274(100), 273 (18), 153(24)
I
II.1.2.2. Cuantificarea compuşilor individuali de flavonol glicozide din fructele de catină folosind RP-UHPLC
Varietatea Serpenta a avut cel mai mare conţinut (3073 mg rutină eq./100 g SU), în timp ce Tiberiu a avut cel mai mic conţinut în compuşi flavonol glicozidici (1268 mg/ 100 g SU). Varietăţile Şerbăneşti şi Ovidiu au avut cantitatea totală de flavonol glocozide variind de la 2014 respectiv la 2188 mg/100 g SU. Concentraţii mai mici au fost observate în cazul varietăţilor Sf.
XVIII
Gheorghe şi Victoria (între 1798 şi 1527 mg/100 g SU). Aceste rezultate sunt în concordanţă cu cele raportate în literatură (Chen şi colab., 2007; Rosch şi colab., 2003).
Varietăţile româneşti sunt dominate de flavonol glicozide având I şi Q ca şi agliconi în raport de 17 la 3, ca şi medie.
II.1.2.3. Identificarea flavonol glicozidelor din frunzele de catină folosind RP-UHPLC-MS
Figura 9 reprezintă amprenta cromatografică UHPLC a flavonol glicozidelor identificate în frunzele de cătină. Douăzeci şi şapte de compuşi au fost tentativ identificaţi ca şi flavonol glicozide cu ajutorul UHPLC–ESI-MS–ului (Tabelul 4).
Fig. 9. Amprenta reprezentativă, (U)HPLC–PDA, a flavonol glicozidelor din frunzele de catină aparţinând varietăţii Victoria, înregistrată la 340 nm. Pentru atribuirea picurilor a se vedea Tabelul 4. Fig. 9. Representative (U)HPLC-PDA flavonol glycosides fingerprint of Victoria seabuckthorn leaf variety, recorded at 340 nm. For peak assignment see Table 4
Tabel 4 Datele LC-(ESI) MS şi identificarea flavonol glicozidelor găsite în frunzele de catină (Rosch et
al., 2004) Table 4
LC-(ESI) MS data and flavonol glycosides identification found in seabuckthorn leaves (Rosch et al., 2004)
No Nr
tR (min) Rt (min)
UV (nm) [M+H]+ m/z
MS2 MS3 Structure Assignment Structura atribuită
1 8.27 228, 394 773 627(2), 611(38), 449(100), 303(38)
303(100) Q 3-glucose-glucose-7-rhamnoside
2 8.54 229 787(100) 641(38),625(40) 479(100), 317(38)
317(100) I 3-sophoroside-7-rhamnoside
3 8.63 229, 254, 349
641(100) 479(100), 317(20) 317(100) I 3,7-diglucoside
4 8.76 230, 253, 351
787(100) 641(37), 479(100), 317(35)
317(100) I 3-sophoroside-7-rhamnoside
5 8.82 251, 358 787(100) 641(40),625(30) 479(100), 317(42)
317(100) I 3-sophoroside-7-rhamnoside
6 9.16 229 787(100) 463(100), 317(50) 317(100) I 3-glucose-glucose-7-rhamnoside
7 9.54 230, 268 611(100) 449(100), 303(27) 303(100) Q 3-glucoside-7-rhamnoside
8 9.80 230, 254, 345
611(100) 449(100), 303(27) 303(100) Q 3-glucoside-7-rhamnoside
9 9.96 229 757(100) 611(40), 449(20), 303(100)
303(52), 285(46), 257(100), 229(60), 164(42)
Q 3-glucoside-7-rhamnoside
XIX
Table 4 continuat No Nr
tR (min) Rt (min)
UV (nm) [M+H]+ m/z
MS2 MS3 Structure Assignment Structura atribuită
10 10.34 250, 345 435(100) 303(100) 286(100), 276(40), 303(12)
Q 3-pentoside
11 10.52 232, 268 787(100) 625(70), 463(100), 317(75)
317(100) I 3-glucose-glucose-7-rhamnoside
12 10.75 230, 253, 344
625(100) 463(100), 317(25) 317(100) I 3-glucoside-7-rhamnoside
13 10.93 625(100) 625(60), 463(100), 317(90)
317(100) I 3-glucoside-7-rhamnoside
14 11 234, 253, 353
625(100) 463(100), 317(20) 317(100) I 3-glucoside-7-rhamnoside
15 11.13 229,254,346
611(100) 465(30), 303(100) 303(50), 257(100) Q 3-rutinoside (Rutin)
16 11.50 229, 254, 341
465(100) 303(100) 303(50), 257(100) Q 3-glucoside
17 12.31 228 625(100) 479(30), 317(100) 317(18), 302(100), 285(40)
I 3-rutinoside
18 12.56 229, 253, 350
625(100) 479(20), 317(100), 302(2)
302(100), 285(43) I 3-rutinoside
19 12.69 228, 266, 394
479(100) 317(100) 317(18), 302(100), 285(42)
I 3-glucoside
20 12.98 229, 253, 351
479(100) 317(100), 302(2) 317(24), 302(100), 285(60)
I 3-glucoside
