5/24/2018 Tipuri de Microscoape Utilizate Pentru Cercetarea Celulelor

1/8

Tipuri de microscoape utilizate pentru cercetarea celulelor

Investigatiile citologice si histologice se bazeaza pe preparatele ``microscopice`` numite extemporsau nepermanente, care se examineaza fie la microscopul optic sau fotonic, fie la alte tipuri de microscoacum sunt: microscoape cu fluorescenta, microscoape cu lumina ultravioleta, microscoape cu camp intunemicroscoape de forta atomica si microscoape electronice prin transmisie sau prin baleaj. Microscoapele optice sau fotonice utilizeaza pentru obtinerea unei imagini marite a preparatelor,

efectele optice ale lentilelor asupra radiatiilor fotonice ale spectrului luminos. Calitatea unui microscop fotonic este data de rezolutia sa. Rezolutia este capacitatea de a distinge idoua obiecte apropiate si este data de distanta minima la care doua imagini punctiforme mai pot fi observdistinct. a este determinata in primul rand de lungimea de unda ! " # a luminii folosite.

1.1. Microscopul optic obisnuit, cu care se examineaza preparatele prin transparenta in luminaspectrului vizibil care are lungimea de unda cuprinsa intre $%&&'(&&& ), este cel mai utilizat in hiostologpentru studiul tesuturilor si in citologie pentru studiul celulelor. *atorita luminii albastre existente in speluminii vizibile si care are lungimea de unda cea mai scurta, respectiv &,+ m, se pot studia preparatecitologice la o putere de rezolutie de aproximativ &,-m, deci pot fi observate detalii cu diametrul deaproximativ m.

/cest tip de microscop este cel mai larg utilizat in cercetarile citologice. /ceste microscoape pot aveasingur tub ocular, si se numesc microscoape monoculare, observatiile putand fi efectuate privind cu un siochi. Cele mai multe microscoape optice au insa doua oculare, si se numesc binoculare, observatiile fiindefectuate privind concomitent cu amandoi ochii.

1.2. Microscopul cu contrast de fazaeste utilizat in special pentru studiul celulelor vii. l repreziadaptare a microscopului obisnuit, prin utilizarea unor anexe care permit transformarea diferentelor de faexistente in preparatul viu si neperceptibile ochiului, in diferenta de amplitudine.

1.3. Microscopul polarizantpermite studierea proprietatilor optice ale structurilor in lumina polar0reparatul este iluminat cu un fascicul de lumina polarizata, obtinut prin interpunerea unui nicol! polarizatorul # in calea fascicolului luminos, sub condensor. 0roprietatile optice ale obiectelor studiate sdeterminate cu ajutorul unui alt nicol ! analizatorul # adaptat la ocular.

1

5/24/2018 Tipuri de Microscoape Utilizate Pentru Cercetarea Celulelor

2/8

1.4. Microscopul cu fond intunecat, are un orificiu de iluminare care nu permite iluminarea intregcamp ci, cu ajutorul unui condensor special care impiedica trecerea razelor directe prin preparat, sunt lasatreaca doar razele laterale. In acest fel, obiectele aflate in campul iluminat lateral, de obicei mici organismaflate in stare vie, vor apare stralucitoare pe un fond intunecat ! fenomenul 23ndal #. Microscopia pe fonintunecat da imagini de suprafata, indicand prezenta si miscarile anumitor obiecte sau microorganismestudiate.

1.5. Microscopul cu lumina ultravioleta. 4tilizeaza radiatii cu lungime de unda mai mica decat c

spectrului vizibil, respectiv, de -.5&& ) in loc de $.%&&' (.&&& ), fapt pentru care acest microscop are o pde rezolutie mai mare decat a microscopului obisnuit. /ceste microscoape au intreaga optica din cuart, fistiut faptul ca sticla este impenetrabila pentru radiatiile ultreviolete.

1.6. Microscopul cu fluorescenta, se bazeaza pe proprietatea unor substante de a transforma radiaultraviolete in radiatii vizibile, proprietate denumita fluorescenta. 0rin ocular de observa imaginile lumindatede structurile devenite fluorescente, datorita faptului ca preparatele au fost tratate cu substante zise``fluorescente``.

1.7. Microscopia focala, permite obtinerea unei imagini tridimensionale a structurii studiate. 0rincde functionare se bazeaza pe osursa punctiforma de lumina care este focalizata pe un preparat printr'o len

de regula printr'un obiectiv de microscop, iar imaginea se reintoarca prin aceeasi lentila la un fotodetectocare are in fata sa o diagrama. *eci, lumina care porneste de la zona punctiforma din planul preparatului exact in focarul obiectiv, va focaliza direct prin diafragma dinaintea fotodetectorului si va fi vizibila, reststructurilor aflate in planurile invecinate nefiind vizibile. 0ot deci fi vizualizate numai imagini punctiformfoarte mici, insa mult mai clare decat cu microscopul obisnuit, deoarece rezolutia este mult mai buna, fiin&,-& nm. /cest microscop permite obtinerea de imagini de la structuri neincluse si nesectionate, prin posibilitatde a executa `` sectiuni optice``, respectiv de a furniza imagini de la diferite nivele ale obiectului studiat.