21 16.97 228, 267, 313
595(100) 309(95), 287(100) 287(60), 241(100), 213(40), 165(50), 121(20)
K -rutinoside
22 17.37 227, 267 595(100) 577(10), 287(100) 288(100), 242(52), 213(40), 165(30), 121(20)
K -rutinoside
23 17.63 227 777(100) 759(10), 615 (90), 597 (100), 579 (75), 541 (18), 303(25)
579 (100), 541 (90), 303(42)
Q 3-hydroxydiglucoside-7-pentoside
24 17.93 227, 269, 317
937(100) 791(70), 629(100), 611 (55), 593(30), 575 (35), 317(22)
611 (100), 593(90), 575 (80), 317(20)
I 3-hydroxycoumaroyl-diglucoside-7-pentoside
25 18.57 227, 332 791(100) 773(15), 629(100), 611 (75), 593(60), 575 (55), 465(10), 317(35)
611 (100), 593(65), 575 (60), 465(12), 317(30)
I 3-hydroxydiglucoside-7-pentoside
26 18.69 227, 253, 352
791(100) 773(10), 629(100), 611 (80), 593(68), 575 (60), 465(14) 317(40)
611 (100), 593(65), 575 (60), 465(18) 317(30)
I 3-hydroxydiglucoside-7-pentoside
27 18.80 227, 35 791(100) 773(18), 629(100), 611 (98), 593(70), 575 (68), 465(10) 317(55)
593(100), 575 (75), 465(50), 317(70)
I 3-hydroxydiglucoside-7-pentoside
II.1.2.4. Cuantificarea compuşilor individuali de flavonol glicozide din frunzele de catină folosind RP-UHPLC
Între varietăţi, Victoria a avut cel mai mare conţinut (3630 mg /100g SU) aproape în acelaşi interval cu varietăţile Ovidiu, Serpenta, Tiberiu şi Sf Gheorghe care au înregistrat valori de 3300, 3149, 3147 şi respectiv 3019 mg/ 100g SU. Cantităţi mai mici au fost înregistrate în cazul varietăţii Şerbăneşti (2719 mg/ 100g SU). În general frunzele au avut o cantitate mai mare de flavonol glicozide decât fructele. Media cantităţii de flavonol glicozide identificate în fructe
XX
(1978 mg/ 100g SU) a fost de 1.6 ori mai mică decât cea identificată în frunze (3161 mg/ 100g SU), corespunzând cu cantitatea totală de polifenoli raportată de Guan şi colab. (2005) în frunzele speciei Hippophae rhamnoides L. ssp. sinensis (Guan şi colab., 2005).
Ca şi în fructe, raportul I faţă de derivaţii de Q şi K a fost întotdeauna în favoarea I, cu o medie de 69 % la 23 şi respectiv 6 %.
II.1.3. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei target a flavonol glicozidelor folosind PCA Pentru a stabili ce compuşi flavonolici pot fi utilizaţi ca şi biomarkeri ce ar putea fi folosiţi în diferenţirea probelor româneşti de fructe şi frunze de cătină s-a aplicat analiza PCA folosindu-se datele obţinute în urma analizei cantitative (Fig. 10A şi respectiv Fig. 10B).
A
B
Fig. 10. Plotul Principalelor Componente (PCA). (A) Plotul scorurilor PCA pentru diferitele varietăţi de fructe de catină (B) Plotul scorurilor PCA pentru diferitele varietăţi de frunze de catină, arătând diferenţele statistice dintre varietăţi, pe baza compoziţiei în flavonol glicozide Fig. 10. Principal Component Analysis (PCA) plots. (A) PCA scores plot for different seabuckthorn berries (B) PCA scores plot for different seabuckthorn leaves revealing statistical differences between different varieties, based on their flavonol glycosides composition
În primul caz, varietăţile de fructe au putut fi clasificate în şase grupuri, dacă se admite că şi varietăţile Tiberiu şi Victoria plasate foarte aproape una de cealaltă formează două grupuri distincte. Poziţia extremă spre dreapta a varietăţii Serpenta de-a lungul axei PC1 în opoziţie cu celelalte patru grupuri situate în partea stângă a plotului Şerbăneşti, Sf Gheorghe şi Tiberiu/Victoria indică corelarea negativă a acestora. În cel de-al doilea caz, când au fost folosite concentraţiile flavonol glicozidelor identificate în frunze s-a putut observa încă o data prezenţa a şase grupe (Fig. 10B). În acest caz, varietatea Tiberiu a fost situată foarte aproape de Sf Gheorghe, în acest fel având caracterisitici similare.
II.1.4. Concluzii 1. În total au fost identificaţi 26 de compuşi în fructele de cătină faţă de 27 de
compuşi identificaţi în frunzele de cătină. 2. În cele şase varietăţi ale cătinei (Hippophae rhamnoides L., ssp. Carpatica) au
fost înregistrate variţii mari în ceea ce priveşte cantitatea flavonol glicozidelor. În cazul fructelor, varietatea Serpenta a avut cel mai mare conţinut în flavonoli (3073 mg/100g SU) în timp ce Tiberiu cea mai mică cantitate (1268 mg/ 100g SU). Spre deosebire de fructe, frunzele au avut concentraţii mai mari, varietatea Victoria având cel mai mare conţinut de flavonoli (3630 mg/ 100 g SU) iar Şerbăneşti cel mai mic conţinut (2719 mg/ 100 g SU)
3. Analiza chemometrică a arătat importanţa contribuţiei diferitelor rapoarte ale compuşilor derivaţi de Izorhamnetină faţă de Quercetină în fructe şi a Izorhamnetinei faţă de Quercetină şi Chemferol în frunze, asupra amprentelor diferitelor varietăţi de catină, asupra clasificării acestora şi asupra recunoaşterii
XXI
autenticităţii lor. În cazul fructelor Serpenta a fost foarte diferită în comparaţie cu restul varietăţilor. Biomarkerii identificaţi în urma analizei PCA şi care contribuie cel mai mult la diferenţierea probelor au fost identificaţi atât din rândul compuşilor majori cât şi din rândul celor minori. Compuşii majori ca I 3-glucozidul (19), I 3-rutinozidul (17), I (26) and I 3-glucozid-7-ramnozid (10) au influenţat distribuţia probelor de-a lungul axei PC1 în timp ce compuşii minori ca I 3,7-diglucozidul (3), Q 3-rutinozid-7-ramnozidul (7), Q 3-rutinozidul (Rutina) (8), I 3-hydroxiferuloyl-feruloyl-glucozid-7-ramnozidul (12), Q (22) and I 3-acyl-glucozid-glucozid-7-ramnozidul (23) au influenţat gruparea probelor de-a lungul axei PC2.
4. În cazul frunzelor selecţia biomarkerilor s-a făcut din rândul compuşilor majori ca I 3-rutinozidul (18), K-rutinozidul (21), I 3-glucozidul (20) I 3-glucozid-7-ramnozidul (13 şi 14) şi din rândul compuşilor minori ca şi I 3,7-diglucozidul (3) şi Q 3-glucozid-7-ramnozidul (8).
5. PCA s-a dovedit a fi o metodă eficientă în discriminarea probelor de fructe şi frunze, clasificându-le în şase grupuri din şase investigate în ambele cazuri.
II.2. ANALIZA COMPARATIVĂ A AMPRENTELOR METABOLICE A FLAVONOL GLICOZIDELOR DIN FRUCTELE ŞI FRUNZELE DE CATINĂ FOLOSIND TEHNICA FTIR
II.2.1. Materiale şi Metode Probele de cătină Procedura de extracţie a probelor este descrisă în capitolul anterior (I). Analizele flavonol glicozidelor prin metoda FTIR-ATR Datele FTIR au fost obţinute folosindu-se spectrometru Schimatzu IR Prestige- 21 (ATR) descris deasemenea în capitoul anterior (I). Analize statistice Interpretarea datelor a fost făcută folosind metoda Analizei Principalelor (PCA, Unscrambler X Software, version 10.1, CAMO Software AS).
II.2.2. Rezultate şi Discuţii II.2.2.1. Amprenta FTIR al extractului de flavonol glicozide obţinut din fructele de catină
Principalele benzi identificate în zona amprentei extractului de flavonol glicozide al fructelor sunt reprezentate în Fig. 11.
Fig. 11. Amprenta regiunii FTIR (600-1800 cm-1) al extractului de flavonol glicozide din fructele
XXII
de catină aparţinând varietăţii Victoria Fig. 11. FTIR fingerprint region of (600-1800 cm-1) seabuckthorn berry flavonol glycosides extract, Victoria variety
Comparând intensitatea benzii produsă de proteine de la 1622 cm-1 cu banda de la 1728 cm-1 datorată legăturii C=O din lipide, putem afirma că extractul de flavonol glicozide al fructelor este mai bogat în lipide decât în proteine. Potrivit studiilor de litaratură prezenţa bezii de la 1622 cm-1 poate fi atribuită legăturii conjugate carbonil din structura flavonoidelor ce predomină în acest extract (Adiana şi Mazura, 2011). Următoarea bandă de la 1382 cm-1 poate fi atribuită grupurilor metil în timp ce a doua bandă de la 1203 cm-1 poate fi atribuită grupărilor -OH din compuşii fenolici (Ficarra şi colab., 2002). Benzile intense de la 1074 şi 1033 cm-1 corespund vibraţiilor de întindere a legăturilor C-OH din reziduurile de oligozaharide sau din flavonoide (vibraţia CH2OH) şi OCH3 (pectină şi polizaharide) (Lu şi colab., 2011). Prezenţa acestor benzi sunt explicate de cantitatea mare de polifenoli care au în structura lor gruparea funcţională a alcoolului.