1.8. Microscopul de forta atomica. /cest tip de microscop poseda un senzor sub forma unei sondmontate pe o tija metalica. Intre varful acestei sonde'senzor si atomii probei de studiat peste care se `` pli

`` senzorul si culege informatii, se stabileste o forta atomica care trebuie mentinuta constanta. 6aloarea aforte este foarte mica, de ordinul a 1 7e8ton, similara cu cea existenta intre doi atomi de neon. 9e pot obimagini ale oricarei probe de studiat, fara o pregatire speciala a acestora si la rezolutii foarte inalte, respecde ordinul angstromilor, ca si la microscoapele electronice. Microscopul de forta atomic este alcatuit dintr'un computer, o unitate de control electronic si o masa microscop.

1.9. Microscoapele alectronice. In microscopia electronica, un fascicul de electroni inlocuieste lumvizibila.lectronii, accelerati la o tensiune de voltaj cuprinsa intre &.&&&'$.&&&.&&& volti, au proprietati unde de numai &,&& nm, respectiv &,& ). Cu ajutorul acestei lungimi de unda s'ar putea atinge in modteoretic o rezolutie de aproximativ &,1 ), deci mai mica decat diametrul unor atomi. /ceasta inseamna ca

microscopul electronic are o rezolutie de +&& de ori mai mare decat cea o microscopului optic si de -&&.&de ori mai mare decat a ochiului uman. Microscoapele electronice utilizeaza o sursa de electroni, respectiv o catoda care fiind incalzita emelectroni. /cesti electroni sunt apoi accelerati cu ajutorul unei tensiuni de zeci de mii, sute de mii sau chimilioane de volti, de'a lungul interiorului coloanei microscopului in care este in permanenta mentinut unfoarte inalt. /ceasta coloana este alcatuita din bobine electromagnetice care dirijeaza fluxul de electroniaccelerati asupra preparatului de studiat, alcatuit de sectiuni ultrafine groase de aproximativ && ), pe caelectronii le traverseaza, preiau din el informatia sub forma de imagine si o transmite mai departe sub formarita pe un ecran fluorescent pentru a fi analizata de observator.

-

5/24/2018 Tipuri de Microscoape Utilizate Pentru Cercetarea Celulelor

3/8

/ceste microscoape electronice se numesc microscoape elctronice prin transmisie. Cele mai bunemicroscoape electronice prin transmisie au o putere de rezolutie de 1 ), putand observa aranjamentul atodin anumite materiale cristaline, stiind faptul ca diametrul atomului de ; este de 1 ). In asemeneamicroscoape se pot obtine mariri de la 1.&&& de ori ale preparatelor studiate pana la (&&.&&& de ori vazutdirect in microscop, iar prin marire fotografica ulterioara se pot atinge mariri de pana la -&.&&&.&&& de or

$

5/24/2018 Tipuri de Microscoape Utilizate Pentru Cercetarea Celulelor

4/8

+

5/24/2018 Tipuri de Microscoape Utilizate Pentru Cercetarea Celulelor

5/8

1.1. Microscopia electronica de inalt volta!.Reprezinta o varianta a microscoapelor electronice transmisie, in sensul ca aceste microscoape permit o accelerare a electronilor de aproximativ 1'$ milioanvolti. /cest voltaj suprainalt permite examinarea fie a unor sectiuni mai groase decat cele studiate inmicroscoapele electronice obisnuite, respectiv de cativa m, fie examinarea unor celule sau microorganisintregi, incluse intr'o capsula speciala.

Cu ajutorul unor asemenea microscoape s'a observat in citoplasma celulelor examinate existenta uorganizari ultrastructurale mai fine decat cea a citoscheletului celular, respectiv s'a observat o retea demicrotrabecule mult mai fine decat cele mai subtiri filamente ale citoscheletului. *e asemenea, acestemicroscoape au permis observarea pentru prima data a unor celule vii, si realizarea unor imagini

5/24/2018 Tipuri de Microscoape Utilizate Pentru Cercetarea Celulelor

6/8

surprinzatoare ale mitocondriei, care apare sub forma unui organit unic intr'o celula, sub aspectul unui arramificat in toata citoplasma. *upa obtinerea acestor imagini s'a considerat ca ceea ce vedem de fapt dinimaginile examinate prin sectiunile analizate si numim mitocondrii nu ar fi altceva decat ramuri sectionatla diferite niveluri ale acestei mitocondrii arborescente unice.

1.11. Microscopia electronica" scannin# sau de balea!

/ceste microscoape permit obtinerea unor imagini tridimensionale ale suprafetelor diferitelor obiecte

preparate biologice de studiat. Cu ajutorul acestor microscoape se pot studia obiecte de dimensiuni relatimari, respectiv de cativa centimetri. *e exemplu poate fi vizualizata structura cristalina a unor roci saudiferite alte materiale aflate in stare solida.