II.2.2.2. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei non-target a extractului de flavonol glicozide obţinut din fructele de catină folosind PCA
Plotul analizei PCA (PC1 vs. PC2) al spectrelor FTIR este ilustrat în Fig. 12.
Fig. 12. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale PC1 şi PC2 a spectrelor FTIR pre-tratate (normalizate) pe intervalul de amprentă a regiunii FTIR (800-1800 cm-1), din fructele de catină. Fig. 12. Seabuckthorn berries score plots of the first two principal components, PC1 and PC2 for pre-treated (normalized) FTIR fingerprint zone (800-1800 cm-1).
Primele două componente (PC1şi PC2) au explicat 93% din varianţa totală a probelor. PC1 a explicat 71% din totalul varianţei în timp ce PC2 a explicat un procent de 22%. Cele şase varietăţi au fost grupate în şase grupuri de-a lungul celor două axe PC1 şi PC2. Încărcătura plotulului (date neprezentate) a indicat variabilele corespunzătoare pentru diferenţierea grupurilor. Distribuţia probelor de-a lungul axei PC1 a fost influenţată în mare măsură de banda de la 1731 cm-1 produsă de gruparea esterilor carbonil din probe (C=O) şi de banda de la 1033 cm-1 a vibraţiilor de întindere a grupărilor C-OH din flavonoide. Distribuţia probelor de-a lungul axei PC2 a fost influenţată în mare măsură de banda de la 1622 cm-1 care poate fi atribuită grupărilor carbonil conjugate din structura flavonoidelor.
II.2.2.3. Amprenta FTIR al extractului de flavonol glicozide obţinut din frunzele de catină
Principalele benzi identificate în zona amprentei extractului de flavonol glicozide al fructelor sunt reprezentate în Fig. 13.
Diferenţa dintre amprentele FTIR a fructelor şi frunzelor de cătină constă în raportul diferit al intensităţii unor benzi specifice identificate în extractele acestora. De exemplu banda datorată proteinelor de la 1608 cm-1 a avut intensitatea mai ridicată în frunze şi mai mică în fructe în timp ce lipidele, reprezentate de banda de la 1716 cm-1 a avut intensitatea mai ridicată în
XXIII
fructe şi mai mică în frunze. Acest lucru este explicat de cantitatea ridicată a lipidelor faţă de proteine din fructe faţă de frunze.
Compuşii fenolici sunt bine reprezentaţi şi în frunze. Picul de la 1454 cm-1 este produs de vibraţia de îndoire a legăturii C-H al inelul aromatic din structura flavonoidelor (Wu şi colab., 2008). Picul de la 1338 cm-1 este datorat vibraţiei de întidere în plan a legăturii C-O combinată cu vibraţia de întindere a inelului fenil (Lu şi colab., 2011). În final, picul cel mai intens de la 1047 cm-1 sugerează prezenţa flavonoidelor sau a compuşilor ce conţin grupări alcool sau grupări =C-O-C prin vibraţia de indindere a acestora. Vibraţille de întindere a grupărilor C-C sau C-OH sugerează şi ei prezenţa compuşilor fenolici (Wu şi colab., 2008).
Fig. 13. Amprenta regiunii FTIR (600-1800 cm-1) al extractului de flavonol glicozide din frunzele de catină aparţinând varietăţii Victoria Fig. 13. FTIR fingerprint region of (600-1800 cm-1) seabuckthorn leaf flavonol glycosides extract, Victoria variety
II.2.2.4. Interpretarea chemometrică a rezultatelor obţinute în urma analizei non-target a extractului de flavonol glicozide obţinut din frunzele de catină folosind PCA
În Fig. 14 este ilustrată analiza PCA a spectrelor obţinute în urma analizei FTIR a extractelor din frunzele de c cătină. Primele două componente (PC1şi PC2) au explicat 87% din varianţa totală a probelor. PC1 a explicat 80% din totalul varianţei în timp ce PC2 a explicat un procent de 7%. Cele şase varietăţi au fost grupate în şase grupri de-a lungul celor două axe PC1 şi PC2 ca şi în cazul fructelor.
Fig. 14. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale PC1 şi PC2 a spectrelor FTIR pre-tratate (normalizate) pe intervalul de amprentă a regiunii FTIR (800-1800 cm-1), din frunzele de cătină. Fig. 14. Seabuckthorn leaf score plots of the first two principal components, PC1 and PC2 for pre-treated (normalized) FTIR fingerprint zone (800-1800 cm-1).
XXIV
Distribuţia grupurilor s-a făcut exclusiv de-a lungul axei PC1. Varietăţile Tiberiu, Ovidiu şi Serpenta au fost situate în partea negativă a plotului în timp varietăţile Victoria, Şerbăneşti şi Sf Gheorghe au fost situate în partea pozitivă.
II.2.3. Concluzii Bazându-ne pe rezultatele analizelor de pâna acum referitoare la caracterizarea metabolomică a flavonol glicozidelor din fructele şi frunzele de cătină putem afirma că:
1. Amprenta flavonol glicozidelor a fost dependentă de varietatea de fructe şi frunze analizate.
2. Considerând spectrele FTIR, s-a constatat relaţia inversă dintre intensitatea picului datorat proteinelor de la 1608 cm-1 (caracteristic frunzelor) şi cel de la 1716 cm-1 datorat lipidelor (caracteristic fructelor). După cum era de aşteptat aceste benzi sunt datorate cantităţii ridicate în ulei faţă de proteine a fructelor faţă de frunze.
3. În urma analizei PCA s-au identificat benzile care au influenţat clasificarea probelor în cele şase grupuri atât la frunze cât şi la fructe. Aşadar benzile care au influenţat gruparea fructelor au fost date de vibraţiile grupărilor carbonil C=O şi de vibraţiile de întindere a grupărilor C-OH din flavonoide. Vibraţiile de întindere a grupărilor =C-O-C, C-C, vibraţiile de îndoire a grupărilor C-OH, vibraţiile în plan (C-H) specifice compuşilor flavonoidici sau compuşilor ce conţin grupări –OH precum şi vibraţiile inelului fenil din structura flavonoidelor (C=C) au influenţat gruparea frunzelor.
CAPITOLUL III
CHEMOMETRIE COMPARATIVĂ BAZATĂ PE ANALIZA INTEGRATĂ A VARIETĂŢILOR DE FRUCTE ŞI FRUNZE DE CĂTINĂ
III.1. ANALIZA COMPARATIVĂ ANOVA, PCA ŞI CA BAZATĂ PE ANALIZA TARGET A VARIETĂŢILOR DE FRUCTE ŞI FRUNZE DE CĂTINĂ
III.1.1. Materiale şi Metode Analize statistice
Integrarea tuturor rezultatelor prezentate în capitolele anterioare a fost făcută folosindu-se analiza statistică avansată precum ANOVA şi a analizei chemometrice (PCA şi CA).
III.1.2. Rezultate şi Discuţii III.1.2.1. Studiul general comparativ al conţinutului total de carotenoide şi flavonol glicozide din fructe şi frunze folosind analiza varianţei ANOVA
Figura 15 prezină rezultatele în ceea ce priveşte cantitatea totală de carotenoide şi flavonol glicozide din fructele şi frunzele de cătină.
XXV
A Carotenoidele din fructe –
Carotenoids in berries
B - Carotenoidele din frunze Carotenoids in leaves
C - Flavonoidele din fructe
Flavonols in berries
D - Flavonoidele din frunze Flavonols in leaves
Fig. 15. Compararea conţinutului total de carotenoide identificate în fructele (A) şi frunzele (B) de cătină cu conţinutul total de flavonol glicozide identificate în fructele (C) şi frunzele (D) de cătină. Valorile sunt exprimate ca medie ± eroarea standard (n=3) iar cele semnificativ diferite (P<0.05) fiind notate cu litere diferite (a, b,ab, c, d, e, f). Fig. 15. Comparative total carotenoid content identified in seabuckthorn berries (A) and seabuckthorn leaves (B) versus total flavonols contents identified in seabuckthorn berries (C) and seabuckthorn leaves (D). Values are expressed as average±standard error of triplicate (n=3) and the ones that are significantly different (P<0.05) are marked by different letters (a, b,ab, c, d, e, f).
Comparând carotenoidele cu flavonolii se poate observa că aceştia au concentraţii mai mici (aproape de 20 de ori mai mici în fructe şi aproape de 7.5 ori mai mici în frunze).