9pre deosebire de microscopia electronica de transmisie, cea cu baleaj realizeaza imaginea pe bazaelectronilor reflectati de suprafetele preparatului care in prealabil au fost metalizate prin depunerea, prinevaporare in vid, a unui strat subtire din anumite metale, de regula aur, platina sau chiar carbon. 4n fascide electron foarte ingust, de aproximativ -&'5& ), efectueaza o miscare de zig'zag, ``maturand``, respectscanand de fapt intreg preparatul, de la un capat la altul si redand informatia culeasa sub forma de imaginafisate pe un monitor de televiziune. 0rincipiul este asemanator televiziunii, imaginile obtinute fiindtridimensionale.

5/24/2018 Tipuri de Microscoape Utilizate Pentru Cercetarea Celulelor

7/8

1.11. Microscopie electronica analitica

In acest caz, microscopul electronic propriu'zis ! cu transmisie sau scanning # este prevazut cu un sistde microanaliza cu raze =, respectiv un spectrometru care permite analiza elementelor componenete alepreparatului studiat, redand pe un monitor imagini sub forma de grafice sau de harti. /semenea microscoelectronice permit analiza a %- elemente de la >or la 4raniu.

2. $repararea probelor biolo#ice pentru e%aminarea in T&M

In microscopul electronic, specimenul este expus intr'un vid avansat, fapt care face imposibilaexaminarea sa in stare vie. Celulele si tesuturile supuse observatiei sunt, in mod normal, prezervate inprealabil prin fixare. *eoarece electronii au putere foarte limitata de penetrare a tesuturilor fixate, pieseletrebuiesc taiate in sectiuni extrem de subtiri ! &'1&& nm # inainte ca ele sa fie examinate.0entru aceasta,specimenele sunt dehidratate si infiltrate cu o rasina sintetica monomerica. 0rin inducerea polimerizarii sobtine un bloc solid si compact de plastic ce contine specimenul. >locul este sectionat la nivelulspecimenului, cu ajutorul unui ultramicrotom, obtinandu'se sectiuni ultrafine,fara apa sau solventi volati/ceste sectiuni sunt montate pe un suport reticulat de forma discoidala, alcatuit din cupru, denumit grilaelectrolitica.

5

5/24/2018 Tipuri de Microscoape Utilizate Pentru Cercetarea Celulelor

8/8

Contrastul imaginii obtinute in microscopul electronic depinde de numarul atomic al atomilor din este alcatuit. Moleculele viului sunt compuse din atomi cu numar atomic mic ! carbon, oxigen, azot sihidrogen #. 0entru a le face vizibile,structurile biologice sunt contrastate ! impregnate, inainte sau dupasectionare # cu saruri ale metalelor grele cum sunt cele de uraniu sau de plumb. *iferitii constituenti celuvor arata grade diferite !variate# de contrast in functie de gradul lor de impregnare !?colorare? # cu acestesaruri. /vand in vedere tabloul esentializat al modului de pregatire a specimenelor biologice pentruexaminarea in 2M prezentat in cele de mai sus, este evident ca imaginea in microscop a structurilor celu

observate va depinde de mai multi factori si in primul rand de: modul de colectare a probei, fixare,dehidratare, includere, sectionare si contrastare.

3. 'i%area

@ixarea chimica a specimenelor are o importanta cruciala pentru rezultatele analizeielectronomicroscopice. 9copurile principale ale fixarii chimice sunt: stoparea proceselor metabolice,prezervarea structurii fine a celulelor si stabilizarea celulelor pentru a face posibile etapele urmatoare aleprocedurii de preparare in vederea vizualizarii. In unele studii, cu caracter mai special, este necesar ca fix

sa prezerve activitatea enzimatica, antigenitatea tisulara etc. 0rocedura de fixare presupune: a#.selectia agentilor chimici de fixare ! fixatorilor #A b#.alegerea unui vehicul adecvat pentru fixator ! solutia tampon in care este dizolvat, p;'ul solutiei prsi alte substante dizolvate in solutia tampon #A c#.alegerea ueii proceduri adecvate de aplicare a solutiei fixatoare ! timp, temperatura, succesiuneafixatorilor etc. #. *e'a lungul timpului au fost descrise numeroase metode de fixare. 7ici una dintre ele nu este la fepotrivita ! avantajoasa # pentru toate tipurile de celule sau tesuturi. Cei mai cunoscuti fixatori chimice utilizati in microscopia electronica sunt glutaraldehida si acidulosmic.

Blutaraldehida leaga moleculele proteice intre ele prin legaturi covalente iar acidul osmic stabilizeatat bistraturile lipidice cat si proteinele. 4ltimul are si un efect benefic asupra amplificarii contrastului, males a membranelor ! bistraturilor #. 2ehnicile moderne de fixare utilizeaza ambii fixatori, fixarea cu glutaraldehida precedand'o pe aceacid osmic. 9e utilizeaza solutii fixatoare apoase, obtinute prin dizolvarea fixatorilor in solutii tampon! tampon fosfat sau tampon cacodilat, de obicei 0h'ul 5,- D 5,< #. 9olutiile fixatoare au urmatoareleconcentratii: -'