III.1.2.2. Analiza comparativă PCA şi CA bazată pe analiza target a varitetăţilor de fructe şi frunze de cătină folosind biomarkerii carotenoidici şi flavonol glicozidici
Capitolele anterioare au descris flavonoidele şi carotenoidele din cele şase varietăţi de fructe şi frunze de cătină românească (Hippophae rhamnoides L. ssp Carpatica) cu scopul de a determina diversitatea metabolică a acestora cu ajutorul chemometriei (PCA) pentru a realiza discriminarea între probe. Pentru a găsi mai multe similarităţi între probele analizate şi pentru a evidenţia distanţa existentă între probe s-a folosit analiza Cluster Analysis (CA) ca şi metodă complementară analizei PCA. Analiza statistică ANOVA a fost deasemenea folosită pentru a evidenţia diferenţele statistic semnificative între determinările cantitative ale acestor compuşi.
Profilul carotenoidelor identificate în fructele de cătină (27 compuşi) şi în frunzele de cătină (11 pigmenţi) au fost utilizaţi ulterior în analiza PCA şi CA pentru a evidenţia diferenţele între varietăţi. Aceeaşi abordare a fost folosită şi în cazul flavonol glicozidelor când cei 26
XXVI
compuşi identificaţi în fructe şi cei 27 compuşi identificaţi în frunze au fost analizaţi cu ajutorul PCA şi CA.
Tabel 5 Evaluarea integrată a datelor (analiza chemometrică şi analitică)-target bazată pe analiza
UHPLC/MS Table 5
Integrated evaluation of data (analytical and chemometric analysis)-targeted analysis based on UHPLC/MS
Carotenoids/ Carotenoide Flavonol glycosides/ Flavonol glicozide
Ber
ries/
Fru
cte
Carotenoids/ Carotenoide Flavonol glycosides/ Flavonol
glicozide
Leav
es/ F
runz
e
Carotenoids and flavonol glycosides/ Carotenoide si flavonol glicozide
Ber
ries/
Fru
cte
Carotenoids and flavonol glycosides/ Carotenoide si flavonol glicozide
Leav
es/ F
runz
e
XXVII
III.1.3. Concluzii 1. Carotenoidele şi flavonol glicozidele sunt corelate negativ în fructe în timp ce în frunze
nu s-a găsit nici o corelaţie semnificativă. 2. Analiza PCA a arătat că: în ceea ce priveşte compoziţia carotenoidelor, o delimitare
evidentă s-a produs în cazul varietătii Şerbanesti – bogată în esteri de carotenoide şi a varietătii Serpenta – săracă în esteri de carotenoide. De asemenea, s-au observat compoziţii similare a varietăţilor Victoria, Tiberiu şi Sf Gheorghe ce pot fi grupate împreună. De asemena este observată discriminarea clară a varietăţii Ovidiu.
3. Analiza PCA a arătat că: în ceea ce priveşte compoziţia flavonol glicozidelor, o delimitare evidentă s-a produs din nou în cazul varietătii Şerbanesti şi Serpenta în timp ce varietăţile Victoria, Tiberiu şi Sf Gheorghe pot fi grupate împreună. Discriminarea clară a variatăţii Ovidiu este observată de asemena
4. Considerând atât valorile carotenoidelor cât şi a flavonol glicozidelor, în fructe discriminarea este în mare măsură influenţată de prezenţa flavonol glicozidelor (raportul flavonol glicozide/carotenoide =20) în timp ce la frunze acest lucru nu este observat (raportul flavonol glycozide/carotenoide =7.5).
III.2. ANALIZA COMPARATIVĂ PCA ŞI CA BAZATĂ PE ANALIZA NON-TARGET A VARIETĂŢILOR DE FRUCTE ŞI FRUNZE DE CĂTINĂ
III.2.1. Materiale şi Metode Analize statistice
Integrarea toturor rezultatelor obţinute în urma analizei non-target prezentate anterior a fost făcută folosind analize chemometrice precum (PCA şi CA). Softul folosit a fost UnscramblerX Software, version 10.1, CAMO Software AS.
III.2.2. Rezultate şi Discuţii III.2.2.1. Analiza comparativă PCA şi CA bazată pe analiza non-target a varitetăţilor de fructe şi frunze de cătină folosind amprenta FTIR al extractului de carotenoide şi flavonol glicozide
XXVIII
Tabel 6 Evaluarea integrată a datelor (analiza chemometrică şi analitică)-non-target bazată pe analiza
FTIR Table 6
Integrated evaluation of data (analytical and chemometric analysis)-untargeted analysis based on FTIR
Carotenoids/ Carotenoide Flavonol glycosides/ Flavonol glicozide
Ber
ries/
Fru
cte
Carotenoids/ Carotenoide Flavonol glycosides/ Flavonol
glicozide
Leav
es/ F
runz
e
Carotenoids and flavonol glycosides/ Carotenoide si flavonol glicozide
Ber
ries/
Fru
cte
Carotenoids and flavonol glycosides/ Carotenoide si flavonol glicozide
Leav
es/ F
runz
e
XXIX
III.2.3. Concluzii 1. S-a obţinut o discriminare bună a probelor bazate pe benzile de absorbţie identificate cu
ajutorul analizei non-target FTIR, dar nu s-a stabilit nici o corelaţie semnificativă a acestor rezultate cu cele obţinute în urma analizei target nici în cazul fructelor nici în cazul frunzelor.
2. Când s-a folosit combinaţia ambilor biomarkeri în clasificarea probelor, s-a observat că la fructe discriminarea între varietăţi este determinată de flavonoli în timp ce la frunze este influenţată şi de alţi compuşi similar rezultatelor obţinute în urma analizei target.
CONCLUZII GENERALE Semnificaţia biologică a rezultatelor noastre este mai bine înţeleasă dacă rezultatele obţinute sunt interpretate chemometric. Cele mai importante rezultate sunt:
Carotenoidele şi flavonol glicozidele ce au calea biosintetică paralelă, necompetitivă, sunt biomarkeri potriviţi pentru a realiza discriminarea diferitelor varietăţi de cătină atât în cazul fructelor cât şi în cazul frunzelor.
Comparând analiza target bazată pe LC-MS am observat că ea oferă rezultate importante şi exacte ce pot fi folosite la discriminarea semnificativă între varietăţi, mai bune decât rezultatele obţinute în urma analizei non-target, ce sunt bazate pe analiza spectrelor FTIR.
Viitoare studii sunt necesare pentru a găsi corelaţiile dintre analiza target şi non-target şi pentru a valida analiza FTIR ca o tehnică rapidă şi ieftină de a autentifica varietăţile de cătină şi care să fie folosită în chemotaxonomie.
Recomandăm folosirea analizei target a acestor biomarkeri ca cea mai bună metodă de a discrimina între varietăţile de cătină, plantă cu calităţi nutriţionale şi potenţial biomedical remarcabil.
Rezultatele şi studiile noastre reprezintă un bun studiu de caz în ceea ce priveşte investigaţiile chemotaxonomice ale plantelor dar şi în evaluarea autenticităţii produselor alimentare
Originalitatea tezei de doctorat:
Pentru prima dată s-au caracterizat diferitele varietăţi româneşti de catină (ssp. Carpatica) fructe şi frunze printr-o analiza extinsă, avansată şi comparativă a carotenoidelor şi flavonol glicozidelor folosind o abordare metabolomică
A fost dezvoltată o noua metodă target de determinare a esterilor de carotenoide
folosind o combinaţie a două metode de analiză avansate precum GC-MS şi (U)HPLC-MS, eliminând metodele de curăţire în prealabil a extractului
Au fost identificate diferenţele metabolice dintre varietăţile de cătină folosind în
paralel tehnici avansate de chemometrie precum PCA şi CA atât pentru fructe cât şi pentru frunze
Analiza PCA a fost utilizată cu succes atât pentru identificarea biomarkerilor
carotenoidici cât şi a biomarkerilor flavonol glicozidici ce contribuie la clasificarea varietăţilor şi recunoaşterea autenticităţii.
XXX
BIBLIOGRAFIE
1. Abdul, R., Yaakob, B., Che, M., Amin, I., Puziah, H. (2010). Application of FTIR Spectroscopy for the Determination of Virgin Coconut Oil in Binary Mixtures with Olive Oil and Palm Oil. Journal of the American Oil Chemists' Society, 87, 601-606.
2. Adiana, M.A., Mazura, M.P. (2011). Study on Senna alata and its different extracts by Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation infrared spectroscopy. Journal of Molecular Structure, 991, 84-91.
3. Andersson, S.C., Olsson, M.E., Johansson, E., Rumpunen, K. (2009). Carotenoids in Sea Buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) Berries during Ripening and Use of Pheophytin a as a Maturity Marker. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 250-258.
4. Bunghez, I.-R., Ion, R.-M. (2011). Complex Spectral Characterization Of Active Principles From Marigold (Calendula Officinalis). Journal of Science and Arts, 1, 59-64.
5. Chen, C., Zhang, H., Xiao, W., Yong, Z.-P., Bai, N. (2007). High-performance liquid chromatographic fingerprint analysis for different origins of sea buckthorn berries. Journal of Chromatography A, 1154, 250-259.
6. de Rosso, V.V., Mercadante, A.Z. (2007). Identification and Quantification of Carotenoids, by HPLC-PDA-MS/MS, from Amazonian Fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 5062-5072.
7. Ficarra, R., Tommasini, S., Raneri, D., Calabrò, M.L., di Bella, M.R., Rustichelli, C., Gamberini, M.C., Ficarra, P. (2002). Study of flavonoids/β-cyclodextrins inclusion complexes by NMR, FT-IR, DSC, X-ray investigation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 29, 1005-1014.
8. Giuffrida, D., Pintea, A., Dugo, P., Torre, G., Pop, R.M., Mondello, L. (2011). Determination of Carotenoids and their Esters in Fruits of Sea Buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) by HPLC-DAD-APCI-MS. Phytochemical Analysis, accepted manuscript.
9. Guan, T.T.Y., Cenkowski, S., Hydamaka, A. (2005). Effect of Drying on the Nutraceutical Quality of Sea Buckthorn (Hippophae rhamnoides L. ssp. sinensis) Leaves. Journal of Food Science, 70.
10. Kallio, H., Yang, B., Peippo, P., Tahvonen, R., Pan, R. (2002). Triacylglycerols, Glycerophospholipids, Tocopherols, and Tocotrienols in Berries and Seeds of Two Subspecies (ssp. sinensis and mongolica) of Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 3004-3009.
11. Konwar, M., Baruah, G.D. (2011). On the nature of vibrational bands in the FTIR spectra of medicinal plant leaves. Archives of Applied Science Research, 3, 214-221.
12. Li, Y.-M., Sun, S.-Q., Zhou, Q., Qin, Z., Tao, J.-X., Wang, J., Fang, X. (2004). Identification of American ginseng from different regions using FT-IR and two-dimensional correlation IR spectroscopy. Vibrational Spectroscopy, 36, 227-232.
13. Lu, X., Wang, J., Al-Qadiri, H.M., Ross, C.F., Powers, J.R., Tang, J., Rasco, B.A. (2011). Determination of total phenolic content and antioxidant capacity of onion (Allium cepa) and shallot (Allium oschaninii) using infrared spectroscopy. Food Chemistry, In Press, Corrected Proof.
14. Pârlog, R.M., Vodnar, D.C., Dulf, F.V., Leopold, L., Socaciu, C. (2009). HPLC- PDA and UV-VIS Spectrometry Analysis used to Fingerprint Sea Buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) Berries Comparatively with Leaves and Seeds Extracts. Bulletin UASVM, Agricultue, 66, 409 - 414.
15. Pintea, A., Varga, A., Stepnowski, P., Socaciu, C., Culea, M., Diehl, H.A. (2005). Chromatographic analysis of carotenol fatty acid esters in Physalis alkekengi and Hippophae rhamnoides. Phytochemical Analysis, 16, 188-195.
16. Rosch, D., Bergmann, M., Knorr, D., Kroh, L.W. (2003). Structure-antioxidant
XXXI
efficiency relationships of phenolic compounds and their contribution to the antioxidant activity of sea buckthorn juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 4233-4239.
17. Rosch, D., Krumbein, A., Mugge, C., Kroh, L.W. (2004). Structural investigations of flavonol glycosides from sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides) pomace by NMR spectroscopy and HPLC-ESI-MSn. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 4039-4046.
18. Rubio-Diaz, D.E., De Nardo, T., Santos, A., de Jesus, S., Francis, D., Rodriguez-Saona, L.E. (2010). Profiling of nutritionally important carotenoids from genetically-diverse tomatoes by infrared spectroscopy. Food Chemistry, 120, 282-289.
19. Stuart, B.H. (2004). Infrared Spectroscopy: Fundamentals and Applications, John Wiley & Sons, Ltd, West Sussex PO19 8SQ, England.
20. Tavitian, B.A., Nabedryk, E., Mäntele, W., Breton, J. (1986). Light-induced Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopic investigations of primary reactions in photosystem I and photosystem II. FEBS Letters, 201, 151-157.
21. Vescan, A., Pamfil, D., Bele, C., Matea, C., Sisea, C.R. (2010). Several Lipophilic Components of Five Elite Genotypes of Romanian Seabuckthorn (Hippophae rhamnoides subs. carpatica). Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj, 38 114-122.
22. Weckwerth, W., Fiehn, O. (2002). Can we discover novel pathways using metabolomic analysis? Current Opinion in Biotechnology, 13, 156-160.
23. Wu, Y.-W., Sun, S.-Q., Zhao, J., Li, Y., Zhou, Q. (2008). Rapid discrimination of extracts of Chinese propolis and poplar buds by FT-IR and 2D IR correlation spectroscopy. Journal of Molecular Structure, 883-884, 48-54.
24. Yang, B., Kallio, H. (2005). Lipophilic Components of Seabuckthorn (Hippophae rhamnoides L.) Seeds and Berries. In: Seabuckthorn (Hippophae L), A Multipurpose Wonder Plant, Vol. II: (70-97), V.Singh (Ed.). India: Daya Publishing House.
25. Yang, B., Kallio, H. (2006). Analysis of triacylglycerols of seeds and berries of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides) of different origins by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Lipids, 41, 381-392.
